WO2014030729A1 - 微生物の検査方法及びその装置 - Google Patents

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明子 中田
真矢 伏田
江藤　聡
真典 松田
保坂　幸男
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株式会社サタケ
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Definitions

  • the present invention relates to a microorganism testing method and apparatus, and more particularly to a microorganism testing method and apparatus suitable for detecting living microorganisms such as plankton contained in ballast water.
  • ballast water In order to stabilize the ship, the ship that is not loaded with cargo travels with ballast water, and discharges the ballast water that is loaded in the sea area where the luggage is loaded. Ballast water is usually discharged into a sea area different from the sea area on which it is mounted. Therefore, problems such as the destruction of ecosystems by transporting microbes such as plankton and bacteria contained in the ballast water to sea areas other than their original habitats. There is a risk of causing it.
  • the “Guidelines for Ballast Water Sampling (G2)” related to the above Ballast Water Management Convention is based on the “Ballast Water Emission Standard (D-2)”.
  • the allowable number of individuals is defined according to the minimum size of the microorganism. For example, for microorganisms having a minimum size of 50 ⁇ m or more (hereinafter referred to as “L size organisms”), 10 microorganisms / m 3 or less, and for microorganisms having a minimum size of 10 ⁇ m or more but less than 50 ⁇ m (hereinafter referred to as “S size organisms”). Is defined as 10 pieces / mL or less.
  • Patent Document 1 a method for measuring microbial cells that live in water such as the ballast water.
  • Patent Document 1 In the method described in Patent Document 1, first, a chemical substance that reacts with an enzyme or coenzyme present in a living cell of a microorganism to generate a fluorescent substance in the cell is allowed to act on a measurement target sample including the microorganism. Next, mixed contact is performed for a certain period of time, and the sample is irradiated with light having a wavelength necessary to excite the fluorescent substance generated in the cell. And it is the measuring method of the living cell of the microbial cell which measures the light emitted from each microorganisms in a sample as the number of points.
  • the measurement time which required 10 hours to several tens of hours in the conventional agar culture method, is dramatically shortened to within 10 minutes.
  • the establishment of a means for optically and electrically detecting and measuring the light emitted from live bacteria enables direct and automatic counting of live bacteria, enabling quick control of sterilization equipment and rapid management of product quality.
  • the measured value may vary depending on differences in water type, temperature, type of dyeing agent, concentration, dyeing time, and the like.
  • the seawater pumped up by a water pump is passed through a flow cell and image measurement is performed (for example, patent document) 2)
  • Microbiological testing devices such as those that pass seawater pumped by a water pump through filter units with different openings and emit microorganisms on the filter to count the microorganisms (for example, Patent Document 3) are known. Yes.
  • the microbiological examination apparatus described in Patent Document 2 includes a staining unit that stains a living organism having living cells present in the specimen while flowing a liquid specimen, and a concentration of the organism while flowing the stained specimen.
  • a concentration unit for concentrating so as to enhance an individual measurement unit for obtaining image information of an individual including the organism in the concentrated specimen, and the image information of the individual from the individual image information output from the individual measurement unit
  • control means for performing measurement This makes it possible to perform a series of steps such as staining organisms in the liquid of the specimen, concentrating organisms in the liquid, and acquiring information on organisms in the liquid.
  • the waiting time until a part of the sample that has completed the process proceeds to the next process can be greatly reduced or reduced to zero, and stable living and death of the organism can be prevented in the sense of preventing deterioration of the staining state during the waiting time. There is an advantage that information can be acquired.
  • the microorganism testing apparatus described in Patent Document 2 causes the seawater pumped up by the water pump to sequentially pass through various processes, so that the apparatus becomes large and the manufacturing cost increases. And it may take at least several hours to complete the measurement.
  • the microorganism testing apparatus described in Patent Document 3 includes a step of passing seawater through a filter unit in which three types of filters having different openings are arranged in series, and a microorganism that is collected and survives in the filter.
  • the microorganism testing apparatus described in Patent Document 3 is configured to sequentially pass seawater pumped by a water pump through various processes in the same manner as Patent Document 1, and the apparatus becomes large and the manufacturing cost may increase.
  • an object of the present invention is to provide a microorganism testing method and apparatus capable of measuring the amount of microorganisms in ballast water simply, in a short time, and with high accuracy.
  • the present invention is a microorganism testing apparatus for measuring the amount of microorganisms in a sample solution, which has a sample container formed of a material that transmits light, and the sample is contained in the sample container.
  • a stirring and mixing means for stirring and mixing the solution; an excitation light source for irradiating the sample container with excitation light; A light receiving means for detecting light and converting it into an electrical signal; and a control means for calculating the amount of microorganisms contained in the sample in the sample container, wherein the sample solution is a fluorescent staining reagent for staining the microorganisms in the sample
  • the light receiving means detects fluorescence emission from the sample solution due to irradiation of the excitation light from the excitation light source, and the control means converts the electrical signal from the light receiving means into an electrical signal. Based on this, technical measures were taken to detect the number of luminescence and calculate the amount of microorganisms contained in the sample in the sample container.
  • a sample and a fluorescent staining reagent for staining microorganisms are added to the sample container, the sample container is stirred and mixed by the stirring and mixing means, and then the excitation light is incident on the sample container while stirring the sample solution.
  • the microorganisms emit light brightly in a very short time compared to the one that is measured without being stirred, and the amount of microorganisms in the ballast water can be easily and quickly It becomes possible to measure.
  • the apparatus of the present invention is not a flow type, it is possible to reduce the size of the apparatus and reduce the manufacturing cost.
  • a filtering unit is provided between the light receiving unit and the control unit, and the filtering unit includes low frequency component noise and high frequency component in the electric signal from the light receiving unit. It is characterized by filtering noise.
  • the disturbance is filtered by the filtering means before the electric signal is taken into the control means, so that the electric signal corresponding to the amount of received fluorescence of the microorganism and the disturbance can be clearly distinguished.
  • the measurement error of the amount of microorganisms does not occur, the problem that the measured value does not vary does not occur, and stable measurement can be performed.
  • the invention according to claim 3 is characterized in that the filtering means is a band-pass filter in which a high-pass filter and a low-pass filter are connected.
  • the excitation light source is arranged so as to irradiate excitation light so as to be orthogonal to the sample container, and the light receiving means is at an angle orthogonal to the excitation light of the excitation light source. It arrange
  • the excitation light from the excitation light source does not directly enter the light receiving means, and the fluorescent light emission thickness portion is reduced (for example, as shown in FIG. 2, the width of the light emission portion is conventionally 20 mm to 30 mm).
  • the difference in the amount of light between the background and the fluorescence emission of the microorganism becomes very clear, and the detection accuracy of the fluorescence emission of the microorganism is improved. It will be improved.
  • the invention described in claim 5 is characterized in that a slit member is provided between the light receiving means and the sample container.
  • the invention described in claim 6 is characterized in that a parallel light converting means for converting light from the excitation light source into parallel light is provided between the excitation light source and the sample container. This suppresses the spread of the excitation light from the excitation light source and irradiates the irradiated surface of the sample container with parallel light, so that the thickness portion of the background fluorescence emission is reduced, and the microorganisms against the background fluorescence emission are reduced. The ratio of the fluorescence emission signal is improved, and the detection accuracy of the fluorescence emission of the microorganism is improved.
  • the invention according to claim 7 is characterized in that the parallel light converting means is formed by drilling a threaded hole in a flat plate.
  • the angle of the excitation light from the excitation light source is forced by the threaded hole by an inexpensive material, and the directivity angle of the light irradiated from the threaded hole can be narrowed.
  • the thickness portion of the background fluorescent light emission becomes thin, the ratio of the fluorescent light emission signal of the microorganism to the background fluorescent light emission is improved, and the detection accuracy of the fluorescent light emission of the microorganism is improved.
  • the invention according to claim 8 is characterized in that the parallel light converting means is formed of a convex lens.
  • the directivity angle of the excitation light from the excitation light source can be narrowed by an inexpensive material. For this reason, the thickness portion of the background fluorescence emission is reduced, the ratio of the fluorescence emission signal of the microorganism to the background fluorescence emission is improved, and the detection accuracy of the fluorescence emission of the microorganism is improved.
  • the invention described in claim 9 is a method for inspecting microorganisms for measuring the amount of microorganisms in a sample solution, and stirring and mixing of the sample solution to which a fluorescent staining reagent for staining microorganisms is added to the sample in the sample container.
  • microorganisms light up brightly in a very short time, and the quantity of microorganisms in ballast water can be measured simply and in a short time.
  • the thickness of the fluorescent light emission is reduced, the light amount difference between the background and the fluorescent light emission of the microorganism becomes extremely clear, and the detection accuracy of the fluorescent light emission of the microorganism can be improved.
  • the invention according to claim 10 is a filtering step of filtering low-frequency component noise and high-frequency component noise in the electrical signal converted by the light-receiving step between the light-receiving step and the microorganism count estimating step. It is provided with.
  • the disturbance is filtered by the filtering means before the electric signal is taken into the control means, so that the electric signal corresponding to the amount of received fluorescence of the microorganism and the disturbance can be clearly distinguished.
  • the measurement error of the amount of microorganisms does not occur, the problem that the measured value does not vary does not occur, and stable measurement can be performed.
  • the present invention it is possible to provide a microorganism testing method and apparatus capable of measuring the amount of microorganisms in ballast water simply, in a short time, and with high accuracy.
  • FIG. 1 is a block diagram showing an overall configuration of a microorganism testing apparatus according to a first embodiment of the present invention. It is a flowchart which shows the measurement flow of the microbe inspection apparatus which concerns on the 1st Embodiment of this invention. It is a block diagram which shows the whole structure of the microbe test
  • PMT photomultiplier tube
  • FIG. 1 is a perspective view showing an entire microorganism testing apparatus according to the present embodiment
  • FIG. 2 is a schematic plan sectional view of a measuring unit according to the present embodiment
  • FIG. 3 is a microorganism testing according to the present embodiment. It is a block diagram which shows the whole structure of an apparatus.
  • an inspection apparatus 1 includes a main body 2 that incorporates a control mechanism such as a CPU board and performs information processing work such as measurement results and statistical processing work, and the main body 2
  • a display unit 4 formed of a liquid crystal panel or the like for displaying the measurement results, and a transparent material that transmits light (for example, glass or
  • a main part is a measurement unit 6 that accommodates a batch-type sample container 5 formed of quartz, acrylic resin, or the like and optically counts the number of microorganisms in the sample solution S.
  • Reference numeral 7 denotes a rotor for stirring the sample solution S accommodated in the sample container 4.
  • the rotor 7 is accommodated in the sample container 5 together with the sample solution S and the luminescent reagent, and the sample container 5 is stored in the sample container 5.
  • the magnetic stirrer 27 built in the measuring unit 5 is rotationally driven. Thereby, the number of microorganisms in the sample solution S can be counted while stirring and mixing the sample solution S composed of the sample and the luminescent reagent in the sample container 5 at a predetermined temperature, and the sample solution S can be measured without being stirred.
  • the microorganisms emit light brightly in a very short time, and the amount of microorganisms in the ballast water can be measured easily and in a short time.
  • the batch-type sample container 5 formed of a transparent material that transmits light is formed in a prismatic shape having a bottom surface of 50 mm ⁇ 50 mm and a height of 60 mm, and the inner volume when the water level is 40 mm is 100 ml (milliliter). Is set.
  • the sample container 5 is not limited to such a prism shape, and may be cylindrical or cubic as long as the internal volume can be secured about 100 ml (milliliter).
  • the measurement unit 6 includes a sample container storage unit 9 that stores and holds the sample container 5, and a light source unit 13 that emits excitation light toward the sample container 5. And a light receiving unit 19 for observing microorganisms that are stained in the luminescent reagent by the excitation light emitted from the light source unit 13 and drift in the sample container 5.
  • the light receiving unit 19 is electrically connected to a CPU substrate 23 that counts the number of microorganisms in the sample solution S and performs information processing operations such as measurement results and statistical processing operations.
  • the sample container storage unit 9 is formed by holding plates 8a and 8b surrounding at least two surfaces of the sample container 5, and stores and holds the sample container 5 so as not to block light irradiation from the light source unit 13. It is. Then, as shown in FIG. 2, the light source unit 13 is arranged so that excitation light from the normal line AP is incident on the irradiated surface G of the sample container 5.
  • the light source unit 13 includes an LED light source 10 disposed in the vicinity of the sample container housing unit 9 and a parallel light converting unit 11 (which converts the light from the LED) to the front surface of the LED light source 10 and converts diffused light into parallel light. And a band-pass filter 12 for exciting light that irradiates the sample container 5 with excitation light composed of slit-like parallel light. .
  • FIG. 8 is a schematic sectional view showing an embodiment of the parallel light converting means 11.
  • the parallel light converting means 11 is formed by drilling a threaded hole 32 having a predetermined diameter in a flat plate 31 having a predetermined thickness. The hole diameter is appropriately set. Thereby, the scattered light of the incident angle ⁇ irradiated from the LED light source 10 is converted into parallel light when passing through the threaded hole 32.
  • the optimum condition of ⁇ and L is determined by a test of the SN ratio. For example, if M3 (outer diameter of screw hole) ⁇ 0.5 (pitch), ⁇ is 9. It was optimal when the angle was 5 ° and L was 15 mm.
  • the parallel light conversion means 11 shown in FIG. 8B is provided with a convex lens 33 on the front surface of the LED light source 10, and the scattered light emitted from the LED light source 10 passes through the convex lens 33 and is emitted to the outside. Is converted into parallel light.
  • the light source unit 13 of the present embodiment uses the LED light source 10 as a light source
  • the parallel light LED light source capable of irradiating parallel light is not limited to the LED light source 10 as long as it can excite the fluorescent substance contained in the microorganism.
  • a laser light source or a light bulb can also be used.
  • the above-mentioned parallel light conversion means 11 is not necessary.
  • the light receiving unit 19 is provided such that the light receiving surface F is arranged at an angle orthogonal to the excitation light by the normal line AP from the light source unit 13.
  • the light-receiving unit 19 is a photomultiplier tube arranged and configured to receive fluorescence with an optical axis orthogonal to the parallel light irradiated with excitation light from the LED light source 10 toward the sample container 5 ( PMT) 14, a fluorescent bandpass filter 15 disposed in front of the photomultiplier tube (PMT) 14, a condensing lens 16 disposed in front of the fluorescent bandpass filter 15, and the condensing
  • a slit 17 disposed on the front surface of the lens 16 and a gap between the slit 17 and the sample container 5 are used to excite a fluorescent substance contained in microorganisms, thereby condensing and imaging the emitted fluorescence.
  • a relay lens 18 is used to excite a fluorescent substance contained in microorganisms, thereby condensing and imaging the e
  • the slit 17 between the photomultiplier tube (PMT) 14 and the sample container 5 narrows the observation surface in a slit shape. That is, in the state without a slit as shown in FIG. 9A, the background in which the light receiving surface F is formed in a circle is monitored, whereas in the state with a slit as shown in FIG. 9B, the light receiving surface F excludes diagonal lines. The background formed by the vertically long slit will be monitored. Therefore, as a result of the light receiving area of the light receiving surface F being narrowed as shown in FIG. 9B, the area of background fluorescent light emission that becomes noise is also narrowed, so that the ratio of the fluorescence light emission signal of the microorganism to the background fluorescent light emission is improved. This improves the detection accuracy of the fluorescence emission.
  • the light receiving unit 19 uses the photomultiplier tube (PMT) 14 as the light receiving sensor, the light receiving unit 19 is not limited to this, and is not limited to this, but a silicon photodiode (SiPD) or an avalanche photodiode (APD). As in the case of a photomultiplier tube (PMT), various types of photodetectors that can detect the emission of a fluorescent substance contained in a microorganism can be employed.
  • an output signal converted from light to electricity by the photomultiplier tube (PMT) 14 is supplied with power from an AC power source 21 or a secondary battery 22.
  • a CPU board 23 is provided for performing analysis, determining whether or not it is within an arbitrary luminance range, pulse counting an arbitrary luminance signal, and controlling on / off of the LED light source 10.
  • An AC / DC converter 24 is interposed between the AC power source 21 and the CPU board 23.
  • the CPU substrate 23 is electrically connected to the photomultiplier tube (PMT) 14, the LED light source 10, a RAM 25 serving as a read / write storage unit, and a ROM 26 serving as a read-only storage unit.
  • PMT photomultiplier tube
  • the power button 3a, the measurement start button 3b, the external output button 3c, and the setting button 3d of the operation unit 3 shown in FIG. 1 are electrically connected.
  • the measurement type is switched (L size microorganism measurement or S size microorganism measurement is switched), the judgment reference setting is changed, the threshold value setting is changed, and the measurement is performed.
  • the time setting can be changed.
  • the CPU board 23 includes a magnetic stirrer 27 for rotating the rotor 7 by magnetic force, the display unit 4 formed of a liquid crystal panel, a cooling fan 28 for control equipment such as the CPU board 23, and RS-232C.
  • An external output terminal 29 is connected.
  • FIG. 4 is a flowchart showing a measurement flow, and the operation in the above configuration will be described with reference to FIGS.
  • an operator uses a pipette or the like to collect 100 ml (milliliter) as a sample from ballast water at a temperature of about 20 ° C. and put it into the sample container 5 (step 1 in FIG. 4).
  • a fluorescent staining reagent is added into the sample container 5 (step 2 in FIG. 4).
  • this fluorescent staining reagent generally known calcein AM (Calcein-AM, manufactured by Promocell® GMBH®, Germany), FDA or the like can be used. Calcein AM tends to stain phytoplankton and FDA tends to stain zooplankton. Therefore, staining with a staining reagent is a mixture of calcein AM and FDA.
  • the dyeing time of the reagent can be shortened and the time required for dyeing can be halved compared to the conventional method.
  • the operator accommodates it in the measurement unit 6 of the inspection apparatus 1 and attaches the lid 30 of the measurement unit 6 to complete the measurement preparation.
  • the power button 3a is pressed, the rotor 7 is rotated by driving the magnetic stirrer 27 built in the measuring unit 6, and the sample solution S is stirred (step 3 in FIG. 4). .
  • the LED light source 10 is turned on after a predetermined time, and the sample container 5 is irradiated with the light transmitted through the excitation light band-pass filter 12.
  • the sample container 5 is irradiated with the light transmitted through the excitation light band-pass filter 12.
  • light having a wavelength of 450 nm to 490 nm is irradiated as wavelength characteristics, and the specimen (microorganism) in the sample container 5 emits fluorescence (step 4 in FIG. 4).
  • This fluorescence passes through the fluorescence band-pass filter 15 and is detected by the photomultiplier tube (PMT) 14 (step 5 in FIG. 4).
  • the photomultiplier tube (PMT) 14 converts light energy into electrical energy by utilizing the photoelectric effect, and has a current amplification function, so that fluorescence emission can be detected with high sensitivity.
  • the detected electrical signal is sent to the CPU substrate 23, and the received light waveform exceeding a certain threshold value is counted (step 6 in FIG. 4).
  • the CPU board 23 estimates the number of microorganisms present in 100 ml (milliliter) of water in the sample container 5 from the received light wave count value, and displays on the display unit 4 whether or not the drainage standard is satisfied. Yes (step 7 in FIG. 4).
  • the present embodiment is different from the first embodiment in that a filtering unit 34 is provided between the light receiving unit 19 and the CPU substrate 23. Since other configurations are the same as those of the first embodiment, description thereof is omitted. Hereinafter, description will be given based on the drawings.
  • the measurement unit 6 includes a sample container storage unit 9 that stores and holds the sample container 5, and a light source unit 13 that emits excitation light toward the sample container 5.
  • the light receiving unit 19 is electrically connected to the CPU substrate 23 via the filtering unit 34.
  • the number of microorganisms in the sample solution S can be counted by an electrical signal from the light receiving unit 19, and information processing work such as measurement results, statistical processing work, and the like can be performed.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of a circuit of filtering means that is a main part of the present invention.
  • an operational amplifier 35, a high-pass filter circuit 36, and a low-pass filter circuit 37 are electrically connected between the photomultiplier tube (PMT) 14 and the CPU substrate 23.
  • the operational amplifier 35 converts the output current generated according to the amount of light received by the photomultiplier tube (PMT) 14 into a voltage, and can detect even a minute current.
  • the high-pass filter circuit 36 is a filtering unit that reduces the frequency component lower than the predetermined frequency without attenuating the frequency component higher than the predetermined frequency in the input signal.
  • the low-pass filter circuit 37 is a filtering unit that reduces the frequency component higher than the predetermined frequency without attenuating the frequency component lower than the predetermined frequency in the input signal.
  • a band-pass filter circuit 38 that passes only a necessary frequency range is obtained.
  • the operational amplifier 35 has an operational amplifier OP and a resistor R.
  • the high-pass filter circuit 36 and the low-pass filter circuit 37 have resistors R1 and R2 and capacitors C1 and C2 that are electrically connected to each other.
  • the output current from the photomultiplier tube (PMT) 14 is converted into a voltage by the operational amplifier 35.
  • the signal Vin (t) is input from the input side of the band-pass filter circuit 38, disturbance is generated on the output side.
  • a signal Vout (t) obtained by filtering the electrical signal is output.
  • FIG. 7 is a flowchart showing a measurement flow, and the operation in the above configuration will be described with reference to FIGS. 1, 2, and 5 to 7.
  • FIG. 7 is a flowchart showing a measurement flow, and the operation in the above configuration will be described with reference to FIGS. 1, 2, and 5 to 7.
  • FIG. 7 is a flowchart showing a measurement flow, and the operation in the above configuration will be described with reference to FIGS. 1, 2, and 5 to 7.
  • a fluorescent staining reagent is added into the sample container 5 (step 2 in FIG. 7).
  • this fluorescent staining reagent generally known calcein AM (Calcein-AM, manufactured by Promocell® GMBH®, Germany), FDA or the like can be used. Calcein AM tends to stain phytoplankton and FDA tends to stain zooplankton. Therefore, staining with a staining reagent is a mixture of calcein AM and FDA.
  • the dyeing time of the reagent can be shortened and the time required for dyeing can be halved compared to the conventional method.
  • the operator accommodates it in the measurement unit 6 of the inspection apparatus 1 and attaches the lid 30 of the measurement unit 6 to complete the measurement preparation.
  • the power button 3a is pressed, the rotor 7 is rotated by driving the magnetic stirrer 27 built in the measurement unit 6, and the sample solution S is stirred (step 3 in FIG. 7). .
  • the LED light source 10 is turned on after a predetermined time, and the sample container 5 is irradiated with the light transmitted through the excitation light band-pass filter 12.
  • the specimen (microorganism) in the sample container 5 emits fluorescence (step 4 in FIG. 7).
  • This fluorescence passes through the fluorescence band-pass filter 15 and is detected by the photomultiplier tube (PMT) 14 (step 5 in FIG. 7).
  • the photomultiplier tube (PMT) 14 converts light energy into electrical energy by utilizing the photoelectric effect and has a current amplification function to detect fluorescence emission with high sensitivity.
  • the detected electrical signal is amplified by the operational amplifier 35 and input to the band-pass filter circuit 36, and a signal obtained by filtering the electrical signal that becomes a disturbance is output (step 6 in FIG. 7). Then, the signal obtained by filtering the electrical signal that becomes a disturbance is sent to the CPU board 23, and the received light waveform exceeding a certain threshold value is counted (step 7 in FIG. 7).
  • the CPU board 23 estimates the number of microorganisms present in 100 ml (milliliter) of water in the sample container 5 from the received light wave count value, and displays on the display unit 4 whether or not the drainage standard is satisfied. Yes (step 8 in FIG. 7).
  • the correlation between the number of microorganisms and the photomultiplier tube (PMT) light reception count was investigated.
  • sample containers 5 100 mL capacity
  • Staining was performed with a fluorescent staining reagent FDA (concentration 0.01 [millimol / liter]).
  • FDA concentration 0.01 [millimol / liter]
  • the count number of the waveform has increased according to the number of housed microorganisms, and 5 samples of 5, 10, 50 and 100 responded linearly (FIGS. 10A and 10B). reference). Therefore, the number of microorganisms present in 100 mL of ballast water can be estimated from the obtained waveform count.
  • FIGS. 11A to 11D A test was conducted as to whether or not detection was possible due to the life and death of microorganisms (see FIGS. 11A to 11D).
  • FDA concentration 0.01 [millimol / liter]
  • FIG. 12 shows the waveform of the acquired voltage before the filtering means is attached.
  • the waveform of the acquired voltage shown in FIG. 12A includes disturbance (background component about 0.9 V waveform), a clear mountain that can be confirmed as a living microorganism that has exceeded the threshold, and an unclear mountain that does not exceed the threshold.
  • the three are mixed.
  • the waveform of the acquired voltage shown in FIG. 12B is a mixture of disturbance (background component about 1.4 V waveform) and a clear mountain that can be confirmed as a living microorganism that exceeds the threshold. Yes.
  • the waveform of the acquired voltage shown in FIG. 12C is a mixture of disturbance (background component waveform of about 0.4 V) and an unclear peak that does not exceed the threshold value.
  • Fig. 13 shows the waveform of the acquired voltage after the filtering means is installed.
  • the waveform of the acquired voltage shown in FIG. 13A is obtained when only the high-pass filter circuit 36 is attached in order to remove a background component that becomes a disturbance.
  • the background component of about 1.4 V is converged to 0 V, and the disturbance is removed.
  • the waveform in FIG. 13B is a rising waveform when the waveform of a mountain surrounded by a broken-line circle shown in FIG. 13A is enlarged.
  • the vertical movement is repeated across the threshold value, which causes a measurement error to increase. Therefore, it is desirable to attach a low-pass filter circuit 37 for the purpose of removing such a high-frequency waveform.
  • the waveform of the acquired voltage shown in FIG. 13C is obtained when a band-pass filter 38 in which a high-pass filter circuit 36 and a low-pass filter circuit 37 are combined is mounted in order to remove disturbance and high-frequency waveform. Compared with the waveform of FIG. 13A, the high frequency noise was removed and the waveform became smooth.
  • the waveform in FIG. 13D is a rising waveform when the waveform of a mountain surrounded by a broken-line circle shown in FIG. 13C is enlarged.
  • the jagged waveform as shown in FIG. 13B disappears and becomes smooth, and the vertical movement is not repeated across the threshold value. Thereby, it becomes possible to measure with high accuracy by making the measurement error extremely small.
  • the sample solution is stirred and mixed by the stirring and mixing means 7, and then the sample solution is stirred while the sample solution is stirred.
  • the excitation light is incident on the irradiated surface of the sample container, and the fluorescent light emission of the microorganisms is received by the light receiving means, so that the microorganisms emit light brightly in a very short time compared to the measurement without standing and stirring.
  • the amount of microorganisms in the ballast water can be measured easily and in a short time. And it becomes possible to miniaturize an apparatus and to reduce manufacturing cost.
  • the disturbance is filtered by the filtering means before the electric signal is taken into the control means, the electric signal corresponding to the amount of received fluorescence of the microorganism and the disturbance can be clearly distinguished, and A measurement error does not occur, and there is no problem that the measurement value varies, so that stable measurement can be performed.
  • the present invention can be applied to a microorganism testing apparatus for confirming whether or not the discharge standard is satisfied when discharging ballast water.

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Abstract

　試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査装置１であって、光を透過する材質で形成された試料容器５に試料と蛍光染色試薬とを添加した試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合手段７と、撹拌混合手段７により試料溶液５を撹拌しつつ試料容器５の被照射面に励起光を照射させる光源を備えた励起光源１０と、励起光源１０からの励起光により蛍光発光された光を検知して電気信号に変換する受光手段１４と、受光手段１４にからの電気信号により発光数を検出し、該発光数から試料容器５中の試料に含まれる微生物量を算出する制御手段２３とを備えた。

Description

微生物の検査方法及びその装置
　本発明は、微生物の検査方法及びその装置に関し、特にバラスト水等に含まれて生存しているプランクトン等の微生物を検出するのに適した微生物の検査方法及びその装置に関する。
　荷物を積載していない船舶は、当該船舶を安定させるためにバラスト水を搭載して航行し、荷物を積載する海域において搭載された前記バラスト水を排出する。
　バラスト水は、通常、搭載する海域と異なる海域に排出されるため、該バラスト水に含まれるプランクトンや細菌等の微生物を本来の生息地以外の海域に運び、生態系を破壊する等の問題を引き起こす虞がある。
　このような問題に対処するため、バラスト水の規制に関する国際的なルールが策定され、「船舶のバラスト水および沈殿物の規制および管理のための国際条約（バラスト水管理条約）」が採択されている。
　上記バラスト水管理条約に関連する「バラスト水サンプリングに関するガイドライン（G２）」は、「バラスト水排出基準（D－２）」において、船舶から排出されるバラスト水に含まれて生存している微生物の許容個体数を、前記微生物の最小サイズにより区分して規定している。例えば、最小サイズが５０μｍ以上の微生物（以下、「Ｌサイズ生物」という。）については１０個／ｍ３以下、最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物（以下、「Ｓサイズ生物」という。）については１０個／ｍＬ以下といったように規定している。
　現在までに、上記バラスト水などの水中で生息している微生物細胞を計測する方法として、特許文献１に記載されたものが知られている。
　上記特許文献１に記載の方法は、まず微生物の生細胞に存在する酵素又は補酵素と反応し細胞内で蛍光物質を生成する化学物質を、微生物を含む測定対象試料に作用させる。次に一定時間混合接触を行い、細胞内に生成した蛍光物質を励起するに必要な波長の光を試料に照射する。そして試料中の個々の微生物から発する光を点の数として計測する微生物細胞の生細胞の計測方法である。
　これにより、従来の寒天培養方法では１０時間～数十時間必要であった測定時間が１０分以内と格段に早くなる。また、生菌の発する光を点として光学的、電気的に検知計測する手段を確立したことにより生菌の直接自動計数が可能となり、殺菌装置のコントロール、製品品質の迅速管理が速やかに行えるといったメリットがある。
　しかしながら、上記特許文献１記載の方法は、水の種類、温度、染色剤の種類、濃度、染色時間などの相違によって測定値がばらつくことがある。
　他の方法として、上記バラスト水を排出する際に上記排出基準を満たしているか否かを確認するために、送水ポンプで汲み上げた海水をフローセルに通水して画像計測するもの（例えば、特許文献２）、送水ポンプで汲み上げた海水を目開きの異なるフィルタユニットに通水してフィルタ上の微生物を発光させて微生物を計数するもの（例えば、特許文献３）などの微生物検査装置が知られている。
　上記特許文献２に記載の微生物検査装置は、液体の検体を流しつつ該検体中に存在する生細胞を持つ生物を染色する染色部と、前記染色が施された検体を流しつつ前記生物の濃度を高めるように濃縮する濃縮部と、前記濃縮された検体中の前記生物を含む個体の画像情報を取得する個体計測部と、前記個体計測部より出力された前記個体の画像情報より前記生物の測定を行う制御手段とを備えている。
　　これにより、検体の液体中の生物の染色工程、液体中の生物の濃縮工程、液体中の生物の情報取得の工程等を一連で行えるため、各方式を個別に行う手法と比べて、ひとつの工程を終えた検体の一部が次の工程に進むまでの待機時間を大幅に短縮、または０とすることができ、待機時間での染色の状態の劣化を防ぐ意味で安定した生物の生死の情報を取得することができるといったメリットがある。
　　しかしながら、上記特許文献２記載の微生物検査装置は、送水ポンプで汲み上げた海水を各種工程に順次通水させるため、装置が大掛かりとなり、製造コスト高となる。そして測定が完了するには少なくとも数時間かかることがある。
　　また、上記特許文献３に記載の微生物検査装置は、海水を目開きの異なる３種のフィルタを直列に配置してなるフィルタユニットに通水する工程と、フィルタに補集され生存している微生物による発色、発光および蛍光のうちいずれかを発生させる工程と、発色、発光および蛍光のうちいずれかを検出して画像解析によってバラスト水または海水中の微生物数を計数する工程とを備えたことを特徴とするものである。
　　これにより、段階的なサイズごとの微生物の捕捉を実現でき、その結果、サイズごとの基準で規制された許容残存基準を満たしているかどうかを迅速に測定できる。
　　しかしながら、特許文献３記載の微生物検査装置は、特許文献１と同様に送水ポンプで汲み上げた海水を各種工程に順次通水させるものであり、装置が大掛かりとなり、製造コスト高になることがある。
特開平３－４３０６９ 特開２００９－８５８９８ 特開２００７－１３５５８２
　　本発明は上記問題点にかんがみ、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で、しかも高精度に測定することができる微生物の検査方法及びその装置を提供することを技術的課題とする。
　　上記課題を解決するため本発明は、試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査装置であって、光を透過する材質で形成された試料容器を有し、該試料容器内で試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合手段と、前記試料容器に励起光を照射する励起光源と、
　光を検知して電気信号に変換する受光手段と、前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する制御手段と、を備え、前記試料溶液は、試料に、微生物を染色する蛍光染色試薬が添加されて構成されており、前記受光手段は、前記励起光源からの前記励起光の照射による、前記試料溶液からの蛍光発光を検知し、前記制御手段は、前記受光手段からの電気信号に基づき発光数を検出し、前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出するという技術的手段を講じた。
　これにより、試料容器に試料と微生物を染色する蛍光染色試薬とを添加し、撹拌混合手段により試料容器の撹拌・混合を行い、次いで試料溶液を撹拌しつつ試料容器に励起光を入射させ、さらに、受光手段により微生物の蛍光発光を受光するため、撹拌しないで静置して計測するものと比較すれば、極めて短時間で微生物が明るく発光し、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で計測することが可能となる。また、本発明の装置はフロー式ではないため装置を小型化することが可能となり、製造コストも安価となる。
　また、請求項２記載の発明は、前記受光手段と前記制御手段との間にフィルタリング手段を備え、前記フィルタリング手段は、前記受光手段からの電気信号中の、低周波成分のノイズ及び高周波成分のノイズを濾波することを特徴とする。
　これにより、電気信号が制御手段に取り込まれる前に、フィルタリング手段によって外乱が濾波されるので、微生物の蛍光発光の受光量に相応する電気信号と外乱とを明確に区別することができる。これにより、微生物量の測定誤差が生じることがなく、測定値がばらつく問題も生じず、安定して測定することが可能となる。
　そして、請求項３記載の発明は、前記フィルタリング手段が、ハイパスフィルタとローパスフィルタとを連結したバンドパスフィルタであることを特徴とする。
　請求項４記載の発明は、前記励起光源が、前記試料容器に対して直交するように励起光を照射するように配置され、前記受光手段は、前記励起光源の励起光と直交した角度で前記蛍光発光を受光するように配置されることを特徴とする。
　これにより、励起光源からの励起光が直接受光手段に入射することがなく、また、蛍光発光の厚み部分が薄くなる（例えば、図２のように、発光部分の幅が従来２０ｍｍ～３０ｍｍであったものが、幅Ｍ（３ｍｍ）のように狭くなり、厚み部分が薄くなる。）ため、バックグラウンドと微生物の蛍光発光との光量の差異がきわめて明確になり、微生物の蛍光発光の検出精度が向上するものとなる。
　また、請求項５記載の発明は、前記受光手段と前記試料容器との間にスリット部材を設けたことを特徴とする。
　これにより、ノイズとなるバックグラウンドの蛍光発光の面積が狭まるため、バックグラウンドの蛍光発光に対する微生物の蛍光発光の信号の比が向上し、微生物の蛍光発光の検出精度が向上するものとなる。
　さらに、請求項６記載の発明は、前記励起光源と前記試料容器との間に前記励起光源からの光を平行光に変換する平行光変換手段を設けたことを特徴とする。
　これにより、励起光源からの励起光の広がりを抑えて、平行光で試料容器の被照射面に照射されるため、バックグラウンドの蛍光発光の厚み部分が薄くなり、バックグラウンドの蛍光発光に対する微生物の蛍光発光の信号の比が向上し、微生物の蛍光発光の検出精度が向上するものである。
　請求項７記載の発明は、前記平行光変換手段が、平板にねじ切孔を穿設して形成したものであることを特徴とする。
　これにより、安価な材料によって励起光源からの励起光がねじ切孔によって角度が強制され、ねじ切孔から照射された光の指向角を狭くすることができる。このため、バックグラウンドの蛍光発光の厚み部分が薄くなるため、バックグラウンドの蛍光発光に対する微生物の蛍光発光の信号の比が向上し、微生物の蛍光発光の検出精度が向上するものである。
　また、請求項８記載の発明は、前記平行光変換手段が、凸レンズで形成したものであることを特徴とする。
　これにより、安価な材料によって励起光源からの励起光の指向角を狭くすることができる。このため、バックグラウンドの蛍光発光の厚み部分が薄くなり、バックグラウンドの蛍光発光に対する微生物の蛍光発光の信号の比が向上し、微生物の蛍光発光の検出精度が向上するものとなる。
　請求項９記載の発明は、試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査方法であって、試料容器内で試料に微生物を染色する蛍光染色試薬を添加した試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合工程と、前記試料容器に励起光を照射する励起工程と、前記励起光の照射による、前記試料容器からの蛍光発光を検知して電気信号に変換する受光工程と、該受光工程により変換された電気信号から発光数を検出し、前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する微生物数推定工程とを備えたものである。
　これにより、撹拌しないで静置して計測するものと比較すれば、極めて短時間で微生物が明るく発光し、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で計測することができる。また、蛍光発光の厚み部分が薄くなるため、バックグラウンドと微生物の蛍光発光との光量差が極めて明確となり、微生物の蛍光発光の検出精度を向上することができる。
　また、請求項１０記載の発明は、前記受光工程と前記微生物数推定工程の間に、前記受光工程により変換された電気信号中の、低周波成分のノイズ及び高周波成分のノイズを濾波するフィルタリング工程を備えたことを特徴とする。
　これにより、電気信号が制御手段に取り込まれる前に、フィルタリング手段によって外乱が濾波されるので、微生物の蛍光発光の受光量に相応する電気信号と外乱とを明確に区別することができる。これにより、微生物量の測定誤差が生じることがなく、測定値がばらつく問題も生じず、安定して測定することが可能となる。
　本発明によれば、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で、しかも高精度に測定することができる微生物の検査方法及びその装置を提供することが可能となる。
本発明の実施形態に係る微生物の検査装置の全体を示す斜視図である。 本発明の実施形態に係る測定部の概略平断面図である。 本発明の第１の実施形態に係る微生物の検査装置の全体構成を示すブロック図である。 本発明の第１の実施形態に係る微生物の検査装置の測定フローを示すフロー図である。 本発明の第２の実施形態に係る微生物の検査装置の全体構成を示すブロック図である。 本発明の第２の実施形態におけるフィルタリング手段の回路の一例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る微生物の検査装置の測定フローを示すフロー図である。 平行光変換手段の一実施形態を示す概略断面図である。 平行光変換手段の一実施形態を示す概略断面図である。 スリットの有無により観察面が狭まることを示す作用図である。 スリットの有無により観察面が狭まることを示す作用図である。 微生物の個体数と光電子増倍管（ＰＭＴ）の受光カウントとの相関関係を示すグラフである。 微生物の個体数と光電子増倍管（ＰＭＴ）の受光カウントとの相関関係を示すグラフである。 微生物の生死によって検出が可能か否かの試験を示すグラフである。 微生物の生死によって検出が可能か否かの試験を示すグラフである。 微生物の生死によって検出が可能か否かの試験を示すグラフである。 微生物の生死によって検出が可能か否かの試験を示すグラフである。 フィルタリング手段を装着する前の取得電圧の波形を示すグラフである。 フィルタリング手段を装着する前の取得電圧の波形を示すグラフである。 フィルタリング手段を装着する前の取得電圧の波形を示すグラフである。 フィルタリング手段を装着した後の取得電圧の波形を示すグラフである。 フィルタリング手段を装着した後の取得電圧の波形を示すグラフである。 フィルタリング手段を装着した後の取得電圧の波形を示すグラフである。 フィルタリング手段を装着した後の取得電圧の波形を示すグラフである。
（第１の実施形態）
　本発明を実施するための形態を図面を参照しながら説明する。図１は本実施形態に係る微生物の検査装置の全体を示す斜視図であり、図２は本実施形態に係る測定部の概略平断面図であり、図３は本実施形態に係る微生物の検査装置の全体構成を示すブロック図である。
　図１及び図２に示すように本発明の検査装置１は、ＣＰＵ基板などの制御機構を内蔵して測定結果等の情報処理作業や統計処理作業などを行う本体部２と、該本体部２に並設した操作ボタン等の配置構成からなる操作部３と、前記測定結果等を表示するために液晶パネル等で形成された表示部４と、光を透過する透明な材質（例えば、ガラスや石英やアクリル樹脂等）で形成されたバッチ式の試料容器５を収容し、試料溶液Ｓ中の微生物数を光学的に計数する測定部６とを主要部として構成されている。符号７は試料容器４内に収容された試料溶液Ｓを撹拌するための回転子であり、該回転子７は前記試料容器５内に試料溶液Ｓ及び発光試薬とともに収容し、前記試料容器５を測定部６に収容したときに、該測定部５内に内蔵されたマグネティックスターラ２７により回転駆動される構成となっている。これにより、試料容器５内の試料と発光試薬とからなる試料溶液Ｓを所定温度で撹拌混合しながら試料溶液Ｓ中の微生物数を計数することができ、撹拌しないで静置して計測するものと比較すれば、極めて短時間で微生物が明るく発光し、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で計測することが可能となる。
　図１に示す検査装置１の寸法は、幅が３００ｍｍ、奥行が３００ｍｍ、高さが１００ｍｍ、重量は約２～４ｋｇの範囲に形成されており、手持ちトランク（図示せず）等に収容して、持ち運び可能であり、船舶内での測定や、屋外での測定が可能である。
　光を透過する透明な材質で形成されたバッチ式の試料容器５は、底面が５０ｍｍ×５０ｍｍ、高さが６０ｍｍの角柱状に形成され、水位が４０ｍｍのときの内容量が１００ｍｌ（ミリリットル）に設定されている。試料容器５はこのような角柱状に限定されることはなく、内容量を１００ｍｌ（ミリリットル）程度確保することができれば、円柱状であっても、立方体であってもよい。
　前記測定部６は、図１、図２及び図３に示すように、試料容器５を収容して保持する試料容器収容部９と、前記試料容器５に向けて励起光を照射する光源部１３と、該光源部１３から照射された励起光により発光試薬に染色されて試料容器５内で漂っている微生物を観察するための受光部１９とを備えている。そして、受光部１９からは、試料溶液Ｓ中の微生物数を計数し、測定結果等の情報処理作業や統計処理作業などを行うＣＰＵ基板２３に電気的に連絡されている。
　前記試料容器収容部９は、前記試料容器５の少なくとも二面を取り囲む保持プレート８ａ，８ｂにより形成され、前記光源部１３からの光の照射を遮断しないように前記試料容器５を収容保持するものである。
　そして、図２に示すように、試料容器５の被照射面Ｇに対して法線ＡＰによる励起光が入射されるよう光源部１３が配置される。前記光源部１３は、前記試料容器収容部９近傍に配置されたＬＥＤ光源１０と、該ＬＥＤ光源１０の前面に配置され、拡散光を平行光に変換する平行光変換手段１１（ＬＥＤの光を、一面に向かって同じ角度で均一に光線が当たる平行光に変換するもの）と、スリット状の平行光からなる励起光を試料容器５に照射する励起光用バンドパスフィルタ１２とを備えている。
　図８は平行光変換手段１１の一実施形態を示す概略断面図である。図８Ａに示す例は、平行光変換手段１１として所定厚さの平板３１に所定径のねじ切孔３２を穿設して形成したものであり、光路長に合わせて平板３１の厚さＬとねじ切孔の孔径とが適宜設定されている。これにより、ＬＥＤ光源１０から照射される入射角度θの散乱光は、ねじ切孔３２を通過する際には平行光に変換されるものとなる。図８Ａに示す例では、θとＬとの最適条件をＳＮ比の試験により決定しており、例えば、Ｍ３（ネジ孔の外径）×０．５（ピッチ）とすれば、θが９．５°、Ｌが１５ｍｍのときが最適であった。
　図８Ｂに示す平行光変換手段１１は、ＬＥＤ光源１０の前面に凸レンズ３３を設けたものであり、ＬＥＤ光源１０から照射された散乱光は、凸レンズ３３内を通過して外部に出射する際には平行光に変換されるものとなる。
　本実施形態の光源部１３は、光源としてＬＥＤ光源１０を用いたが、微生物に含まれる蛍光物質を励起させることができれば、ＬＥＤ光源１０に限らず、平行光の照射が可能な平行光ＬＥＤ光源やレーザ光源や電球を採用することもできる。言うまでもないが、平行光の照射が可能な平行光ＬＥＤやレーザ光源を採用するときは、前述の平行光変換手段１１は不要となる。
　図２に示すように、前記受光部１９は、光源部１３からの法線ＡＰによる励起光と直交した角度を持って受光面Ｆが配置されるように設けられる。また、受光部１９は前記ＬＥＤ光源１０から試料容器５に向けて励起光が照射される平行光に対し、これと直交する光軸で蛍光が受光されるように配置構成した光電子増倍管（ＰＭＴ）１４と、該光電子増倍管（ＰＭＴ）１４の前面に配置した蛍光用バンドパスフィルタ１５と、該蛍光用バンドパスフィルタ１５の前面に配置した集光用レンズ１６と、該集光用レンズ１６の前面に配置したスリット１７と、該スリット１７と前記試料容器５との間隙に設置され、微生物に含まれる蛍光物質を励起させ、これにより発光した蛍光を集光し結像させるためのリレーレンズ１８と、を備えたものである。
　前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１４と試料容器５との間のスリット１７は、観察面をスリット状に狭めるものである。すなわち、図９Ａのようにスリットなしの状態では、受光面Ｆが円で形成されるバックグラウンドを監視するのに対し、図９Ｂのようにスリットありの状態では、受光面Ｆが斜線を除いた縦長スリットで形成されるバックグラウンドを監視することになる。したがって、受光面Ｆの受光面積が図９Ｂのように狭まる結果、ノイズとなるバックグラウンドの蛍光発光の面積も狭まるため、バックグラウンドの蛍光発光に対する微生物の蛍光発光の信号の比が向上し、微生物の蛍光発光の検出精度が向上するのである。
　なお、受光部１９は、受光センサとして光電子増倍管（ＰＭＴ）１４を用いた例を示したが、これに限定されることはなく、シリコンフォトダイオード（ＳiＰＤ）や、アヴァランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）など、光電子増倍管（ＰＭＴ）と同様に微生物に含まれる蛍光物質の発光を検知することができる各種の光検出器を採用することができる。
　さらに、図３を参照して、本実施形態の検査装置１の電気的な制御構成を説明する。本体部２を形成する筐体２０内中央には、ＡＣ電源２１や二次電池２２から電源の供給を受けて、前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１４により光から電気に変換された出力信号を解析したり、任意の輝度範囲以上にあるか否かを判定したり、任意の輝度の信号をパルスカウントしたり、前記ＬＥＤ光源１０のオン・オフ制御などを行うＣＰＵ基板２３が配置されている。前記ＡＣ電源２１と前記ＣＰＵ基板２３との間には、ＡＣ／ＤＣ変換器２４を介在させてある。
　前記ＣＰＵ基板２３には、前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１４、前記ＬＥＤ光源１０、読み出し書き込み用記憶部となるＲＡＭ２５及び読み出し専用記憶部となるＲＯＭ２６がそれぞれ電気的に接続される。また、図１に示す操作部３の電源ボタン３ａ、測定開始ボタン３ｂ、外部出力ボタン３ｃ及び設定ボタン３ｄが電気的に接続されている。そして、前記電源ボタン３ａの押下によりオン・オフの切換制御が行われ、前記測定開始ボタン３ｂの押下により測定が開始され、外部出力ボタン３ｃの押下により外部のプリンタやパソコンへデータの転送が行われ、設定ボタン３ｄの押下により、測定の種類の切換（Ｌサイズ微生物の測定かＳサイズ微生物の測定かの切換）や、判定基準の設定の変更や、しきい値の設定の変更や、測定時間の設定の変更を行うことができる構成となっている。
　そのほか、前記ＣＰＵ基板２３には、前記回転子７を磁力により回転させるマグネティックスターラ２７、液晶パネル等で形成された表示部４、ＣＰＵ基板２３など制御機器の冷却用ファン２８、及びＲＳ－２３２Ｃなど外部出力端子２９を接続してある。
　図４は測定フローを示すフロー図であり、図１乃至図４を参照して上記構成における作用を説明する。
　まず、作業者はピペット等を使用し、温度２０℃程度のバラスト水から１００ｍｌ（ミリリットル）を試料として採取し、試料容器５に投入する（図４のステップ１）。次に、試料容器５内に蛍光染色試薬を添加する（図４のステップ２）。この蛍光染色試薬は一般的に知られているカルセインＡＭ（Calcein-AM，ドイツ国Promocell GMBH 社製）や、ＦＤＡなどを使用することができる。カルセインＡＭは、植物性プランクトンに対して染色しやすい傾向があり、ＦＤＡは、動物性プランクトンに対して染色しやすい傾向があり、このため、染色試薬による染色を、カルセインＡＭとＦＤＡとを混合した試薬により染色を行うと、試薬の染色時間を短くして、染色に要する時間を従来の半分にすることが可能となる。そして、作業者は試料容器５に回転子７を投入後、検査装置１の測定部６に収容し、測定部６の蓋３０を被着することで測定準備が完了する。ここで、電源ボタン３ａを押下すれば、該測定部６内に内蔵されたマグネティックスターラ２７の駆動により回転子７が回転し、試料溶液Ｓが撹拌されることになる（図４のステップ３）。
　次に、作業者は操作部の測定開始ボタン３ｂの押下により、所定時間後ＬＥＤ光源１０が点灯し、励起光用バンドパスフィルタ１２を透過した光が試料容器５に照射されることになる。このとき、例えば、波長特性として４５０nm～４９０nmの波長の光が照射され、試料容器５内の検体（微生物）が蛍光発光することになる（図４のステップ４）。そして、この蛍光が蛍光用バンドパスフィルタ１５を透過して光電子増倍管（ＰＭＴ）１４により検知されることになる（図４のステップ５）。
　光電子増倍管（ＰＭＴ）１４は、光電効果の利用により光エネルギが電気エネルギに変換されるとともに、電流増幅機能が付加され、高感度に蛍光発光を検知することができる。検知した電気信号はＣＰＵ基板２３に送られ、一定しきい値以上の受光波形がカウントされることになる（図４のステップ６）。
　さらに、ＣＰＵ基板２３では、受光波形カウント値から前記試料容器５内の水１００ｍｌ（ミリリットル）中に存在する微生物数を推定して、排水基準を満たすか否かを表示部４に表示されるのである（図４のステップ７）。
（第２の実施形態）
　本実施形態においては、受光部１９とＣＰＵ基板２３との間にフィルタリング手段３４が設けられている点が第１の実施形態と異なっている。その他の構成は第１の実施形態と同様であるため説明を省略する。以下、図面に基づいて説明する。
　測定部６は、図１、図２及び図５に示すように、試料容器５を収容して保持する試料容器収容部９と、前記試料容器５に向けて励起光を照射する光源部１３と、該光源部１３から照射された励起光により試料容器５内で漂って発光している微生物を観察するための受光部１９とを備えている。そして、受光部１９からは、フィルタリング手段３４を介してＣＰＵ基板２３に電気的に連絡されている。ＣＰＵ基板２３では、受光部１９からの電気信号により試料溶液Ｓ中の微生物数を計数し、測定結果等の情報処理作業や統計処理作業などを行うことができる。
　　図６は本発明の要部となるフィルタリング手段の回路の一例を示す図である。図６に示すように、光電子増倍管（ＰＭＴ）１４とＣＰＵ基板２３との間には、演算増幅器３５、ハイパスフィルタ回路３６及びローパスフィルタ回路３７を電気的に接続している。前記演算増幅器３５は、前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１４により受光した受光量に応じて生成された出力電流を電圧に変換し、微小な電流であっても検出を可能とするものである。また、ハイパスフィルタ回路３６は、入力信号のうち、所定の周波数より高い周波数の成分を減衰させず、所定の周波数より低い周波数の成分を逓減させるフィルタリング手段である。一方、ローパスフィルタ回路３７は、入力信号のうち、所定の周波数より低い周波数の成分を減衰させず、所定の周波数より高い周波数の成分を逓減させるフィルタリング手段である。そして、前記ハイパスフィルタ回路３６とローパスフィルタ回路３７とを連結すると、必要な範囲の周波数のみを通過させるバンドパスフィルタ回路３８となる。
　　前記演算増幅器３５は、オペアンプＯＰと抵抗Ｒとを有する。そして、前記ハイパスフィルタ回路３６及びローパスフィルタ回路３７は、互いに電気的に接続された抵抗Ｒ１，Ｒ２とコンデンサＣ１，Ｃ２とをそれぞれ有している。これにより、演算増幅器３５により光電子増倍管（ＰＭＴ）１４からの出力電流が電圧に変換され、次いで、バンドパスフィルタ回路３８の入力側から信号Ｖin（ｔ）を入力すると、出力側では外乱となる電気信号が濾波された信号Ｖout（ｔ）が出力されることになる。この濾波された信号Ｖout（ｔ）をＣＰＵ基板２３に入力すれば、微生物の蛍光発光の受光量に相応する電気信号と外乱とがすでに明確に区別されているから、微生物量の測定誤差が生じることはなく、測定値がばらつく問題も生じず、安定して測定することが可能となる。
　　図７は測定フローを示すフロー図であり、図１、図２、図５乃至図７を参照して上記構成における作用を説明する。
　　まず、作業者はピペット等を使用し、温度２０℃程度のバラスト水から１００ｍｌ（ミリリットル）を試料として採取し、試料容器５に投入する（図７のステップ１）。次に、試料容器５内に蛍光染色試薬を添加する（図７のステップ２）。この蛍光染色試薬は一般的に知られているカルセインＡＭ（Calcein-AM，ドイツ国Promocell GMBH 社製）や、ＦＤＡなどを使用することができる。カルセインＡＭは、植物性プランクトンに対して染色しやすい傾向があり、ＦＤＡは、動物性プランクトンに対して染色しやすい傾向があり、このため、染色試薬による染色を、カルセインＡＭとＦＤＡとを混合した試薬により染色を行うと、試薬の染色時間を短くして、染色に要する時間を従来の半分にすることが可能となる。そして、作業者は試料容器５に回転子７を投入後、検査装置１の測定部６に収容し、測定部６の蓋３０を被着することで測定準備が完了する。ここで、電源ボタン３ａを押下すれば、該測定部６内に内蔵されたマグネティックスターラ２７の駆動により回転子７が回転し、試料溶液Ｓが撹拌されることになる（図７のステップ３）。
　　次に、作業者は操作部の測定開始ボタン３ｂの押下により、所定時間後ＬＥＤ光源１０が点灯し、励起光用バンドパスフィルタ１２を透過した光が試料容器５に照射されることになる。このとき、例えば、波長特性として４５０nm～４９０nmの波長の光が照射され、試料容器５内の検体（微生物）が蛍光発光することになる（図７のステップ４）。そして、この蛍光が蛍光用バンドパスフィルタ１５を透過して光電子増倍管（ＰＭＴ）１４により検知されることになる（図７のステップ５）。
　　光電子増倍管（ＰＭＴ）１４は、光電効果の利用により光エネルギが電気エネルギに変換されるとともに、電流増幅機能が付加され、高感度に蛍光発光を検知することができる。検知した電気信号は、演算増幅器３５により増幅されてバンドパスフィルタ回路３６に入力され、外乱となる電気信号が濾波された信号が出力される（図７のステップ６）。そして、外乱となる電気信号が濾波された信号はＣＰＵ基板２３に送られ、一定しきい値以上の受光波形がカウントされることになる（図７のステップ７）。
　　さらに、ＣＰＵ基板２３では、受光波形カウント値から前記試料容器５内の水１００ｍｌ（ミリリットル）中に存在する微生物数を推定して、排水基準を満たすか否かを表示部４に表示されるのである（図７のステップ８）。
　　以下、本発明の実施例について説明する。まず、上記実施形態の微生物の検査装置の検査精度の確認試験を行った。
　　微生物の個体数と光電子増倍管（ＰＭＴ）の受光カウントとの相関関係を調査した。Ｓ型シオミズツボワムシ（最小サイズ約１００μｍ＝Ｌサイズ生物）を複数の試料容器５（１００ｍＬ容量）にそれぞれ５個体、１０個体、５０個体、１００個体、１０００個体と個体別に収容し、それぞれを蛍光染色試薬ＦＤＡ（濃度０．０１[ミリmol／リットル]）で染色した。その結果、収容した微生物の個体数に応じて、波形のカウント数が増加してきており、５個体、１０個体、５０個体及び１００個体の５サンプルについては直線的に応答した（図１０Ａ、図１０Ｂ参照）。このため、得られた波形のカウント数からバラスト水１００ｍＬ中に存在する微生物の個体数が推定できる。
　　微生物の生死によって検出が可能か否かの試験を行った（図１１Ａ～図１１Ｄ参照）。熱により殺滅処理（６０℃、３０分の加熱）したＳ型シオミズツボワムシ（最小サイズ約１００μｍ＝Ｌサイズ生物）を、蛍光染色試薬ＦＤＡ（濃度０．０１[ミリmol／リットル]）で染色する。殺滅処理１時間後、殺滅処理２０時間後、殺滅処理５日後の３サンプルを作成してそれぞれ測定した。その結果、殺滅処理したものはいずれも一定のしきい値以上の波形が発見されず、殺滅処理せずに微生物が存在するサンプルと殺滅処理して微生物が存在しないサンプルとの判別が可能である。
　　前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１４とＣＰＵ基板２３との間に、フィルタリング手段を装着する前と装着した後の取得電圧の波形を比較する。
　　図１２はフィルタリング手段を装着する前の取得電圧の波形である。図１２Ａに示す取得電圧の波形は、外乱（バックグラウンド成分約０．９Ｖ波形）と、しきい値を超えた生きた微生物と確認できる明確な山と、しきい値を超えない不明瞭な山との３つが混在したものとなっている。また、図１２Ｂに示す取得電圧の波形は、外乱（バックグラウンド成分約１．４Ｖ波形）と、しきい値を超えた生きた微生物と確認できる明確な山との２つが混在したものとなっている。さらに、図１２Ｃに示す取得電圧の波形は、外乱（バックグラウンド成分約０．４Ｖ波形）と、しきい値を超えない不明瞭な山との２つが混在したものとなっている。
　　図１３はフィルタリング手段を装着した後の取得電圧の波形である。図１３Ａに示す取得電圧の波形は、外乱となるバックグラウンド成分を取り除くため、ハイパスフィルタ回路３６のみを装着したときのものである。図１２Ｂに示す波形と比較すると、約１．４Ｖあったバックグラウンド成分が０Ｖに収束されており、外乱が除去されていることが分かる。
　　図１３Ｂの波形は、図１３Ａで示す破線の円で囲まれた山の波形を拡大したときの立ち上がり波形である。図１３Ｂの波形では、しきい値を挟んで上下動を繰り返しており、測定誤差を大きくする要因となる。そこで、このような高周波波形を除去する目的でローパスフィルタ回路３７を装着するのが望ましい。
　　図１３Ｃに示す取得電圧の波形は、外乱の除去と高周波波形の除去とを行うため、ハイパスフィルタ回路３６とローパスフィルタ回路３７とを結合したバンドパスフィルタ３８を装着したときのものである。図１３Ａの波形と比較すると、高周波ノイズが除去されて波形が滑らかとなった。
　　図１３Ｄの波形は、図１３Ｃで示す破線の円で囲まれた山の波形を拡大したときの立ち上がり波形である。図１３Ｄの波形では、図１３Ｂのようなギザギザ波形がなくなって滑らかになり、しきい値を挟んで上下動を繰り返すこともなくなった。これにより、測定誤差を極めて小さくすることで、精度よく測定することが可能となる。
　　以上のように本実施形態によれば、試料容器５に試料と蛍光染色試薬とを添加した後、撹拌混合手段７により試料溶液の撹拌・混合を行い、次いで、前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を入射させ、さらに、受光手段により微生物の蛍光発光を受光するため、撹拌しないで静置して計測するものと比較すれば、極めて短時間で微生物が明るく発光し、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で計測することが可能となる。そして、装置を小型化することが可能となり、製造コストが安価となる。
　　また、電気信号が制御手段に取り込まれる前に、フィルタリング手段によって外乱が濾波されるので、微生物の蛍光発光の受光量に相応する電気信号と外乱とを明確に区別することができ、微生物量の測定誤差が生じることはなく、測定値がばらつく問題も生じず、安定して測定することが可能となる。
　　本発明は、バラスト水を排出する際に排出基準を満たしているか否かを確認するための微生物の検査装置に適用することができる。
　１　　検査装置
　２　　本体部
　３　　操作部
　４　　表示部
　５　　試料容器
　６　　測定部
　７　　回転子
　８　　保持プレート
　９　　試料容器収容部
　１０　　ＬＥＤ光源
　１１　　平行光変換手段
　１２　　励起光用バンドパスフィルタ
　１３　　光源部
　１４　　光電子増倍管（ＰＭＴ）
　１５　　蛍光用バンドパスフィルタ
　１６　　集光用レンズ
　１７　　スリット
　１８　　リレーレンズ
　１９　　受光部
　２０　　筐体
　２１　　ＡＣ電源
　２２　　二次電池
　２３　　ＣＰＵ基板
　２４　　ＡＣ／ＤＣ変換器
　２５　　ＲＡＭ
　２６　　ＲＯＭ
　２７　　マグネティックスターラ
　２８　　ファン
　２９　　外部出力端子
　３０　　蓋
　３１　　平板
　３２　　ねじ切孔
　３３　　シリンドリカルレンズ
　３４　　フィルタリング手段
　３５　　演算増幅器
　３６　　ハイパスフィルタ回路
　３７　　ローパスフィルタ回路
　３８　　バンドパスフィルタ回路

Claims (10)

  1. 　　試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査装置であって、
    　　光を透過する材質で形成された試料容器を有し、該試料容器内で試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合手段と、
    　　前記試料容器に励起光を照射する励起光源と、
    　光を検知して電気信号に変換する受光手段と、
    　前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する制御手段と、を備え、
    　前記試料溶液は、試料に、微生物を染色する蛍光染色試薬が添加されて構成されており、
    　前記受光手段は、前記励起光源からの前記励起光の照射による、前記試料溶液からの蛍光発光を検知し、
    　前記制御手段は、前記受光手段からの電気信号に基づき発光数を検出し、前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する微生物の検査装置。
  2. 　前記受光手段と前記制御手段との間にフィルタリング手段を備え、
    　前記フィルタリング手段は、前記受光手段からの電気信号中の、低周波成分のノイズ及び高周波成分のノイズを濾波する
    　請求項１に記載の微生物の検査装置。
  3. 　　前記フィルタリング手段は、ハイパスフィルタとローパスフィルタとを連結したバンドパスフィルタである
    　請求項２記載の微生物の検査装置。
  4. 　　前記励起光源は、前記試料容器に対して直交するように励起光を照射するように配置され、
    　前記受光手段は、前記励起光源の励起光と直交した角度で前記蛍光発光を受光するように配置される
    　請求項１から３のいずれかに記載の微生物の検査装置。
  5. 　　前記受光手段と前記試料容器との間には、スリット部材を設けてなる
    　請求項１から４のいずれかに記載の微生物の検査装置。
  6. 　　前記励起光源と前記試料容器との間には、前記励起光源からの光を平行光に変換する平行光変換手段を設けてなる
    　請求項１から５のいずれかに記載の微生物の検査装置。
  7. 　　前記平行光変換手段が、平板にねじ切孔を穿設して形成したものである
    　請求項６に記載の微生物の検査装置。
  8. 　　前記平行光変換手段が、凸レンズで形成したものである
    　請求項６記載の微生物の検査装置。
  9. 　　試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査方法であって、
    　　試料容器内で試料に微生物を染色する蛍光染色試薬を添加した試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合工程と、
    　　前記試料容器に励起光を照射する励起工程と、
    　　前記励起光の照射による、前記試料容器からの蛍光発光を検知して電気信号に変換する受光工程と、
    　　該受光工程により変換された電気信号から発光数を検出し、前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する微生物数推定工程と、
    　を備えた微生物の検査方法。
  10. 　前記受光工程と前記微生物数推定工程の間に、
    　前記受光工程により変換された電気信号中の、低周波成分のノイズ及び高周波成分のノイズを濾波するフィルタリング工程と、
    　を備えた請求項９に記載の微生物の検査方法。
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