JPS63134958A - フローサイトメトリーによる白血球の分類方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、臨床検査分野に２ける血球の分類が１１定
法およびそれに使用する試薬に関するものであり、さら
に詳しくは、フローサイトメーターを用いて、螢光染色
処理された血球を光学的に測定し、白血球を分類する２
つの方法及びそれらに使用される試薬に関するものであ
る。

（促米の技術） 健常人の末梢皿中の白血球にに、リンパ涼、単球、好中
球、好酸球、好塩基球の種類がある。これらは各々その
慎能が異っており、血液中の白血球を種類別に計数する
ことによって、病気の診断に貢献することかでさる。た
とえば、好中球の増７）Ｏは、炎症、心筋梗塞、白血病
などにみられ、好中球のｔｃｔｐは、ウィルス性疾患、
男性不良性貧血、無顎程琢症などに見られる。好酸球の
増加は、寄生虫症、ホジキン病、アレルギー疾患などに
みられる。単球の増加は、感染症の快復期、単球性白血
病などにみられる。

白血球を分類・計数するために従来から最も良く笑施さ
れている方法は、血液像鑑定（視算法、用手法）と呼ば
れるものである。

この方法は、血液をスライドグラス上に塗抹し、血球を
固定し、ざらに染色したのち、顕微鏡で観察し、一つず
つの白血球の形態的特徴（白血球の大きさ、核の形態、
細胞質の形態、顆粒の有無等）や染色度合から測定者が
いずれの血球であるかを判定し、分類−計数するもので
ある。このとき、一般の検査室では１００〜２００個の
白血球を計数し、白血球全体の数の中に占める各々の血
球の百分率（％）を測定値としている。

この方法は、顕微鏡による観察の前に、血液の塗抹、固
定、染色等の繁雑な憚本作成操作が必要であることと、
顕微鏡を用いた分類−計数は、血球のわずかな差を見分
けなければならないこと、とのために、測定者に大きな
負担をかけるものとなっている。δらに、計数する白血
球数が少い上に、塗抹試料上の血球が不均一な分布とな
っている場合もあり、熟練した測定者でも再現性のある
測定値を出すことは難しい。

このために、白血球の分類・計数が自動的に行なえる方
法が強く求められており、現在のところ、大きく分けて
二種類の方法が実現されている。

そのうちの一つの方法は、血球像をビデオカメラ等でと
らえ、コンピュータによる画像処理によって白血球を分
類するものである。この方法は従来の視算法に原理的に
は近い方法であるが、コンピューターによる処理では分
類できない血球も多く、完全には視算法に取ってかわる
ものとけなっていない。また、装置が複雑で大型になり
、価格が高くなるという問題もちる。

白血球を自動的に分類−計数するもう一つの方法は、フ
ローシステムを利用した方法である。この方法は、血球
を希釈液中に浮遊させた試料を用い、血球が一個ずつ細
い検出器中を通過するようにこの試料を流し、このとき
検出器で発生する信号を分析することにより白血球を分
類するものである。このフローシステムを利用した方法
は、さらに、二つの方法に細分される。

第１の方法は、赤血球を溶解剤で破壊し、白血球のみが
浮遊した電Ｓｔを細孔中に流し、血球が細孔を通過した
ときの細孔部のインピーダンス変化を検出し、検出信号
の大きさによって白血球を分類するものである。

第２の方法は、光源と、試料中の細胞が１個ずつ細い流
路を流れるようにしたフローセルと、細胞から発せられ
た光を検出する測光部と、検出信号を解析する解析装置
とを備えたフローサイトメーターを使用するものである
。この方法では、血球を染色し、染色された血球を光で
照射し、そのとき血球から発する螢光および場合によっ
ては散乱光を一緒に検出し、検出信号の強度によって白
血球を分類しようとするものである。

この第２の方法に属するものとしては、例えば特公昭５
９−８５３号公報およびエル・エイ・カメンツキー（Ｌ
、Ａ、Ｋａｍｅｎｔｓｋｙ）　「ブラッド・セルズ（Ｂ
ｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ）　Ｊ　、第６巻、１２１〜１４
０頁、１９８０年に記載された方法がある。この方法は
、血液に１０倍量のアクリジンオレンジ染色液を加え、
１分間インキュベートしたのち、アルゴンイオンレーザ
−等の光源で照射したとき血球から発する緑色螢光と赤
色螢光を測定し、その二次元分布から、白血球を分類・
計数するものである。

第２の方法に属する他の例としては、特開昭５０−２０
８２０号公報およびエイチ・エム・シャピロ（Ｈ，Ｍ、
５ｈａｐｉｒ６）他「ザ・ジャーナル・オブ・ヒストケ
ミストリー・アンド・サイトケミスト　リー（Ｔｈｔｔ
　　Ｊｏｕｒｎαｌ　　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｃｈｇｒｎｉ
ｓｔデｙａｎｄ　Ｃ’／ｌｏｃｈｇｒｒＬｔｓｔｒｙ）
第２４巻第１号、３９６〜４１１頁、１９７６年：同じ
く第２５巻第８号、９７６〜９８９頁、１９７７年に記
載された方法がある。この方法は、血液に４倍量の染色
液１を加え、３分間インキュベートした後、血液と等容
の２０％ホルムアルデヒドを加え、５分間固定を行ない
、希釈用の染色液■で１５〜２０倍に希釈し、フローサ
イトメーターで測定するものである。

この泗ｊ］定に用いられるフローサイトメーターは、光
源として光を３分割した水銀アークランプ又は三本のレ
ーザーを備え、染色液に含まれる３種の螢光染料を各々
励起し、その３種の螢光と前方散乱光、側方散乱光、吸
光の６つのパラメーターを測定し、４段階の二次元分布
解析により白血球を分類・計数する装置でおる。

？らに、昭和６１年９月１０出願の特願昭６１−２１３
７）５号においては、緩衝液、無機塩類及び螢光染料か
らなる染色液に血液を加えて染色するという一段階染色
工程が開示されているが、未溶解の赤血球が測定データ
に影響を及ぼし、測定か不明確となるおそれがあった。

（発明が解決しようとする問題点） フローシステムを利用して白血球を分類・計数する方法
のうち第１の方法に８いては、赤血球を破壊しなければ
ならないが、血液によっては赤血球の溶解が完全に行な
われ得ない場合もあり、このときには測定値の正確さが
損なわれるという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの特公昭５
９−８５３号公報等に記載された方法は、細胞による染
料の吸収が平衡に違する前に、すなわち、染色の途中で
各白血球の螢光強度の差が最大となる時間に測定するこ
とを特徴としている。

しかしながら、白血球数が極端に多いか、または少い検
体については、染色強度が適正レベルとなる染色時間は
正常な検体とは異ることＫなり、検体とと忙適切な染色
時間を選定しなければならない。また、この方法は螢光
強度の差のみＫよって白血球を分類しようとしているた
め、リンパ球と卓球との分離等容血球の分離が必ずしも
良くないという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの他の例す
なわち特開昭５０−２０８２０号公報等に記載された方
法は、操作手順が多く、染色時間が長くかかる上に、複
雑な試薬を使用しなければならない。また、光源が３樵
必要であることに加え、６つのパラメーターを測定しな
ければならないため装置が非常に複雑で高価なものとな
る。嘔らに、このように多くのパラメーターを測定して
いるため解析が複雑となり、大容量の解析装置を必要と
するという問題もある。

畑らに、前出の特願昭６１−２１３７）５号の発明を含
めフローサイトメトリーにより白血球を分類する方法に
おいては、血液を長時間放置しておいたため好中球が死
細胞になると、フローサイトメーターでは検出できなく
なる場合があると言う問題があった。このため測定血液
は必ず新鮮血液を使用しなければならなかった。

この発明は、上記従来の問題点を解決するためになされ
たもので、簡単な手順と構成で、白血球を正確に分類・
計数するための方法と装置を提供するものである。

（問題点を解決するための手段および作用）不発明の白
血球の分類方法には二つの方法かあり、以下それぞれを
１ステツプ法、２ステツプ法と呼ぶ。

ｌステップ法は以下（ａ］〜（ｃＪの各工程からなる。

（ａ）　好酸球と好塩基球の両刀を特異的に螢光染色す
る染料と、白血球のうち少くともリンパ球を螢光染色す
る染料と、ｐＨを７．０〜１０．０に保つための緩衝剤
と、染色液を白血球の形態を保持する浸透圧に調整する
ための浸透圧補償剤とからなる染色液Ｋ、抗凝固処理を
施した血液を加えて、平衡状態に達するまで染色して測
定用試料を調整する工程。

（ｂｌ　　前記測定用試料をフローサイトメーターに流
し、白血球と他の血球とを螢光強度によって区別し、白
血球の側方（９０つ散乱光信号と、螢光信号とを測定す
る工程。

ｔｃ＋　　白血球より発せられた前記側方散乱光信号２
よび螢光信号により、各白血球の種類を判別し、計数し
、各白血球の比率を算出する工程。

２ステツプ法は以下（ａｉ〜（ｄ）の各工程からなる。

（ａ）好酸球と好塩基球の両方を特異的に螢光染色する
染料と、白血球のうち少くともリンパ球を螢光染色する
染料と、ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤とからなる低
張な第１液に、抗凝固処理を施した血液を加えて、赤血
球を溶血させる工程。

（ｂ）　　第１液の緩衝剤中の酸を中和し、溶液ｐＨを
染色ｐＨに保つための緩衝剤と、溶液を白血球の形態を
保持する浸透圧に調整するための浸透圧補償剤とからな
る第２液を、前記（５）で得られた、第１液で処理され
た血液試料に加えて、白血球を染色する工程。

（Ｃ）　　前記染色された試料をフローサイトメーター
に流し、白血球と他の血球やゴーストとを螢光強度によ
って区別し、白血球の螢光信号と側方（９０つ散乱光信
号とを測定する工程。

（ｄ＋　　白血球より発せられた前記螢光信号および側
方散乱光信号により、各白血球の種類を判別し、計数し
、各白血球の比率を算出する工程。

また、本発明の、フローサイトメトリーによる白血球５
分類に使用される試薬は、以下の組成を有する。

（１）好酸球と好塩基球の両方を特異的に螢光染色する
染料たとえばアストラゾンイエロー３Ｇ＋２３　　白血
球のうち少くともリンパ球を螢光染色する下記の染料の
うちの一つ。

アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ ベルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロワレツド アクロノール７ａキシンＦＦ５ ｌ、１′−ジメチルチオカルボシアニンｌ、１′−ジエ
チルチオカルボシアニン３．３′−ジエチル−９−メチ
ルチオカルボシアニンプロミド ４．５−ペンゾオキサゾリクムヨージドアストラゾンレ
ッド６Ｂ ペイシックバイオレット１６ ２−　Ｃｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−
４，５−ベンゾナアゾリ９ムヨージド２．４−ビス（ｐ
−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−ピリジニウ
ムヨーシト ２．６−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
チル−ピリジニウムヨーシト ＴＡ−２（日本感光色素研究所：岡山布）アストラゾン
オレンジＲ （轡にアストラゾンオレンジＲが好適である。）さて、
白血球より発せられる前記螢光信号２よび側方散乱光信
号のうち１．螢光信号は、細胞化学的特性を反映するも
のであり、染料と各白血球との相互作用により、各白血
球から異なる強度の信号が得られる。

一方、側方散乱光信号は細胞内情報を反映するものであ
る。すなわち、細胞内の細胞核が大きいほど、１だ、顆
粒が多いほど細胞内での光の反射が強まり、側方散乱光
強度は増大する。したがって、リンパ球は、その内部に
顆粒が存在しないかあるいは少いので、散乱光強度は一
番小さく、好中球は、その内部に顆粒が多く存在し、ま
た、大きな核を持つので、散乱光強度は一番犬き゛くな
る。単球、好酸球、好塩基球による散乱光強度はリンパ
球と好中球の中間にある。このような理由により、各白
血球の側方散乱光の相対強度は、第２図に示すものとな
る。

したがって、螢光信号と側方散乱光信号とを組み合わぜ
ることにより、後に詳細に述べるように白血球の５分類
が可能となる。

本発明の方法は、前述のように、複雑な前処理等の操作
を必要とせず、１ステツプまたは２ステツプの量率な染
色のみで、７０−サイトメーターにより血液中の白血球
だけを分類・計数するものでおる。

本発明に使用されるフローサイトメーターの光学系の一
具体例を第１図に示された図面に基いて説明する。第１
図は側方散乱光と赤帯元と縁帯元とを測定する場合を示
している。このフローサイトメーターの光学系１０に使
用された光源は、波長；４８８ｎｙｘ、　　出力；　１
０ｍＷのアルゴンイオンレーザ−１２である。レーザー
１２から発せられた光は、シリンドリカルレンズ１６に
よって絞られ、フローセル１４中を流れる測定用試料を
照射する。

測定用試料中の染色された白血球がレーザー元によって
照射されると、白血球からは散乱光と螢光が発せられる
。

このうち、側方へ発せられた散乱光と螢光はコンデンサ
レンズ１８によって集められ、アパーチャ２０を通過し
たのち、ダイクロイックミラー２２に述する。

ダイクロイックミラー２２は側方散乱光２４を反射し、
螢！２６を透過させる。ダイクロイックミラー２２によ
って反射てれた側方散乱光２４（グ光電子増倍管ｚ８に
よって測定される。ダイクロイックミラー２２を透過し
た螢光２６のうち赤帯元３２はダイクロイックミラー３
０によって反射式ぞられ、縁帯光３８のみが透過させら
れる。反射された赤帯光３２はカラーフィルター３４を
通過したのち、元電子増イき・、？３６によって６１１
１定される。透過した縁帯光３８！−１カラーフィルタ
ー４０を通過したのち元電子増倍雪４２によって測定さ
れる。

ところで、測定用試料中の赤血球は非常に弱い螢光しか
発しないので、螢光強度をζ１１定する限りにおいては
、赤血球が白血球と同時に検出部を通Ａ（同時通過）し
ても、白血球の測定には妨害を与えない。しかし、散乱
光を測定する場合には、赤血球は白血球と同レベルの価
度の散乱光を発するため、白血球の計数に対して妨害を
与える。このとき、螢光と散乱光を同時に測定し、一定
レベル以上の強度の螢光を発したもののみを白血球とす
ることはできるが、白血球と赤血球が同時通過し次とき
には、白血球による散乱光に赤血球による散乱光が重畳
づれるので、正しい白血球の散乱光強度を測定すること
ができない。第１図に示したフローサイトメーターの光
学系１０では、希釈倍率をたとえば２０倍とし、赤血球
と白血球との同時通過が起る確率を減少でせ、赤血球に
よる妨害の程度を実用上無視できる程度におさえた測定
用試料をフローセル１４に流すようにしている。

しかし、螢光強度によって好酸球と好塩基球とを除外し
たのちの残った白血球すなわちリンパ球、単球、好中球
の側方散乱光信号の強度分布を描くと、第３図に示すよ
うに、これら３つの集団は完全には分離されていない。

測定用試料の希釈倍率をさらに上げ、赤血球と白血球と
の同時通過が起る確率を、赤血球による妨害が完全に無
視できる程度に抑えれば、リンパ球、単球、好中球によ
る側方敗乱元宕号強度の度数分布は第４図のようになり
、これら三つは完全に分離できるようになる。しかし測
定値の精密反を確保するためには白血球数で約Ｉ　Ｑ、
ＯＯ０個測定する必要があるため、布敷倍率を上げて試
料を薄くすると測定時間が長くかかりすぎ、実用的でな
くなる。

測定試料に対して、赤血球溶皿処理等の赤血球除去操作
を行えば、赤血球による妨害の上記問題は解決できるが
、従来技術では染色条件に適合する赤血球溶血法等の赤
血球除去方法が存在しなかったため行なえなかった。螢
光染色による白血球５分類で溶血を行なっている先行技
術例はない。

又、１分以内で赤血球のみを溶血し、白血球の側方散乱
光（形態情報）を損なわない様な方法は存在しなかった
。

一般に赤血球を除去した白血球６１１１定用試料を調整
する罠は、下記の方法が知られている。

１）赤血球溶血能力 α）外面活性剤処理 ｂ）四級アンモニウム塩（たとえば、ｍｙ、ｃｔ）処理 Ｃ）低張処理（生理的ｐＨ） １１）分離法 ｄ）遠心分離 ｅ）沈降分離 ハその他 上記（ａ）〜（ｓ＋３について以下に説明する。

４）　　界面活性剤処理は染色を阻害する、赤血球溶血
と同時に、白血球の裸核化、膨潤、収縮等の形態学的変
化を生じ、散乱光信号による。白血球分画が、困難とな
る白血球形態が、経時的に変化する等の問題がある。

ｂ）四級アンモニウム塩処理 染色を阻害する、赤血球溶血能力が低く、たとえば全血
を２０倍希′釈した濃厚試料は調整が困難、赤血球溶血
に時間がかかる（３〜５分）等の問題がある。

Ｃ）低張処理 一般に低張溶液中では、赤血球に比べ白血球の抵抗性が
高いことを利用し、赤血球のみを溶血し、白血球のみを
残すが、生理的ｐＨのもとでは赤血球が完全に溶血する
条件下では、白血球の一部も、破壊される。

ｄｏｓよびＣ）遠心分離と沈降分離 ・操作が繁雑で時間がかかる。

・白血球の損失、分画比のｆ＠が３こりやすい等の問題
がある。

本発明のうち２ステツプ法では、前述の赤血球−白血球
同時通過による。側方散乱光強度分布の乱れを低減テせ
るため試料中の赤血球を酸性低張処理することにより破
壊している。

前述のように、生理的ｐＨ域で低張処理ケ行なった場合
、赤血球破壊と同時に一部の白血球の破壊も生ずる。

酸性ｐＨ域特にｐＨ２，０〜５．０で低張処理を行なっ
た場合、白血球は完全に保持てれ赤血球のみが破壊され
る。この場合、白血球の裸核化、膨潤、収縮等の形態学
的変化は、生じない。

赤血球選択溶血の作用機序は不明であるが、Ｓそらく、
低張処理による。赤血球溶血の進行とともに酸性ｐＨに
よる、赤血球の、脆弱化、白血球の酸性固定が進行し、
赤血球に比べ抵抗力のある白血球のみが残ると考えられ
る。

敵性低張処理によって赤血球は、ゴースト化され、一部
フラグメント化される。その結果赤血球側方散乱光信号
強度は、リンパ球側方散乱光信号強度のに〜に以下とな
り事実上赤血球−白血球の同時通過は、無視しつるもの
となる。

しかし、酸性低張処理においては、赤血球が全部７ラグ
メント化されるわけではないので、散乱光信号強度のみ
によって赤血球と白血球を完全に弁別することけ困難で
ある。

したがって、赤血球と白血球との弁別は、前述のように
螢光信号強度によって行なうことが望ましい。

次に染料の作用について詠べる。

アストラゾンイエロー３Ｇの化学構造式は次のとおりで
ある。

アストラゾンイエロー３Ｇ （Ａｓｔｒａｚｏｎｅ　Ｉｌｌｌｏｗ　３Ｇ）アストラ
ゾンイエロー３Ｇの励起−螢光特性な第５図に示す。励
起極大は４３０〜４５５　ｎｍ、　　螢光極大は５２５
　ｎｍである。

アストラゾンイエロー３Ｇは、好酸球８よび好塩基球内
部物質のヘパリン、ヒスタミン、ピストン、プロタミン
などと結合し、顆粒を強く染色する。

螢光強度と側方敗乱元強度による二次元分布図を描くと
、アストラゾンイエロー３Ｇが低濃度（５０〜１００ｐ
ｐｒｒＬ）では第６図に示すように好塩基球のみが測定
可能域にある。好塩基球の螢光強度は１００〜２００　
ｐｐｍで一定値となり、それ以上では増大しない。

アストラゾンイエロー３ＧＱ度１００〜２００ｐｐｒｎ
では好酸球が測定可能となり、染料濃度の増加とともに
第７図に示すように螢光強度は増大する。

第７図に示されるように、アストラゾンイエロー３Ｇの
みの染料では全白皿球を測定できないため、アストラゾ
ンイエロー３Ｇの染色性能を損わずに全白血球の核を染
色する染料をかえる必要がある。前述の白血球をリンパ
球、卓球、頌粒球に分類する染料は、いずれもこの目的
に合致するものであるが、特に、フローサイトメーター
の光源工２にアルゴンイオンレーザ−を使用する場合に
は励起極大が４８８　ｎｍ付近にある染料が好ましい。

このように選定された染料がアストラゾンオＶンジＲで
ある。　　′ アストラゾ７オレンジＲの化学格造式は矢のとおりであ
る。

アストラゾンオレンジＲ （Ａｓｔｒａｚｏｎｅ　Ｏｒａｎｇｅ　Ｒ）アストラゾ
ンオレンジＲの励起、螢光特性を第８図に示す。励起極
大は４９０　ｎｍ、螢光極大ば５２０　ｎｍである。

アストラゾンイエロー３Ｇとアストラゾ／オレンジＲと
を組み合わせた染料を使用して白血球を分類したときの
、螢光と側方散乱光による二次元分布図を第９図に示す
。第９１閾において、ＦＬは螢光相対強度、Ｂｉｄε　
Ｓｃは側方敗乱元相対強度を、またｌはリンパ球、２は
単球、３は好中球、４は好酸球、５は好塩基の各集団を
示す。６はノイズ成分を表わす（以下同じ）。

第９図に示すように螢光強度と側方散乱光強度によって
白血球を５分類できる。このように、アストラゾンイエ
ロー３ＧとアストラゾンオンンジＲとを組み合わせた染
料を使用すると、螢光信号としてはｌチャンネルのみを
測定すれば良いので、第１１凶のフローサイトメーター
の光学系の中の、グイクロイックミラー３０、カラーフ
ィルター３４、光電子増倍管３６は不用となり、特願昭
６１−２１３７）５号の具体例で使用された装置と較べ
て構成が簡単となる。

次に、溶液の組成、ｐＨ１浸透圧について前述の１ステ
ツプ法と２ステツプ法について詳細に述べる。

ｌステップ法 （ａ１　色素濃度 アストラゾンイエロー３ＧｇＪ度５０〜４００ｐｐｒｎ
の５水準とアストラゾンオレンジＲ濃度１００〜４００
　ｐｐｍの４水準との組み合わせ２０組の各色素濃度で
の好酸球と好塩基球の螢光相対強度を第１θ図および第
１１図に示す。第１０図には好塩基球と好酸球について
の結果をそれぞれ実線と点線で、第１１図には、リンパ
球・好中球と卓球とについての結果をそれぞれ実線と点
線で示している。第１０図からアストラゾンイエロー３
Ｇ濃度１１００ｐｐ以上で好塩基球による強度が他の白
血球による強度よりも増大し、２００７）ｆ）ｍ以上で
は好酸球による強度が増大すること、また、第１１図か
ら他の白血球の強度はアストラゾンイエロー３Ｇ濃度の
増加に対して、はとんど増大しないことがわかる。した
がって、好塩基式および好酸球を他の白血球から螢光強
度によって分離するためには、アストラゾンイエロー３
Ｇ濃度を１５０〜２００　ｐｐｍ以上とすれば良いこと
がわかる。

第１２図はアストラゾンイエロー３Ｇ溌ｆＪｆ３００　
ｐｐｍにおけるリンパ球・好中球の螢光強度とノイズの
強度のアストラゾンオレンジＲＱ度への依存性を示して
いる。アストラゾンオレンジＲａ度１００　ｐｐｍ以上
でリンパ球・好中球の螢光強度とノイズとが分離できる
ようになり、２００　ｐｐｍ以上で分離が良好になる。

３００　ｐｐｒｎ以上ではリンパ球・好中球とノイズと
の分離は、はぼ一定となり、また、アストラゾンオレン
ジＲＱ度の上昇に伴い、好塩基球および好酸球の螢光強
度が若干低下するので、アストラゾンオレンジＲ襄度は
３００９ｐ肩程度が好ましい。

ｔｂｌ　　ｐＨ 染色液ｐＨを７．５〜９．５の間で変化させたときの好
中球に対する好塩基球の、２よび好中球に対する好酸球
の螢光強度比の変化をそれぞれ第１３図、第１４図に示
゛す。図より、好中球に対する好塩基球３よび好酸球の
螢光強度比が最も大きいのはｐＨ８，５〜９．０である
ことがわかる。

［Ｃ１緩衝剤の七１類 緩衝剤としては、グリシルグリシン、タウリ／、Ｈ，Ｂ
Ｏ８、トライシン等が使用できるが、中でも、トライシ
ン１０〜１００　ｔｎＭ　）ｆＥ　用が好ましい。

（ｄ）　　浸透圧補償剤 塩化ナトリウム濃度７５　ｒｎＭ〜２２５　ｒｎＭの間
では螢光強度は変化しない。等張（１５０ｍＭ）付近で
使用すれば良い。

２ステツプ法 色素濃度については、２ステツプ法の最終０度を１ステ
ツプ法における濃度範囲内に設定すれば良い。他の東件
について述べる。

（４１第１液ｐｇ 第１ｇｐＨは、赤血球を溶血さぞるために５．０以下が
良いが、血小板の凝集を防ぐためには３．５以上が必要
である。特にｐＨ４，５が逼している。

ｔｂｌ　　第１液緩衝剤 第１液緩衝剤としては、クエン酸、マレイン酸、ジグリ
コールαなどｐＫａが４．５付近の緩衝剤なら使用可能
である。たとえばジグリコール酸ン用いたとき、ジグリ
コール酸濃度５ｒｎＭ以下では、好塩基球の螢光強度に
若干の低下が見られ、５０　ｒｎＭ以上では赤血球の溶
血不良が見られる。最適なジグリコール濃度は約１０ｍ
Ｊ／でおる。

（Ｃ１第２液浸透圧 第２ｆｆに添加する浸透圧補償剤（たとえば塩化す）　
ＩＪウム）の量を変化させて、最終浸透圧を１６７〜３
８７　ｍｏｓｎＬ／Ｊｃｇの間に変えても、分画パター
ンに変化は無い。第２液浸透圧は最終浸透圧がほぼ等張
（’：ｌ　８０　ｍＤｓｍ／に９）となるようにすれば
良い。

（ｄ＋　　第２ｇ、緩衝剤 ｆ’Ｔ　２液緩衝剤としては、ホウ酸、トリス、トライ
シンなどｐＫａが８．５〜９．０付近の緩衝剤が使用で
きる。たとえばトライシンな用いたとき、トライシン濃
度５０　ｍＭ以下では、好塩基球および好酸球の螢光強
度が低下する。

好ましいトライシンｏ度は３００　ｍＭである。

（実施例） 本発明を、前述した組成範囲の中で最も好適な条件のも
とで実施した例を以下に示す。

試薬組成 ラム 塩化ナトリウム　（浸透圧ｆＡ整剤）　　　１１５ｍＡ
ｆｐＨ８，７、浸透圧　２８０　ｍｏｓｍ／ｌｃ９染色
方法 １体積のＥＤＴＡ２Ｋ　抗凝固血液に２０体積の染色液
を加え、撹拌後２５℃で約１分間インキュベートする。

グイクロイックミラー２２　　　　　５１０ｎｖｎ（５
１ＯｒＬｒＩＬ以下の波 侵を反射し反射しな かった元は透過する） カラーフィルター４０　　　　　　　　５２０ｎｙＩＬ
（５２０ｎｍ以上の波 艮な透過するもの） 分析精来 上記榮件にて、フローサイトメーターで測定し、螢光強
度と側方散乱光強度による二次元分布図を描くと第１５
図のようになる。図のように白血球が５分類されている
が、リンパ球ど好中球の間に若干の分布の重なりが見ら
れる。これは赤血球と白血球との同時通過の影響で側方
散乱光か礼式れているだめである。

試薬組成 第１液 リウム ｐＨ４，５、浸透圧　５０　ｒｎｏ　ｓ　ｒｎ／に９第
２液 塩化ナトリワム　（浸透圧調整剤）　　　７５０ｒｎＭ
ｐＨ９，ＢＮ２．９ 浸透圧２２００　ｍ０！ｔｒｎ／に９ 染色方法 １谷を都のル°ＤＴＡ２Ｋ　　抗凝固血液に１８容全部
の第１液を加え、撹拌後２５℃で２０秒間インキュベー
トしたのち、２容量部の第２液を加え、撹拌後２５℃で
４０秒間インキュベートする。最終染色条件はｐＨ８，
６〜８，７、浸透圧２８６　ｒｎｏｓｒｎ／に９　（等
張）となる。

フィルター、グイクロイックミラーの選定実施例１と同
じ。

分析績果 上記条件にて、フローサイトメーターで測定し、螢光強
度と側方散乱光強度による二次元分布図を描くと＠１６
図のようになる。図のように白血球力７５分類され、実
施例１においてリンパ球と好中球の間に見られた若干の
分布の重なりは現れていない。これは赤血球を溶血させ
たために、赤血球と白血球との同時通過の影響を完全に
除いたためである。

次に実施倒已において顕著に見られる本発明の特有の作
用について述べる。

実施例２の条件で、採血後６時間以内の新鮮面を測定す
ると、第１７図に示すような二次元分布図が得られる。

第１７図に８いて、領域Ａの中には白血球がほと、んと
分布していない。ところが同様の条件で、同じ検体を採
血後２２時間放置した後、測定すると、＠１８図に示さ
れるように、領域Ａの中に未知の集団が見られる。この
未知集団は以下述べるように好中球の死細胞であると推
定される。

まず、上記採血後２２時間放置し°た血液に、生きた細
胞のみを染色できるフルオレセインジアセテート（ＦＤ
Ａ）をｌ　ｐｐｍ、２　ｐｐｍ、５　ｐｐｍ、１０ｐｐ
ｍ、２０　ｐｐｍ添加する。そのときの二次元分布図を
それぞれ第１９図〜第２３図に示す。これらの図におい
て、ＦＤＡを添加しても領域Ａ内の未知集団は動かず、
他の白血球のかが動いている（ＦＤＡで染色されている
）ことがわかる。したがって、この未知集団は死細胞で
ある。

次に、ある検体（検体ｌ）の好中球数と未知集団中に含
ｌれる個数の検体放置時間に対する変化を第２４図に示
す。検体放置時間とともに、図中・印で示される好中球
比率は減少していき、反対に未知集団中の個数の比率は
増加していく。好中球比率と未知集団比率を加えると、
丙申Ｏ印で示すれるように、検体を放置しても、はぼ一
定である。他の検体（Ｏ印は検体２、Ｃ印は検体３）に
ついても、好中球比率と未知集団比率を加えたものは、
はぼ一定である。以上のことから、未知集団は好中球の
死細胞であると推定される。

従来、検体を長時間放置したときに見られるこのような
死細胞はフローサイトメトリーでは計数できない場合が
あったが、本発明では領域Ａ内に分画される個数と本来
の好中球の位置に分画される個数とを加えて、元の好中
球数とすることができる。

なお、検体を長時間放置することは、白血球以外の他の
血液項目の測定においても好ましいことではないので、
領域Ａ内に所定の個数以上の細胞が計数された場合には
、検体役時間放置の９報を自動的に出力し、測定者に注
意を促すようにすることが望しい。

なお、以上述べた実施例は、すべて、完全に染色が終了
したのちに（すなわち染色が平衡状態に達したのちに）
、測定を開始するものであるから、カｊｊ定中に試料が
経時変化することはなく、また、白血球が極端に多いか
、または、少い検体についても、常に、一定時間で適正
な強度にまで染色レベルが達している。したがって、安
定な測定が可能となるとともに、比較的低出力の光源を
使用しても、充分な螢光強度の信号が得られる。たとえ
ば、この実施例では′、すべて、１０ｍＷのアルゴンイ
オンレーザ−を７０−サイトメーターの光源として使用
している。

しかし、この発明に使用されるフローサイトメーターの
光源は、前述の低出力のアルゴンイオンレーザ−に限ら
ず、池の光源、たとえば、水銀アークランフ、クセノン
アークランフ’、Ｈｅ−ｃｄレ−ｆ−１Ｈｅ−Ｈｅレー
ザー、大出力のアルゴンイオンレーザ−等の光源であっ
てもかまわない。そのときには、各光源に応じた、染色
条件、測定条件を設定すれば良い。

（発明の効果） この発明の方法によって血液を１１１定し、白血球を分
類・計数すると、以下に述べる様な効果が得られる。

染色液に抗凝固処理を施した血液を加えるという一段階
の染色、または （１）抗凝固処理を施した血液に第１ｆｉを加え、次に
第２液を加えるという二段階の染色のみで測定用試料が
得られるので、試料の前処理が簡単である。

（２）１分程度の試料調製時間で測定することが可能で
あるため、測定迄に要する時間が短くて済む。

（３）完全に染色が終了した状態で測定するため、測定
中の試料の経時的変化が無く、筐た、正常な検体のみな
らず、白血球が極端に多いか、または少い検体について
も、一定時間で常に適正な強度に染色がなされている。

このため検体によって染色時間を変えるという必要は生
じない。

（４）　　完全に染色が終了し、強い染色強度に達した
のち測定するので、光源は低出方のもので良い。

さらに光源は一個しか必要とせず、測定パラメーターも
螢光１チャンネル、側方敗乱元ｌチャンネルを測定し、
分析するだけで良いので、この発明の方法を実施するた
めの装置は、構成が簡単で低価格のものとなる。

（５）２ステツプ法に３いては酸性低張処理により赤血
球のみを溶血させてしまうので、赤血球と白血球の同時
通過が無くなったため、側方散乱光信号によるリンｌ々
球と単球と好中球との分離が著しく良くなった。

（ｂ）白血球と他の血球等との分離は螢光強度によって
行っているので、２ステツプ法において全ての赤血球が
フラグメント化されなくても、測定値に影響を与えるこ
とがない。

（７）　　好中球の死細胞を計数することができるので
、採血後長時間放置した血液でも正しく好中球数を算定
できる。

（８）好塩基球と好酸球を両刃とも染色できる染料（ア
ストラゾンイエロー３Ｇ）を使用するので染色工程が簡
単である。

本発明の方法において、一検体につき１００００個以上
の白血球を測定すると、正確度および再現性にすぐれた
測定値が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明に使用されるフローサイトメーター
の光学系の一具体例を示す概略図。第１図中の符号は次
のとおりに説明される：１０７０−サイトメーターの光
学系 １２　レーザー １４　フローセル １６　シリンドリカルレンズ １８　コンデンサーレンズ ２０　アパーチャー ２２　ダイクロイックミラー ２４　側方散乱光 ２６　螢光 ２８　光電子増倍管 ３０　ダイクロイックミラー ３２　赤帯光 ３４　カラーフィルター ３６　光電子増倍管 ３８　縁帯光 ４０　カラーフィルター ４２　光電子増倍管 第２図は、各白血球の側方散乱光相対強度を示すグラフ
。 第３図は、赤血球の同時通過の影響があるときの側方散
乱光相対強度の度数分布を示す図。 第４図は、赤血球の同時通過の影響が無いときの側方散
乱光相対強度の度数分布を示す図。 第５図は、アストラゾンイエロー３Ｇの励起・螢光特性
を示すグラフ。 第６図、第７図は、アストラゾ／イエロー３Ｇで染色し
たときの螢光および側方散乱光による二次元分布図。図
中、イは好塩基球、口はその他の白血球、ハはアストラ
ゾンイエロー３Ｇ４００ｐｐｍでの好酸な、二はアスト
ラゾンイエロー３Ｇ２００　ｐｐｍでの好酸球である。 第８図は、アストラゾンオレンジＲの励起・螢光特性を
示すグラフ。 第９図は、螢光と側方散乱光を使用して、白血球な５分
類したときの二次元分布図。図面中の符号ｌはリンパ球
、２は単球、３は好中球、４は好酸球、５は好塩基球の
集合を、６はノイズを表わしている。 第１０１Ａは、好酸球、好塩基球螢光強度のアストラゾ
ンイエロー３Ｇｍ度への依存性を示すグラフ。 １凶甲の符号は次のような意味である。 Ｏ：アストラゾンオレンジＲ１００ｐｐｒｎ・：　　　
　　　　　　　　　　　　　２００　ｐｐｒｎ□：　　
　　　　　　　　　　　　　　３００ｐｐ扉（）：　　
　　　　　　　　　　　　　　４００ｐｚ順第１１図は
、リンパ球、好中球、卓球螢光強度のアストラゾンイエ
ロー３Ｇ濃度への依存性を示すグラフ。 図中の符号は次のとおりである。 ○：アストラゾンオレンジＥ　　　　１１００ｐｐ・：
　　　　　　　　　　　　　　　　２００ｐｐｍＯ”　
　　　　　　　　　　　　　　　３ｏｏｐｐｍＯ”　　
　　　　　　　　　　　　　　４００１）？７Ｌ第１２
図は、リンパ球・好中球螢ｆｆ、強度のアストラゾンオ
レンジＲ濃度への依存性（アストラゾンイエロー３Ｇ濃
度３００　ｐｐｍ）を示すグラフ。 第１３図、第１４図は、それぞれ、好塩基球の好中球に
対する、または、好酸球の好中球に対する螢光強度比の
ｐＨへの依存性を示すグラフ。図中の符号は次の意味を
有する： ○：　　１１００ｐｐ　　＋’　　１００１００ｐｐ：
　　　ＺＯＯ＋　　　２００ ・：３００＋３００ ■：　　３５０　　　　＋　　　１００第１５図は、ｌ
ステップ法の実施例の結果を示す二次元分布図。 第１６図、第１７図は、２ステツプ法の実施例の結果を
示す二次元分布図。 第１８図〜第２３図は、ＦＤＡを添加したときΩ結果を
示す二次元分布図。第１５〜２３図においてＰＬは螢光
強度、５ｉｄｅ　　５ＣＪｄ側方散乱光相対強度を示す
。 第２４図は、〔好中球＋未知集団〕比率と〔好中球〕、
〔未知集団〕比率の検体放置時間による変化を示すグラ
フ。〔好中球〕、〔不明集団〕比率は恢体ｌのみを示し
た。 ○：倹体ｌ　　■：検体２　　Ｃ：検体３０：侠体１の
好中球 ：：シ：検体１の未知集団 待ＦＦ出願人　東亜医用電子株式会社 （外５名） 第２図 □　ｔ＋甲珠 □　　　　　　　　単　　孫 −−−−リンツマ球 ・イＩｆｆ　ニジｙ＊　古Ｌ　’ｆｅ、　！８　’ＥＴ
　４Ｌ７ｔ４１「１方飲ｔし九指寸強凍 情１ｆ歓匍、九相ｎ５鼠贋 第９図 第６　図 第７図 債１工歓乱九相苅洩康 第１Ｏ図 アストラゾン　イエロー　　３６　濃屓第１１図 アストラグンイエロー　１Ｌ慶 第１２図 Ｏ１００２００３００４００（ｐｐｍ）アストラ′ｆン
　イレンソ　　Ｒ５１ＬＮ第１３図 ｔ：５５占に１１】求／室子’ｙｙ末　平均１を九強洩
よシカｐＨへの・剣（（１す生第１４図 ７．５　　８．０　　　Ｂ、５　　　９．Ｑ　　　９．
５　　　ｐＨ童パ腺抹／好中ｙ承平７７−を九強幾１乙
ｎ　ｐＨへ９律）・ト１１ｄｅＳｃ Ｓｉｄｅ　　　Ｓｃ 第１７図 ５ｉｄｅ　　　Ｓｃ 第１８図 ５ｉｄｅ　　ＥＣ 第１９図 １　ｐｐｍ 第２０図 ｐｐｍ 第２１図 ５ρρｍ ５ｉｄｅ　　　Ｓｃ。 第２２図 ０ｐｐｍ Ｓｉｄｅ　　　Ｓｃ。 第２３図 ２０ρｐｍ Ｓｉｄｅ　　Ｓｃ 第２４図 （％Ｊ 楡休λ装置行間 手　　続　　順　　正　　書 昭和６２年４月３日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）以下（ａ）〜（ｃ）の各工程からなることを特徴
   とする、フローサイトメトリーによる白血球の分類方法
   。 （ａ）好酸球と好塩基球の両方を特異的に螢光染色する
   染料と、白血球のうち少くともリンパ球を螢光染色する
   染料と、ｐＨを６．０〜１１．０に保つための緩衝剤と
   、染色液を白血球の形態を保持する浸透圧に調整するた
   めの浸透圧補償剤とからなる染色液に、抗凝固処理を施
   した血液を加えて、平衡状態に達するまで染色して測定
   用試料を調製する工程。 （ｂ）前記測定用試料をフローサイトメーターに流し、
   白血球と他の血球とを螢光強度によって区別し、白血球
   の側方散乱光信号と螢光信号とを測定する工程。 （ｃ）白血球より発せられた前記側方散乱光信号および
   螢光信号により、各白血球の種類を判別し、計数し、各
   白血球の比率を算出する工程。 （２）以下（ａ）〜（ｄ）の各工程からなることを特徴
   とする、フローサイトメトリーによる白血球の分類方法
   。 （ａ）好酸球と好塩基球の両方を特異的に螢光染色する
   染料と、白血球のうち少くともリンパ球を螢光染色する
   染料と、ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤とからなる低
   張な第１液に、抗凝固処理を施した血液を加えて、赤血
   球を溶血させる工程。 （ｂ）第１液の緩衝剤中の酸を中和し、溶液ｐＨを染色
   ｐＨに保つための緩衝剤と、溶液を白血球の形態を保持
   する浸透圧に調整するための浸透圧補償剤とからなる第
   ２液を、前記（ａ）で得られた、第１液で処理された血
   液試料に加えて、白血球を染色する工程。 （ｃ）前記染色された試料をフローサイトメーターに流
   し、白血球と他の血球やゴーストとを螢光強度によって
   区別し、白血球の螢光信号と側方散乱光信号とを測定す
   る工程。 （ｄ）白血球より発せられた前記螢光信号および側方散
   乱光信号により、各白血球の種類を判別し、計数し、各
   白血球の比率を算出する工程。 （３）好酸球と好塩基球とを特異的に螢光染色する染料
   がアストラゾンイエロー３Ｇである特許請求の範囲第（
   １）項または第（２）項記載の方法。 （４）白血球のうち少くともリンパ球を螢光染色する染
   料が下記に示す染料のうちの一つである特許請求の範囲
   第（１）項または第（２）項記載の方法。 アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ ベルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンＦＦＳ １，１′−ジメチルチオカルボシアニン １，１′−ジエチルチオカルボシアニン ３，３′−ジエチル−９−メチルチオカルボシアニンブ
   ロミド ２−〔γ−（１′−エチル−４′，５′−ベンゾチアゾ
   リリデン）プロペニル〕−１−エチル−４，５−ベンゾ
   オキサゾリウムヨージド アストラゾンレッド６Ｂ ベイシックバイオレット１６ ２−（ρ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−４
   ，５−ベンゾチアゾリウムヨージド ２，４−ビス（ρ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
   チル−ピリジニウムヨージド ２，６−ビス（ρ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
   チル−ピリジニウムヨージド ＴＡ−２ アストラゾンオレンジＲ （５）好酸球と好塩基球の両方を特異的に螢光染色する
   染料を含むことを特徴とするフローサイトメーター用白
   血球５分類試薬。 ６　好酸球と好塩基球の両方を特異的に螢光染色する染
   料がアストラゾンイエロー３Ｇである特許請求の範囲第
   （５）項記載の試薬。 （７）好酸球と好塩基球の両方とを特異的に螢光染色す
   る染料と、白血球のうち少くともリンパ球を螢光染色す
   る染料とを含むことを特徴とするフローサイトメーター
   用白血球５分類試薬。 （８）白血球のうち少くともリンパ球を螢光染色する染
   料が下記に示す染料のうちの一つである特許請求の範囲
   第（７）項記載の試薬。 アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ ペルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンＦＦＳ １，１′−ジメチルチオカルボシアニン １，１′−ジエチルチオカルボシアニン ３，３′−ジエチル−９−メチルチオカルボシアニンブ
   ロミド ２−〔γ−（１′−エチル−４′，５′−ベンゾチアゾ
   リリデン）プロペニル〕−１−エチル−４，５−ベンゾ
   オキサゾリウムヨージド アストラゾンレッド６Ｂ ベイシックバイオレット１６ ２−（ρ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−４
   ，５−ベンゾチアゾリウムヨージド ２，４−ビス（ρ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
   チル−ピリジニウムヨージド ２，６−ビス（ρ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
   チル−ピリジニウムヨージド ＴＡ−２ アストラゾンオレンジＲ