JPH0611506A

JPH0611506A - 白血球測定用試薬及び白血球測定用試料調製方法

Info

Publication number: JPH0611506A
Application number: JP4228837A
Authority: JP
Inventors: Takashi Sakata; 孝坂田; Tomoyuki Kuroda; 知之黒田
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1986-11-27
Filing date: 1992-08-27
Publication date: 1994-01-21
Anticipated expiration: 2010-03-15
Also published as: JPS63134957A; JPH0723890B2; JPH0635972B2

Abstract

(57)【要約】【目的】赤血球を溶血させる溶血剤を含む白血球測定
用試薬及び白血球測定用試料調製方法を提供する。【構成】（ａ）ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤を含
有する低張な溶液からなる赤血球溶血剤；および（ｂ）
上記緩衝剤中の酸を中和するための緩衝剤と、溶液を白
血球の形態を保持する浸透圧に調製するための浸透圧補
償剤とからなる溶液からなる白血球測定用試薬；ならび
に（ａ）ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤を含有する低
張な溶液からなる赤血球溶血剤に、抗凝固処理を施した
新鮮な血液を加えて、赤血球を溶血させる工程；および
（ｂ）上記緩衝剤中の酸を中和するための緩衝剤と、溶
液を白血球の形態を保持する浸透圧に調製するための浸
透圧補償剤とからなる溶液を、前記（ａ）で得られた、
赤血球溶血剤で処理された血液試料に加える工程からな
る白血球測定用試料調製方法であることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、臨床検査分野におい
て、赤血球を除去した白血球測定用試料を調製するため
の試薬および白血球測定用試料の調製方法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】健常人の末梢血中の白血球には、リンパ
球、単球、好中球、好酸球、好塩基球の種類がある。こ
れらは各々その機能が異っており、血液中の白血球を種
類別に計数することによって、病気の診断に貢献するこ
とができる。たとえば、好中球の増加は、炎症、心筋梗
塞、白血病などにみられ、好中球の減少は、ウイルス性
疾患、再性不良性貧血、無顆粒球症などに見られる。好
酸球の増加は、寄生虫症、ホジキン病、アレルギー疾患
などにみられる。単球の増加は、感染症の快復期、単球
性白血病などにみられる。

【０００３】白血球を分類・計数するために従来から最
も良く実施されている方法は、血液像鑑定（視算法、用
手法）と呼ばれるものである。

【０００４】この方法は、血液をスライドグラス上に塗
抹し、血球を固定し、さらに染色したのち、顕微鏡で観
察し、一つずつの白血球の形態的特徴（白血球の大き
さ、核の形態、細胞質の形態、顆粒の有無等）や染色度
合から測定者がいずれの血球であるかを判定し、分類・
計数するものである。このとき、一般の検査室では１０
０〜２００個の白血球を計数し、白血球全体の数の中に
占める各々の血球の百分率（％）を測定値としている。

【０００５】この方法は、顕微鏡による観察の前に、血
液の塗抹、固定、染色等の繁雑な標本作製操作が必要で
あることと、顕微鏡を用いた分類−計数は、血球のわず
かな差を見分けなければならないこととのために、測定
者に大きな負担をかけるものとなっている。さらに、計
数する白血球数が少い上に、塗抹試料上の血球が不均一
な分布となっている場合もあり、熟練した測定者でも再
現性のある測定値を出すことは難しい。

【０００６】このために、白血球の分類・計数が自動的
に行なえる方法が強く求められており、現在のところ、
大きく分けて二種類の方法が実現されている。

【０００７】そのうちの一つの方法は、血球像をビデオ
カメラ等でとらえ、コンピュータによる画像処理によっ
て白血球を分類するものである。この方法は従来の視算
法に原理的には近い方法であるが、コンピュータによる
処理では分類できない血球も多く、完全には視算法に取
ってかわるものとはなっていない。また、装置が複雑で
大型になり、価格が高くなるという問題もある。

【０００８】白血球を自動的に分類・計数するもう一つ
の方法は、フローシステムを利用した方法である。この
方法は、血球を希釈液中に浮遊させた試料を用い、血球
が一個ずつ細い検出器中を通過するようにこの試料を流
し、このとき検出器で発生する信号を分析することによ
り白血球を分類するものである。このフローシステムを
利用した方法は、さらに、二つの方法に細分される。

【０００９】第１の方法は、赤血球を四級アンモニウム
塩などの界面活性剤を含有する溶解剤で破壊し、白血球
のみが浮遊した電解液を細孔中に流し、血球が細孔を通
過したときの細孔部の電気的インピーダンス変化を検出
し、検出信号の大きさによって白血球を分類するもので
ある。

【００１０】第２の方法は、光源と、試料中の細胞が１
個ずつ細い流路を流れるようにしたフローセルと、細胞
から発せられた光を検出する測光部と、検出信号を解析
する解析装置とを備えたフローサイトメーターを使用す
るものである。この方法では、血球を染色し、染色され
た血球を光で照射し、そのとき血球から発する蛍光およ
び場合によっては散乱光を一緒に検出し、検出信号の強
度によって白血球を分類しようとするものである。

【００１１】この第２の方法に属するものとしては、例
えば特公昭５９−８５３号公報およびエル・エイ・カメ
ンツキー（Ｌ．Ａ．Ｋａｍｅｎｔｓｋｙ）「ブラッド・
セルズ（ＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓ）」、第６巻、１２１
〜１４０頁、１９８０年に記載された方法がある。この
方法は、血液に１０倍量のアクリジンオレンジ染色液を
加え、１分間インキュベートしたのち、アルゴンイオン
レーザー等の光源で照射したとき血球から発する緑色蛍
光と赤色蛍光を測定し、その二次元分布から、白血球を
分類・計数するものである。

【００１２】第２の方法に属する他の例としては、特開
昭５０−２０８２０号公報およびエイチ・エム・シャピ
ロ（Ｈ．Ｍ．Ｓｈａｐｉｒｏ）他（ザ・ジャーナル・オ
ブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー
（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２
４巻第１号、３９６〜４１１頁、１９７６年；同じく第
２５巻第８号、９７６〜９８９頁、１９７７年に記載さ
れた方法がある。この方法は、血液に４倍量の染色液Ｉ
を加え、３分間インキュベートした後、血液と等容の２
０％ホルムアルデヒドを加え、５分間固定を行ない、希
釈用の染色液ＩＩで１５〜２０倍に希釈し、フローサイ
トメーターで測定するものである。この測定に用いられ
るフローサイトメーターは、光源として光を３分割した
水銀アークランプ又は三本のレーザーを備え、染色液に
含まれる３種の蛍光染料を各々励起し、その３種の蛍光
と前方散乱光、側方散乱光、吸光の６つのパラメーター
を測定し、４段階の二次元分布解析により白血球を分類
・計数する装置である。

【００１３】さらに、昭和６１年９月１０日出願の特願
昭６１−２１３７１５号においては、緩衝液、無機塩類
及び蛍光染料からなる染色液に血液を加えて染色すると
いう一段階染色工程が開示されているが、未溶解の赤血
球が測定データに影響を及ぼし、測定が不明確となるお
それがあった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】フローシステムを利用
して白血球を分類・計数する方法のうち第１の方法にお
いては、赤血球を破壊しなければならないが、血液によ
っては赤血球の溶解が完全に行なわれ得ない場合もあ
り、このときには測定値の正確さが損なわれるという問
題がある。さらに、血液分析装置等に汎用される四級ア
ンモニウム塩などの界面活性剤で血液を処理する場合に
は、白血球の裸核化が生じることにより、白血球を３分
類以上に分類することが困難となる。

【００１５】上記第２の方法の一つである前出の特願昭
６１−２１３７１５号においては次のような問題があっ
た。すなわち測定用試料中の赤血球は非常に弱い蛍光し
か発しないので、蛍光強度を測定する限りにおいては、
赤血球が白血球と同時に検出部を通過（同時通過）して
も、白血球の測定には妨害を与えない。しかし、散乱光
を測定する場合には、赤血球は白血球と同レベルの強度
の散乱光を発するため、白血球の計数に対して妨害を与
える。このとき、蛍光と散乱光を同時に測定し、一定レ
ベル以上の強度の蛍光を発したもののみを白血球とする
ことはできるが、白血球と赤血球が同時通過したときに
は、白血球による散乱光に赤血球による散乱光が重畳さ
れるので、正しい白血球の散乱光強度を測定することが
困難である。なお、第１の方法である電気的インピーダ
ンス測定の場合は上述のような蛍光を併用できないので
赤血球が存在する場合、より重大な困難を生じる。

【００１６】上記出願の発明においては、測定用試料の
希釈倍率をたとえば２０倍とし、赤血球と白血球との同
時通過が起る確率を減少させたが、完全には赤血球によ
る妨害を阻止し得なかった。そのため蛍光強度によって
好酸球と好塩基球を除外したのちの残った白血球すなわ
ちリンパ球、単球、好中球を側方散乱光信号の強度によ
って識別する場合、第２図に示すように、これらを完全
に分離することは困難であった。

【００１７】測定用試料の希釈倍率をさらに上げ、赤血
球と白血球との同時通過が起る確率を、赤血球による妨
害が完全に無視できる程度に抑えれば、リンパ球、単
球、好中球による側方散乱光信号強度の度数分布は第３
図のようになり、これら三つは完全に分離できるように
なる。しかし測定値の精密度を確保するためには白血球
数で約１０，０００個測定する必要があるため、希釈倍
率を上げて試料を薄くすると測定時間が長くかかりす
ぎ、実用的でなくなる。

【００１８】測定試料に対して、赤血球溶血処理等の赤
血球除去操作を行えば、赤血球による妨害の上記問題は
解決できるが、従来技術では染色条件に適合する赤血球
溶血法等の赤血球除去方法が存在しなかったため行なえ
なかった。蛍光染色による白血球５分類で溶血を行なっ
ている先行技術例はない。又、１分以内で赤血球のみを
溶血し、白血球の形態情報（たとえば側方散乱光信号）
を損なわない様な方法は存在しなかった。

【００１９】一般に赤血球を除去した白血球測定用試料
を調製するには、下記の方法が知られている。

【００２０】ｉ）赤血球溶血法ａ）界面活性剤処理ｂ）アンモニウム塩（たとえばＮＨ₄ Ｃｌ）処理ｃ）低張処理（生理的ｐＨ）ｉｉ）分離法ｄ）遠心分離ｅ）沈降分離ｆ）その他上記（ａ）〜（ｅ）について以下に説明する。

【００２１】ａ）界面活性剤処理は染色を阻害する、赤
血球溶血と同時に、白血球の裸核化、膨潤、収縮等の形
態的変化を生じ、散乱光信号による、白血球分画が困難
となる、白血球形態が経時的に変化する等の問題があ
る。

【００２２】ｂ）アンモニウム塩処理染色を阻害する、赤血球溶血能力が低く、たとえば全血
を２０倍希釈した濃厚試料は調製が困難、赤血球溶血に
時間がかかる（３〜５分）等の問題がある。

【００２３】ｃ）低張処理一般に低張溶液中では、赤血球に比べ白血球の抵抗性が
高いことを利用し、赤血球のみを溶血し、白血球のみを
残す。しかし、生理的ｐＨのもとでは赤血球が完全に溶
血する条件下では白血球の一部も、破壊される。

【００２４】ｄ）およびｅ）遠心分離と沈降分離操作が繁雑で時間がかかる。

【００２５】白血球の損失、分画比の変動がおこりやす
い等の問題がある。

【００２６】この発明は、上記従来の第１の方法及び第
２の方法の問題点、特に赤血球の影響を解決するために
なされたもので、簡単な手順と構成で、赤血球を除去し
た、白血球測定用試料を調製するための試薬および白血
球測定用試料の調製方法を提供するものである。

【００２７】

【課題を解決するための手段および作用】本発明の白血
球測定用試薬は、（ａ）ｐＨを酸性域に保つための緩衝
剤を含有する低張な溶液からなる赤血球溶血剤；および
（ｂ）上記緩衝剤中の酸を中和するための緩衝剤と、溶
液を白血球の形態を保持する浸透圧に調整するための浸
透圧補償剤とからなる溶液からなる。

【００２８】また、本発明の白血球測定用試料の調製方
法は上記試薬を使用するものであって、次の工程を含
む：（ａ）ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤を含有する低張
な溶液からなる赤血球溶血剤に、抗凝固処理を施した新
鮮な血液を加えて、赤血球を溶血させる工程；および
（ｂ）上記緩衝剤中の酸を中和するための緩衝剤と、溶
液を白血球の形態を保持する浸透圧に調整するための浸
透圧補償剤とからなる溶液を、前記（ａ）で得られた、
赤血球溶血剤で処理された血液試料に加える工程。

【００２９】さて、上記調製された試料を、たとえばフ
ローサイトメーターに流し、側方（９０°）散乱光信号
を測定した場合、側方散乱光信号は細胞内情報を反映す
る。すなわち、細胞内の細胞核が大きいほど、また、顆
粒が多いほど細胞内での光の反射が強まり、側方散乱光
強度は増大する。したがって、リンパ球は、その内部に
顆粒が存在しないかあるいは少いので、散乱光強度は一
番小さく、好中球は、その内部に顆粒が多く存在し、ま
た、大きな核を持つので、散乱光強度は大きくなる。好
酸球の散乱光強度は好中球のそれにほぼ匹敵する。単球
による散乱光強度はリンパ球と好中球の中間にある。こ
のような理由により、赤血球の同時通過による影響がな
い場合各白血球の側方散乱光の相対強度は、第３図に示
すものとなる。ちなみに、赤血球の同時通過による影響
がある場合は第２図に示すものとなる。同時通過の赤血
球の影響でピークが不明瞭になってしまうことが明示さ
れている。

【００３０】一方、白血球を分類するため蛍光染色した
場合は、得られる蛍光信号は、細胞化学的特性を反映す
るものであり、染料と各白血球との相互作用により、各
白血球から異なる強度の信号が得られる。

【００３１】したがって、好酸球と好塩基球を特異的に
染色し、蛍光強度により好酸球と好塩基球を分離し、残
った白血球すなわちリンパ球、単球、好中球を側方散乱
光強度によって分離することにより、白血球の５分類が
可能となる。

【００３２】この発明の方法は、前述のように、複雑な
前処理等の操作を必要とせず、二段階の工程のみで、血
液中の赤血球だけを溶解し、白血球測定用試料を調製す
るための試薬および白血球測定用試料調製方法に関す
る。ここで光学的信号測定に使用されるフローサイトメ
ーターの光学系の一具体例を第１図に示された図面に基
いて説明する。第１図は側方散乱光と赤蛍光と緑蛍光と
を測定する場合を示している。このフローサイトメータ
ーの光学系１０に使用された光源は、波長；４８８ｎ
ｍ、出力；１０ｍＷのアルゴンイオンレーザー１２であ
る。レーザー１２から発せられた光は、シリンドリカル
レンズ１６によって絞られ、フローセル１４中を流れる
測定用試料を照射する。

【００３３】測定用試料中の染色された白血球がレーザ
ー光によって照射されると、白血球からは散乱光と蛍光
が発せられる。

【００３４】このうち、側方へ発せられた散乱光と蛍光
はコンデンサレンズ１８によって集められ、アパーチャ
２０を通過したのち、ダイクロイックミラー２２に達す
る。

【００３５】ダイクロイックミラー２２は側方散乱光２
４を反射し、蛍光２６を透過させる。ダイクロイックミ
ラー２２によって反射された側方散乱光２４は光電子増
倍管２８によって測定される。ダイクロイックミラー２
２を透過した蛍光２６のうち赤蛍光３２はダイクロイッ
クミラー３０によって反射させられ、緑蛍光３８のみが
透過させられる。反射された赤蛍光３２はカラーフィル
ター３４を通過したのち、光電子増倍管３６によって測
定される。透過した緑蛍光３８はカラーフィルター４０
を通過したのち光電子増倍管４２によって測定される。

【００３６】さて、本発明では、前述の赤血球−白血球
同時通過による、側方散乱光強度分布のような光学的信
号に限らず電気的インピーダンスなど他の信号の乱れを
低減させるため試料中の赤血球を酸性低張処理すること
により破壊している。

【００３７】前述のように、生理的ｐＨ域で低張処理を
行なった場合、赤血球破壊と同時に一部の白血球の破壊
も生ずる。酸性ｐＨ域特にｐＨ２．０〜５．０で低張処
理を行なった場合、白血球は完全に保持され赤血球のみ
が破壊される。この場合、白血球の裸核化、膨潤、収縮
等の形態学的変化は、生じない。

【００３８】赤血球選択溶血の作用機序は不明である
が、おそらく低張処理による赤血球溶血の進行とともに
酸性低ｐＨによる赤血球膜の脆弱化、白血球の酸性固定
が進行し、赤血球に比べ抵抗力のある白血球のみが残る
と考えられる。

【００３９】酸性低張処理によって赤血球はゴースト化
され、一部フラグメント化される。その結果赤血球側方
散乱光信号強度は、リンパ球側方散乱光信号強度の１／
２〜１／３以下となり事実上赤血球−白血球の同時通過
は、無視しうるものとなる。電気的インピーダンスにお
いても同様である。

【００４０】しかし、酸性低張処理においては、赤血球
が全部フラグメント化されるわけではないので、光学的
信号による白血球分類の場合、側方散乱光信号強度のみ
によって赤血球と白血球を完全に弁別することは困難で
ある。したがって、光学的に白血球を分類測定する場合
は赤血球と白血球との弁別は、前述のように蛍光信号強
度によって行なうことが望ましい。

【００４１】以下、本発明の白血球測定用試料調製用試
薬および試料調製方法を、フローサイトメーターを用い
て光学的に白血球を分類測定する場合を例にとって詳細
に説明する。抗凝固剤処理を施された血液は、まず、赤
血球溶血剤と染料から構成される第１液と混合すること
により、赤血球がゴースト、フラグメント化され、次
に、第２液の添加により白血球が染色される。

【００４２】第１液に含まれる色素は、白血球中の細胞
構成成分（特に、顆粒成分）とイオン的に結合すると考
えられる。

【００４３】上記工程で使用される染料の化学構造式は
次のとおりである。

【００４４】アストラゾンオレンジＧは、好塩基球顆粒中のヘパリ
ン、ヒスタミン等の酸性物質と強く結合すると考えら
れ、結合によりアストラゾンオレンジＧの蛍光波長が５
２０〜５４０ｎｍから５６０〜５８０ｎｍにシフトする
（これをメタクロマジー現象と言う）。アストラゾンオ
レンジＧは、同時に、他の白血球（好酸球、リンパ球、
単球、好中球）顆粒とも結合するが、好塩基球に見られ
るようなメタクロマジー現象は認め難い。また、アスト
ラゾンオレンジＧは核表面や細胞表面にも弱く結合し、
５２０〜５４０ｎｍの蛍光を発する。

【００４５】ニュートラルレッドも主に顆粒を染色し、
６２０ｎｍの蛍光を発する。特に、好酸球顆粒において
強く結合し、他の白血球に比べ強い蛍光を発する。

【００４６】第１液と第２液が添加された試料をフロー
サイトメーターで測定すると第４図に示されるような二
次元分布が得られる。第４図においてＲｅｄＦＬ、は
赤蛍光の相対強度を、ＧｒｅｅｎＦＬは緑蛍光の相対
強度を表わしている。また、１はリンパ球、２は単球、
３は好中球、４は好酸球、５は好塩基球、６は白血球以
外のものすなわち血小板、赤血球のゴースト、フラグメ
ントを表わしている（以下同じ）。

【００４７】第４図において、６で示される血小板、赤
血球のゴースト、フラグメントは緑蛍光の強度が低いた
め、白血球と分離できる。好酸球４と好塩基球５は二次
元分布上で完全に分離される。特異的な蛍光を発しない
他の白血球（リンパ球１、単球２、好中球３）は緑と赤
の蛍光による二次元分布によっては分離されず、側方散
乱光強度によって第３図に示されるように分類される。

【００４８】次に、第１液、第２液の組成、ｐＨ、浸透
圧について詳細に述べる。

【００４９】（１）色素濃度ａ．アストラゾンオレンジＧ濃度アストラゾンオレンジＧ濃度は染色ｐＨ９．０の場合１
５ｐｐｍにおいて最も、好塩基球と好中球の分離が良
い。

【００５０】１５ｐｐｍ以下では好塩基球の緑蛍光強度
の低下により分離能は悪化する。

【００５１】１５ｐｐｍ以上では好塩基球の緑蛍光強度
の低下と、好中球の緑蛍光強度の増加により分離能は悪
化する。

【００５２】最適分離能の得られるアストラゾンオレン
ジＧ濃度は、ｐＨにより異なりｐＨの低下により染色性
は低下する。

【００５３】ｂ．ニュートラルレッド濃度ニュートラルレッド濃度は、１〜１０ｐｐｍの濃度域で
は、高濃度程好酸球と好中球の分離が良い。

【００５４】低ｐＨ程好酸球の染色性は良い。

【００５５】ｃ．アストラゾンオレンジＧとニュートラ
ルレッドの相互作用ニュートラルレッドは好塩基球の顆粒をも染色する（蛍
光強度に特異性はない）ため、アストラゾンオレンジＧ
による好塩基球の特異染色を阻害する。したがって、好
酸球と好塩基球の両者に対して分離度の良いニュートラ
ルレッド濃度を決定する必要がある。

【００５６】第５図はアストラゾンオレンジＧ濃度１５
ｐｐｍ、ｐＨ９．０の条件のもとでのニュートラルレッ
ド濃度に対する好酸球と好中球の分離能および好塩基球
と好中球の分離能の変化を図示したものである。第５図
において好塩基球／好中球緑色蛍光比は好塩基球と好中
球の緑蛍光強度の比を示し、好酸球／好中球赤色蛍光比
は好酸球と好中球の赤蛍光強度の比を示し（以下同じ）
ており、図中の上方の点ほど、好塩基球または好酸球と
好中球との分離の程度が良いことを表わしている。

【００５７】第５図では、ニュートラルレッド濃度３．
０ｐｐｍで好塩基球、好酸球の分離が同程度となるが実
際には、白血球中の好塩基球の個数が通常は少ないの
で、好塩基球の分離能を向上させるため、ニュートラル
レッドの濃度を低めに、たとえば、２ｐｐｍに設定する
ことが望ましい。

【００５８】なお、第１液と第２液の容積比を後の実施
例で述べるように９：１とする場合には、最終濃度をア
ストラゾンオレンジＧ１５ｐｐｍ、ニュートラルレッド
２ｐｐｍとするために、第１液中のアストラゾンオレン
ジＧの濃度を１６．５ｐｐｍ、ニュートラルレッドの濃
度を２．２ｐｐｍとすれば良い。

【００５９】（２）ｐＨａ．最終（混合時の）ｐＨアストラゾンオレンジＧ濃度１５．０ｐｐｍ、ニュート
ラルレッド濃度３．０ｐｐｍの条件のもとでｐＨの変化
に対する、好塩基球または好酸球の好中球に対する分離
能の変化を第６図に示す。ｐＨの上昇に伴い好酸球の好
中球に対する分離能は低下する。好塩基球の好中球に対
する分離能はｐＨ９．０付近まではｐＨの上昇に伴って
上り、ｐＨ９．０以上では低下する。

【００６０】なお、ｐＨの上昇に伴い、好塩基球の染色
速度（蛍光強度が最大に達するまでの時間）は速くな
る。しかし、最大強度に達してから後の劣化も速くな
る。好酸球の染色速度はｐＨによって余り変化しない。

【００６１】結局、好酸球、好塩基球の分離能と好塩基
球の蛍光強度の劣化を考慮して、最終ｐＨは８．６〜
８．７付近にすることが望ましい。この最終ｐＨの値を
染色ｐＨと呼んでいる。しかし、上記染色ｐＨは最適条
件を示したものであり、ｐＨ５〜１１であれば、染色可
能であることは、特願昭６１−２１３７１６に記載され
ている通りである。なお、染色ｐＨは染料ごとに異るも
のであり、たとえばアクリジンオレンジではｐＨ７．４
±１．０である（特公昭５９−８５３号公報参照）。

【００６２】前述の特願昭６１−２１３７１５には一般
的な染色条件としてｐＨ３．５〜１０が記載されてい
る。

【００６３】ｂ．第１液ｐＨ第１液ｐＨは赤血球溶血能に影響する。赤血球の溶血は
ｐＨ５．０以下で速やかに進行し、ｐＨの低い程溶血は
速くなる。しかしｐＨ２．０以下では、溶血の進行とと
もに、ヘモグロビン等のタンパクの変性が始まり、変性
の進行は低ｐＨほど速くなる。タンパクが変性した場合
には、最終の染色ｐＨにした時点で凝集塊を生成してし
まう。上記の点を考慮し、第１液のｐＨは２．０〜５．
０とすることが望ましい。

【００６４】（３）緩衝剤ａ．第１液緩衝剤第１液緩衝剤は、溶液のｐＨを溶血条件に維持するため
に添加するものであり、ｐＫａ３．５±１．５ならば、
いずれの緩衝剤でも使用可能である。たとえばマレイン
酸、マロン酸、フタル酸、ジグリコール酸、サリチル
酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸などであ
る。緩衝剤の濃度は、第１液の浸透圧を低くするためな
るべく少なくすることが望ましい。本発明の目的には５
０ｍＭ以下が望ましい。さらに好適には、５〜３０ｍＭ
が望ましい。

【００６５】ｂ．第２液緩衝剤第２液緩衝剤は、第１液緩衝剤中の酸を中和し、溶液ｐ
Ｈを染色ｐＨに維持するものである。上述の染料を用い
る場合にはｐＫａ８．０〜９．５の緩衝剤であれば、い
ずれの緩衝剤でも使用可能である。たとえばトリス、ト
ライシン、ビシン、２−アミノ−２−メチル−１，３−
プロパンジオール、タウリン、ホウ酸、セリンなどであ
る。緩衝剤の濃度は、最終（混合時）濃度１０ｍＭ以上
であることが望ましい。本発明の目的には最終濃度３０
〜１００ｍＭが好適である。

【００６６】（４）浸透圧ａ．第１液浸透圧第１液の浸透圧は低いほど赤血球の溶血が速やかに行な
われる。本発明の目的には０〜１００ｍＯｓｍ／ｋｇの
範囲、特に、０〜５０ｍＯｓｍ／ｋｇであることが望ま
しい。

【００６７】ｂ．第２液浸透圧（または最終浸透圧）第２液浸透圧は最終（混合時）の浸透圧を決定するもの
である。最終浸透圧は白血球の形態保持に影響し、１５
０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲、特に、１５０〜３０
０ｍＯｓｍ／ｋｇであることが望ましい。

【００６８】

【実施例】本発明中の溶血剤を前述した組成範囲の中で
最も好適な条件のもとで使用した例を以下に示す。

【００６９】試薬組成第１液（第１液は本出願人により既に出願された特願昭
６１−２１３７１６に記載された蛍光染料と本発明の特
徴的部分に係る赤血球溶血剤とから構成される）蛍光染料アストラゾンオレンジＧ（好塩基球特異染料）１６．５ｐｐｍニュートラルレッド（好酸球特異染料）２．２ｐｐｍ赤血球溶血剤クエン酸−水酸化ナトリウム（緩衝剤）１０ｍＭｐＨ３．０、浸透圧１０ｍＯｓｍ／ｋｇ第２液タウリン−水酸化ナトリウム（緩衝剤）５００ｍＭ塩化ナトリウム（浸透圧補償剤）３００ｍＭｐＨ９．７〜９．８、浸透圧２６００ｍＯｓｍ／ｋｇ染色方法１容量部のＥＤＴＡ２Ｋ抗凝固血液に１８容量部の第１
液を加え、攪拌後２５℃で２０秒間インキュベートした
のち、２容量部の第２液を加え、攪拌後２５℃で４０秒
間インキュベートする。最終染色条件はｐＨ８．７、浸
透圧２６０ｍＯｓｍ／ｋｇとなる。

【００７０】蛍光特性上記組成の試薬で染色した場合の各白血球の波長特性を
第７図に示す。

【００７１】フィルター、ダイクロイックミラーの選定上記蛍光特性により、最適のフィルター、ダイクロイッ
クミラーは以下のように選定された。

【００７２】ダイクロイックミラー２２５３０ｎｍ（青反射）ダイクロイックミラー３０６００ｎｍ（赤反射）カラーフィルター３４６００ｎｍ（シャープ
カットフィルター）カラーフィルター４０５４０ｎｍ（シャープ
カットフィルター）分析結果上記条件にて、フローサイトメーターで測定し、赤蛍光
強度と緑蛍光強度とによる二次元分布図を描くと第８図
のようになる。血小板等６は白血球と分離されている。
好酸球４と好塩基球５は他の白血球と良く分離されてい
る。残りの白血球すなわちリンパ球１、単球２、好中球
３について側方散乱光の度数分布を書くと第９図のよう
になり、三つは良く分離されている。なお、第９図にお
いて、ＳｉｄｅＳｃ、は側方散乱光の相対強度を、Ｆ
ｒｅｑ、は度数を表わしている。

【００７３】なお、以上述べた実施例は、完全に染色が
終了したのちに（すなわち染色が平衡状態に達したのち
に）、測定を開始するものであるから、測定中に試料が
経時変化することはなく、また、白血球が極端に多い
か、または、少ない検体についても、常に、一定時間で
適正な強度にまで染色レベルが達している。したがっ
て、安定な測定が可能となるとともに、比較的低出力の
光源を使用しても、充分な蛍光強度の信号が得られる。
たとえば、この実施例では１０ｍＷのアルゴンイオンレ
ーザーをフローサイトメーターの光源として使用してい
る。

【００７４】しかし、使用されるフローサイトメーター
の光源は、前述の低出力のアルゴンイオンレーザーに限
らず、他の光源、たとえば、水銀アークランプ、クセノ
ンアークランプ、Ｈｅ−Ｃｄレーザー、Ｈｅ−Ｎｅレー
ザー、クリプトンイオンレーザー、大出力のアルゴンイ
オンレーザー等の光源であってもかまわない。そのとき
には、各光源に応じた染色条件、測定条件を決定すれば
良い。

【００７５】

【発明の効果】この発明の白血球測定用試薬および白血
球測定用試料調製方法を使用することによって血液を測
定し、白血球を分類・計数すると、以下に述べる様な効
果が得られる。

【００７６】（１）抗凝固処理を施した血液に赤血球溶
血剤を加え、次に緩衝剤と浸透圧補償剤を含む溶液を加
えるという二段階の処理で白血球の損傷を防いで赤血球
のみを溶血した測定用試料が得られる。

【００７７】（２）１分程度の試料調製時間で測定する
ことが可能であるため、測定迄に要する時間が短くて済
む。

【００７８】（３）酸性低張処理により赤血球のみを溶
血させてしまうので、赤血球と白血球の同時通過が無く
なったため、白血球の信号の分離が著しく良くなった。

【００７９】第２図および第３図を比較してみると、後
者において白血球が明確に弁別されているのがはっきり
わかるが、これは本発明の試薬中の赤血球溶血剤による
赤血球の溶血処理にもとづくものである。本発明ではさ
らに、溶血処理後、溶血剤によって白血球が損傷しない
ための緩衝剤による酸中和処理と浸透圧補償剤による処
理によって白血球分類に適した血液試料を提供できる。
各種白血球をその微妙な差異によって鋭く細かく分類す
るには，これらの処理が不可欠である。

【００８０】つまり、本発明によって初めて、簡単な工
程で、白血球の形態を維持したままで、赤血球を溶解す
ることができるようになった。

【００８１】さらに、たとえば蛍光染色法と組み合わせ
ることにより、白血球分類が非常に明瞭に行なえるよう
になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例で用いたフローサイトメーターの光学系
の一具体例を示す概略図。

【図２】赤血球の同時通過の影響があるときの側方散乱
光相対強度の度数分布を示す図。

【図３】赤血球の同時通過の影響が無いときの側方散乱
光相対強度の度数分布を示す図。

【図４】赤蛍光と緑蛍光を使用して、白血球を分類した
ときの二次元分布図。

【図５】ニュートラルレッドの濃度に対する好酸球と好
中球の分離能および好塩基球と好中球の分離能の変化を
示す図。

【図６】ｐＨの変化に対する好酸球と好中球の分離能お
よび好塩基球と好中球の分離能の変化を示す図。

【図７】各白血球の蛍光波長強度分布を示す図。

【図８】実施例において、赤蛍光と緑蛍光を使用して、
白血球を分類したときの二次元分布図。

【図９】実施例において、白血球を分類したときの側方
散乱光相対強度の度数分布を示す図。

【符号の説明】

図１中の符号は次のとおりに説明される：１０フローサイトメーターの光学系１２レーザー１４フローセル１６シリンドリカルレンズ１８コンデンサーレンズ２０アパーチャー２２ダイクロイックミラー２４側方散乱光２６蛍光２８光電子増倍管３０ダイクロイックミラー３２赤蛍光３４カラーフィルター３６光電子増倍管３８緑蛍光４０カラーフィルター４２光電子増倍管図４、８および９中の符号は次のとおりに説明される：１リンパ球２単球３好中球４好酸球５好塩基球６血小板等

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記（ａ）および（ｂ）からなる白血球
測定用試薬。（ａ）ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤を含有する低張
な溶液からなる赤血球溶血剤；（ｂ）上記緩衝剤中の酸を中和するための緩衝剤と、溶
液を白血球の形態を保持する浸透圧に調整するための浸
透圧補償剤とからなる溶液。
【請求項２】赤血球溶血剤のｐＨが２．０〜５．０で
あり、浸透圧が０〜１００ｍＯｓｍ／ｋｇである請求項
１記載の試薬。
【請求項３】下記（ａ）および（ｂ）の工程からなる
ことを特徴とする白血球測定用試料調製方法。（ａ）ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤を含有する低張
な溶液からなる赤血球溶血剤に、抗凝固処理を施した新
鮮な血液を加えて、赤血球を溶血させる工程；（ｂ）上記緩衝剤中の酸を中和するための緩衝剤と、溶
液を白血球の形態を保持する浸透圧に調整するための浸
透圧補償剤とからなる溶液を、前記（ａ）で得られた、
赤血球溶血剤で処理された血液試料に加える工程。
【請求項４】赤血球溶血剤のｐＨが２．０〜５．０で
あり、浸透圧が０〜１００ｍＯｓｍ／ｋｇである請求項
３記載の方法。