JP4792880B2 - 微生物計数方法および微生物計数装置 - Google Patents
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Description
まず、微生物を含む試料を測定するために、固定部となるスライドグラスや、培養ディッシュ、マルチウェルプレート、またはろ過膜や、測定に適した形状を持つセルの観察面表面の表側、もしくは裏側の一方に微生物を固定する。固定は、ポリ−L−リジンのような試薬や、ゼラチンなどの粘着性、付着性をもった高分子材料を表面に薄く塗布し、微生物を含んだ試料を滴下し、表面に吸着させる。またメンブランフィルタのようなろ過膜の場合、上方から液体試料を吸引してろ過し、メンブランフィルタ表面に微生物を平面状に捕捉し、固定する。本発明において、最も好適に実施するものとしては、このようなろ過膜を使用することで、以下の染色や洗浄などの操作が簡便かつ微生物を流失することなく扱うことができるのでよい。また、メンブランフィルタは、薄く、小さいため、そのままでは取り扱いが容易でない。そのため、専用の支持台、吸引口付きのホルダーを使用したり、もしくは膜に保持部を結合するか、一体化させたデバイスとすることで容易に膜を取り扱うことができる。
X=0.3933×R/255+0.3651×G/255+0.1903×B/255
Y=0.2123×R/255+0.7010×G/255+0.0858×B/255
Z=0.0182×R/255+0.1117×G/255+0.9570×B/255
さらに、
x=X/(X+Y+Z)
y=Y/(X+Y+Z)
式中のR、G、BはそれぞれR輝度値、G輝度値、B輝度値であることを示す。これにより細胞および微生物または夾雑物かの判断に必要な値として、最終的にx、yの値が算出される。
M =(P−α)×(Q−β)
また、有効エリア面積は、レンズ系の倍率などから、画素あたりの面積を求め、画素あたりの面積をsとするとし、測定視野数をNとして、1画面あたりの有効エリア面積Sと全有効面積は、
(数式3)
S = Ms
全有効面積:S×N
となる。
E.coliを含む菌液と、水道水(塩素除去済み)の中の菌数を測定する。これらの液体試料を、孔径が0.45μm、直径9mmの黒色メンブランフィルタに表面を金属蒸着したものの上方からピペットにて滴下し、吸引ろ過した。メンブランフィルタは、そのままでは表面に触れてしまう恐れがあり、扱いにくいため、周囲を樹脂枠で覆い、一体化させたものを使用した。吸引ろ過圧は、あまり高すぎるとろ過できず、低すぎると微生物へのダメージとなってしまうばかりか、メンブランフィルタが破損することがあるため、100から400Torr付近のポンプ圧に設定して行った。メンブランフィルタ上にろ過するとき、計数しやすさや、逆算する精度の問題から、微生物などの発光物はできるだけ均一に分散させる必要がある。そのため、メンブランフィルタのろ過性能を均一にするために、メンブランフィルタ下方の吸引口にはろ紙などを挟み、吸引圧を拡散して、メンブラン全体に均一にかかるようにして行った。また、それとは別に、メンブランフィルタのポアの通過抵抗を減少させるため、液体試料をろ過する前に、少量の界面活性剤希釈液(Tween20 0.1%)をろ過した。液体試料は、E.coli菌液の場合は0.1mL、水道水の場合は20mLろ過した。
実施例の1に示された微生物計数装置1において、E.coliを含む菌液と、水道水(塩素除去済み)をそれぞれ一定量メンブレンフィルタ10にろ過し、値を測定した。
実施例1に示された微生物計数装置1において、E.coliを含む菌液と、水道水(塩素除去済み)をそれぞれ一定量メンブレンフィルタ10にろ過し、値を測定した。
実施例1に示された微生物計数装置1において、E.coliを含む菌液と、水道水(塩素除去済み)をそれぞれ一定量メンブレンフィルタ10にろ過し、値を測定した。
実施例1に示された微生物計数装置1において、E.coliを含む菌液と、水道水(塩素除去済み)をそれぞれ一定量メンブレンフィルタ10にろ過し、値を測定した。
2 励起光源
3 干渉フィルタ
4 集光レンズ
5 ハイパスフィルタ
6 受光フィルタ
7 レンズユニット
8 受光素子
9 検査台
10 メンブランフィルタ
11 CCDユニット
12 演算部
13 輝点除去部
14 発光点抽出部
15 発光点照合部
16 出力部
17 蛍光評価部
18 有効エリア算出部
19 生死判断部
20 微生物判断部
21 ドットプロット
22 カーソル
23 始点
24 頂点a
25 頂点b
26 終点
27 多角線
28 始点
29 頂点
30 頂点
31 頂点
32 頂点
33 多角形
34 中心
35 長軸
36 短軸
37 長軸の長さ
38 長軸の角度
39 楕円形
40 楕円形
Claims (5)
- 微生物に対して、生死菌染色試薬にて蛍光染色を行い励起光源にて蛍光を発する特定の波長を照射しその照射により蛍光を発生させ発光させ、死菌染色試薬にて蛍光染色を行い励起光源にて蛍光を発する特定の波長を照射しその照射により蛍光を発生させ発光させ、それら発光点の生死菌染色試薬の輝度と死菌染色試薬の輝度を用いて発光点が生菌群であるか死菌群であるかいずれかに分類して判別し、判別した生菌群と死菌群のRGBの輝度値より演算されたXYZ表色系に基づいた色度を、生菌群であった場合には、生菌群に対して設定された色度しきい値と比較し、死菌群であった場合には、死菌群に対して設定された色度しきい値と比較して、それぞれ夾雑物を除外し、生菌と死菌をカウントする微生物計数方法。
- 液体試料をメンブランフィルタでろ過し、前記メンブランフィルタ上に捕集された微生物に対する請求項1記載の微生物計数方法。
- 発光点からドット欠けの輝点を除去することを特徴とする請求項1または2記載の微生物計数方法。
- 発光点の画像が複数あってそれぞれ異なる波長を示すものであり、各画像上にある発光点の位置を合わせて発光点を照合することを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の微生物計数方法。
- 請求項1乃至4のいずれかに記載の微生物計数方法を使用した微生物計数装置。
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