JP3783808B2

JP3783808B2 - 白血球分類計数用試薬

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Publication number: JP3783808B2
Application number: JP12847297A
Authority: JP
Inventors: 利洋水上; 宗孝石山; 孝坂田
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1997-05-19
Filing date: 1997-05-19
Publication date: 2006-06-07
Anticipated expiration: 2017-05-19
Also published as: JPH10319010A; SA01220457A; EP0882983B1; US6004816A; DE69829606D1; EP0882983A3; EP0882983A2; DE69829606T2

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はフローサイトメトリーによる白血球の分類計数用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の分野においては、白血球の分類計数を行うことにより、疾患の診断を行う上で極めて有用な情報を得ることができる。例えば、通常、正常な末梢血液中の白血球には、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球の５つの正常白血球が一定の比率で存在する。疾患の存在により、これらの白血球の比率は変動することがあり、これらの正常白血球を分類計数する事により各白血球の比率を測定することは疾患の存在についての情報を得るうえで有用である。
【０００３】
また、一方、疾患によっては、これらの正常白血球以外に、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球などの幼若顆粒球、赤芽球、などの通常骨髄内に存在し末梢血には存在しない幼若白血球や幼若赤血球が末梢血中に出現することがある。さらに、リンパ芽球、異形リンパ球、異常リンパ球等の異常白血球が出現することもある。これらの細胞の出現を検出、さらに、分類計数する事も疾患の診断において極めて有用である。
【０００４】
従来、白血球分類を行うには、血液の塗抹標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら分類計数するのが一般的であった。一方、近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動白血球分類計数装置が提供されている。しかしながら、これらの装置は、正常な白血球を高精度に分類することはできるが、上述の幼若白血球などの異常細胞の分類計数を、正常白血球を分類計数するのと同時に行う事はできなかった。
【０００５】
例えば、ＲＦ／ＤＣ測定原理を用いて幼若白血球の出現を高精度に検出する試薬および方法が提供されている（特開平６−２７３４１３号）。前記公報の方法は、特定の条件下では正常白血球よりも幼若白血球の方が破壊されにくいという性質を利用して電気的に測定を行うものである。また、散乱光情報によって測定できることも示唆されている。しかし、この方法は幼若白血球の検出のみを目的としており、幼若白血球の検出においては優れた性能を有するが、幼若白血球の測定と同時に正常白血球を分類計数することはできない。正常な白血球を分類計数するには別途、他の方法で行う必要がある。
【０００６】
また、これとは別に蛍光測定原理を用いて白血球を４分類すると同時に種々の幼若白血球を分類計数する方法が提供されている（特開平６−２０７９４２号）。この方法は、正常白血球を同時に４分類しかできず、好塩基球を測定するためには別途、他の方法で行う必要がある。また、複数の蛍光信号を測定する必要があり装置が複雑で高価になるという問題もある。
【０００７】
さらに、白血球を５分類すると同時に種々の幼若白血球を分類計数する方法が提供されている（特開平５−３４２５１号）。この方法では、白血球の５分類を行うために複雑な検出器が必要であり、また、２つの蛍光情報が必要であり、装置が大型で高価になるという問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡便に高精度で幼若白血球や異常白血球等の異常細胞を分類計数すると同時に、正常白血球の分類計数ならびに、白血球計数を行うことができる試薬を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ある色素を使用することによって、簡便に白血球を少なくとも５分類できることを見出した。すなわち本発明の白血球分類計数用試薬は、以下の構造式を有するＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する色素を少なくとも１つ含むことを特徴とする。
【００１０】
【化４】

（式中、Ｒ₁ 及びＲ ₄ は、水素原子、メチル基、エチル基又は炭素数６〜１８のアルキル基を表し、かつ、いずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基であり、他方が水素原子、メチル基又はエチル基であり；Ｒ₂及びＲ₃は水素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基又はエトキシ基であり；Ｚは硫黄、酸素又はメチル基を有する炭素であり；ｎは０，１又は２であり；Ｘ^-はアニオンである。）
【００１１】
なお、本発明に係る試薬を使用する白血球分類方法は、以下の工程からなる：
１) 血液試料を、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適な状態にする溶血剤と混合する工程、
２) 前記１）で調製した試料と、化４の構造式で表される細胞中のＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する色素と混合することにより血液試料中の有核細胞を蛍光染色する工程：
３) 前記２）で調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する工程、および
４）前記３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて正常な白血球を少なくとも５つに分類計数する工程。
【００１２】
白血球分類方法において使用する血液試料とは、末梢血液、骨髄液、尿、アフェレーシスで採取した血液試料など、白血球を含む体液試料をいう。
【００１３】
異常細胞とは、通常骨髄中に存在し、末梢血液には存在しない幼若細胞、例えば、骨髄芽球（Ｂｌａｓｔ）、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球などの幼若顆粒球（IG）等の幼若白血球、さらには異形リンパ球(Ａ−Ｌｙｍｐｈ)、リンパ芽球（Ｌ−Ｂｌａｓｔ）、異常好中球（Ａｂ−Ｎｅｕｔ）等の異常白血球、および赤芽球（ＮＲＢＣ）等の通常末梢血に存在しない細胞をいう。
【００１４】
白血球分類方法において、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適な状態にする溶血剤と混合する工程とは、血液試料を適当な溶血剤と混合する工程である。
【００１５】
本工程の目的は、測定対象とする白血球細胞の細胞膜に少なくとも色素分子が透過するのに十分な細孔をあけるだけである。この目的に使用する溶血剤は、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤、少なくとも一つのノニオン性界面活性剤、ｐＨを一定に保つための緩衝剤を含むｐＨ4.5 - 11.0、好ましくはｐＨ5.0 - 10.0の水溶液である。
【００１６】
カチオン性界面活性剤としては、４級アンモニウム塩型界面活性剤又はピリジニウム塩型界面活性剤が好ましい。４級アンモニウム塩型およびピリジニウム塩型界面活性剤は、
【化６】

〔Ｒ₁は炭素数６〜１８のアルキル又はアルケニル基、Ｒ₂およびＲ₃は炭素数１〜４のアルキル又はアルケニル基、Ｒ₄は炭素数１〜４のアルキルおよびアルケニル基又はベンジル基、Ｘはハロゲン原子である。〕で表される全炭素数９〜３０の界面活性剤が挙げられる。Ｒ₁の炭素数６〜１８のアルキル又はアルケニル基としてはへキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等を挙げることができるが、とりわけオクチル、デシル、ドデシル等の直鎖のアルキル基が好ましい。また、Ｒ₂およびＲ₃の炭素数１〜４のアルキル、アルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。さらに、Ｒ₄の炭素数１〜４のアルキルおよびアルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。
【００１７】
ノニオン性界面活性剤としては以下の式のポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい：
Ｒ₁−Ｒ₂−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−Ｈ
〔式中、Ｒ₁は炭素数８〜２５のアルキル、アルケニル又はアルキニル基；Ｒ₂はＯ、
【化７】

またはＣＯＯ；ｎは１０〜５０の整数を表す。〕
【００１８】
溶血剤の組成は特に限定されるものではないが、例えば、特開平６−２０７９４２号、特開平７−１８１１７７号に記載の溶血剤等が好適に使用できる。
【００１９】
さらに、溶血剤中に少なくとも１つの、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくはその塩を含有することは、白血球の散乱光強度分布を、分類により好適なように調整するために好適である。
【００２０】
例えば、安息香酸、フタル酸、馬尿酸、サリチル酸、p-アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸もしくはその塩などが好適に使用できる。これらの有機酸を含有することにより、特に好酸球の散乱光強度が増加し、結果として、好中球と好酸球の分離が改善される。例えば、実質的に側方散乱光のみを用いて白血球の４分画が可能となる。
【００２１】
溶血剤のｐＨは4.5 - 11.0、好ましくは5.0 - 10.0であり、ｐＨを一定に保つために例えば、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩などの緩衝剤を含む。なお、前述の酸が緩衝剤として作用する場合には、緩衝剤は必ずしも必要な成分ではない。ｐＨが低すぎる場合、好酸球、好塩基球の分離が悪くなり、正常白血球を５分画することが困難になる。しかしながら、正常白血球を３分画（リンパ球、単球、顆粒球）並びに幼若白血球、異常白血球を分類計数する事は可能である。
【００２２】
ｐＨが高すぎる場合は白血球が損傷を受けやすくなり、好ましくない。
【００２３】
細胞中のＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する色素としては、ＲＮＡの存在しない環境では蛍光強度が低く、ＲＮＡと結合することによって蛍光強度の増加する色素が使用できる。
【００２４】
大部分の幼若白血球や異常白血球等の異常細胞は、正常な白血球に比べ、ＲＮＡを豊富に含有する。これは、例えば幼若白血球では、成熟途中の細胞であるために、細胞成熟に伴う種々の生産活動（タンパク質合成等）をおこなっており、そのためにＲＮＡが豊富に存在すると考えられる。
【００２５】
本発明の白血球分類計数用試薬には以下の色素が含まれている：
【化８】

（式中、Ｒ₁ 及びＲ ₄ は、水素原子、メチル基、エチル基又は炭素数６〜１８のアルキル基を表し、かつ、いずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基であり、他方が水素原子、メチル基又はエチル基であり；Ｒ₂及びＲ₃は水素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基又はエトキシ基であり；Ｚは硫黄、酸素又はメチル基を有する炭素であり；ｎは０，１又は２であり；Ｘ^-はアニオンである。）
【００２６】
上記色素は、ＲＮＡと結合することにより、著しく蛍光強度の増加する性質を有する。
【００２７】
さらに予期せぬことに、これらの色素を使用することにより、好塩基球を同時に分類することが可能となった。
【００２８】
上述したように、これらの色素はＲＮＡに結合した場合に蛍光強度が増加する（特異性がある）。
【００２９】
ＤＮＡに対して特異性を有する場合でも使用可能であるが、ＲＮＡからの蛍光信号に、ＤＮＡからの蛍光信号が重畳され、正常白血球と幼若白血球、異常白血球との間の蛍光強度差が小さくなる傾向がある。従って本発明の目的には、ＤＮＡとの親和性（特異性）の低いものが用いられる。
【００３０】
本発明においては、ＤＮＡとの結合の影響を少なくし、ＲＮＡに対する特異性を高めるために、Ｒ₁あるいはＲ₄のいずれか一方が長鎖の（炭素数６〜１８の）アルキル基であり、他方が水素原子、メチル基又はエチル基である色素を合成し、正常および異常白血球の分類計数に使用した。
【００３１】
その結果、上記の色素は、作用機序は明確ではないが、一個の長鎖アルキル基（一個の炭素数６〜１８のアルキル基）を分子構造内に有するために細胞核膜を透過できない、あるいは、立体障害のためにＤＮＡ分子への結合が阻害されるため、ＤＮＡに起因する蛍光増加が少なく、よりＲＮＡ主体の蛍光を測定できるという利点があることが判明した。これによって、幼若白血球や異常白血球等の異常細胞と正常白血球の分離が著しく改善される。
【００３２】
炭素数６〜１８の長鎖アルキル基の鎖長（炭素数）は長いほどＤＮＡに起因する蛍光強度増加が抑制され、ＲＮＡ特異性が高まるが、一方、分子が疎水性になる傾向があり、水に難溶となって、使用不可能ではないが、取り扱いが難しくなる。これらの点を勘案すると、Ｒ₁もしくはＲ₄のいずれか一方のアルキル基の炭素数が６、８、１０の色素が特に好適である。
【００３３】
Ｒ₂およびＲ₃は、メチル基、メトキシ基、エチル基、エトキシ基である。
【００３４】
Ｘ^-として好適なアニオンにはＦ^-、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-、Ｉ^-等のハロゲンイオン、およびＣＦ₃ＳＯ₃ ^-、ＢＦ₄ ^-などを含む。
【００３５】
Ｚとしては、硫黄原子、酸素原子、あるいはメチル基で置換されている炭素原子である。
【００３６】
色素の濃度は使用する色素により異なるが、一般に0.001 - 1000 ppm、好ましくは0.01 - 100 ppm、さらに好ましくは0.1 - 10 ppmである。なお、この濃度は白血球分類計数試薬中の濃度であり、染色液と溶血剤を別々にする場合には、染色液と溶血剤とを混合した状態での濃度である。
【００３７】
本発明の白血球分類計数試薬は上記色素をエチレングリコール、メタノール、ＤＭＳＯなどの水溶性有機溶媒に溶解して染色液として保存し、血液試料と溶血剤とを混合して調製した試料に使用時に加えることができる。あるいは、溶血剤中に混合して１液構成の試薬とすることも可能である。
【００３８】
このようにして調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する。
【００３９】
本明細書でいう散乱光とは、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光であり、側方散乱光、前方低角散乱光（受光角度０〜５度付近）、前方高角散乱光（５〜２０度付近）等をいい、白血球の大きさもしくは内部構造情報を反映する散乱角度が選ばれる。このうち側方散乱光がもっとも好適である。
【００４０】
また、散乱光を１つ以上使用することにより、より分類精度をあげることができる。
【００４１】
特に、前方低角散乱光を使用すると、細胞の大きさに関する情報が得られるため、例えば、Hairy Cell Leukemia等の大きさのみが変わって、ＲＮＡ量の増加しない異常球の検出にも本発明を用いることができ、有用である。
【００４２】
なお、前方高角散乱光を使用した場合、前方低角散乱光と側方散乱光の中間の情報が得られる。つまり、細胞の大きさ情報と細胞の内部構造情報の両方を含む情報が得られる。
【００４３】
蛍光は、ＲＮＡ，ＤＮＡ等の細胞成分と結合した色素から発せられるもので、使用する色素によって好適な受光波長が選択される。
【００４４】
フローサイトメータの光源は、特に限定されず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、アルゴンイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半導体レーザ、水銀アークランプなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べ非常に安価かつ小型であり、装置コストを大幅に下げることができ、さらに小型化できるため、好適である。
【００４５】
「測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて正常な白血球を少なくとも５つに分類計数する工程」とは、（１）例えばＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラム（２次元分布図）を描いた場合、例えば、図１に示すように、各白血球細胞は各細胞毎に集団を形成する；そして（２）この集団を、適当な解析ソフトで解析することにより、各白血球細胞の数と割合を算出する、工程をいう。例えば、各細胞集団を囲むウインドウを設け、その中の細胞数を算出することにより、各白血球細胞の数と割合を算出することができる。
【００４６】
本発明の試薬を用いると、正常な白血球を少なくとも５つに分類計数できるのみでなく、異常細胞の分類計数を同時に行うことができる。本発明の試薬で分類計数するのに適した異常細胞は、正常細胞よりもRNA量の増加した細胞であり、例えば幼若顆粒球、骨髄芽球、赤芽球及び異形リンパ球から選択される１つ以上である。
【００４７】
本発明に係る試薬を用いて、以下の白血球分類計数試薬キットを提供することができる。すなわち、
１) 血液試料を、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適な状態にする溶血剤、及び
２）化４の構造式で表されるＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する色素を少なくとも１つ含むことを特徴とする染色液
よりなる試薬キットを提供することができる。
【００４８】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、従って、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００４９】
なお、添付の各図において、以下の略号はそれぞれ次の物を意味する。
Lymph：リンパ球 Eo：好酸球
Mono：単球 Baso：好塩基球
Neut：好中球 WBC：白血球
IG：用若顆粒球 Blast：骨髄芽球
NRBC：赤芽球 A-Lymph：異形白血球
【００５０】
【実施例】
実施例１色素化合物Ａの合成
色素化合物Ａ（Ｒ₁=メチル，Ｒ₂=Ｒ₃=Ｈ，Ｒ₄=ｎ-オクチル，ｎ=１，Ｚ=Ｓ，X=ＣＦ₃ＳＯ₃ ^-）を以下のようにして製造した。
【００５１】
３−メチル−２−メチルベンゾチアゾリウムメタンサルフェート１当量と、Ｎ,Ｎ−ジフェニルホルムアミジン３当量を酢酸中で、９０℃の油浴上で１．５時間加熱撹拌した。反応液をヘキサンにあけ、赤色油状物をさらにヘキサンで懸濁洗浄し、酢酸を除いた。粗生成物を酢酸エチルーヘキサンで再結晶した（収率４８％）。これに１−オクチルレピジニウムトリフレート１当量とピリジンを加え、９０℃の油浴上で3時間加熱撹拌した。反応液を濃縮し、残った青色粗製物をフラッシュクロマトグラフィーにてメタノール−クロロホルムで精製した（収率６２％）。
【００５２】
濃暗青色粉末の色素化合物Ａ（Ｒ₁=メチル，Ｒ₂=Ｒ₃=Ｈ，Ｒ₄=ｎ-オクチル，ｎ=１，Ｚ=Ｓ，Ｘ=ＣＦ₃ＳＯ₃ ^-）を得た。
ＴＬＣ（シリカゲル、１０％メタノール-塩化メチレン）：Ｒf=０．５
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ（ＴＭＳ）：0.88(t,3H) 1.28(bＲ,10H) 1.64(s,2H) 1.82(bＲ,2H) 3.60(s,3H) 4.23(t,2H) 6.35(d,1H) 6.82〜7.26(m,2H) 7.39〜7.90(m,6H) 8.10〜8.26(dd,2H)
IＲ(cm^-1)：1625,1560,1540,1520,1480,1460,1410,1400,1310,1260,1210,1150,1130,740,640
ＭＡＳＳ（ＦＡＢｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｍ／ｚ＝４２９
ＴＬＣ９５．７％（１０％メタノール−塩化メチレン）
極大吸収スペクトル６２９ｎｍ（メタノール）
【００５３】
実施例２色素化合物Ｂの合成
色素化合物Ｂ（Ｒ₁=へキシル、Ｒ₂=Ｒ₃=Ｈ、Ｒ₄=メチル、ｎ=1、Ｚ=Ｓ、Ｘ=ＣＦ₃ＳＯ₃ ^-）を以下のようにして製造した。
【００５４】
３−へキシル−２−メチルベンゾチアゾリウムトリフレート１当量と、Ｎ,Ｎ−ジフェニルホルムアミジン４当量を酢酸中で、９０℃の油浴上で１０時間加熱撹拌した。反応液を濃縮し、残った粗製物をフラッシュクロマトグラフィーにてヘキサン−酢酸エチルで精製した（収率２７％）。これにヨウ化１−メチルレピジニウム１．３当量とピリジンを加え、９０℃の油浴上で３時間加熱撹拌した。反応液を濃縮し、残った青色粗製物をフラッシュクロマトグラフィーにてメタノール−クロロホルムで精製した（収率７５％）。
【００５５】
濃暗青色粉末の色素化合物Ｂ（Ｒ₁=へキシル，Ｒ₂=Ｒ₃=Ｈ，Ｒ₄=メチル，ｎ=1，Ｚ=Ｓ，Ｘ=ＣＦ₃ＳＯ₃ ^-）を得た。
ＴＬＣ（シリカゲル、１０％メタノール-塩化メチレン）：Ｒf=０．５
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ（ＴＭＳ）：0.90(t,3H) 1.17〜1.81(m,12H) 4.12(s,3H) 6.50(m,1H) 6.96〜8.26(m,10H)
IＲ(cm^-1)；1620,1560,1530,1510,1480,1460,1410,1380,1310,1250,1210,1150,1100,750,640
ＭＡＳＳ（ＦＡＢｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｍ／ｚ＝４０１
ＴＬＣ９３．０％（１０％メタノール−塩化メチレン）
極大吸収スペクトル６２９ｎｍ（メタノール）
【００５６】
実施例３白血球分類計数試薬組成例
以下の組成の試薬を調製した。

【００５７】
上記試薬１．０ｍｌに抗凝固剤処理した健常人の血液３０μｌを加え、３５℃で４０秒間反応させたのちフローサイトメータ（ＦＣＭ）で、側方散乱光、前方低角散乱光、蛍光を測定した。
【００５８】
光源は６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光（赤蛍光）を測定した。
【００５９】
図１にＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを示す。
【００６０】
図２にＸ軸に前方低角散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを示す。
【００６１】
白血球はリンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球の５つの集団に分かれる。
【００６２】
参考までに図３に、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとったスキャッタグラムを、図４に側方散乱光強度のヒストグラムを示す。白血球はリンパ球、単球、好中球、好酸球の４つの集団に分かれる。
【００６３】
各々の集団にウインドウを設けウィンドウ内の細胞数の計数、細胞比率の算出を行う。
【００６４】
図５〜９に従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と本法（図１）との白血球分類の相関図を示す。
【００６５】
図１０に従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と本法（図１）との白血球数の相関図を示す。いずれの項目も、従来法と良好な相関がある。
【００６６】
なお、従来法の測定は以下の測定試薬を用い、操作はＳＥ−９０００で全自動で行った：
・白血球数：セルパック−３Ｄ（II）^TM（東亞医用電子）とストマトライザ−ＥＯ（II）^TM（東亞医用電子）の１：１混合物に血液を加えて測定、
・リンパ球及び単球：セルパック−３Ｄ（II）^TM（東亞医用電子）により溶血後、ストマトライザ−３Ｄ（II）^TM（東亞医用電子）を添加して測定、
・好酸球：ストマトライザ−ＥＯ（II）^TM（東亞医用電子）を使用して測定、
・好塩基球：ストマトライザ−ＢＡ（II）^TM（東亞医用電子）を使用して測定、
・好中球：(白血球数)−{(リンパ球数)＋(単球数)＋(好酸球)＋(好塩基数)}により求めた。
【００６７】
実施例４幼若顆粒球、異常白血球の出現した検体の分類計数
実施例３の試薬並びに方法を用いて以下の検体を測定した。
・幼若顆粒球（後骨髄球、骨髄球）の出現した検体（図１１）
従来法（目視）で４．５％、本法で４．０％
・骨髄芽球の出現した検体（図１２）
従来法で８１．５％、本法で８５．１％
・赤芽球の出現した検体（図１３）
従来法で２５％、本法で２１．５％
・異形リンパ球と幼若顆粒球の出現した検体（図１４）
異形リンパ球：従来法で２．０％、本法で１．８９％
幼若顆粒球：従来法で２．０％、本法で２．１７％
【００６８】
いずれの幼若顆粒球、異常白血球も正常白血球と明確に分離され分類計数する事ができる。なお、従来法は塗抹標本をメイーグリュンワルドーギムザ染色法で二重染色し、白血球を顕微鏡（倍率：ｘ１０００）で２００個分類計数した。
【００６９】

【００７０】
上記試薬１．０ｍｌに抗凝固剤処理した血液３０μｌを加え、３５℃で４０秒間反応させたのちＦＣＭで、側方散乱光、蛍光を測定した。測定サンプルは、正常検体、幼若顆粒球の出現した検体を用いた。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を測定した。光源、蛍光受光波長は実施例３に同じである。
【００７１】
図１５−１６にチアゾールブルーを使用した場合のスキャッタグラム、図１７〜１８に色素化合物Ａを使用した場合のスキャッタグラム、図１９〜２０に色素化合物Ｂを使用した場合のスキャッタグラムを示す。
【００７２】
Ｒ₁およびＲ₄の両方が、エチル基のような低級アルキル基の場合には正常好中球と幼若顆粒球の弁別は困難であるが、Ｒ ₁ およびＲ ₄ のいずれか一方に炭素数６及び８のような長鎖アルキル基を導入した場合、正常好中球と幼若顆粒球は明確に弁別できる。
【００７３】
実施例６試薬組成例
以下の組成の試薬を調製した。

【００７４】
上記試薬１．０ｍｌに抗凝固剤処理した健常人の血液３０μｌを加え、３５℃で４０秒間反応させたのちＦＣＭで、側方散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光（赤蛍光）を測定した。
【００７５】
図２１に酸類としてクエン酸を使用した場合のスキャッタグラムを、図２２に酸類としてフタル酸を使用した場合のスキャッタグラムを示す。
【００７６】
酸類としてフタル酸（分子構造中に芳香環を有する有機酸）を使用した場合、クエン酸に比べ、好中球と好酸球の分離が改善される。
【００７７】
【発明の効果】
本発明の白血球分類計数用試薬によれば、血液試料を溶血剤と混合し、本発明の色素と混合することにより血液試料中の有核細胞を蛍光染色し、フローサイトメータにより少なくとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光を測定するだけで簡便に高精度で幼若白血球や異常白血球の異常細胞を分類計数すると同時に、正常白血球の分類計数ならびに白血球計数を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３の試薬で測定した健常人の血液試料の側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図２】実施例３の試薬で測定した健常人の血液試料の前方低角散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図３】実施例３の試薬で測定した健常人の血液試料の側方散乱−前方低角散乱スキャッタグラムである。
【図４】実施例３の試薬で測定した健常人の血液試料の側方散乱ヒストグラムである。
【図５】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例３の分類計数法によるリンパ球比率の相関図である。
【図６】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例３の分類計数法による単球比率の相関図である。
【図７】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例３の分類計数法による好中球比率の相関図である。
【図８】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例３の分類計数法による好酸球比率の相関図である。
【図９】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例３の分類計数法による好塩基球比率の相関図である。
【図１０】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例３の分類計数法による白血球数の相関図である。
【図１１】実施例３の試薬で測定した幼若顆粒球（後骨髄球、骨髄球）の出現した検体の側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図１２】実施例３の試薬で測定した骨髄芽球の出現した検体の側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図１３】実施例３の試薬で測定した赤芽球の出現した検体の側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図１４】実施例３の試薬で測定した異形リンパ球と幼若顆粒球の出現した検体の側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図１５】実施例５において色素としてチアゾールブルーを使用して正常検体を測定した場合の側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図１６】実施例５において色素としてチアゾールブルーを使用して幼若顆粒球の出現した検体を測定した場合の側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図１７】実施例５において色素として色素化合物Ａを使用して正常検体を測定した場合の側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図１８】実施例５において色素として色素化合物Ａを使用して幼若顆粒球の出現した検体を測定した場合の側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図１９】実施例５において色素として色素化合物Ｂを使用して正常検体を測定した場合の側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図２０】実施例５において色素として色素化合物Ｂを使用して幼若顆粒球の出現した検体を測定した場合の側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図２１】実施例６において酸類としてクエン酸を使用して健常人の血液試料を測定した場合の側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図２２】実施例６において酸類としてフタル酸を使用して健常人の血液試料を測定した場合の側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。

Claims

以下の構造式で表されるＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する色素を少なくとも１つ含むことを特徴とする白血球分類計数用試薬：

（式中、Ｒ₁ 及びＲ ₄ は、水素原子、メチル基、エチル基又は炭素数６〜１８のアルキル基を表し、かつ、いずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基であり、他方が水素原子、メチル基又はエチル基であり；Ｒ₂及びＲ₃は水素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基又はエトキシ基であり；Ｚは硫黄、酸素又はメチル基を有する炭素であり；ｎは０，１又は２であり；Ｘ^-はアニオンである。）