JP2006238779A - 微生物細胞検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、生菌を含有するか含有する可能性のある検体に対し蛍光指示薬を用いて生菌を検出する方法であり、従来から知られている方法と比較して正確性を向上させ、簡便に生菌の検出する方法及び生菌計数装置を提供すること。
【解決手段】光源３からの同一の励起光と、同一の蛍光分光フィルタ４にて使用可能な２種類以上の活性指標の異なる蛍光指示薬を、同一の微生物細胞試料に接触させ、少なくとも一種類以上の蛍光指示薬によって標識された微生物細胞を生菌として計数することを特徴としたものであり、複数の指標を示す蛍光指示薬を併用し、かつ同時に使用することによって、それぞれの蛍光指示薬で標識されない菌種を補い合うことで測定感度を向上しつつ、簡便な生菌検出方法、小型で低コストな生菌検出装置を提供することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、生菌を含有するか含有する可能性のある検体に対し蛍光指示薬を用いて生菌を検出する方法であり、従来から知られている方法と比較して正確性を増加させ、簡便に生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置に関する。

従来、蛍光指示薬を用いて生菌を検出する方法の一例として蛍光性酵素基質であるフルオレセイン系蛍光指示薬が生菌を検出するための試薬として有用であることは、当業者によく知られている事実である。フルオレセイン系蛍光指示薬は、生菌に細胞膜を透過して取り込まれると、細胞質内のエステラーゼ酵素群により加水分解され、フルオレセイン骨格を有する蛍光物質（５−カルボキシフルオレセインなど）に変換されて発光機能が発現する。従って、微生物採取用フィルタ上に捕捉した生菌にフルオレセイン系蛍光指示薬を接触させてから、または、フルオレセイン系蛍光指示薬を接触させた生菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉してから、フィルタ上に励起光を照射することで生じる光点を生菌と判定する方法が古くから知られている。

しかしながら、上記の方法では生菌を正確に検出することができないという問題がある。

これは、主に微生物細胞のもつエステラーゼ酵素群による蛍光性酵素基質の分解性や、または蛍光性酵素基質が微生物細胞の持つ細胞膜を自然拡散によって透過し、細胞質内に取り込まれる際の拡散速度の点で、微生物種による格差が大きく、結果として、このような性質の劣る微生物細胞種の生菌を検出することが困難になるという側面を有するからである。

従来、この種の生菌検出方法においては、このような微生物細胞種の格差の少ない蛍光指示薬を選定して使用するといった方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。

下記、特許文献１において、生菌を検出するための蛍光指示薬として、エステラーゼ活性指標指示薬である５−スルホフルオレセインジアセテート及び６−スルホフルオレセインジアセテートを用いた方法が提案されている。これは、各地の土壌中に存在する微生物細胞を、寒天培地によって培養し、得られた微生物コロニーに対して蛍光指示薬を使用して染色評価試験を実施した結果として、５−スルホフルオレセインジアセテート及び６−スルホフルオレセインジアセテートの２種類を、有力な生菌検出用指示薬として提案している。

一方、他の生菌検出用蛍光指示薬として、生体細胞のエネルギー源として利用されているグルコースを化学的に蛍光標識した蛍光グルコース誘導体である２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（以下、２−ＮＢＤＧ）が提案されている（例えば、特許文献２）。この方法は、グルコースの２位に、蛍光標識色素誘導体であるＮ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾール−４−イル）アミノクロリド（以下、ＮＢＤ−Ｃ１）を化学結合により標識したものであり、大腸菌などの微生物細胞の生菌にはグルコースと等価に取り込まれ、死菌には取り込まれない。従って、微生物採取用フィルタ上に捕捉した生菌に２−ＮＢＤＧを接触させてから、または、２−ＮＢＤＧを接触させた生菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉してから、フィルタ上に励起光を照射することで生じる光点を生菌と判定する方法が考えられる。

さらに別の方法として、非特許文献１に示されているような選択的に細胞膜の膜透過性を調製した核酸染色色素を利用した、生菌検出方法が提案されている。これは、生菌の細胞膜に対して選択的に透過性を与えられたモノメチン架橋非対称シアニン色素の一例である色素と、生菌の細胞膜に対して不透過性を示すヨウ化プロピジウムによるものであるが、６２６項および６２７項の本文中、及びＦｉｇｕｒｅ１５．３９に示される通り、大腸菌生菌の細胞膜に対して、イソプロピルアルコールを用いて殺菌したものを、大腸菌の生菌が含まれる液体試料に適当な割合で混合し、染色したものを、蛍光分光光度計にて蛍光スペクトルを測定したものである。この方法によると、モノメチン架橋非対称シアニン色素の蛍光波長による緑色蛍光は、含まれる生菌の割合と共に減少し、殺菌液では検出されないことが示されているが、この方法により、生菌のみをモノメチン架橋非対称シアニン色素にて標識することができるというものである。
特開平７−１３５９９６号公報 特許第２９５８４７７号公報 Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ． Ｈａｕｇｌａｎｄ著 「Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ Ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒ ｏｄｕｃｔｓ Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ」 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ 社出版、２００２年、６２６−６２７項

しかしながら、上記特許文献１、２に提案されている生菌検出方法によっても、必ずしも満足できる成果を得ることができるわけではない。なぜならば、これらのいずれの方法も蛍光指示薬を単独で使用する限りは、例えばグルコースを栄養源として利用する微生物細胞種であるか（いわゆる資化性）など、微生物細胞種によって蛍光標識されない菌が存在するために、未知試料中にこのような微生物細胞種が含まれるリスクを持つ以上は、完全な生菌数を求めることは、非常に困難であるからである。また、膜透過性指標の蛍光指示薬においては、微生物細胞種による蛍光標識の格差に加え、生菌であっても微生物細胞試料の置かれている環境（例えば希釈溶媒など）によって、膜透過性は変化しやすいことが知られており、単独の使用で生菌数を求めることは非常に困難である。

表１は、様々な微生物細胞種を３種類の活性指標指示薬によって、それぞれ染色し、顕微蛍光画像により、発光強度を３段階で評価したものの一覧表である。ここで示されているように、微生物細胞種によって蛍光標識に格差が見られ、各蛍光指示薬を個別に使用して計測すると検出漏れが発生してしまう恐れがあることを示すものである。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、生菌を含有するか含有する可能性のある検体から蛍光指示薬を用いて生菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較して、より正確に生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置を提供することを目的としている。

また、近年のＨＡＣＣＰの導入によって、食品そのものの生菌数だけでなく、原料から工場の設備、調理器具、作業工程から空気環境に至るまで、一貫した環境管理が行われるようになり、それによって生菌数検査の重要性が増している。しかしながら、その一方で従来の技術は、煩雑であることや専門知識を要することなど、現場で高精度を維持しつつ簡便に誰でも測定を行えるようなものではなかった。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、生菌を含有するか含有する可能性のある検体から蛍光指示薬を用いて生菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較して、高精度を持たせつつより簡便に生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置を提供することを目的としている。

本発明の生菌検出方法は、上記目的を達成するために、請求項１記載の通り、生菌検出手段として、同一の励起光と、同一の蛍光分光フィルタにて使用可能な２種類以上の活性指標の異なる蛍光指示薬を、同一の微生物細胞試料に接触させ、少なくとも一種類以上の蛍光指示薬によって標識された微生物細胞を生菌として計数することを特徴としたものであり、複数の指標を示す蛍光指示薬を併用し、かつ同時に使用することによって、測定感度を向上しつつ、簡便な測定を実現することができる。

また、請求項２記載の生菌検出方法は、請求項１記載の生菌検出方法において、微生物細胞の活性指標として、細胞内エステラーゼ活性またはおよび栄養源の取り込み活性またはおよび細胞膜透過性とすることを特徴としている。これにより、公知の試薬を使用することで、新たな高機能の蛍光指示薬を開発することなく、精度を向上させることができる。

また、請求項３記載の生菌検出方法は、請求項１または２記載の生菌検出方法において、細胞内エステラーゼ活性指標の蛍光指示薬が、５−カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテート、フルオレセインジアセテート、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル、フルオレセイン−５−カルボニルアジドジアセテートから選ばれることを特徴とする。これらの色素は常温にて使用することができ、細胞内エステラーゼによってアセトキシメチルエステル基が加水分解され、無蛍光性の色素から、安定して蛍光強度が高い蛍光性の色素へと変換され、細胞内に蓄積される性質であるため、検出精度を向上させることができるものである。

また、請求項４記載の生菌検出方法は、請求項１または２記載の生菌検出方法において、栄養源の取り込み活性指標の蛍光指示薬が、２−ＮＢＤＧ、６−ＮＢＤＧから選ばれることを特徴とする。これらの色素は、水溶液中での安定性に優れており、色素の分解による濃度の変化が少なく、安定して検出精度を得ることができるというものである。

また、請求項５記載の生菌検出方法は、請求項１または２記載の生菌検出方法において、細胞膜透過性指標の蛍光指示薬が、（Ａ群）アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、モノメチン架橋非対称シアニン色素、（Ｂ群）ヨウ化プロピジウム、臭化エチジウムより一つずつ選ばれて使用されることを特徴とする。これらの色素は、非常に強い蛍光強度を示し、核酸に結合していない状態では無蛍光性であるため、画像背景を抑え、高感度な蛍光測定を実現することができるといういものである。

また、請求項６記載の生菌検出方法は、請求項１乃至５のいずれかに記載の生菌検出方法として、蛍光指示薬を含む染色液に、乾燥防止成分を混合して使用することを特徴とする。これにより、乾燥などによる蛍光強度の変化を軽減することができ、検出精度が安定した計数を実現することができる。

また、請求項７記載の生菌検出方法は、請求項６記載の生菌検出方法として、蛍光指示薬を含む染色液に、乾燥防止成分とし、グルセロールを混合して使用することを特徴とする。これにより、乾燥防止効果を安定して与えることができ、しかも安価に実現することができる。

また、請求項８記載の生菌検出方法は、請求項７記載の生菌検出方法として、蛍光指示薬を含む染色液に、乾燥防止成分とし、グルセロール濃度を１０から６０％とすることを特徴とする。これにより、混合して使用する方法では操作性がよく、ろ過圧の上昇による計測の阻害を起こすこともなく、簡便な検出方法を実現できるというものである。

また、請求項９記載の生菌検出方法は、請求項１から８のいずれかに記載の生菌検出方法として、蛍光指示薬を含む染色液に、細胞膜透過性増加成分を混合して使用することを特徴とするものである。これにより、主にエステラーゼ活性指示薬の細胞膜透過性を向上させ、検出精度を向上させることができる。

また、請求項１０記載の生菌検出方法は、請求項９記載の生菌検出方法として、蛍光指示薬を含む染色液に、細胞膜透過性増加成分としてキレート剤を使用することを特徴とするものである。これにより、主にエステラーゼ活性指示薬の細胞膜透過性を向上しつつ、安定化させ、検出精度を向上させることができる。

また、請求項１１記載の生菌検出方法は、請求項９記載の生菌検出方法として、キレート剤をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）として使用することを特徴とする。これにより、比較的入手しやすく、安価な方法で、検出精度の向上を行うことができるというものである。

また、請求項１２記載の生菌検出方法は、請求項１乃至１１のいずれかに記載の生菌検出方法として、蛍光指示薬の励起光源として、発光ダイオードを使用することを特徴とする。これにより、蛍光指示薬の励起光源を、他の種類の光源、例えば水銀ランプやレーザーに比べて、小型化し、低コスト化することができ、それによって、生菌計測現場により近いところに効果的に普及できる生菌数計測装置とすることができるようになる。

また、請求項１３記載の生菌検出方法は、請求項１から１２のいずれかに記載の生菌検出方法として、蛍光指示薬にて標識された微生物細胞を、２次元状に展開させ、レンズ、光学フィルタ、光電変換素子を用いて顕微蛍光画像を取得し、得られた画像中の発光点を微生物細胞数として計数することを特徴とする。これにより、平面に展開させて拡大し、直接微生物細胞数と生死を判別することができる機構とすることで、安定して高精度な計測を実現することができる装置を提供することができる。

また、請求項１４記載の生菌検出方法は、請求項１乃至１３のいずれかに記載の生菌検出方法として、メンブレンフィルタを用いて微生物細胞を捕集し、検出することを特徴とする。これにより、検体成分を除去しやすくなり、それに起因する計測誤差の発生を軽減することができ、安定して検出精度の高い計測方法を実現することができる。

また、請求項１５記載の生菌検出方法は、請求項１乃至１４のいずれかに記載の生菌検出方法として、メンブレンフィルタ上の捕集した後、栄養源を供給して培養し、形成された微小なコロニーを、前記蛍光指示薬を用いて標識し、発光点として計数することを特徴とする。これにより、検体成分に含まれる、微生物細胞と同程度の大きさと自家蛍光波長をもつ夾雑物質と、微生物細胞とを大きさによって識別することができ、かつ非常に低濃度の微生物細胞を含むような試料であっても、高感度かつ高精度な計測方法、計測装置を実現することができる。

本発明の生菌検出方法によれば、生菌を標識するための複数種類の蛍光指示薬を同一の試料に使用することにより、それぞれの指示薬によって染色がなされない微生物細胞種を補い合うことができ、従来から知られている方法と比較して正確、簡便に生菌の検出を行うことができる。

また、本発明の生菌検出方法によれば、生菌を標識するための複数の蛍光指示薬を同一の励起光源および同一の蛍光分光フィルタで使用可能とすることにより、小型で低コストな生菌検出方法、生菌検出装置を提供できる。

本発明の請求項１記載の発明は、生菌検出手段として、同一の励起光と、同一の蛍光フィルタにて使用可能な２種類以上の活性指標の異なる蛍光指示薬を、同一の微生物細胞試料に接触させ、少なくとも一種類以上の蛍光指示薬によって標識された微生物細胞を生菌として計数することを特徴としたものであり、２種類以上の活性指標を用いることで、それぞれ検出できない微生物細胞種を補い合い、検出された生菌数の正確性を向上させるという作用を有する。また、同時に、同一の励起光源と蛍光フィルタで使用可能とすることで、それぞれの指示薬を単独で計測する方法に比較し、測定手順の簡略化、装置の小型化、低コスト化、測定時間の短縮を行うことができるという作用を有する。

また、請求項２記載の発明は、微生物細胞の活性指標として、細胞内エステラーゼ活性、栄養源の取り込み活性、細胞膜透過性とすることで、公知の試薬を適用できるものであるため、新たな試薬の開発を行わずに感度の向上が図れ、開発コストの低コスト化を行うことができるという作用を有する。

また、請求項６記載の発明は、蛍光指示薬を含む染色液に、乾燥防止成分を混合して使用することで、乾燥に由来する蛍光強度の低下を防止し、検出精度の安定化を図ることができるという作用を有する。

また、請求項９記載の発明は、蛍光指示薬を含む染色液に、細胞膜の透過性を向上させることができる成分を混合して使用するというものであり、主にエステラーゼ活性指標蛍光指示薬の細胞質内への導入を安定化し、生菌検出精度の安定化を図ることができるという作用を有する。

また、請求項１２記載の発明は、蛍光指示薬の励起光源として、発光ダイオードを使用するというものであり、励起光源として知られる水銀ランプ、キセノンランプ、各種レーザーに比較し、小型化、低コスト化を図ることができるという作用を有する。

また、請求項１３記載の発明は、蛍光指示薬にて標識された微生物細胞を、２次元状に展開させ、レンズ、光学フィルタ、光電変換素子を用いて顕微蛍光画像を取得し、得られた画像中の発光点を微生物細胞数として計数することを特徴とするものであり、微生物細胞を含有する試料をサンプリングしたのち、２次元状に展開させて、レンズにより拡大することで、微生物細胞を１個ずつ検出することが可能となり、検出精度の向上を図ることができるという作用を有する。

また、請求項１４記載の発明は、メンブレンフィルタを用いて微生物細胞を捕集し、検出することを特徴とするもので、微生物細胞を含む試料に含まれる他の成分による検出精度低下の要因（例えば、ｐＨ変化など）となる物質を、ろ過することで除去することができるため、検出精度が安定化するという作用を有する。また、液体試料中に含まれる微生物細胞を２次元状に集めることができるため、測定面積を限定させることができ、測定時間を短縮できるという作用を有する。

また、請求項１５記載の発明は、メンブレンフィルタ上の捕集した後、栄養源を供給して培養し、形成された微小なコロニーを、前記蛍光指示薬を用いて標識し、発光点として計数することを特徴とするものである。測定対象とする試料に、微生物細胞と大きさが等しく、上記蛍光指示薬の蛍光波長と同じ波長を含む自家蛍光を発するような夾雑物質が含まれていた場合、生菌として誤認識してしまい、検出精度が低下するため、生菌をこれらの夾雑物質とは十分に差別化しうる程度の大きさのコロニーを形成するまで培養し、この微小コロニーを上記蛍光指示薬により標識し、検出することで、検出感度を向上させることができるという作用を有する。

本発明において用いることができる蛍光指示薬としては、細胞内エステラーゼ活性指標指示薬として、５−カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテート、フルオレセインジアセテート、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル、フルオレセイン−５−カルボニルアジドジアセテートなどの公知の試薬が挙げられる。これらの試薬は、生菌に細胞膜を透過して取り込まれると、細胞質内のエステラーゼなどの酵素により加水分解されてフルオレセイン骨格を有する蛍光物質であるカルボキシフルオレセイン系化合物に変換されて発光機能が発現する。

また、本発明において用いることができる蛍光指示薬として、栄養源の取り込み活性指標の蛍光指示薬が、２−ＮＢＤＧ、６−ＮＢＤＧなどの公知の試薬が挙げられる。これらの試薬は、生菌に細胞膜を通して能動的に取り込まれ、細胞質内に蛍光物質が蓄積することで、生菌を検出することができるものである。

また、本発明において用いることができる蛍光指示薬として、細胞膜透過性指標の蛍光指示薬が、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、モノメチン架橋非対称シアニン色素、ヨウ化プロピジウム、臭化エチジウムなどの公知の試薬が挙げられる。これらの試薬は、細胞質内に存在するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と結合し、蛍光を発することができる色素であり、（Ａ群）アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、モノメチン架橋非対称シアニン色素は、生菌、死菌ともに細胞質内へ透過し、ＤＮＡと結合して蛍光を発することから、生菌および死菌検出指示薬として知られるものである。また（Ｂ群）ヨウ化プロピジウム、臭化エチジウムは生菌の細胞質内には透過することができず、死菌の細胞質内に透過し、ＤＮＡと結合して蛍光を発する、死菌検出用指示薬として知られたものである。これらは、（Ａ群）、（Ｂ群）から一つずつ選択し、適当な濃度比において同時に使用することによって、生菌は主に（Ａ群）の指示薬、死菌は主に（Ｂ群）の指示薬で標識されることとなり、生菌を検出することができるものである。

以下、本発明の生菌検出方法について順を追って説明する。

（実施の形態１）
まず、微生物採取用フィルタの上方から液体試料を吸引してろ過し、メンブレンフィルタ表面に微生物細胞を２次元的に捕捉して蛍光指示薬を接触させるか、または、蛍光指示薬を接触させた微生物細胞を微生物採取用フィルタ上に吸引によりろ過し、微生物細胞を２次元的に捕捉する。この操作自体は、公知の方法に準じて行えばよい。本発明において菌を含有するか含有する可能性のある検体は液状検体であるが、検査対象が飲料水などの液状サンプルの場合は、それ自体が液状検体となる。検査対象が野菜や肉をはじめとする食材などの固体サンプルの場合は、それをホモジナイズして液状検体としたり、その表面から綿棒などを用いて菌を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体としたりする。また、まな板などの調理器具などが検査対象となる場合、その表面から綿棒などを用いて菌を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体とする。こうした液状検体を微生物採取用フィルタで吸引濾過することでフィルタ上に菌を捕捉してから蛍光指示薬をフィルタの上方から滴下するか、または、液状検体に蛍光指示薬を混合した後、液状検体を微生物採取用フィルタで吸引ろ過することで、フィルタ上に蛍光標識された菌を捕捉する。

なお、２種類以上の異なる蛍光指示薬は、微生物試料に対して、あらかじめ１から１００μＭとなるようを混合しておき、同時に作用させるか、もしくは別々に、時間を置かず、もしくは適当な時間間隔を開けて作用させる。

また、微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌を含む物質表面が、測定中に乾燥し輝度が変化することを防ぐための手段として蛍光試薬には１０から６０％ｗ／ｖのグリセロールを混合させておく。

なお、微生物試料に対して蛍光指示薬を作用させる前、もしくは同時にエステラーゼ活性蛍光指示薬の取り込み促進剤であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を適当な濃度で混合させておく。

なお、微生物採取用フィルタとしては、例えば、孔径が０．１μｍ〜１μｍの公知のものを用いることができる。

蛍光指示薬を接触させた後、微生物細胞が検出しうる十分な蛍光強度をもたせるため、一定の染色時間をとる。つづいて、蛍光標識された生菌が展開されているメンブレンフィルタに対し励起光を照射することで生じる光点を検出する。

この操作は、例えば、カルボキシフルオレセイン系化合物は、波長が４９５ｎｍ付近の励起光を照射した場合、波長が５２４ｎｍ付近の蛍光を発し、また２−ＮＢＤＧは波長が４６６ｎｍ付近の励起光を照射した場合、波長が５４０ｎｍ付近の蛍光を発し、またモノメチン架橋非対称シアニン色素は波長が４８８ｎｍ付近の蛍光を照射した場合、波長が５２０ｎｍ付近の蛍光を発する。そのため励起光源としての発光ダイオードは、青色のもので、好ましくは４８０ｎｍ付近の波長を発することができるものを使用する。また蛍光フィルタとしては、緑色のもので、好ましくは５１０ｎｍから５４０ｎｍまでの範囲に透過性能をもつものを使用する。当該蛍光は拡大レンズ系を通し、光電変換素子であるＣＣＤカメラを用いて露光時間１秒から１０秒程度の露光時間で画像撮影することにより取得される。

これらの操作により取得された蛍光画像は、生菌の蛍光由来による発光点を含むものであるが、これらの発光点は画像解析手段によって適切な閾値により抽出され、個数を計数することができる。これにより、もとの微生物試料に含まれていた微生物細胞の生菌数を計数することができるのである。

図１は、本発明の生菌検出方法を好適に実施するための生菌計数装置の一態様を示す概念図である。この生菌計数装置１は、光源３、光源集光手段としてのレンズ５受光部１０を含む。光源３から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ４で分光する。分光された励起光はダイクロイックミラー７を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ５を経て検査台６にセットされた微生物採取用フィルタ２（別途の操作によりフィルタ上に染色された菌を捕捉してあるもの）上に集光される。光源３から発せられた励起光は、レンズ５によって集光されるが、その際、レンズ５によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。ここで、微小な一定面積とは、生菌の大きさに基づいて設定した場合、直径１ｍｍ程度の範囲を指し示す。励起光を照射する範囲（微小な一定面積）は、フィルタ上を移動手段により連続的にまたは断続的に移動させられる。励起光により生菌が発する蛍光は、再びダイクロイックミラー７を透過する。その際、蛍光はダイクロイックミラー７をそのまま透過し、受光部１０に到達する。一定の時間内に受光部１０に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルタ８を経て、受光部１０に内蔵された光電変換素子９に到達し、信号化される。これにより得られた信号は画像化され、演算部１１によって画像処理により生菌の発光を示す発光点を検出し、数を計数する。これにより、生菌数を求めることができるのである。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定して解釈されるものではない。

（実施例１）：本発明の生菌検出法の効果について
１つの前培養した大腸菌をろ過滅菌蒸留水などに懸濁し、液体試料を調製した。液状検体を孔径が０．４５μｍの微生物採取用メンブレンフィルタに、マニホールドを用いて吸引濾過し、フィルタ上に大腸菌を捕捉した。

濃度１０μＭの５−（６−）カルボシキフルオレセインジアセテート、１００μＭの２−ＮＢＤＧ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０％ｗ／ｖグリセロールの混合水溶液をメンブレンフィルタ上に滴下し、室温にて１０分間染色を行った。再びメンブレンフィルタ上の余分な試薬を吸引濾過してフィルタ上の液状成分を除去した。染色を行ったメンブレンフィルタ生菌計数装置１の検査台６に微生物採取用メンブレンフィルタ２をセットする。そして、演算器より生菌計数装置１に運転の指令を与えると微生物採取用フィルタ２をセットした検査台６は、レンズ５の下方に移動させられ、フィルタ上に励起光が照射され画像が撮影される。検査台はレンズ５の下方にて移動しながら微生物採取用メンブレンフィルタの表面を走査し、あらかじめ指定した一定の面積の画像を取得する。取得した画像は演算器にて画像処理され、発光点数を計数し、最終的な生菌数を求めることができる。

図２は、微生物が含まれると考えられる野菜のホモジナイズ液を液体試料とし、５−（６−）カルボシキフルオレセインジアセテート単独で染色された画像１２、２−ＮＢＤＧ単独で染色された画像１３、２種類の蛍光指示薬を混合した試薬によって染色された画像１４をそれぞれ示す。混合した試薬により染色された画像に比較し、それぞれ単独の蛍光指示薬にて染色された画像では一部の微生物細胞種だけがそれぞれ発光しているのが確認できる。２種類の蛍光指示薬を混合することで、両方の微生物細胞種を発光させることができ、どちらの種類も測定を漏らすことなく一度に計数することができることが確認できている。

本発明は、生菌を含んだ検体から蛍光指示薬によって生菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較してより正確かつ簡便性を併せ持たせた生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

本発明の実施の形態１の生菌計測を効果的に実施する為の生菌計測装置を示す概念図 本発明の実施例１の２種類の蛍光指示薬を併用した生菌計測の蛍光画像を示す図

符号の説明

１ 生菌計数装置
２ 微生物採取用フィルタ
３ 光源
４ 励起光分光フィルタ
５ レンズ
６ 検査台
７ ダイクロイックミラー
８ 蛍光分光フィルタ
９ 光電変換素子
１０ 受光部
１１ 演算部
１２ ２−ＮＢＤＧにより染色された蛍光画像
１３ ５−（６−）カルボシキフルオレセインジアセテートにより染色された蛍光画像
１４ ２−ＮＢＤＧおよび５−（６−）カルボシキフルオレセインジアセテートの混合試薬により染色された蛍光画像

Claims (15)

1. 同一の励起光と、同一の蛍光分光フィルタにて使用可能な２種類以上の異なる活性指標の蛍光指示薬を同一の微生物細胞試料に接触させ、少なくとも一種類以上の前記蛍光指示薬によって標識された微生物細胞を生菌として計数することを特徴とする微生物細胞検出方法。
2. 細胞内エステラーゼ活性あるいはおよび栄養源の取り込み活性あるいはおよび細胞膜透過性を微生物細胞の活性指標とすることを特徴とする請求項１記載の微生物細胞検出方法。
3. 細胞内エステラーゼ活性指標の蛍光指示薬が、５−カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテート、フルオレセインジアセテート、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル、フルオレセイン−５−カルボニルアジドジアセテートから選ばれることを特徴とする請求項１または２記載の微生物細胞検出方法。
4. 栄養源の取り込み活性指標の蛍光指示薬が、２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコース、６−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコースから選ばれることを特徴とする請求項１または２記載の微生物細胞検出方法。
5. 細胞膜透過性指標の蛍光指示薬が、下記（Ａ群）、（Ｂ群）より一つずつ選ばれて使用されることを特徴とする請求項１または２記載の微生物細胞検出方法。
   （Ａ群）アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、モノメチン架橋非対称シアニン色素
   （Ｂ群）ヨウ化プロピジウム、臭化エチジウム
6. 前記蛍光指示薬を含む染色液に、乾燥防止成分を混合して使用することを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の微生物細胞検出方法。
7. 前記蛍光指示薬を含む染色液に、乾燥防止成分とし、グルセロールを混合して使用することを特徴とする請求項６記載の微生物細胞検出方法。
8. 前記蛍光指示薬を含む染色液に、乾燥防止成分とし、グルセロール濃度を１０から６０％とすることを特徴とする請求項７記載の微生物細胞検出方法。
9. 前記蛍光指示薬を含む染色液に、細胞膜透過性増加成分を混合して使用することを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の微生物細胞検出方法。
10. 前記蛍光指示薬を含む染色液に、細胞膜透過性増加成分としてキレート剤を混合して使用することを特徴とする請求項９に記載の微生物細胞検出方法。
11. 前記キレート剤をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）として使用することを特徴とする請求項９記載の微生物細胞検出方法。
12. 前記蛍光指示薬の励起光源として、発光ダイオードを使用することを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の微生物細胞検出方法。
13. 前記蛍光指示薬にて標識された微生物細胞を、２次元状に展開させ、レンズ、光学フィルタ、電荷結合素子を用いて顕微蛍光画像を取得し、得られた画像中の発光点を微生物細胞数として計数することを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかに記載の微生物細胞検出方法。
14. メンブレンフィルタを用いて微生物細胞を捕集し、検出することを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかに記載の微生物細胞検出方法。
15. メンブレンフィルタ上の捕集した後、栄養源を供給して培養し、形成された微小なコロニーを、前記蛍光指示薬を用いて標識し、発光点として計数することを特徴とする請求項１乃至１４のいずれかに記載の微生物細胞検出方法。

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