JP4484442B2 - 細菌測定方法と装置とプログラム - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、検体中の細菌を検出し、その細菌が桿菌であるか球菌であるかを自動的に判定する方法、装置及びプログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
試料中に含まれる細菌を検出し、その種類を判定することが、臨床検査や食品衛生検査の分野で行われている。細菌の種類は、細菌のグラム染色性（陽性または陰性）や形状（桿菌または球菌）により分類されることが多く、グラム陰性桿菌やグラム陽性球菌には人体に悪影響を与えるものが多い。
【０００３】
細菌を分類する方法としては寒天培養法が最も一般的な方法である。これは試料を寒天培地に塗布し、所定時間培養して形成したコロニーを、染色又は無染色にて、顕微鏡を用いて観察者が分類する検査方法である。しかしこの寒天培養法は、基本的に用手法であり処理が煩雑であり、また培養を要するため菌種の判定までに時間がかかる。
【０００４】
そこで、近年になって、フローサイトメータ等の粒子測定装置を用いて細菌を自動的に測定する方法が試みられ、この発明に関連する技術としては、次のようなものが知られている。
（１）培養前・培養後の試料をフローサイトメータで測定し、両測定結果の差をとることにより試料中の夾雑物の影響による誤測定を防止する微生物の測定方法及び装置（例えば、特許文献１参照）。
（２）細菌を含む試料にカチオン性界面活性剤を作用させて細菌の色素透過性を亢進させ、さらに色素を作用させて細菌を染色することにより、試料中に夾雑物が存在しても培養することなしに細菌を夾雑物から分離して計数する方法（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許第６１６５７４０号明細書
【特許文献２】
特開２００１−２５８５９０号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
フローサイトメータ等の粒子測定装置によって細菌を自動的に測定する方法を用いると、比較的短時間で測定ができるが、このような方法において、より精度良く、桿菌・球菌の判別を行う方法は提案されていなかった。この発明はこのような事情を考慮してなされたもので、検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを精度良く判定する方法と装置とプログラムを提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この発明は、検体中の細菌を蛍光染色して試料を調製し、調製した試料中の各細菌から細菌の大きさ情報と、細菌の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報とを検出し、検出された大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとするスキャッタグラムを作成し、スキャッタグラム上の細菌の分布状態を解析し、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する細菌測定方法を提供するものである。
【０００８】
また、この発明は蛍光染色した試料をサンプリングするサンプリング部と、サンプリングした試料中の各粒子から、粒子の大きさ情報を検出する大きさ情報検出器と、粒子の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報を検出する蛍光情報検出器と、を備えた検出部と、大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとした粒子のスキャッタグラムを作成するスキャッタグラム作成部と、スキャッタグラムから細菌の分布状態を解析する解析部と、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する判定部とからなる細菌測定装置を提供するものである。
【０００９】
また、この発明は検体をセットする検体セット部と、蛍光染色試薬をセットする試薬セット部と、検体と蛍光染色試薬を反応させ試料を調製する反応部と、調製した試料中の各粒子から、粒子の大きさ情報を検出する大きさ情報検出器と、粒子の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報を検出する蛍光情報検出器と、を備えた検出部と、大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとした粒子のスキャッタグラムを作成するスキャッタグラム作成部と、スキャッタグラムから細菌の分布状態を解析する解析部と、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する判定部とからなる細菌測定装置を提供するものである。
【００１０】
さらにこの発明は、検体中の細菌を蛍光染色して調製した試料中の各細菌から、細菌の大きさ情報と、細菌の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報とを検出し、大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとするスキャッタグラムを作成する装置において、スキャッタグラム上の細菌の分布状態を解析し、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する手順をコンピュータに実行させるプログラムを提供するものである。
またこの発明は、検体中の細菌を蛍光染色して試料を調製し、調製した試料中の各細菌から細菌の大きさ情報と、細菌の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報とを検出し、検出された大きさ情報と蛍光情報とを解析し、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定し、判定結果と、大きさ情報と蛍光情報をパラメータとするスキャッタグラムと、を表示する、細菌測定方法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この発明の菌種判定方法は、検体中の細菌を蛍光染色して試料を調製し、調製した試料中の各細菌から細菌の大きさ情報と、細菌の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報とを検出し、検出された大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとするスキャッタグラムを作成し、スキャッタグラム上の細菌の分布状態を解析し、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定することを特徴とする。
【００１２】
ここで、細菌の蛍光染色には、細菌を構成する成分と結合して蛍光を発する蛍光色素を使用し、検体中の細菌を特異的に染色する方法が用いられる。例えば、以下の（１）〜（１１）の色素を使用すれば、細菌の細胞内物質が特異的に蛍光染色される。
【００１３】
（１）チアゾールオレンジ
【００１４】
（２）
【化１】
【００１５】
（３）
【化２】
【００１６】
（４）
【化３】
【００１７】
（５）
【化４】
【００１８】
（６）
【化５】
【００１９】
（７）
【化６】
【００２０】
（８）
【化７】
【００２１】
（９）
【化８】
【００２２】
（１０）以下の一般式で表される化合物
【化９】
【００２３】
（式中、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基又は炭素数１〜３のアルキル基；Ｒ5は水素原子、置換されていてもよい炭素数１〜３のアルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子又は炭素数１〜３のアルキル基で置換された炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである）
【００２４】
（１１）以下の一般式で表される化合物
【化１０】
【００２５】
（式中、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜１８のアルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基、又は炭素数１〜１８のアルキル基；Ｚは硫黄、酸素、あるいは炭素数１〜３のアルキル基を有する炭素であり；ｎは０,1又は２であり；Ｘ-はアニオンである）。
【００２６】
これらの色素のうち、（１）は市販品を入手できる。（２）、（３）は日本感光色素研究所（株）より入手できる。（５）〜（９）は、Molecular Probes,Inc.より入手できる。
【００２７】
また、（１０）は、特開平９−１０４６８３号に、（１１）は、特開平１０−３１９０１０号に製造方法が記載されている。
【００２８】
なお、（１０）の一般式で示される色素のうち、特に、次の色素；
【化１１】
が好適である。
【００２９】
蛍光染色処理を施した試料中の各粒子から蛍光情報（蛍光の強度）を検出すれば、ある程度の蛍光強度を有する細菌と、蛍光強度をほとんど有さない夾雑物とを弁別できる。
【００３０】
粒子の大きさ情報を検出する方法としては、調製した試料を微細孔に通し、通過時の試料の電気抵抗の変化から粒子のサイズを検出する電気抵抗法や、フローサイトメトリーによって粒子の発する散乱光強度や散乱光パルス幅を検出する方法を用いることができる。ここで粒子の大きさ情報とは、粒子径、粒子径に直行する方向の粒子の幅、粒子の体積など、粒子の大きさを反映した情報である。電気抵抗法により検出される電気抵抗の変化値や、フローサイトメトリーによって検出される散乱光信号の強度やパルス幅といったものを大きさ情報として使用できる。
【００３１】
蛍光情報を検出する方法としては、フローサイトメトリーによって蛍光染色された粒子の発する蛍光強度を検出する方法を用いることができる。
【００３２】
フローサイトメトリーとは、被検粒子を含む試料液の流れに対してレーザ光を照射し、粒子がレーザ光照射エリアを通過するごとに生じる散乱光や蛍光を検出し、検出した光学的情報に基づき粒子を分析する方法である。これら光学的情報は、ホトダイオードやホトマルチプライヤチューブ等の光電変換素子によりパルス状の電気信号として検出される。この電気信号につき、パルスのピーク高に基づき信号強度を得たり、パルス幅に基づき発光時間を得たりすることができる。一般に、前方散乱光信号は粒子の大きさを反映し、蛍光信号は予め蛍光染色された粒子の染色度合いを反映する。
【００３３】
スキャッタグラムとは、粒子の特徴を反映するものとして検出された複数の情報（本発明では粒子の大きさを表わす大きさ情報、及び蛍光情報）を座標軸にとり、検出された粒子を座標空間上の対応する位置にプロットしたものである。桿菌出現検体と球菌出現検体とを比較した場合、得られる大きさ情報が同じであれば、球菌より桿菌の方が得られる蛍光情報が大きい傾向にあり、スキャッタグラム上での分布状態に違いがあることを本願発明者は見出した。本発明は、この分布状態の違いに基づいて検体中の細菌が桿菌であるか球菌であるかを判定するものである。
【００３４】
桿菌出現検体と球菌出現検体との分布状態の違いは、分布状態の傾きに表れる。以下、分布状態の傾きについて説明する。図６は桿菌出現検体から得られたスキャッタグラムの一例、図７は球菌出現検体から得られたスキャッタグラムの一例を示すものであり、Ｘ軸に蛍光強度（ＦＬ）を、Ｙ軸に前方散乱光強度（Ｆｓｃ）をとっている。各図中の領域ＢＣＴは細菌が出現すると目される領域である。スキャッタグラム上で細菌の集団は一定方向へ（左下から右上の方向へ）延びるように分布している。ここで、スキャッタグラムの座標空間における、前記一定方向の有する傾きが、分布状態の傾きである。図６と図７を比較すると、集団が右上へ伸びる方向のＸ軸に対する傾き（＝分布状態の傾き）は、桿菌出現検体（図６）よりも球菌出現検体（図７）の方が大きくなっている。このことから本発明は、分布状態の傾きに基づき、検体中の細菌が桿菌であるか球菌であるかを判別する。分布状態の傾きは、細菌のプロットの最大分散方向を求め、最大分散方向の傾きを求めて分布状態の傾きとすることができる。また細菌のプロットから計算される近似式の傾きを用いることができる。
【００３５】
実施例
以下、本発明に係る自動細菌測定装置につき説明する。これによってこの発明が限定されるものではない。図１は自動細菌測定装置１の外観を実線で、装置内部の概略構成を破線で示したものである。装置の最前面には実線で示すように、各種設定入力を行なったり、また測定結果を表示出力するための液晶タッチパネル１１、検体セット部カバー１２、試薬セット部カバー１３、スタートスイッチ１４を備える。検体セット部カバー１２を開けると、装置内部に設置された検体セット部に検体をセットできるようになっている。試薬セット部カバー１３を開けると、装置内部に設置された試薬セット部に試薬をセットできるようになっている。検体セット部、試薬セット部については後述する。
【００３６】
破線で示す装置の内部構成において、上部にはマイクロコンピュータや各種回路等からなる分析制御部４００が配置されている。下部の手前側には、試料液を調製するための試料調製部２００が配置されている。下部の奥側には試料液中の細菌から信号を検出するための検出部３００が配置されている。
【００３７】
試料調製部
図２に自動細菌測定装置１の試料調製部２００を示す。試料調製部２００は、検体セット部２０１、試薬セット部２０２、インキュベータ（反応部）２０４、分注装置２０５を有している。検体セット部２０１には、検体の入った容器２０１ａをセットするようになっている。この自動細菌測定装置１では、測定用の試薬として希釈液及び染色液を用いるようになっており、試薬セット部２０２には、希釈液の入った容器２０２ａ及び染色液の入った容器２０２ｂをそれぞれセットするようになっている。インキュベータ２０４には、検体と試薬を反応させるさせるための容器２０４ａをセットするようになっている。分注装置２０５は、図示しない駆動装置により上下左右に移動可能で、液体を定量して吸引・吐出できるようになっている。分注装置２０５は、検体セット部２０１にセットされた容器２０１ａ中の検体と、試薬セット部２０２にセットされた容器２０２ａ中の希釈液・容器２０２ｂ中の染色液とを、それぞれ所定量吸引し、インキュベータ２０４にセットされた容器２０４ａに吐出する。インキュベータ２０４は容器２０４ａを所定の温度に保ち、検体と試薬を反応させ、試料液を調製する。調製された試料液は分注装置２０５によりサンプリングされ、試料容器１１２に供給される。試料調製部２００の詳細な動作については後述する。
【００３８】
検出部
図３は検出部３００の光学系と流体系を示す説明図である。シースフローセル１０７は、前記試料調製部２００の試料容器１１２から供給された試料液を流すためのものであり、試料容器１１２と接続されている。またシースフローセル１０７は試料液をオリフィス１１１に向って上方へ噴射するノズル１１３と、シース液供給口１１０と、排液口１１４を備える。シースフローセル１０７の近傍には、シースフローセル１０７中を流れる試料液にレーザ光を照射するためのレーザ光源１１７、およびレーザ光を照射された試料液中の細菌から発せられた前方散乱光や蛍光を集光するための各種光学部品（コンデンサレンズ１１８、ビームストッパー１１９、コレクタレンズ１２０、ピンホール１２１を有する遮光板１３０、ダイクロイックミラー１２２、フィルタ１２３）が設けられている。また集光された蛍光を検出するための検出器としてホトマルチプライヤーチューブ１２４を、前方散乱光を検出するための検出器としてホトダイオード１２５を備えている。
【００３９】
シース液供給口１１０には陽圧ポンプ１４７で加圧されたシース液容器１０９がバルブ１０５を介して接続される。排液口１１４は図示しない廃液チャンバーに接続される。ノズル１１３は、バルブ１０１を介して試料容器１１２に接続され、さらに、流路１３９とバルブ１０２を介して陰圧ポンプ１４８に接続され、流路１３９のバルブ１０２側にシリンジポンプ１３３が接続されている。
【００４０】
以上の構成により検出部３００は、試料調製部２００で調製された試料液をシースフローセル１０７に流し、試料液中の細菌から前方散乱光信号や蛍光信号を検出する。検出した信号は分析制御部４００へ送る。検出部３００の詳細な動作については後述する。
【００４１】
分析制御部
図４は分析制御部４００の構成を示すブロック図である。分析制御部４００は、ＣＰＵ・ＲＡＭ・ＲＯＭ・ハードディスクなどからなるコンピュータ、各種回路等からなり、情報処理部１３４及び駆動回路部１３７としての機能を有する。図４に示すように情報処理部１３４は、分析部１４１と格納部１４５と制御部１４６を備え、分析部１４１はスキャッタグラム作成部１４２と解析部１４３と判定部１４４を備える。
【００４２】
格納部１４５は、装置各部の動作を制御する制御プログラムや、前記検出部３００により試料中の細菌から得た信号を分析部１４１で分析するための分析プログラムを格納している。制御プログラムに基づき、制御部１４６は駆動回路部１３７を制御する。駆動回路部１３７は、制御部１４６の制御に基づき、図２に示す分注装置２０５や図３に示すシリンジポンプ１３３、バルブ１０１、１０２、１０５、陽圧ポンプ１４７、陰圧ポンプ１４８およびレーザ光源１１７を駆動する。
【００４３】
全体制御
図１５は、制御プログラムによる自動細菌測定装置１の全体制御を示すフローチャートである。操作者が試料調製部２００（図２）の検体セット部２０１に、検体が入った容器２０１ａを、試薬セット部２０２に、希釈液の入った容器２０２ａと染色液の入った容器２０２ｂを、またインキュベータ２０４に、検体と試薬を反応させるための容器２０４ａ（この時点では空である）をセットした後、スタートスイッチ１４を押すと、制御プログラムが起動し、ステップＡ（試料調製部制御）、ステップＢ（検出部制御）、ステップＣ（分析部制御）が順次実行される。これにより、試料調製部２、検出部３、分析部１４１が制御され、自動細菌測定測定装置１の一連の動作が自動的に実行される。上記ステップＡ、Ｂ、Ｃによる装置各部の動作の詳細を以下に説明する。
【００４４】
ステップＡ（試料調製部制御）
試料調製部制御による試料調製部２００の動作を、図２を用いて説明する。まず分注装置２０５が、検体セット部２０１の容器２０１ａから検体を定量し、インキュベータ２０４の容器２０４ａに５０μｌ分注する。次に、分注装置２０５は試薬セット部２０２の容器２０２ａから希釈液を定量し、前記検体の分注された容器２０４ａに３４０μｌを分注する。インキュベータ２０４は温度を４２℃に保ちながら１０秒間、検体と希釈液を撹拌する。そして分注装置２０５は試薬セット部２０２の容器２０２ｂから染色液を定量し、前記容器２０４ａに１０μｌ分注する。インキュベータ２０４は容器２０４ａの温度を４２℃に保ちながら２０秒間振盪撹拌して染色液を反応させ、試料液を調製する。調製した約４００μｌの試料液が分注装置２０５によりサンプリングされ、試料容器１１２に供給する。試料容器１１２中の試料液は後述するように、検出部３００のシースフローセル１０７に流される。
【００４５】
ステップＢ（検出部制御）
検出部制御による検出部３００の動作を、図３を用いて説明する。前記試料調製部２００によって調製された試料液が試料容器１１２に収容されると、まず陰圧ポンプ１４８が駆動する。ここでバルブ１０１・１０２を所定時間開けると、試料が陰圧によりバルブ１０１と１０２の間の流路１３９に満たされる。その後、バルブ１０１・１０２を閉じる。
【００４６】
次に、シリンジポンプ１３３が一定流量で流路１３９の試料をノズル１１３へ押し出すことにより、ノズル１１３から試料がシースフローセル１０７に吐出される。それと同時にバルブ１０５を開けることによりシース液容器１０９からシースフローセル１０７にシース液が供給される。
【００４７】
これによって試料はシース液に包まれ、さらにオリフィス１１１によって細く絞られて流れる。試料液の流れを粒子径と同程度まで絞り込むことにより、試料液に含まれた粒子を一列に整列させて流すことができる。オリフィス１１１を通過した試料液とシース液は排液口１１４から排出される。
【００４８】
オリフィス１１１を流れる試料液流１２６に対して、レーザ光源１１７からレーザ光が出射され、コンデンサーレンズ１１８で絞られて照射される。
【００４９】
試料液中の粒子に当たらずそのままフローセル１０７を透過したレーザ光はビームストッパ１１９で遮光される。レーザ光をうけた粒子から発せられる前方散乱光及び前方蛍光はコレクターレンズ１２０により集光され、遮光板１３０のピンホール１２１を通過する。そして、ダイクロイックミラー１２２に到達する。
【００５０】
散乱光より長波長の蛍光はそのままダイクロイックミラー１２２を透過し、フィルター１２３で更に散乱光が除かれた後にホトマルチプライヤーチューブ１２４で検出され、蛍光信号１２７（パルス状の電気信号）として出力される。
【００５１】
また、散乱光はダイクロイックミラー１２２で反射され、ホトダイオード１２５で受光されて散乱光信号１２８（パルス状の電気信号）として出力される。そして、蛍光信号１２７と前方散乱光信号１２８は図４に示す情報処理部１３４へ入力される。
【００５２】
ステップＣ（分析部制御）
検出部３００から、情報処理部１３４に蛍光信号１２７と前方散乱光信号１２８が入力されると、分析部１４１により信号の解析が行われる。これが自動細菌測定装置１の全体制御におけるステップＣ（分析部制御）である。以下、分析部制御による分析部１４１の動作を、図５のフローチャートを用いて説明する。この動作手順を表わすプログラムは、他の制御プログラムと共に格納部１４５に予め格納されるが、外部の記録媒体や通信網から供給されてもよい。
【００５３】
まず、検出部３００で検出された前方散乱光信号１２８と蛍光信号１２７が、分析部１４１のスキャッタグラム作成部１４２に入力される（ステップＳ１）。
【００５４】
スキャッタグラム作成部１４２は、入力された前方散乱光信号１２８の最大ピーク値から前方散乱光強度Ｆｓｃを、粒子の大きさ情報として算出する。また同様に、蛍光信号１２７から蛍光強度ＦＬを蛍光情報として算出する。そして、得られたＦＬをＸ軸とし、ＦｓｃをＹ軸とする二次元スキャッタグラムを作成する（ステップＳ２）。
【００５５】
次に解析部１４３が、前記作成した二次元スキャッタグラム上に出現した粒子から細菌を弁別し、細菌として弁別された粒子を計数する（ステップＳ３）。図６は桿菌出現検体から作成された二次元スキャッタグラムの一例である。図に示すように、この二次元スキャッタグラムには、細菌と他の粒子とを弁別するために、細菌のみが出現すると目される領域ＢＣＴが予め設定されており、領域ＢＣＴ内に出現した粒子が細菌とみなさる。この領域ＢＣＴ内に出現した粒子のみを細菌として計数する。
【００５６】
さらに解析部１４３は、領域ＢＣＴ内に存在する粒子の、Ｘ−Ｙ２次元空間における分散を求め、分散の中心点を通り分散が最大となる方向ベクトルＥを求める。求めた方向ベクトルＥを図６に示す。そして前記求めた方向ベクトルＥを、図８に示すように単位ベクトル（長さが１のベクトル）に変換する。この単位ベクトルをＸ軸方向成分、Ｙ軸方向成分に分解し、このうちのＹ軸方向成分の大きさをＰとする（ステップＳ４）。Ｐは前記方向ベクトルＥのＸ軸に対する傾き度合いを表わす値である。
【００５７】
図７は、球菌出現検体から作成された二次元スキャッタグラムの例であり、図６同様に方向ベクトルＥを求めた様子を示す。図６と図７を比較して明らかなように、方向ベクトルＥのＸ軸に対する傾き度合いは桿菌出現検体（図６）よりも球菌出現検体（図７）の方が大きくなる。よってＰの値も、桿菌出現検体（図６）より球菌出現検体（図７）の方が大きくなる。
【００５８】
そこで、判定部１４４は、前記解析部１４３が算出したＰの値を所定値Ａ（ここでは、Ａ＝０.６８）と比較する（ステップＳ５）。Ｐ≧Ａの場合には、検体に含まれる細菌は球菌であると判定し（ステップＳ６、Ｓ７）、Ｐ＜Ａの場合には、桿菌であると判定する（ステップＳ６、Ｓ８）。
【００５９】
判定部１４４による判定結果は、ステップＳ２で作成された二次元スキャッタグラムや、ステップＳ３で計数された細菌数と併せて液晶タッチパネル１１に出力される（ステップＳ９）。液晶タッチパネル１１に出力された画面の例を図１６に示す。スキャッタグラム、菌種の判定結果、菌数が表示されている。菌種の判定結果を示す欄では、「桿菌」、「球菌」のうち「桿菌」に印がついており、判定結果が桿菌であったことを示している。
【００６０】
検体測定
以下、上記に説明した自動細菌測定装置１を用いて検体を測定し、菌種を判定した結果について説明する。
【００６１】
検体
検体として、次の（ａ）〜（ｇ）を用いた。
（ａ）E. aerogenes（桿菌）が出現したヒトの尿
（ｂ）E. coli（桿菌）が出現したヒトの尿
（ｃ）S. aureus（黄色ブドウ球菌）が出現したヒトの尿
（ｄ）S. epidermidis（表皮ブドウ球菌）が出現したヒトの尿
（ｅ）E. coli（桿菌）を混釈させたハートインフュージョン液体培地（菌数６×１０5個／ｍＬ程度）
（ｆ）P. aeruginosa（小型の桿菌）を混釈させたハートインフュージョン液体培地（菌数６×１０5個／ｍＬ程度）
（ｇ）S. aureus（黄色ブドウ球菌）を混釈させたハートインフュージョン液体培地（菌数６×１０5個／ｍＬ程度）
【００６２】
測定用試薬
検体を処理して測定用試料を調製するための試薬として、以下の組成の希釈液と染色液を使用した。
【００６３】
希釈液
クエン酸・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍＭ
硫酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ９０ｍＭ
アミド硫酸・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍＭ
ＮａＯＨ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｐＨ２．５になる量
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド・・・１ｇ
精製水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１リットル
【００６４】
染色液
以下の構造式の色素・・・・・・・・・・・・・・・・４０ｍｇ
【化１２】
エチレングリコール・・・・・・・・・・・・・・・・１リットル
【００６５】
前記検体（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）をそれぞれ測定した結果得られた二次元スキャッタグラムを図１１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）に示す。Ｘ軸（横軸）にはＦＬを、Ｙ軸（縦軸）にはＦｓｃをとっている。
【００６６】
図１２は、図１１の各二次元スキャッタグラムから算出されたＰの値、および前記フローチャートに基づく菌種の判定結果を示す。桿菌出現検体から算出されるＰの値は、球菌出現検体から算出されるＰの値と比べて小さい値となることがわかる。また各検体から得られたＰの値と所定値Ａ（ここではＡ＝０.６８）とを比較した結果に基づく菌種の判定結果は、実際の菌種と一致していることがわかる。
【００６７】
前記検体（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）を測定した結果得られた二次元スキャッタグラムを図１３の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）に示す。Ｘ軸（横軸）にはＦＬを、Ｙ軸（縦軸）にはＦｓｃをとっている。
【００６８】
図１４は、図１３の各二次元スキャッタグラムから算出されたＰの値、および前記フローチャートに基づく菌種の判定結果を示す。桿菌出現検体から算出されるＰの値は、球菌出現検体から算出されるＰの値と比べて小さい値となることがわかる。また各検体から得られたＰの値と所定値Ａ（ここではＡ＝０.６８）とを比較した結果に基づく菌種の判定結果は、実際の菌種と一致していることがわかる。
【００６９】
大型の桿菌であるE.coliと小型の桿菌であるP.aeruginosaとを比較すると、二次元スキャッタグラム上でP. aeruginosaの方がＦｓｃに関し低値の位置に多く出現しており、分布の仕方に違いが見られる。しかしＰの値に基づく菌種判定により、いずれも正しく桿菌として判定されている。
【００７０】
判定の精度
対照法として平板寒天培養法により菌種を判定したヒトの尿検体（桿菌出現検体５３検体および球菌出現検体２６検体）を、上記自動細菌測定装置１によって測定し、菌種を判定した場合の判定精度を図１０に示す。図１０から分かるように、桿菌出現検体では、４７検体について判定が一致し（精度８８.７％）、球菌出現検体では２１検体が一致している（精度８０.１％）。 また、合計すると、７６検体の内、６８検体について判定が一致している（精度８６.１％）。従って、この発明は８０％以上の判定精度を有するといえる。
【００７１】
図９は図５の手順の変形例を示すフローチャートであり、図５のステップＳ６においてＰ＜Ａの場合のみの手順を変更し、その他の手順は図５と同等としたものである。
【００７２】
つまり、図９に示すフローチャートにおいて判定部１４４は、Ｐ＜Ａの場合、パラメータＰを、Ａより小さい所定値Ｂ（例えばＢ＝０.６０）と比較する（ステップＳ６ａ）。Ｐ＜Ｂの場合（ステップＳ６ｂ）には検体に含まれる粒子は桿菌と判定され（ステップＳ８）、Ａ＞Ｐ≧Ｂの場合には判定困難と判定される（ステップＳ６ｂ，Ｓ６ｃ）。
【００７３】
これらの判定結果に応じた画面が、液晶タッチパネル１１に出力される（ステップＳ９）。また液晶タッチパネル１１には、ステップＳ２で作成されたスキャッタグラムや、ステップＳ３で計数された細菌数も併せて出力される。液晶タッチパネル１１に出力された画面の例を図１７に示す。二次元スキャッタグラム、菌種の判定結果、菌数が表示されている。菌種の判定結果を示す欄では、「桿菌」、「球菌」、「判定困難」のうち「判定困難」に印がついており、この検体は菌種の判定が困難であったことを示している。
【００７４】
図９に示すフローチャートのステップＳ６ｂでＡ＞Ｐ≧Ｂの場合、図１７のように球菌・桿菌いずれの菌種かを判定せず、単に判定困難である旨を出力してもよいが、球菌・桿菌いずれかの菌種の存在を示唆しつつ、示唆していない方の種類の菌も多く存在する可能性がある旨を警告するよう出力してもよい。
【００７５】
【発明の効果】
この発明によれば、細菌の大きさ情報と蛍光情報によって作成したスキャッタグラムの分布状態から、検体中の細菌が桿菌であるか球菌であるかを判定することができる。細菌の培養を必要とせずにきわめて能率よく菌種を判定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の自動細菌測定装置の斜視図である。
【図２】図１に示す装置の試料調製部を示す斜視図である。
【図３】この発明に係る検出部の光学系と流体系を示す説明図である。
【図４】この発明に係る分析制御部を示すブロック図である。
【図５】この発明の動作を示すフローチャートである。
【図６】この発明におけるスキャッタグラムの一例を示す図である。
【図７】この発明におけるスキャッタグラムの他の例を示す図である。
【図８】この発明に係る単位ベクトルの説明図である。
【図９】図５に示すフローチャートの変形例を示すフローチャートである。
【図１０】この発明の判定精度を示す説明図である。
【図１１】この発明における各種スキャッタグラムの例を示す図である。
【図１２】この発明における図１１に基づく菌種判定結果を示す説明図である。
【図１３】この発明における各種スキャッタグラムの例を示す図である。
【図１４】この発明における図１３に基づく菌種判定結果を示す説明図である。
【図１５】この発明の自動細菌測定装置の全体制御を示すフローチャートである。
【図１６】この発明の自動細菌測定装置が表示出力した画面の一例を示す説明図である。
【図１７】この発明の自動細菌測定装置が表示出力した画面の一例を示す説明図である。
【符号の説明】
１ 自動細菌測定装置
１１ 液晶タッチパネル
１２ 検体セット部カバー
１３ 試薬セット部カバー
１４ スタートスイッチ
１０１ バルブ
１０２ バルブ
１０５ バルブ
１０７ シースフローセル
１０９ シース液容器
１１０ シース液供給口
１１１ オリフィス
１１３ ノズル
１１４ 排液口
１１７ レーザ光源
１１８ コンデンサレンズ
１１９ ビームストッパー
１２０ コンタクトレンズ
１２１ ピンホール
１２２ ダイクロイックミラー
１２３ フィルター
１２４ ホトマルチプライヤチューブ
１２５ ホトダイオード
１３０ 遮光板
１３３ シリンジポンプ
１３９ 流路
１４７ 陽圧ポンプ
１４８ 陰圧ポンプ
２００ 試料調製部
３００ 検出部
４００ 分析制御部
【発明の属する技術分野】
この発明は、検体中の細菌を検出し、その細菌が桿菌であるか球菌であるかを自動的に判定する方法、装置及びプログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
試料中に含まれる細菌を検出し、その種類を判定することが、臨床検査や食品衛生検査の分野で行われている。細菌の種類は、細菌のグラム染色性（陽性または陰性）や形状（桿菌または球菌）により分類されることが多く、グラム陰性桿菌やグラム陽性球菌には人体に悪影響を与えるものが多い。
【０００３】
細菌を分類する方法としては寒天培養法が最も一般的な方法である。これは試料を寒天培地に塗布し、所定時間培養して形成したコロニーを、染色又は無染色にて、顕微鏡を用いて観察者が分類する検査方法である。しかしこの寒天培養法は、基本的に用手法であり処理が煩雑であり、また培養を要するため菌種の判定までに時間がかかる。
【０００４】
そこで、近年になって、フローサイトメータ等の粒子測定装置を用いて細菌を自動的に測定する方法が試みられ、この発明に関連する技術としては、次のようなものが知られている。
（１）培養前・培養後の試料をフローサイトメータで測定し、両測定結果の差をとることにより試料中の夾雑物の影響による誤測定を防止する微生物の測定方法及び装置（例えば、特許文献１参照）。
（２）細菌を含む試料にカチオン性界面活性剤を作用させて細菌の色素透過性を亢進させ、さらに色素を作用させて細菌を染色することにより、試料中に夾雑物が存在しても培養することなしに細菌を夾雑物から分離して計数する方法（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許第６１６５７４０号明細書
【特許文献２】
特開２００１−２５８５９０号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
フローサイトメータ等の粒子測定装置によって細菌を自動的に測定する方法を用いると、比較的短時間で測定ができるが、このような方法において、より精度良く、桿菌・球菌の判別を行う方法は提案されていなかった。この発明はこのような事情を考慮してなされたもので、検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを精度良く判定する方法と装置とプログラムを提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この発明は、検体中の細菌を蛍光染色して試料を調製し、調製した試料中の各細菌から細菌の大きさ情報と、細菌の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報とを検出し、検出された大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとするスキャッタグラムを作成し、スキャッタグラム上の細菌の分布状態を解析し、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する細菌測定方法を提供するものである。
【０００８】
また、この発明は蛍光染色した試料をサンプリングするサンプリング部と、サンプリングした試料中の各粒子から、粒子の大きさ情報を検出する大きさ情報検出器と、粒子の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報を検出する蛍光情報検出器と、を備えた検出部と、大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとした粒子のスキャッタグラムを作成するスキャッタグラム作成部と、スキャッタグラムから細菌の分布状態を解析する解析部と、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する判定部とからなる細菌測定装置を提供するものである。
【０００９】
また、この発明は検体をセットする検体セット部と、蛍光染色試薬をセットする試薬セット部と、検体と蛍光染色試薬を反応させ試料を調製する反応部と、調製した試料中の各粒子から、粒子の大きさ情報を検出する大きさ情報検出器と、粒子の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報を検出する蛍光情報検出器と、を備えた検出部と、大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとした粒子のスキャッタグラムを作成するスキャッタグラム作成部と、スキャッタグラムから細菌の分布状態を解析する解析部と、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する判定部とからなる細菌測定装置を提供するものである。
【００１０】
さらにこの発明は、検体中の細菌を蛍光染色して調製した試料中の各細菌から、細菌の大きさ情報と、細菌の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報とを検出し、大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとするスキャッタグラムを作成する装置において、スキャッタグラム上の細菌の分布状態を解析し、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する手順をコンピュータに実行させるプログラムを提供するものである。
またこの発明は、検体中の細菌を蛍光染色して試料を調製し、調製した試料中の各細菌から細菌の大きさ情報と、細菌の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報とを検出し、検出された大きさ情報と蛍光情報とを解析し、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定し、判定結果と、大きさ情報と蛍光情報をパラメータとするスキャッタグラムと、を表示する、細菌測定方法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この発明の菌種判定方法は、検体中の細菌を蛍光染色して試料を調製し、調製した試料中の各細菌から細菌の大きさ情報と、細菌の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報とを検出し、検出された大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとするスキャッタグラムを作成し、スキャッタグラム上の細菌の分布状態を解析し、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定することを特徴とする。
【００１２】
ここで、細菌の蛍光染色には、細菌を構成する成分と結合して蛍光を発する蛍光色素を使用し、検体中の細菌を特異的に染色する方法が用いられる。例えば、以下の（１）〜（１１）の色素を使用すれば、細菌の細胞内物質が特異的に蛍光染色される。
【００１３】
（１）チアゾールオレンジ
【００１４】
（２）
【化１】
（３）
【化２】
（４）
【化３】
（５）
【化４】
（６）
【化５】
（７）
【化６】
（８）
【化７】
（９）
【化８】
（１０）以下の一般式で表される化合物
【化９】
（式中、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基又は炭素数１〜３のアルキル基；Ｒ5は水素原子、置換されていてもよい炭素数１〜３のアルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子又は炭素数１〜３のアルキル基で置換された炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである）
【００２４】
（１１）以下の一般式で表される化合物
【化１０】
（式中、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜１８のアルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基、又は炭素数１〜１８のアルキル基；Ｚは硫黄、酸素、あるいは炭素数１〜３のアルキル基を有する炭素であり；ｎは０,1又は２であり；Ｘ-はアニオンである）。
【００２６】
これらの色素のうち、（１）は市販品を入手できる。（２）、（３）は日本感光色素研究所（株）より入手できる。（５）〜（９）は、Molecular Probes,Inc.より入手できる。
【００２７】
また、（１０）は、特開平９−１０４６８３号に、（１１）は、特開平１０−３１９０１０号に製造方法が記載されている。
【００２８】
なお、（１０）の一般式で示される色素のうち、特に、次の色素；
【化１１】
【００２９】
蛍光染色処理を施した試料中の各粒子から蛍光情報（蛍光の強度）を検出すれば、ある程度の蛍光強度を有する細菌と、蛍光強度をほとんど有さない夾雑物とを弁別できる。
【００３０】
粒子の大きさ情報を検出する方法としては、調製した試料を微細孔に通し、通過時の試料の電気抵抗の変化から粒子のサイズを検出する電気抵抗法や、フローサイトメトリーによって粒子の発する散乱光強度や散乱光パルス幅を検出する方法を用いることができる。ここで粒子の大きさ情報とは、粒子径、粒子径に直行する方向の粒子の幅、粒子の体積など、粒子の大きさを反映した情報である。電気抵抗法により検出される電気抵抗の変化値や、フローサイトメトリーによって検出される散乱光信号の強度やパルス幅といったものを大きさ情報として使用できる。
【００３１】
蛍光情報を検出する方法としては、フローサイトメトリーによって蛍光染色された粒子の発する蛍光強度を検出する方法を用いることができる。
【００３２】
フローサイトメトリーとは、被検粒子を含む試料液の流れに対してレーザ光を照射し、粒子がレーザ光照射エリアを通過するごとに生じる散乱光や蛍光を検出し、検出した光学的情報に基づき粒子を分析する方法である。これら光学的情報は、ホトダイオードやホトマルチプライヤチューブ等の光電変換素子によりパルス状の電気信号として検出される。この電気信号につき、パルスのピーク高に基づき信号強度を得たり、パルス幅に基づき発光時間を得たりすることができる。一般に、前方散乱光信号は粒子の大きさを反映し、蛍光信号は予め蛍光染色された粒子の染色度合いを反映する。
【００３３】
スキャッタグラムとは、粒子の特徴を反映するものとして検出された複数の情報（本発明では粒子の大きさを表わす大きさ情報、及び蛍光情報）を座標軸にとり、検出された粒子を座標空間上の対応する位置にプロットしたものである。桿菌出現検体と球菌出現検体とを比較した場合、得られる大きさ情報が同じであれば、球菌より桿菌の方が得られる蛍光情報が大きい傾向にあり、スキャッタグラム上での分布状態に違いがあることを本願発明者は見出した。本発明は、この分布状態の違いに基づいて検体中の細菌が桿菌であるか球菌であるかを判定するものである。
【００３４】
桿菌出現検体と球菌出現検体との分布状態の違いは、分布状態の傾きに表れる。以下、分布状態の傾きについて説明する。図６は桿菌出現検体から得られたスキャッタグラムの一例、図７は球菌出現検体から得られたスキャッタグラムの一例を示すものであり、Ｘ軸に蛍光強度（ＦＬ）を、Ｙ軸に前方散乱光強度（Ｆｓｃ）をとっている。各図中の領域ＢＣＴは細菌が出現すると目される領域である。スキャッタグラム上で細菌の集団は一定方向へ（左下から右上の方向へ）延びるように分布している。ここで、スキャッタグラムの座標空間における、前記一定方向の有する傾きが、分布状態の傾きである。図６と図７を比較すると、集団が右上へ伸びる方向のＸ軸に対する傾き（＝分布状態の傾き）は、桿菌出現検体（図６）よりも球菌出現検体（図７）の方が大きくなっている。このことから本発明は、分布状態の傾きに基づき、検体中の細菌が桿菌であるか球菌であるかを判別する。分布状態の傾きは、細菌のプロットの最大分散方向を求め、最大分散方向の傾きを求めて分布状態の傾きとすることができる。また細菌のプロットから計算される近似式の傾きを用いることができる。
【００３５】
実施例
以下、本発明に係る自動細菌測定装置につき説明する。これによってこの発明が限定されるものではない。図１は自動細菌測定装置１の外観を実線で、装置内部の概略構成を破線で示したものである。装置の最前面には実線で示すように、各種設定入力を行なったり、また測定結果を表示出力するための液晶タッチパネル１１、検体セット部カバー１２、試薬セット部カバー１３、スタートスイッチ１４を備える。検体セット部カバー１２を開けると、装置内部に設置された検体セット部に検体をセットできるようになっている。試薬セット部カバー１３を開けると、装置内部に設置された試薬セット部に試薬をセットできるようになっている。検体セット部、試薬セット部については後述する。
【００３６】
破線で示す装置の内部構成において、上部にはマイクロコンピュータや各種回路等からなる分析制御部４００が配置されている。下部の手前側には、試料液を調製するための試料調製部２００が配置されている。下部の奥側には試料液中の細菌から信号を検出するための検出部３００が配置されている。
【００３７】
試料調製部
図２に自動細菌測定装置１の試料調製部２００を示す。試料調製部２００は、検体セット部２０１、試薬セット部２０２、インキュベータ（反応部）２０４、分注装置２０５を有している。検体セット部２０１には、検体の入った容器２０１ａをセットするようになっている。この自動細菌測定装置１では、測定用の試薬として希釈液及び染色液を用いるようになっており、試薬セット部２０２には、希釈液の入った容器２０２ａ及び染色液の入った容器２０２ｂをそれぞれセットするようになっている。インキュベータ２０４には、検体と試薬を反応させるさせるための容器２０４ａをセットするようになっている。分注装置２０５は、図示しない駆動装置により上下左右に移動可能で、液体を定量して吸引・吐出できるようになっている。分注装置２０５は、検体セット部２０１にセットされた容器２０１ａ中の検体と、試薬セット部２０２にセットされた容器２０２ａ中の希釈液・容器２０２ｂ中の染色液とを、それぞれ所定量吸引し、インキュベータ２０４にセットされた容器２０４ａに吐出する。インキュベータ２０４は容器２０４ａを所定の温度に保ち、検体と試薬を反応させ、試料液を調製する。調製された試料液は分注装置２０５によりサンプリングされ、試料容器１１２に供給される。試料調製部２００の詳細な動作については後述する。
【００３８】
検出部
図３は検出部３００の光学系と流体系を示す説明図である。シースフローセル１０７は、前記試料調製部２００の試料容器１１２から供給された試料液を流すためのものであり、試料容器１１２と接続されている。またシースフローセル１０７は試料液をオリフィス１１１に向って上方へ噴射するノズル１１３と、シース液供給口１１０と、排液口１１４を備える。シースフローセル１０７の近傍には、シースフローセル１０７中を流れる試料液にレーザ光を照射するためのレーザ光源１１７、およびレーザ光を照射された試料液中の細菌から発せられた前方散乱光や蛍光を集光するための各種光学部品（コンデンサレンズ１１８、ビームストッパー１１９、コレクタレンズ１２０、ピンホール１２１を有する遮光板１３０、ダイクロイックミラー１２２、フィルタ１２３）が設けられている。また集光された蛍光を検出するための検出器としてホトマルチプライヤーチューブ１２４を、前方散乱光を検出するための検出器としてホトダイオード１２５を備えている。
【００３９】
シース液供給口１１０には陽圧ポンプ１４７で加圧されたシース液容器１０９がバルブ１０５を介して接続される。排液口１１４は図示しない廃液チャンバーに接続される。ノズル１１３は、バルブ１０１を介して試料容器１１２に接続され、さらに、流路１３９とバルブ１０２を介して陰圧ポンプ１４８に接続され、流路１３９のバルブ１０２側にシリンジポンプ１３３が接続されている。
【００４０】
以上の構成により検出部３００は、試料調製部２００で調製された試料液をシースフローセル１０７に流し、試料液中の細菌から前方散乱光信号や蛍光信号を検出する。検出した信号は分析制御部４００へ送る。検出部３００の詳細な動作については後述する。
【００４１】
分析制御部
図４は分析制御部４００の構成を示すブロック図である。分析制御部４００は、ＣＰＵ・ＲＡＭ・ＲＯＭ・ハードディスクなどからなるコンピュータ、各種回路等からなり、情報処理部１３４及び駆動回路部１３７としての機能を有する。図４に示すように情報処理部１３４は、分析部１４１と格納部１４５と制御部１４６を備え、分析部１４１はスキャッタグラム作成部１４２と解析部１４３と判定部１４４を備える。
【００４２】
格納部１４５は、装置各部の動作を制御する制御プログラムや、前記検出部３００により試料中の細菌から得た信号を分析部１４１で分析するための分析プログラムを格納している。制御プログラムに基づき、制御部１４６は駆動回路部１３７を制御する。駆動回路部１３７は、制御部１４６の制御に基づき、図２に示す分注装置２０５や図３に示すシリンジポンプ１３３、バルブ１０１、１０２、１０５、陽圧ポンプ１４７、陰圧ポンプ１４８およびレーザ光源１１７を駆動する。
【００４３】
全体制御
図１５は、制御プログラムによる自動細菌測定装置１の全体制御を示すフローチャートである。操作者が試料調製部２００（図２）の検体セット部２０１に、検体が入った容器２０１ａを、試薬セット部２０２に、希釈液の入った容器２０２ａと染色液の入った容器２０２ｂを、またインキュベータ２０４に、検体と試薬を反応させるための容器２０４ａ（この時点では空である）をセットした後、スタートスイッチ１４を押すと、制御プログラムが起動し、ステップＡ（試料調製部制御）、ステップＢ（検出部制御）、ステップＣ（分析部制御）が順次実行される。これにより、試料調製部２、検出部３、分析部１４１が制御され、自動細菌測定測定装置１の一連の動作が自動的に実行される。上記ステップＡ、Ｂ、Ｃによる装置各部の動作の詳細を以下に説明する。
【００４４】
ステップＡ（試料調製部制御）
試料調製部制御による試料調製部２００の動作を、図２を用いて説明する。まず分注装置２０５が、検体セット部２０１の容器２０１ａから検体を定量し、インキュベータ２０４の容器２０４ａに５０μｌ分注する。次に、分注装置２０５は試薬セット部２０２の容器２０２ａから希釈液を定量し、前記検体の分注された容器２０４ａに３４０μｌを分注する。インキュベータ２０４は温度を４２℃に保ちながら１０秒間、検体と希釈液を撹拌する。そして分注装置２０５は試薬セット部２０２の容器２０２ｂから染色液を定量し、前記容器２０４ａに１０μｌ分注する。インキュベータ２０４は容器２０４ａの温度を４２℃に保ちながら２０秒間振盪撹拌して染色液を反応させ、試料液を調製する。調製した約４００μｌの試料液が分注装置２０５によりサンプリングされ、試料容器１１２に供給する。試料容器１１２中の試料液は後述するように、検出部３００のシースフローセル１０７に流される。
【００４５】
ステップＢ（検出部制御）
検出部制御による検出部３００の動作を、図３を用いて説明する。前記試料調製部２００によって調製された試料液が試料容器１１２に収容されると、まず陰圧ポンプ１４８が駆動する。ここでバルブ１０１・１０２を所定時間開けると、試料が陰圧によりバルブ１０１と１０２の間の流路１３９に満たされる。その後、バルブ１０１・１０２を閉じる。
【００４６】
次に、シリンジポンプ１３３が一定流量で流路１３９の試料をノズル１１３へ押し出すことにより、ノズル１１３から試料がシースフローセル１０７に吐出される。それと同時にバルブ１０５を開けることによりシース液容器１０９からシースフローセル１０７にシース液が供給される。
【００４７】
これによって試料はシース液に包まれ、さらにオリフィス１１１によって細く絞られて流れる。試料液の流れを粒子径と同程度まで絞り込むことにより、試料液に含まれた粒子を一列に整列させて流すことができる。オリフィス１１１を通過した試料液とシース液は排液口１１４から排出される。
【００４８】
オリフィス１１１を流れる試料液流１２６に対して、レーザ光源１１７からレーザ光が出射され、コンデンサーレンズ１１８で絞られて照射される。
【００４９】
試料液中の粒子に当たらずそのままフローセル１０７を透過したレーザ光はビームストッパ１１９で遮光される。レーザ光をうけた粒子から発せられる前方散乱光及び前方蛍光はコレクターレンズ１２０により集光され、遮光板１３０のピンホール１２１を通過する。そして、ダイクロイックミラー１２２に到達する。
【００５０】
散乱光より長波長の蛍光はそのままダイクロイックミラー１２２を透過し、フィルター１２３で更に散乱光が除かれた後にホトマルチプライヤーチューブ１２４で検出され、蛍光信号１２７（パルス状の電気信号）として出力される。
【００５１】
また、散乱光はダイクロイックミラー１２２で反射され、ホトダイオード１２５で受光されて散乱光信号１２８（パルス状の電気信号）として出力される。そして、蛍光信号１２７と前方散乱光信号１２８は図４に示す情報処理部１３４へ入力される。
【００５２】
ステップＣ（分析部制御）
検出部３００から、情報処理部１３４に蛍光信号１２７と前方散乱光信号１２８が入力されると、分析部１４１により信号の解析が行われる。これが自動細菌測定装置１の全体制御におけるステップＣ（分析部制御）である。以下、分析部制御による分析部１４１の動作を、図５のフローチャートを用いて説明する。この動作手順を表わすプログラムは、他の制御プログラムと共に格納部１４５に予め格納されるが、外部の記録媒体や通信網から供給されてもよい。
【００５３】
まず、検出部３００で検出された前方散乱光信号１２８と蛍光信号１２７が、分析部１４１のスキャッタグラム作成部１４２に入力される（ステップＳ１）。
【００５４】
スキャッタグラム作成部１４２は、入力された前方散乱光信号１２８の最大ピーク値から前方散乱光強度Ｆｓｃを、粒子の大きさ情報として算出する。また同様に、蛍光信号１２７から蛍光強度ＦＬを蛍光情報として算出する。そして、得られたＦＬをＸ軸とし、ＦｓｃをＹ軸とする二次元スキャッタグラムを作成する（ステップＳ２）。
【００５５】
次に解析部１４３が、前記作成した二次元スキャッタグラム上に出現した粒子から細菌を弁別し、細菌として弁別された粒子を計数する（ステップＳ３）。図６は桿菌出現検体から作成された二次元スキャッタグラムの一例である。図に示すように、この二次元スキャッタグラムには、細菌と他の粒子とを弁別するために、細菌のみが出現すると目される領域ＢＣＴが予め設定されており、領域ＢＣＴ内に出現した粒子が細菌とみなさる。この領域ＢＣＴ内に出現した粒子のみを細菌として計数する。
【００５６】
さらに解析部１４３は、領域ＢＣＴ内に存在する粒子の、Ｘ−Ｙ２次元空間における分散を求め、分散の中心点を通り分散が最大となる方向ベクトルＥを求める。求めた方向ベクトルＥを図６に示す。そして前記求めた方向ベクトルＥを、図８に示すように単位ベクトル（長さが１のベクトル）に変換する。この単位ベクトルをＸ軸方向成分、Ｙ軸方向成分に分解し、このうちのＹ軸方向成分の大きさをＰとする（ステップＳ４）。Ｐは前記方向ベクトルＥのＸ軸に対する傾き度合いを表わす値である。
【００５７】
図７は、球菌出現検体から作成された二次元スキャッタグラムの例であり、図６同様に方向ベクトルＥを求めた様子を示す。図６と図７を比較して明らかなように、方向ベクトルＥのＸ軸に対する傾き度合いは桿菌出現検体（図６）よりも球菌出現検体（図７）の方が大きくなる。よってＰの値も、桿菌出現検体（図６）より球菌出現検体（図７）の方が大きくなる。
【００５８】
そこで、判定部１４４は、前記解析部１４３が算出したＰの値を所定値Ａ（ここでは、Ａ＝０.６８）と比較する（ステップＳ５）。Ｐ≧Ａの場合には、検体に含まれる細菌は球菌であると判定し（ステップＳ６、Ｓ７）、Ｐ＜Ａの場合には、桿菌であると判定する（ステップＳ６、Ｓ８）。
【００５９】
判定部１４４による判定結果は、ステップＳ２で作成された二次元スキャッタグラムや、ステップＳ３で計数された細菌数と併せて液晶タッチパネル１１に出力される（ステップＳ９）。液晶タッチパネル１１に出力された画面の例を図１６に示す。スキャッタグラム、菌種の判定結果、菌数が表示されている。菌種の判定結果を示す欄では、「桿菌」、「球菌」のうち「桿菌」に印がついており、判定結果が桿菌であったことを示している。
【００６０】
検体測定
以下、上記に説明した自動細菌測定装置１を用いて検体を測定し、菌種を判定した結果について説明する。
【００６１】
検体
検体として、次の（ａ）〜（ｇ）を用いた。
（ａ）E. aerogenes（桿菌）が出現したヒトの尿
（ｂ）E. coli（桿菌）が出現したヒトの尿
（ｃ）S. aureus（黄色ブドウ球菌）が出現したヒトの尿
（ｄ）S. epidermidis（表皮ブドウ球菌）が出現したヒトの尿
（ｅ）E. coli（桿菌）を混釈させたハートインフュージョン液体培地（菌数６×１０5個／ｍＬ程度）
（ｆ）P. aeruginosa（小型の桿菌）を混釈させたハートインフュージョン液体培地（菌数６×１０5個／ｍＬ程度）
（ｇ）S. aureus（黄色ブドウ球菌）を混釈させたハートインフュージョン液体培地（菌数６×１０5個／ｍＬ程度）
【００６２】
測定用試薬
検体を処理して測定用試料を調製するための試薬として、以下の組成の希釈液と染色液を使用した。
【００６３】
希釈液
クエン酸・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍＭ
硫酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ９０ｍＭ
アミド硫酸・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍＭ
ＮａＯＨ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｐＨ２．５になる量
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド・・・１ｇ
精製水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１リットル
【００６４】
染色液
以下の構造式の色素・・・・・・・・・・・・・・・・４０ｍｇ
【化１２】
【００６５】
前記検体（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）をそれぞれ測定した結果得られた二次元スキャッタグラムを図１１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）に示す。Ｘ軸（横軸）にはＦＬを、Ｙ軸（縦軸）にはＦｓｃをとっている。
【００６６】
図１２は、図１１の各二次元スキャッタグラムから算出されたＰの値、および前記フローチャートに基づく菌種の判定結果を示す。桿菌出現検体から算出されるＰの値は、球菌出現検体から算出されるＰの値と比べて小さい値となることがわかる。また各検体から得られたＰの値と所定値Ａ（ここではＡ＝０.６８）とを比較した結果に基づく菌種の判定結果は、実際の菌種と一致していることがわかる。
【００６７】
前記検体（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）を測定した結果得られた二次元スキャッタグラムを図１３の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）に示す。Ｘ軸（横軸）にはＦＬを、Ｙ軸（縦軸）にはＦｓｃをとっている。
【００６８】
図１４は、図１３の各二次元スキャッタグラムから算出されたＰの値、および前記フローチャートに基づく菌種の判定結果を示す。桿菌出現検体から算出されるＰの値は、球菌出現検体から算出されるＰの値と比べて小さい値となることがわかる。また各検体から得られたＰの値と所定値Ａ（ここではＡ＝０.６８）とを比較した結果に基づく菌種の判定結果は、実際の菌種と一致していることがわかる。
【００６９】
大型の桿菌であるE.coliと小型の桿菌であるP.aeruginosaとを比較すると、二次元スキャッタグラム上でP. aeruginosaの方がＦｓｃに関し低値の位置に多く出現しており、分布の仕方に違いが見られる。しかしＰの値に基づく菌種判定により、いずれも正しく桿菌として判定されている。
【００７０】
判定の精度
対照法として平板寒天培養法により菌種を判定したヒトの尿検体（桿菌出現検体５３検体および球菌出現検体２６検体）を、上記自動細菌測定装置１によって測定し、菌種を判定した場合の判定精度を図１０に示す。図１０から分かるように、桿菌出現検体では、４７検体について判定が一致し（精度８８.７％）、球菌出現検体では２１検体が一致している（精度８０.１％）。 また、合計すると、７６検体の内、６８検体について判定が一致している（精度８６.１％）。従って、この発明は８０％以上の判定精度を有するといえる。
【００７１】
図９は図５の手順の変形例を示すフローチャートであり、図５のステップＳ６においてＰ＜Ａの場合のみの手順を変更し、その他の手順は図５と同等としたものである。
【００７２】
つまり、図９に示すフローチャートにおいて判定部１４４は、Ｐ＜Ａの場合、パラメータＰを、Ａより小さい所定値Ｂ（例えばＢ＝０.６０）と比較する（ステップＳ６ａ）。Ｐ＜Ｂの場合（ステップＳ６ｂ）には検体に含まれる粒子は桿菌と判定され（ステップＳ８）、Ａ＞Ｐ≧Ｂの場合には判定困難と判定される（ステップＳ６ｂ，Ｓ６ｃ）。
【００７３】
これらの判定結果に応じた画面が、液晶タッチパネル１１に出力される（ステップＳ９）。また液晶タッチパネル１１には、ステップＳ２で作成されたスキャッタグラムや、ステップＳ３で計数された細菌数も併せて出力される。液晶タッチパネル１１に出力された画面の例を図１７に示す。二次元スキャッタグラム、菌種の判定結果、菌数が表示されている。菌種の判定結果を示す欄では、「桿菌」、「球菌」、「判定困難」のうち「判定困難」に印がついており、この検体は菌種の判定が困難であったことを示している。
【００７４】
図９に示すフローチャートのステップＳ６ｂでＡ＞Ｐ≧Ｂの場合、図１７のように球菌・桿菌いずれの菌種かを判定せず、単に判定困難である旨を出力してもよいが、球菌・桿菌いずれかの菌種の存在を示唆しつつ、示唆していない方の種類の菌も多く存在する可能性がある旨を警告するよう出力してもよい。
【００７５】
【発明の効果】
この発明によれば、細菌の大きさ情報と蛍光情報によって作成したスキャッタグラムの分布状態から、検体中の細菌が桿菌であるか球菌であるかを判定することができる。細菌の培養を必要とせずにきわめて能率よく菌種を判定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の自動細菌測定装置の斜視図である。
【図２】図１に示す装置の試料調製部を示す斜視図である。
【図３】この発明に係る検出部の光学系と流体系を示す説明図である。
【図４】この発明に係る分析制御部を示すブロック図である。
【図５】この発明の動作を示すフローチャートである。
【図６】この発明におけるスキャッタグラムの一例を示す図である。
【図７】この発明におけるスキャッタグラムの他の例を示す図である。
【図８】この発明に係る単位ベクトルの説明図である。
【図９】図５に示すフローチャートの変形例を示すフローチャートである。
【図１０】この発明の判定精度を示す説明図である。
【図１１】この発明における各種スキャッタグラムの例を示す図である。
【図１２】この発明における図１１に基づく菌種判定結果を示す説明図である。
【図１３】この発明における各種スキャッタグラムの例を示す図である。
【図１４】この発明における図１３に基づく菌種判定結果を示す説明図である。
【図１５】この発明の自動細菌測定装置の全体制御を示すフローチャートである。
【図１６】この発明の自動細菌測定装置が表示出力した画面の一例を示す説明図である。
【図１７】この発明の自動細菌測定装置が表示出力した画面の一例を示す説明図である。
【符号の説明】
１ 自動細菌測定装置
１１ 液晶タッチパネル
１２ 検体セット部カバー
１３ 試薬セット部カバー
１４ スタートスイッチ
１０１ バルブ
１０２ バルブ
１０５ バルブ
１０７ シースフローセル
１０９ シース液容器
１１０ シース液供給口
１１１ オリフィス
１１３ ノズル
１１４ 排液口
１１７ レーザ光源
１１８ コンデンサレンズ
１１９ ビームストッパー
１２０ コンタクトレンズ
１２１ ピンホール
１２２ ダイクロイックミラー
１２３ フィルター
１２４ ホトマルチプライヤチューブ
１２５ ホトダイオード
１３０ 遮光板
１３３ シリンジポンプ
１３９ 流路
１４７ 陽圧ポンプ
１４８ 陰圧ポンプ
２００ 試料調製部
３００ 検出部
４００ 分析制御部
Claims (10)
- 検体中の細菌を蛍光染色して試料を調製し、調製した試料中の各細菌から細菌の大きさ情報と、細菌の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報とを検出し、検出された大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとするスキャッタグラムを作成し、スキャッタグラム上の細菌の分布状態を解析し、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する細菌測定方法。
- 細菌の分布状態を解析する工程は、分布状態の傾きを求める工程を備え、判定する工程は、前記求めた分布状態の傾きに基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する工程からなる請求項１に記載の細菌測定方法。
- 分布状態の傾きを求める工程は、細菌の分布における分散の中心点を通り分散が最大となる方向ベクトルを求め、方向ベクトルの傾きを求めて分布状態の傾きとする、請求項２に記載の細菌測定方法。
- 蛍光染色した試料をサンプリングするサンプリング部と、
サンプリングした試料中の各粒子から、粒子の大きさ情報を検出する大きさ情報検出器と、粒子の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報を検出する蛍光情報検出器と、を備えた検出部と、
大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとした粒子のスキャッタグラムを作成するスキャッタグラム作成部と、
スキャッタグラムから細菌の分布状態を解析する解析部と、
解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する判定部とからなる細菌測定装置。 - 解析部は分布状態の傾きを求め、判定部は前記解析部が求めた分布状態の傾きに基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する請求項４に記載の細菌測定装置。
- 解析部は、細菌の分布における分布の中心点を通り分散が最大となる方向ベクトルを求め、方向ベクトルの傾きを求めて分布状態の傾きとする、請求項５に記載の細菌測定装置。
- 検体をセットする検体セット部と、
蛍光染色試薬をセットする試薬セット部と、
検体と蛍光染色試薬を反応させ試料を調製する反応部と、
調製した試料中の各粒子から、粒子の大きさ情報を検出する大きさ情報検出器と、粒子の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報を検出する蛍光情報検出器と、を備えた検出部と、
大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとした粒子のスキャッタグラムを作成するスキャッタグラム作成部と、
スキャッタグラムから細菌の分布状態を解析する解析部と、
解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する判定部とからなる細菌測定装置。 - 判定部の判定結果に応じた出力を行なうための出力部をさらに備える請求項７に記載の細菌測定装置。
- 検体中の細菌を蛍光染色して調製した試料中の各細菌から、細菌の大きさ情報と、細菌の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報とを検出し、大きさ情報と蛍光情報とをパラメータとするスキャッタグラムを作成する装置において、スキャッタグラム上の細菌の分布状態を解析し、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定する手順をコンピュータに実行させるプログラム。
- 検体中の細菌を蛍光染色して試料を調製し、調製した試料中の各細菌から細菌の大きさ情報と、細菌の発する蛍光の強度を表わす蛍光情報とを検出し、検出された大きさ情報と蛍光情報とを解析し、解析結果に基づいて検体中の細菌の種類が桿菌であるか球菌であるかを判定し、判定結果と、大きさ情報と蛍光情報をパラメータとするスキャッタグラムと、を表示する、細菌測定方法。
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