JP3048260B2 - 白血球分類計数用試料調製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、臨床検査分野におけ
る血球の分類計数に用いる測定用試料の調製方法に関す
るものであり、さらに詳しくはフローサイトメーターを
用いて血球を光学的あるいは光学と電気的に測定し、白
血球を分類計数するための測定用試料の調製方法に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】通常、健常人の末梢血液は、リンパ球、
単球、好中球、好酸球、好塩基球の５種類の白血球を含
む。

【０００３】これらの白血球は、各々その機能が異なっ
ており、末梢血液中の白血球を種類別に分類計数するこ
とは、種々の病気を診断するうえで有用である。

【０００４】一方、白血病、溶血性貧血、癌などの疾患
患者の末梢血液には、この５種類以外に、通常骨髄に存
在し、末梢血液中には存在しない幼若顆粒球、芽球、赤
芽球が出現することが知られている。以下この３つの細
胞を異常球とよぶ。この異常球を検出し、分類計数する
ことは、疾患を診断するうえで極めて重要である。

【０００５】白血球を分類計数するために、従来より最
も良く実施されている方法は、血液像鑑定（用手法、視
算法）と呼ばれる方法である。この方法は、血液をスラ
イドグラス上に塗抹し、血液を固定染色した標本を作製
したのち、顕微鏡で観察し、１つ１つの白血球の形態的
特徴や染色度合いから観察者が何れの血球であるかを判
定し、分類計数する方法である。通常の検査室では、１
００−２００個の白血球を分類計数し白血球全体の数の
中に占める各々の白血球の百分率を分類計数値としてい
る。この方法は、標本作製操作が煩雑であること、顕微
鏡を用いた分類は熟練を必要とし測定者間の測定差が少
なからずあること、計数する白血球数が少ないことによ
り大きな統計学的誤差があること、さらに、測定者に大
きな負担を強いる方法である等の問題がある。

【０００６】この為、多数の白血球を自動的に分類計数
することにより、測定精度を高め、省力化を図る測定方
法が強く求められている。近年、この問題を解決するた
めに、フローシステムを用いた自動化装置が市販されて
いる。これらの自動化装置は、測定原理によって主に３
種類の装置に分られる。

【０００７】第１の装置は、主に３系統の溶解剤と３種
類の検出部からなるものであり、第１のステップは、第
１の溶解剤で血液試料中の白血球以外の細胞を溶解し、
残った白血球のＲＦ信号及びＤＣ信号を測定し、その信
号強度差によって白血球をリンパ球、単球、顆粒球の３
つに分類する。

【０００８】第２のステップは、第２の溶解剤で血液試
料中の好酸球以外の細胞を溶解し、残った細胞のＤＣ信
号を測定し、その信号強度差によって好酸球のみを分類
計数する。

【０００９】ここで、ＲＦ信号及びＤＣ信号は次のよう
に説明される。

【００１０】微細孔をはさんで設けられた、電極間に直
流（ＤＣ）電流を供給し、粒子が微細孔を通過する際の
インピーダンス変化に基づき発生した信号をＤＣ信号と
いい、電極間に数＋ＭＨＺの高周波（ＲＦ）電流を供給
し、粒子が微細孔を通過する際のインピーダンス変化に
基づき発生した信号をＲＦ信号という。

【００１１】もちろん、両電流を同時に供給し、ＤＣ信
号とＲＦ信号の両方を検出することができる。

【００１２】第３ステップは、第３の溶解剤で血液試料
中の好塩基球以外の細胞を溶解し、残った細胞のＤＣ信
号測定し、その信号強度差によって好塩基球のみを分類
計数する。最後に第１のステップで求めた顆粒球から、
第２のステップで求めた好酸球と第３のステップでもと
めた好塩基球を減ずることにより、好中球を算出する方
法である。

【００１３】第２の装置は、１系統の試薬系と１種類の
検出部からなるものであり、公開平１−５０２５３３に
詳細が述べられているように、白血球を損なうこと無く
白血球以外の血液を溶解する溶解剤で血液試料を処理し
た後に、ＲＦ、ＤＣ、散乱光の３つの信号を同時に測定
し、各信号を適当に組み合わせることにより、白血球を
５つに分類計数する方法である。

【００１４】第３の装置は、２系統の試薬系と２種類の
検出部からなるものであり、先ず、溶解剤の作用によっ
て血液試料中の白血球以外の血球を溶解し、さらに染色
液によって、ペルオキシターゼ染色を行った後に、各白
血球の吸光度、散乱光信号を測定し、その強度差によっ
て白血球をリンパ球、単球、好中球，好酸球の４つに分
類計数する。次に、もう１系統の好塩基球以外の細胞を
溶解する溶解剤で血液試料を処理したのちに、２種類の
散乱光を測定し、その信号強度差によって好塩基球を分
類計数する方法である。

【００１５】これらの、自動化のための方法はすべて、
前述の用手法の問題を一応解決しており、特に精度の点
では用手法の精度を遙に上回る結果が得られており、臨
床検査の分野においてはほぼ満足のいく性能を有してい
る。

【００１６】しかし、これらの方法は全て、異常球のみ
を特徴的に分類計数する方法を持たないために、異常球
の出現している試料においては分類結果が不正確にな
る、または、異常球の存在そのものを検出できないとい
う問題を有している。市販されている装置においては、
異常球の出現によって生じるスキャッタグラムの異常を
検出し、アブノーマル、あるいはサスペクトフラグ等の
警告を発することにより、測定者に用手法による再検査
を促すようになっており、異常の見逃しを極力減少する
よう努力されている。但し、この場合は検査を再度行う
必要があり、省力化の目的が完全に達成されていないと
いう問題がある。

【００１７】一方、これらの方法とは別に、血液学的試
料に蛍光染色を施した測定用試料中の各々の白血球の蛍
光あるいは、散乱光をフローサイトメーターで測定し、
白血球分類を行う方法が幾つか報告されている。これら
のうち主なものは、特公昭５９−８５３号公報、特開昭
５０−２０８２０号公報、特開昭６３−７０１６６号で
ある。

【００１８】一般に、図１に示すような市販されている
フローサイトメーターで、適当な方法により血液学的試
料から白血球以外の血球成分の影響を除去した測定用試
料を測定した場合、図３に示すようなスキャッタグラム
が得られ、主に側方散乱光の強度差によって、白血球は
リンパ球１′、単球２′、顆粒球３′からなる３つの分
画に分離され、個々の分画を容易に分類計数できること
は、既知の事実である。

【００１９】さらに、前述の蛍光染色法を組み合わせる
ことにより、顆粒球を好酸球、好塩基球、好中球に分画
することも、既に可能である。我々もまた、すでに特開
昭６３−１３４９５８号において、フローサイトメータ
ーを用いて白血球を５つに分類計数するための方法およ
び試薬を開示している。

【００２０】さらに、我々は、特開昭６３−１３４９５
７号において、好酸球を特異的に染色する色素ニュート
ラルレッド好塩基球を特異的に染色する色素アストラゾ
ンオレンジＧを組み合わせることにより、白血球を５分
類する方法を開示している。これら方法においてもま
た、異常球を特異的に検出することはできなかった。

【００２１】ちなみに、異常球を含む全ての白血球をベ
イシックオレンジ（Ｂａｓｉｃ Ｏｒａｎｇｅ）２１で
蛍光染色した。のちに、蛍光顕微鏡をもちいる用手法
で、白血球分類計数を行う方法が米国特許第４，５０
０，５０９号に開示されているが、この方法は、前述し
た用手法の問題を解決しておらず、自動化測定方法を提
供するものではない。

【００２２】

【発明が解決しようとする課題】前述したように、本発
明は、従来の自動化法では実施不可能であった異常球を
特徴的に検出し、異常球を分類計数すること、ならび
に、異常球の分類計数を含む白血球分類を行うためのフ
ローサイトメーター測定用試料の調製方法を提供するこ
とを課題とする。

【００２３】

【課題を解決するための手段】本発明の測定用試料調製
工程は、大きく分けて２つの工程からなる。１つは、血
液学的試料に存在する赤血球の影響を除去して、白血球
の散乱光強度あるいは散乱光強度と細胞体積を正確に測
定出来るようにする工程と、もう１つは、白血球と赤芽
球とを特異的に染色する工程である。

【００２４】通常、血液学的試料中には白血球の１００
０倍程度の個数の赤血球が存在し、フローサイトメータ
ーで測定した散乱光信号においては、リンパ球と赤血球
の信号強度は等価であり、リンパ球と赤血球との分離が
困難であり、正確な白血球分類結果を得ることは困難で
ある。さらに、多量に存在する赤血球は、フローサイト
メーターの検出部において、白血球と同時通過すること
により、白血球の散乱光信号強度を不正確にし、側方散
乱光によるリンパ球、単球、好中球の分離を困難にす
る。また、抵抗式測定原理を用いた装置では多数の赤血
球の存在下で細胞体積を測定することはできない。これ
らの問題を解決するためには、何らかの方法によって血
液学的試料中の赤血球を除去する必要がある。

【００２５】血液学的試料中に存在する赤血球の影響を
除去する工程は、以下の工程からなる。白血球染色に影
響を与えることなく赤血球を溶解する工程であって、以
下の工程で血液学的試料を処理する。まず、血液学的試
料を酸性の低浸透圧条件下におくことにより、赤血球は
ゴースト化され、次いで、断片化される。赤血球の断片
化が終了した時点で、ｐＨ、浸透圧を白血球に損傷を与
えない条件にすることにより、白血球に損傷を与えるこ
と無く赤血球を断片化することができる。この結果赤血
球散乱光強度は、リンパ球の１／２〜１／３となり、事
実上赤血球と白血球の同時通過は、無視しうるものとな
り、フローサイトメーターによる散乱光の測定は正確に
行える。

【００２６】一方、血液学的試料中の芽球を測定するた
めには、抵抗式検出原理による細胞体積の測定を正確に
行う必要がある。断片化しただけの赤血球は、白血球と
同時通過して、白血球の細胞体積を不正確なものにす
る。この影響を除去するためには、断片化した赤血球を
さらに小さくする必要がある。このために、断片化した
赤血球のみを溶解するノニオン性界面活性剤によって断
片化した赤血球を溶解する工程を加える。

【００２７】次に白血球と赤芽球を染色する工程は、４
つの色素の作用によって説明される。先ず、本発明独自
の特異染色は、３つの色素の作用によって説明される。
まず、アストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッド
の共存下で、血液学的試料を蛍光染色した場合、アスト
ラゾンイエロー３Ｇは好塩基球と幼若顆粒球のみを特異
的に蛍光染色する。好酸球はニュートラルレッドによっ
て特異的に赤蛍光染色される。

【００２８】損傷を受けた細胞の核のみを染色する第３
の蛍光色素は、上述の赤血球を断片化する工程によっ
て、細胞膜が溶解されほとんど核のみの状態になった、
赤芽球の核のみを特異的に染色する。次に、少なくとも
白血球の核と細胞質を染色する色素である第４の色素
は、アストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッドと
第３の色素で染色されない他の白血球を染色し、蛍光強
度の違いにもとづいて、血液学的試料中に存在する他の
細胞との分離を可能とする。

【００２９】また、通常フローサイトメーターによる光
学的パラメーターの測定においては、調製した測定用試
料の電気伝導度を調整する必要はないが、抵抗式測定原
理で細胞体積を測定するためには、測定用試料の電気伝
導度を、抵抗式測定原理で細胞体積を測定するのに適し
た電気伝導度に調整する必要がある。この場合には、水
溶液中でイオンに解離する塩類を適当量添加すればよ
い。

【００３０】なお、ここで細胞体積を測定するのに適し
た電気伝導度とは、５〜２５ｍＳ／ｃｍの範囲にあるこ
とが好適である。さらに好適には、１０〜２０ｍＳ／ｃ
ｍの範囲にあることが望ましい。

【００３１】まず、本発明でいう血液学的試料とは、動
物特にヒトの末梢血液あるいは、骨髄穿刺液等の主に血
液細胞からなる生物学的試料であって、好ましくは、抗
凝固剤処理のなされた静脈採血血液である。上記、血液
学的試料から、適当な方法、例えば、密度勾配遠心法な
どによって白血球以外の血球を除去した血液学的試料も
好適な試料である。リンパ球、単球、好中球、好塩基
球、好酸球は、一般の臨床検査室で行われるロマノフス
キー染色を用いた用手法で同定される細胞と同一であ
る。

【００３２】幼若顆粒球とは、用手法によって同定され
る前骨髄球、骨髄球、後骨髄球からなる群である。また
２つの幼若顆粒球群とは、用手法によって１次顆粒（ア
ズール顆粒）の存在が同定される幼若顆粒球であって、
主に前骨髄球からなる幼若顆粒球群１と、１次顆粒の存
在が殆ど同定されない幼若顆粒球であって、主に骨髄球
と後骨髄球からなる幼若顆粒球群２の２つをいう。

【００３３】赤芽球とは、幼若な赤血球で細胞中に核を
有する赤血球系細胞をいう。

【００３４】芽球とは、リンパ球、単球、顆粒球のもっ
とも幼若な細胞であって、用手法で芽球と判定される細
胞のうち、大きさがリンパ球よりも大きいものをいう。

【００３５】フローサイトメーターとは、図１に示され
るような、少なくとも赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光の３
つ好ましくは前方散乱光を含む４つの光学的情報を測定
できる装置であって、少なくとも４つの光学的情報を用
いて細胞種の解析ができる装置をいう。さらに、細胞の
大きさを測定するためには図２に示すような電気抵抗式
測定原理を搭載することによって細胞体積を同時測定で
きるフローサイトメーターはさらに好適である。

【００３６】本発明の最も好ましい実施態様は、血液学
的試料中の細胞を染色するのに十分な量の （１）少なくとも好塩基球と幼若顆粒球を特異的に染色
する色素であるアストラゾンイエロー３Ｇと、 （２）少なくとも、好酸球を特異的に染色するニュート
ラルレッドと、 （３）細胞膜に損傷を受けた細胞の核を染色する色素
と、 （４）白血球の核あるいは細胞質あるいはその両方を染
色する色素と、 （５）水溶液のｐＨを酸性にするために十分な量の緩衝
剤 からなる低浸透圧の第一の水溶液と血液学的試料を混合
する。赤血球の断片化と、赤芽球の細胞膜の損傷が終了
し、白血球の損傷が起こる前に （６）第一の水溶液中の酸を中和し、さらに、ｐＨを染
色に適したｐＨにするために十分な量の緩衝剤と （７）白血球を損傷することなく保つために浸透圧を調
整するのに十分な量の浸透圧補償剤と （８）断片化した赤血球を溶解するのに十分な量のノニ
オン性界面活性剤を（６）〜（８）からなる第二の水溶
液を添加して赤血球を溶解し、染色を行う。

【００３７】なお、電気抵抗式測定原理による細胞体積
の測定をしない場合は、（８）の成分は、必要な構成要
素ではない。

【００３８】好塩基球と幼若顆粒球を特異的に染色する
のに十分なアストラゾンイエロー３Ｇの量とは、水溶液
中に５０ｍｇ／ｌ以上の濃度である。上限は実験によっ
て１０００ｍｇ／ｌの濃度まで、本発明の効果を得るこ
とができることが確認されているが、これ以上の濃度で
本発明の効果がなくなることを意味するわけではない。

【００３９】好適球を特異的に染色するのに十分なニュ
ートラルレッドの濃度は、水溶液中に１ｍｇ／ｌ以上の
濃度であり、さらに好適には、アストラゾンイエロー３
Ｇの濃度の１／５０〜１／１０の範囲の濃度である。ア
ストラゾンイエロー３Ｇのニュートラルレッドの染色は
競合反応であり、アストラゾンイエロー３Ｇの濃度に比
べ著しく高い濃度のニュートラルレッドの存在はアスト
ラゾンイエロー３Ｇによる幼若顆粒球の特異的染色をも
阻害する。

【００４０】細胞膜に損傷を受けた細胞の核を染色する
色素とは、以下の群の中らか選ばれた少なくとも１つの
蛍光色素である。

【００４１】 （１）エチジウム ブロマイド （２）プロピジウム アイオダイド （３）Ｎ−メチル−４−（１−ピレン）ビニル−ピリジ
ニウム アイオダイド 細胞膜に損傷を受けた細胞の核を染色するのに十分な量
とは、フローサントメーターでの測定において、赤芽球
を他の細胞と分離するのに十分な強度の蛍光を発生させ
るのに十分な量であって、使用する色素によって最適な
濃度がことなり、実験によって最適な濃度が決定され
る。例えばエチジウムブロマイドであれば、１０ｍｇ／
ｌ以上の濃度が好適である。

【００４２】細胞膜に損傷を受けた細胞の核を染色する
色素は上記に記載した３種の色素は、実験によってその
効果が確認されたものであり、これらの色素に限定され
るわけではなく、細胞膜に損傷を受けた細胞の核のみを
染色する色素であれば、使用可能である。

【００４３】白血球の核あるいは細胞質あるいはその両
方を染色する色素とは以下の群の中から選ばれた少なく
とも１つの蛍光色素である。

【００４４】 （１）アストラゾンオレンジＲ （２）アストラバイオレット（ＣＩ Ｎｏ．４８０７
０、Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ１２） （３）ローダミン６Ｇ（ＧＩ Ｎｏ．４５１６０） （４）ローダミン１９ （５）ローダミンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５１７０、Ｂａｓ
ｉｃ Ｖｉｏｌｅｔ １０） （６）ローダミン３ＧＯ（ＣＩ Ｎｏ．４５２１０、Ｂ
ａｓｉｃ Ｒｅｄ ３） （７）ピロニンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５０１０） （８）シアノシン （９）３，３′−ジメチルチオカルボシアニン アイオ
ダイド （１０）３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１１）３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１２）３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１３）３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデ
シルアクリジニウム プロマイド （１４）７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンゾオキサ
ジアゾール （１５）７−フルオロ−４−ニトロベンゾオキサジアゾ
ール （１６）アストラゾンレッド６Ｂ（ＣＩ Ｎｏ．４８０
２０、Ｂａｓｉｃ Ｖｉｏｌｅｔ ７） 白血球の核あるいは細胞質あるいはその両方を染色する
のに十分な量とは、フローサイトメーターでの測定にお
いて、白血球を他の細胞と分離するのに十分な強度の蛍
光を発生させるのに十分な量であって、使用する色素に
よって最適な濃度がことなり、実験によって最適な濃度
が決定される。例えばアストラゾンオレンジＲであれ
ば、１００ｍｇ／ｌ以上の濃度が好適に使用される。上
記の１６種類の色素は、我々が実験においてその効果を
確認した色素であってこれら以外の色素の効果を否定す
るものではない。前述の条件を満たす色素であれば、使
用可能である。

【００４５】第一液の酸性とは、ｐＨ２．０−４．０が
好適であり、さらに好適には２．０−３．５である。第
一液で用いられる緩衝剤は特に限定されず、酸解離定数
ｐＫａ３．０±２．０の緩衝剤が好適に使用される。緩
衝剤の濃度は混合物のｐＨを２．０−４．０の範囲に維
持するのに必要な量であり、好適には、５−５０ｍＭ／
ｌの濃度である。

【００４６】ｐＨが２．０以下になった場合、白血球の
染色は、明らかに妨げられる、またｐＨ４．０以上で
は、赤血球を断片化する作用が明らかに妨げられる。低
浸透圧とは、１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧をいい
浸透圧が１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上では赤血球を断片化
する作用が明らかに妨げられる。

【００４７】赤血球の断片化を完了するのに必要な第一
液と血液学的試料の反応時間は、幾分温度依存性がある
が、室温（１８−２５℃）の場合は、５−２０秒程度で
完了する。濃度が高い場合は幾分短い、温度が低い場合
は幾分長い時間を必要とする。

【００４８】血液学的試料と、第一の水溶液との混合体
積比は特に限定されないが、フローサイトメーターでの
測定において、１：５〜１：２００の混合比率が好適に
使用される。

【００４９】染色に適したｐＨとは、ｐＨ７．０−１
１．０である。さらに好適には、７．５−１０．０であ
る。ｐＨが７．０以下の場合、好塩基球と幼若顆粒球を
特異的に染色する効果が得にくくなる。ｐＨが１１．０
以上の場合、白血球が損傷を受けやすくなる。

【００５０】第二液に用いられる緩衝剤の種類は特に制
限はなく、ｐＫａ（酸解離定数）が９．０±２．０付近
にある緩衝剤が好適に用いられる。緩衝剤種の濃度は特
に限定されないが、通常５〜１００ｍＭ／ｌの濃度が好
適に用いられる。

【００５１】染色を完了するのに必要な時間は、幾分温
度依存性があるが、室温（１８−２５℃）の場合は、１
０−４０秒程度で完了する。温度が高い場合は幾分短
い、温度が低い場合は幾分長い時間を必要とする。

【００５２】白血球の損傷を抑制し、少なくともリンパ
球、単球、好中球を散乱光によって分離するために必要
な形態に保持するためには、混合物の浸透圧が１００〜
５００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内にあることが好適であ
る。さらに好適には、２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの
範囲にあることが好ましい。混合物の浸透圧がこの範囲
を外れる場合には、水溶液に浸透圧補償剤を含むことが
好適である。浸透圧補償剤の種類は、特に限定されない
がアルカリ金属あるいは、糖類など、通常生物学的細胞
を生理的浸透圧に保つための物質が好適に使用される。
また、電気抵抗式の測定原理を搭載したフローサイトメ
ーターで細胞体積を測定するためには、最終的に調製さ
れる測定用試料の電気伝導度を調整することが好適であ
る。通常は、シース液と同一の電気伝導度となるよう
に、調整することが好適である。

【００５３】通常は、第一液あるいは第二液に含まれる
緩衝剤がイオンに解離することによって、適度な電気伝
導度となるため調整は不要である。ただし、水溶液中で
イオンに解離し、水溶液に電気伝導度を付与する塩類を
第二液に添加しておくことによって電気伝導度を細胞体
積を測定するのに好適な値に調整することは、好適に行
われる。使用される塩類は特に限定されないが、アルカ
リ金属塩類が特に好適である。

【００５４】断片化した赤血球を溶解するためのノニオ
ン線界面活性剤とは、分子構造中の親水基にポリオキシ
エレンを有する界面活性剤であって、ポリオキシエチレ
ンの平均重合度が２０以上のものが好適である。さらに
好適には、平均重合度２５以上のものが好適である。平
均重合度２０以下のものは、白血球を損傷する効果があ
り使用は困難である。

【００５５】ノニオン性界面活性剤は、第一の水溶液、
第二の水溶液のいずれか一方または、両方に含むことが
できる。第二の水溶液にのみ含むことは、好適である。

【００５６】本法において用いられる色素の構造は、以
下に示される。

【００５７】アストラゾンイエロー３Ｇ（ＣＩ Ｎｏ．
４８，０５５、ＣＩ Ｂａｓｉｃ Ｙｅｌｌｏｗ １
１）

【００５８】

【００５９】ニュートラルレッド（ＣＩ Ｎｏ．５０，
０４０、ＣＩ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ５）

【００６０】

【００６１】アストラゾンオレンジＲ（ＣＩ Ｎｏ．４
８，０４０、ＣＩ Ｂａｓｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ２２）

【００６２】

【００６３】アストラバイオレット（ＣＩ Ｎｏ．４
８，０７０、Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ １２）

【００６４】

【００６５】ローダミン６Ｇ（ＣＩ Ｎｏ．４５，１６
０）

【００６６】

【００６７】ピロニンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５，０１０）

【００６８】

【００６９】シアノシン

【００７０】

【００７１】３，３′−ジメチルチオカルボシアニン
アイオダイド

【００７２】

【００７３】式（II）中Ｒ₁ ：−ＣＨ₃ Ｒ₂ ：−Ｓ− ３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイオダイド 式（II）中Ｒ₁ ：−Ｃ₂ Ｈ₅ Ｒ₂ ：−Ｓ− ３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン アイオダ
イド 式（II）中Ｒ₁ ：−Ｃ₃ Ｈ₇ Ｒ₂ ：−Ｏ− ３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン アイオダ
イド 式（II）中 Ｒ₁ ：−Ｃ₆ Ｈ₁₃ Ｒ₂ ：−Ｏ− ３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデシルアク
リジニウム ブロマイド

【００７４】

【００７５】７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンゾオ
キサジアゾール

【００７６】

【００７７】７−フルオロ−４−ニトロベンゾオキサジ
アゾール

【００７８】

【００７９】アストラゾンレッド６Ｂ（ＣＩ Ｎｏ．４
８，０２０、ＢａｓｌｃＶｉｏｌｅｔ ７）

【００８０】

【００８１】エチジウムブロマイド

【００８２】

【００８３】プロピジウムアイオダイド

【００８４】

【００８５】Ｎ−メチル−４−（１−ピレン）ビニルピ
リジニウムアイオダイド

【００８６】

【００８７】以下に本発明を実施するために用いられる
フローサイトメーターについて説明する。図１は一般の
フローサイトメーターの構成を図示した概略図である。
１は、フローサイトメーターの光源を示し、少なくとも
アストラゾンイエロー３Ｇと、ニュートラルレッドで染
色された少なくとも好酸球、好塩基球、幼若顆粒球か
ら、特異的な蛍光を励起するのに適した波長の光を放出
する光源であり、波長、４００−５２０ｎｍ付近の光を
放出するアルゴンイオンレーザ、水銀アークランプなど
が好適に用いられる。光源からの光は、レンズ２によっ
て粒子の流領域２０に偏平円形状に集束され、そこを通
過する細胞等の粒子１３に照射される。このとき、粒子
１３からは前方に前方散乱光２１、側方に赤蛍光２２緑
蛍光２３、側方散乱光２４が発せられる。

【００８８】なお、粒子は、ノズル１７から吐出され、
シース液供給口１４から供給されるシース液につつま
れ、フローセル内でシースフローを形成する。前方散乱
光２１はビームストーパー５によって直接光が除去さ
れ、散乱光が集光レンズ４によって光検出部６に送られ
る。

【００８９】側方に発せられた光２２，２３，２４は集
光レンズ３によって集められ、光検出部に送られる。

【００９０】側方散乱光２４はダイクロイックミラー１
０によって反射され光検出部７におくられる。

【００９１】赤蛍光２２はダイクロイックミラー１１に
よって反射され、光検出部８に送られる。

【００９２】緑蛍光２３はダイクロイックミラー１１を
通過し、光検出部９に送られる。

【００９３】光検出部６，７，８，９に送られた光は、
それぞれ電気信号に変換され、信号処理部１５によって
増幅され、解析部１６に送られ、解析される。

【００９４】本発明において前方散乱光とは、検出部を
通過する細胞から光源の放射軸に対して０°に近い狭い
角度で放射された散乱光である。側方散乱光とは、検出
部の細胞から光源の放射軸に対してほぼ９０°方向に放
射された散乱光である。赤蛍光とは検出部の細胞から全
方向に放射される蛍光のうち、波長５６０ｎｍ以上の蛍
光をいう。通常のフローサイトメータでは、装置構成の
都合上光源の放射軸にたいしてほぼ０°あるいはほぼ９
０°の蛍光が集光される。

【００９５】緑蛍光とは検出部の細胞から全方向に放射
される蛍光のうち、波長５２０ｎｍ−５６０ｎｍ付近の
蛍光をいう。通常のフローサイトメータでは、装置構成
の都合上光源の放射軸にたいしてほぼ０°あるいはほぼ
９０°の蛍光が集光される。図２は、本発明の方法に使
用される、光学的信号と電気抵抗式信号を同時に測定可
能とするフローサイトメータの概略図である。光学的信
号検出についての説明は、図１について述べたと同様で
ある。一方、電気抵抗信号の検出については、フローセ
ル１８は電気抵抗式測定を実施する為のオリフィス１８
ａを備えている。光源１から放出される光はレンズ２に
よりオリフィス１８ａの中心付近に集光される。よく知
られている様に、ある大きさの細胞がオリフィス１８ａ
を通過する際、電極２０ａ，２０ｂ間の抵抗値の変化を
測定することにより細胞の正確な体積を測定することが
可能である。本発明においては、電気抵抗式の信号と光
学的信号の検出を同時に行うことを可能にしている。

【００９６】光学的信号の検出と同様に、測定試料はノ
ズル１７からセル１８の中に導入される。また、シース
液供給口１４からシース液が供給され、フローセル１８
では層流状態が形成され粒子１３は１個ずつオリフィス
部１８ａを通過する。この際、電気抵抗式原理に基づい
た信号と光学的信号とが同時に獲得される。

【００９７】電気抵抗式原理で検出された信号は検出部
１９により細胞の体積に比例した高さを持つ電気パルス
信号に変換される。検出部６，７，８，９，１９に検出
された各信号は信号処理部１５により増幅等の処理がな
された後、解析部１６にて所定の解析がなされる。

【００９８】

【実施例】次に具体的な実施例によって、本発明の処理
工程について述べる。この実施例に使用した試薬系は、
一般に市販されている試薬級の化学原料から調製した。

【００９９】実施例１ 組成例１ 試薬第１級 アストラゾンイエロー３Ｇ ３００ｍｇ ニュートラルレッド ２０ｍｇ エチジウムブロマイド ５０ｍｇ アストラゾンオレンジＲ ３００ｍｇ クエン酸−水塩 ２．１０ｇ（ｐＨ２．６２） 精製水 １ｌ （ｐＨ２．６２、浸透圧 約１０ｍＯｓｍ／ｋｇ） 試薬第２液 タウリン ３７．５ｇ ＮａＣｌ ５８．４ｇ ＮａＯＨ １６．０ｇ 精製水 １ｌ 組成例１の試薬第１液０．９０ｍｌと異常球（赤芽球、
幼若顆粒球）の出現した末梢血液０．０５ｍｌを混合し
５秒以上経過した後に、試薬第２液０．１０ｍｌを加え
さらに１０秒以上おくことにより、測定用試料が調製で
きる。白血球の分類計数は、例えば、図１に示すフロー
サイトメーターで個々の細胞の赤蛍光、緑蛍光、側方散
乱光、前方散乱光を測定する。次に、まず、図４に示す
赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラ
ムを描くと、白血球は、赤芽球〔ＮＲＢＣ〕、好酸球
〔Ｅｏ〕その他の白血球〔Ａｌ〕、白血球以外の細胞
〔Ａ２〕の副集団に分離される。全ての白血球をウィン
ド１〔Ｗ１〕によって囲み白血球のみの数を計数し、全
白血球数を計数する。次に、ウィンド２〔Ｗ２〕によっ
て好酸球〔Ｅｏ〕を、ウィンド３〔Ｗ３〕によって赤芽
球〔ＮＲＢＣ〕を囲み細胞数を計数する。ウィンド４
〔Ｗ４〕によってその他の白血球〔Ａ１〕をゲーティン
グして取り出し図５に示すように、側方散乱光強度と緑
あるいは赤蛍光強度のスキャッタグラムを描くと、リン
パ球〔Ｌｙｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕好中球〔Ｎｅｕ
ｔ〕、好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球群１〔Ｉｍ１〕、
幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕は個々にその細胞のみからな
る副集団に分離される。この集団を個々にウィンドで囲
んで計数することによりその数を求め上述の全白血球数
で除算することにより、個々の白血球の比率を求めるこ
とができる。

【０１００】実施例２ 組成例２ 第一の水溶液 アストラゾンイエロー３Ｇ ３００ｍｇ ニュートラルレッド ２０ｍｇ エチジウムブロマイド ５０ｍｇ アストラゾンオレンジＲ ３００ｍｇ クエン酸−水塩 ２．１０ｇ（ｐＨ２．６２） 精製水 １ｌ （ｐＨ２．６２、浸透圧 約１０ｍＯｓｍ／ｋｇ） 試薬第２液 Ｔａｕｒｉｎｅ ３７．５ｇ Ｎａｃｌ ５８．４ｇ ＮａＯＨ １６．０ｇ ポリオキシエチレンセチルエーテル ５０ｇ 精製水 １ｌ 組成例２の試薬第１液０．９０ｍｌと末梢血液０．０５
ｍｌを混合し５秒以上経過した後に、試薬第２液０．１
０ｍｌを加えさらに１０秒以上おくことにより、測定用
試料が調製できる。白血球の分類計数は、例えば、第２
図に示す電気抵抗式測定原理を搭載したフローサイトメ
ーターで個々の細胞の赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光、細
胞体積を測定し、次に、図６に示す、赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描くと白血球
は、赤芽球〔ＮＲＢＣ〕好酸球〔Ｅｏ〕、その他の白血
球〔Ａ３〕の３つに分離される。まずウィンド５〔Ｗ
５〕によって白血球のみを囲んで、白血球数を計数し、
全白血球数を求める。次にウィンド６〔Ｗ６〕よって好
酸球〔Ｅｏ〕を分類計数し、ウィンド７によって赤芽球
〔ＮＲＢＣ〕を分類計数する。ウィンド８〔Ｗ８〕によ
ってその他の白血球〔Ａ３〕をゲーティングして図７に
示すように、側方散乱光強度と緑あるいは赤蛍光強度の
スキャッタグラムを描くと、リンパ球と芽球〔Ｌｙｍ＋
Ｂｌａｓｔ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕ
ｔ〕、好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球群１〔Ｉｍ１〕、
幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕は個々にその細胞の副集団を
形成する。この集団を個々にウィンドで囲んで計数する
ことにより、個々の白血球の数を計数する事が出来る。
リンパ球と芽球は、ウィンド９〔Ｗ９〕によってゲーテ
ィングし、図８に示すように、側方散乱光強度と電気抵
抗式測定原理によって測定した細胞体積を座標軸にして
描くと、リンパ球〔Ｌｙｍ〕と芽球〔Ｂｌａｓｔ〕の２
つの副集団に分離される。個々の細胞をウィンドで囲ん
で、計数することにより、個々の白血球数を求める。個
々に求めた白血球数を全白血球数で除算することによ
り、個々の白血球の比率を求めることができる。

【０１０１】

【発明の効果】１．血液学的試料を本発明の方法で処理
して、フローサイトメータ測定用試料を作製することに
より、幼若顆粒球赤芽球を特異的に染色し、分離するこ
とができる。

【０１０２】この結果１つの測定用試料をフローサイト
メータで測定するだけで少なくとも、白血球を８つに分
類計数する事が可能となる。

【０１０３】２．さらに電気抵抗式測定原理を搭載した
フローサイトメータで測定することにより、芽球を分離
することができる。

【０１０４】この結果１つの測定用試料をフローサイト
メータで測定するだけで、少なくとも白血球を９つに分
類計数する事が出来る。

【図面の簡単な説明】

【図１】一般のフローサイトメータの構成を示した概略
図である。

【図２】本発明の方法に使用される光学的信号と電気抵
抗式信号を同時に測定できるフローサイトメータの概略
図である。

【図３】血液学的試料から白血球以外の血球成分の影響
を除外した測定用試料を一般のフローサイトメータで測
定した場合に得られるスキャッタグラムである。

【図４】実施例１において得られた血液学的試料の赤蛍
光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムで
ある。

【図５】図４の副集団〔Ａ１〕のデータの血液学的試料
の側方散乱光強度と緑あるいは赤蛍光強度のスキャッタ
グラムである。

【図６】実施例２において得られた血液学的試料の赤蛍
光強度と緑蛍光強度とを座標軸とするスキャッタグラム
である。

【図７】図６の副集団〔Ａ３〕のデータの血液学的試料
の側方散乱光強度と緑あるいは赤蛍光強度のスキャッタ
グラムである。

【図８】図７のウインドＷ９から得られたデータの血液
学的試料の側方散乱光強度と電気抵抗式測定原理によっ
て測定した細胞体積とを座標軸とするスキャッタグラム
である。

【符号の説明】

１ 光源 ２ レンズ ３ 集光レンズ ４ 集光レンズ ５ ビームストーパー ６〜９ 光検出部 １０〜１１ ダイクロイックミラー １３ 粒子 １４ 供給口 １５ 信号処理部 １６ 解析部 １７ ノズル １８ フローセル １８ａ オリフィス １９ 検出部 ２０ 粒子の流領域 ２０ａ，ｂ 電極 ２１ 前方散乱光 ２２ 赤蛍光 ２３ 緑蛍光 ２４ 側方散乱光 １′ リンパ球 ２′ 単球 ３′ 顆粒球 〔ＮＲＢＣ〕 赤芽球 〔Ｅｏ〕 好酸球 〔Ａ１〕 好酸球以外の白血球および赤芽球 〔Ａ２〕 白血球以外の細胞 〔Ｗ１〕−〔Ｗ９〕 ウィンド１−９ 〔Ｌｙｍ〕 リンパ球 〔Ｍｏｎｏ〕 単球 〔Ｎｅｕｔ〕 好中球 〔Ｂａ〕 好塩基球 〔Ｉｍ１〕 幼若顆粒球群１ 〔Ｉｍ２〕 幼若顆粒球群２ 〔Ｂｌａｓｔ〕 芽球 〔Ｌｙｍ＋Ｂｌａｓｔｓ〕 リンパ球および芽球

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １つの測定用試料をフローサイトメータ
   で測定することにより、血液学的試料中の白血球を少な
   くとも幼若顆粒球からなる２つの群、赤芽球、好塩基
   球、好酸球、リンパ球、単球、好中球の８つを分類計数
   するための測定用試料を調製するための方法であって、
   以下の工程からなることを特徴とする方法： （１）血液学的試料から白血球の形態を損なうこと無し
   に赤血球の影響を除去する工程と赤芽球の細胞膜に損傷
   を与える工程であって、 ｉ）溶液のｐＨを酸性域に保つための緩衝剤からなる低
   浸透圧の第１の水性溶液と血液学的試料を混合すること
   により、血液学的試料中の赤血球を断片化し、赤芽球の
   膜に損傷を与え、 ii）ｉ）の溶液に、白血球の形態を損なうこと無しに保
   つための浸透圧補償剤と、第１の水性溶液中の酸を中和
   し、染色に適したｐＨにするための緩衝剤からなる第２
   の溶液を添加することからなる工程；および （２）血液学的試料に含まれる白血球を、 ｉ）少なくとも好塩基球と幼若顆粒球を染色する色素で
   あるアストラゾンイエロー３Ｇと ii）少なくとも好酸球を染色する色素であるニュートラ
   ルレッドと iii ）少なくとも白血球の核あるいは細胞質あるいはそ
   の両方を染色する色素と iv）損傷を受けた細胞の核のみを染色する蛍光色素との
   少なくとも４種類の色素で染色する工程。
2. 【請求項２】 少なくとも白血球の細胞質あるいは核を
   染色するための色素が （１）アストラゾンオレンジＲ （２）アストラバイオレット （３）ローダミン６Ｇ （４）ローダミン１９ （５）ローダミンＢ （６）ローダミン３ＧＯ （７）ピロニンＢ （８）シアノシン （９）３，３′−ジメチルチオカルボシアニン アイオ
   ダイド （１０）３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイ
   オダイド （１１）３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン
   アイオダイド （１２）３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン
   アイオダイド （１３）３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデ
   シルアクリジニウム プロマイド （１４）７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンゾオキサ
   ジアゾール （１５）７−フルオロ−４−ニトロベンゾオキサジアゾ
   ール （１６）アストラゾンレッド６Ｂ からなる群の中から選ばれた少なくとも１種類の色素で
   ある請求項１項記載の測定用試料調製方法。
3. 【請求項３】 損傷を受けた細胞の核のみを染色する蛍
   光色素が （１）エチジウムブロマイド （２）プロピジウムアイオダイド （３）Ｎ−メチル−４−（１−ピレン）ビニル−プロピ
   ジウム アイオダイド からなる群の中から選ばれた少なくとも１種類の色素で
   ある請求項１項記載の測定用試料調製方法。
4. 【請求項４】 １つの測定用試料をフローサイトメータ
   で測定することにより、血液学的試料中の白血球を少な
   くとも幼若顆粒球からなる２つの群、赤芽球、芽球、好
   塩基球、好酸球、リンパ球、単球、好中球の９つに分類
   計数するための測定用試料を調製するための方法であっ
   て、以下の工程からなることを特徴とする方法： （１）血液学的試料から白血球の形態を損なうこと無し
   に、赤血球の影響を除去する工程と赤芽球膜に損傷をあ
   たえる工程であって、 ｉ）溶液のｐＨを酸性域に保つための緩衝剤からなる低
   浸透圧の第１の水性溶液と血液学的試料を混合すること
   により、血液学的試料中の赤血球を断片化し、 ii）ｉ）の溶媒に、白血球の形態を損なうこと無しに保
   つための浸透圧補償剤と、第１の水性溶液中の酸を中和
   し、染色に適したｐＨにするための緩衝剤からなる第２
   の溶液を添加し、 iii ）ｉ）あるいはii）において、断片化した赤血球を
   ノニオン性界面活性剤で溶解し、 iv）最終的に調製される試料に水溶液中でイオンに解離
   して水溶液の電気伝導性を好適に保つ塩類を添加するこ
   とにより、該試料の電気伝導度を電気抵抗式測定原理を
   用いた測定装置で測定できるようにし、細胞の大きさを
   正確に測定できるようにする工程；および （２）血液学的試料に含まれる白血球を、色素で染色す
   る工程であって、 ｉ）少なくとも好塩基球と幼若顆粒球を接触する色素で
   あるアストラゾンイエロー３Ｇと ii）少なくとも好線球を染色する色素であるニュートラ
   ルレッドと iii ）少なくとも白血球の核あるいは細胞質あるいはそ
   の両方を染色する色素と iv）損傷を受けた細胞の核のみを染色する蛍光色素との
   少なくとも４種類の色素で染色する工程。
5. 【請求項５】 断片化した赤血球を溶解するノニオン性
   界面活性剤が、分子構造中の親水基にポリオキシエチレ
   ンを含む界面活性剤であって、ポリオキシエチレンの重
   合度が２０以上のノニオン性界面活性剤である請求項４
   項の測定用試料調製方法。
6. 【請求項６】 少なくとも白血球の細胞質あるいは核を
   染色するための色素が （１）アストラゾンオレンジＲ （２）アストラバイオレット （３）ローダミン６Ｇ （４）ローダミン１９ （５）ローダミンＢ （６）ローダミン３ＧＯ （７）ピロニンＢ （８）シアノシン （９）３，３′−ジメチルチオカルボシアニン アイオ
   ダイド （１０）３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイ
   オダイド （１１）３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン
   アイオダイド （１２）３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン
   アイオダイド （１３）３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデ
   シルアクリジニウム プロマイド （１４）７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンゾオキサ
   ジアゾール （１５）７−フルオロ−４−ニトロベンゾオキサジアゾ
   ール （１６）アストラゾンレッド６Ｂ からなる群の中から選ばれた少なくとも１種類の色素で
   ある請求項４項記載の測定用試料調製方法。
7. 【請求項７】 損傷を受けた細胞の核のみを染色する蛍
   光色素が （１）エチジウムブロマイド （２）プロピジウムアイオダイド （３）Ｎ−メチル−４−（１−ピレン）ビニル−ピリジ
   ニウム アイオダイド からなる群の中から選ばれた少なくとも１種類の色素で
   ある請求項４項記載の測定用試料調製方法。