JPH0664053B2 - フロ−サイトメトリ−による白血球の分類方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、臨床検査分野における血球の分類測定法に
関するものであり、さらに詳しくは、フローサイトメー
ターを用いて、蛍光染色処理された血球を光学的に測定
し、白血球を分類する方法に関するものである。

（従来の技術） 健常人の末梢血中の白血球には、リンパ球、単球、好中
球、好酸球、好塩基球の種類がある。これらは各々その
機能が異っており、血球中の白血球を種類別に計数する
ことによって、病気の診断に貢献することができる。た
とえば、好中球の増加は、炎症、心筋梗塞、白血球など
にみられ、好中球の減少は、ウイルス性疾患、再生不良
性貧血、無顆粒球症などに見られる。好酸球の増加は、
寄生虫症、ホジキン病、アレルギー疾患などにみられ
る。単球の増加は、感染症の快復期、単球性白血球など
にみられる。

白血球を分離・計数するために従来から最も良く実施さ
れている方法は、血液像鑑定（視算法、用手法）と呼ば
れるものである。

この方法は、血液をスライドグラス上に塗抹し、血球を
固定し、さらに染色したのち、顕微鏡で観察し、一つず
つの白血球の形態的特徴（白血球の大きさ、核の形態、
細胞質の形態、顆粒の有無等）や染色度合から測定者が
いずれも血球であるかを判定し、分類−計数するもので
ある。このとき、一般の検査室では１００〜２００個の
白血球を計数し、白血球全体の数の中に占める各々の血
球の百分率（％）を測定値としている。

この方法は、顕微鏡による観察の前に、血液の塗抹、固
定、染色等の繁雑な標本作成操作が必要であることと、
顕微鏡を用いた分類−計数は、血球のわずかな差を見分
けなければならないこととのために、測定者に大きな負
担をかけるものとなっている。さらに、計数する白血球
数が少ない上に、塗抹試料上の血球が不均一な分布とな
っている場合もあり、熟練した測定者でも再現性のある
測定値を出すことは難しい。

このために、白血球の分類・計数が自動的に行える方法
が強く求められており、現在のところ、大きく分けて二
種類の方法が実現されている。

そのうちの一つの方法は、血球像をビデオカメラ等でと
らえ、コンピュータによる画像処理によって白血球を分
類するものである。この方法は従来の視算法に原理的に
は近い方法であるが、コンピュータによる処理では分類
できない血球も多く、完全には視算法に取ってかわるも
のとはなっていない。また、装置が複雑で大型になり、
価格が高くなるという問題もある。

白血球を自動的に分類−計数するもう一つの方法は、フ
ローシステムを利用した方法である。この方法は、血球
を希釈液中に浮遊させた試料を用い、血球が一個ずつ細
い検出器中を通過するようにこの試料を流し、このとき
検出器で発生する信号を分析することにより白血球を分
類するものである。このフローシステムを利用した方法
は、さらに、二つの方法に細分される。

第１の方法は、赤血球を溶解剤で破壊し、白血球のみが
浮遊した電解液を細孔中に流し、血球が細孔を通過した
ときの細孔部のインピーダンス変化を検出し、検出信号
の大きさによって白血球を分類するものである。

第２の方法は、光源と、試料中の細胞が１個ずつ細い流
路を流れるようにしたフローセルと、細胞から発せられ
た光を検出する測光部と、検出信号を解析する解析装置
とを備えたフローサイトメーターを使用するものであ
る。この方法では、血球を染色し、染色された血球を光
で照射し、そのとき血球から発する蛍光および場合によ
っては散乱光を一緒に検出し、検出信号の強度によって
白血球を分類しようとするものである。

この第２の方法に属するものとしては、例えば特公昭５
９−８５３号公報およびエル・エイ・カメンツキー(L.
A.Kamentsky)「ブラッド・セルズ(Blood Cells)」、第
６巻，１２１〜１４０頁、１９８０年に記載された方法
がある。こお方法は、血液に１０倍量のアクリジンオレ
ンジ染色液を加え、１分間にインキュベートしたのち、
アルゴンイオンレーザー等の光源で照射したとき血球か
ら発する緑色蛍光と赤色蛍光を測定し、その二次元分布
から、白血球を分類・計数するものである。

第２の方法に属する他の例としては、特開昭５５−２０
８２０号公報およびエイチ・エム・シヤピロ(H.M.Shapi
ro)他「ザ・ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・
アンド・サイトケミストリー(The Journal of Histoche
mistry and Cytochemistry)第２４巻第１号、３９６〜
４１１頁、１９７６年；同じく第２５巻第８号、９７６
〜９８９頁、１９７７年に記載された方法がある。この
方法は、血液に４倍量の染色液Ｉを加え、３分間インキ
ュベートした後、血液と等容の２０％ホルムアルデヒド
を加え、５分間固定を行い、希釈用の染色液IIで１５〜
２０倍に希釈し、フローサイトメーターで測定するもの
である。この測定に用いられるフローサイトメーター
は、光源として光を３分割した水銀アークランプ又は三
本のレーザーを備え、染色液に含まれる３種の蛍光染料
を各々励起し、その３種の蛍光と前方散乱光、側方散乱
光、吸光の６つのパラメーターを測定し、４段階の二次
元分布解析により白血球を分類・計数する装置である。

さらに、昭和６１年９月１０日出願の特願昭６１−２１
３７１５号においては、緩衝液、無機塩類及び蛍光染料
からなる染色液に血液を加えて染色するという一段階染
色工程が開示されているが、未溶解の赤血球が測定デー
タに影響を及ぼし、測定が不明確となるおそれがあっ
た。

（発明が解決しようとする問題点） フローシステムを利用して白血球を分類・計数する方法
のうち第１の方法においては、赤血球を破壊しなければ
ならないが、血液によっては赤血球の溶解が完全に行な
われ得ない場合もあり、このときには測定値の正確さが
損なわれるという問題がある。

フローシステムを利用した第２図の方法のうちの特公昭
５９−８５３号公報等に記載された方法は、細胞による
染料の吸収が平衡に達する前に、すなわち、染色の途中
で各白血球の蛍光強度の差が最大となる時間に測定する
ことを特徴としている。しかしながら、白血球数が極端
に多いか、または少い検体については、染色強度が適正
レベルとなる染色時間は正常な検体とは異ることにな
り、検体ごとに適切な染色時間を選定しなければならな
い。また、この方法は蛍光強度の差のみによって白血球
を分類しようとしているため、リンパ球と単球との分離
等各血液の分離が必ずしも良くないという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの他の例す
なわち特開昭５０−２０８２０号公報等に記載された方
法は、操作手順が多く、染色時間が長くかかる上に、複
雑な試薬を使用しなければならない。また、光源が３種
必要であることに加え、６つのパラメーターを測定しな
ければならないため装置が非常に複雑で高価なものとな
る。さらに、このように多くのパラメーターを測定して
いるため解析が複雑となり、大容量の解析装置を必要と
するという問題もある。

この発明は、上記従来の問題点を解決するためになされ
たもので、簡単な手順と構成で、白血球を正確に分類・
計数するための方法と装置を提供するものである。

（問題点を解決するための手段および作用） 本発明の方法は以下（ａ）〜（ｄ）の各工程からなる。

(a)好酸球および好塩基球による前方散乱光の強度を選
択的に低下させる物質と、pHを酸性域に保つための緩衝
剤とからなる低張な第１液に、抗凝固処理を施した血液
を加えて、赤血球を溶血させる工程。

(b)第１液の緩衝剤中の酸を中和し、溶液pHを反応pHに
保つための緩衝剤と、溶液を白血球の形態を保持する浸
透圧に調整するための浸透圧補償剤とからなる第２液
を、前記（ａ）で得られた溶血させた第１液で処理され
た血液試料に加えて、白血球を反応させる工程。

(c)前記染色された試料をフローサイトメーターに流
し、白血球の前方散乱光信号と側方(90゜)散乱光信号と
を測定する工程。

(d)白血球より発せられた前記前方散乱光および側方散
乱光信号により、各白血球の種類を判別し、計数し、各
白血球の比率を算出する工程。

なお、上記（ａ）の工程において第１液に白血球の核を
蛍光染色する染料を加え、（ｃ）の工程において蛍光に
より白血球を他の血球とあらかじめ区別したのち、白血
球の前方散乱光信号と側方散乱光信号とを測定する場合
もある。

また、本発明の、フローサイトメトリーによる白血球５
分類に使用される試薬は、以下の組成を有する。

（１）好酸球および好塩基球による前方散乱光の強度を
選択的に低下させる物質たとえばアストラゾンイエロー
３Ｇ （２）蛍光により白血球を他の血球と区別する場合に
は、白血球の核を染色する下記の染料のうちの一つ； アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ ペルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンＦＦＳ １，１′−ジメチルチオカルボシアニン １，１′−ジエチルチオカルボシアニン １，１′−ジエチル−９−メチルチオカルボシアニンブ
ロミド ２−［γ−（１′−エチル−４′，５′−ベンゾチアゾ
リリデン）プロペニル］−１−エチル−４，５−ベンゾ
オキサゾリウムヨージド アストラゾンレッド６Ｂ ベイシックバイオレット１６ ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−
４，５−ベンゾチアゾリウムヨージド ２，４−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
チル−ピリジニウムヨージド ２，６−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
チル−ピリジニウムヨージド ＴＡ−２（日本感光色素研究所：岡山市） アストラゾンオレンジＲ （特にアストラゾンオレンジＡが好適である。） さて、白血球からは前記前方散乱光信号及び側方散乱光
信号が発せられる。白血球の核を染色した場合には、さ
らに、蛍光信号も発せられる。蛍光信号は、細胞化学的
特性を反映するものであるが、本発明の白血球を他の血
球と区別する手段の一つとして使用される。この手段と
しては他の手段たとえば前方散乱光を用いてもかまわな
い。側方散乱光信号は細胞内情報を反映するものであ
る。すなわち、細胞内の細胞核が大きいほど、また、顆
粒が多いほど細胞内での光の反射が強まり、側方散乱光
強度は増大する。したがって、リンパ球は、その内部に
顆粒が存在しないかあるいは少いので、散乱光強度は一
番小さく、好中球は、その内部に顆粒が多く存在し、ま
た、大きな核を持つので散乱光強度は大きくなる。好酸
球の散乱光強度は好中球のそれにほぼ匹敵する。単球、
好塩基球による散乱光強度はリンパ球と好中球の中間に
ある。前方散乱光は細胞の内部状態及び大きさについて
の情報を反映し、特に本発明で使用するアストラゾンオ
レンジ３Ｇは好酸球と好塩基球のみの前方散乱光強度を
低下させ、単球、好中球からこれらの白血球を区別でき
るようにしている。各白血球の蛍光、前方散乱光及び側
方散乱光の相対強度は、第２（ａ）および２（ｂ）図に
示すものとなる。

次に、上記各光を測定する場合、蛍光は強度が小さいた
め、測定しようとすると高感度の光電子増幅管が必要と
なる。このため装置のコストが高くつく。

側方散乱光は、蛍光よりも強度が大きいので比較的低感
度の光電子増倍管を使用すればよい。

一方、前方散乱光は蛍光や側方散乱光と比較して強度が
非常に大きいので、光電子増倍管のような高感度の受光
素子を必要とせず、コンデンサーレンズで集光してフォ
トダイオードで測定することが可能である。

したがって、前方散乱光信号と側方散乱光信号とのみを
組み合わせることにより、後に詳細に述べるように白血
球の５分類が可能となり、これにより簡単でコストの低
い装置が実現できる。

本発明の方法は、前述のように、複雑な前処理等の操作
を必要とせず、２ステップの簡単な反応のみで、フロー
サイトメーターにより血液中の白血球だけを分類・計数
するものである。

本発明に使用されるフローサイトメーターの光学系の一
具体例を第１図に示された図面に基いて説明する。第１
図は前方散乱光と側方散乱光と蛍光を測定する場合を示
している。蛍光は、後述の実施例で示す様に蛍光信号に
より白血球を他の血球と区別する場合には必要である
が、その以外の手段たとえば前方散乱光により区別する
場合には必要ではない。実施例では、蛍光強度を用いて
白血球を分類する方法との比較も行なっているため、蛍
光の測定が必要であったので、上記、白血球と他の血球
とを区別する手段としても蛍光を利用した。このフロー
サイトメーターの光学系１０に使用された光源は、波
長；４８８nm、出力；１０ｍＷのアルゴンイオンレーザ
ー１２である。レーザー１２から発せられた光は、シリ
ンドリカルレンズ１６によって絞られ、フローセル１４
中を流れる測定用試料を照射する。

測定用試料中の染色された白血球がレーザー光によって
照射されると、白血球からは散乱光と蛍光が発せられ
る。

このうち、側方へ発せられた散乱光と蛍光はコンデンサ
ーレンズ１８によって集められ、アパーチャ２０を通過
したのち、ダイクロイックミラー２２に達する。

ダイクロイックミラー２２は側方散乱光２４を反射し、
蛍光２６を透過させる。ダイクロイックミラー２２によ
って反射された側方散乱光２４は光電子増倍管２８によ
って測定される。ダイクロイックミラー２２を透過した
蛍光２６はカラーフィルター４０を通過したのち光電子
増倍管４２によって測定される。

一方、光源１２からフローセル１４を前方へ透過した前
方散乱光３６はビームストッパ３０によって遮断され、
フォトダイオードに直接入らないようにする。ビームス
トッパ３０を通過した光はコンデンサーレンズ３２によ
り集光され、つづいてフォトダイオード３４で受光され
る。

カラーフィルター４０と光電子増倍管４２およびダイク
ロイックミラー２２は、前方散乱光と側方散乱光とによ
る測定結果と、蛍光と側方散乱光とによる測定結果とを
比較するために、参考として蛍光を測定するためのもの
である。ダイクロイックミラー２２は、蛍光を参考とし
て測定するために、蛍光と側方散乱光を分けるために置
かれているが、側方散乱光のみを測定するのであれば、
アパーチャ２０の後に光電子増倍管２８を直接配置する
だけで良い。蛍光を参考として測定しなければ、カラー
フィルター４０、ダイクロイックミラー２２及び高感度
であるとが要求される光電子増倍管４２は一切必要とし
ないので装置の構成が非常に簡単且つコスト安になる。

ところで、測定用試料中の赤血球は非常に弱い蛍光しか
発しないので、蛍光強度を測定する限りにおいては、赤
血球が白血球と同時に検出部を通過（同時通過）して
も、白血球の測定には妨害を与えない。しかし、散乱光
を測定する場合には、赤血球は白血球と同レベルの強度
の散乱光を発するため、白血球の計数に対して妨害を与
える。このとき、蛍光と散乱光を同時に測定し、一定レ
ベル以上の強度の蛍光を発したもののみを白血球とする
ことはできるが、白血球と赤血球が同時通過したときに
は、白血球による散乱光に赤血球による散乱光が重量さ
れるので、正しい白血球の散乱光強度を測定することが
できない。測定値の精密度を確保するためには白血球数
で約10,000個測定する必要があるため、赤血球などの影
響を少なくするために希釈倍率を上げて試料を薄くする
と測定時間が長くかかりすぎ、実用的でなくなる。

測定試料に対して、赤血球溶血処理等の赤血球除去操作
を行えば、赤血球による妨害の上記問題は解決できる
が、従来技術では染色条件に適合する赤血球溶血法等の
赤血球除去方法が存在しなかったため行なえなかった。
フローサイトメトリーによる白血球５分類で溶血を行な
っている先行技術例はない。又、１分以内で赤血球のみ
を溶血し、白血球の側方散乱光（形態情報）を損なわな
い様な方法は存在しなかった。

一般に赤血球を除去した白血球測定用試料を調整するに
は、下記の方法が知られている。

ｉ）赤血球溶血法 ａ）界面活性剤処理 ｂ）アンモニウム塩（たとえばＮＨ_４Ｃ）処理 ｃ）低張処理（生理的pH） ii）分離法 ｄ）遠心分離 ｅ）沈降分離 ｆ）その他 上記（ａ）〜（ｅ）について以下に説明する。

ａ）界面活性剤処理は反応を阻害する、赤血球溶血と同
時に、白血球の裸核化、膨潤、収縮等の形態学的変化を
生じ、散乱光信号による、白血球分画が、困難となる白
血球形態が、経時的に変化する等の問題がある。

ｂ）アンモニウム塩処理 反応を阻害する、赤血球溶血能力が低く、たとえば全血
を２０倍希釈した濃厚試料は調整が困難、赤血球溶血に
時間がかかる（３〜５分）等の問題がある。

ｃ）低張処理 一般に低張溶液中では、赤血球に比べ白血球の抵抗性が
高いことを利用し、赤血球のみを溶血し、白血球のみを
残すが、生理的pHのもとでは、赤血球が完全に溶血する
条件下では、白血球の一部も、破壊される。

ｄ）およびｅ）遠心分離と沈降分離 ・操作が繁雑で時間がかかる。

・白血球の損失、分画比の変動がおこりやすい等の問題
がある。

本発明方法では、前述の赤血球−白血球同時通過による
側方散乱光強度分布の乱れを低減させるため試料中の赤
血球を酸性低張処理することにより破壊している。

前述のように、生理的pH域で低張処置を行なった場合、
赤血球破壊と同時に一部の白血球の破壊も生ずる。

酸性pH域特にpH2.0〜5.0で低張処理を行なった場合、白
血球は完全に保持され、赤血球のみが破壊される。この
場合、白血球の裸核化、膨潤、収縮等の形態学的変化
は、生じない。

赤血球選択溶血の作用機序は不明であるが、おそらく、
低張処理による赤血球溶血の進行とともに、酸性pHによ
る赤血球の脆弱化、白血球の酸性固定が進行し、赤血球
に比べ抵抗力のある白血球のみが残ると考えられる。

酸性低張処理によって赤血球は、ゴースト化され、一部
フラグメント化される。その結果赤血球側方散乱光信号
強度は、リンパ球側方散乱光信号強度の1/2〜1/3以下と
なり事実上赤血球−白血球の同時通過は、無視しうるも
のとなる。

なお、側方散乱光信号強度のみによって赤血球と白血球
を完全に弁別することは困難であるが、前方散乱光信号
強度を比較すれば、酸性低張処理後の赤血球または血小
板と白血球とを完全に区別することができる。したがっ
て前方散乱光信号強度が所定レベル以上のものを白血球
とし、赤血球や血小板またはノイズと弁別する。

次に好酸球および好塩基球による前方散乱光の強度を選
択的に低下させる物質の作用について述べる。

アストラゾンイエロー３Ｇの化学構造式は次のとおりで
ある。

アストラゾンイエロー３Ｇの励起−蛍光特性として、励
起極大は４３０〜４５５nm、蛍光極大は５２５nmであ
る。

アストラゾンイエロー３Ｇは、好酸球および好塩基球内
部物質のヘパリン、ヒスタミン、ヒストン、プロタミン
などと結合し、顆粒を強く染色する。このことが前方散
乱光強度の低下にも大きく寄与している。

蛍光強度と側方散乱光強度による二次元分布図を描く
と、アストラゾンイエロー３Ｇが低濃度（５０〜１００
ppm）では好塩基球のみが測定可能域にある。好塩基球
の蛍光強度は１００〜２００ppmで一定値となり、それ
以上では増大しない。アルトラゾンイエロー３Ｇ濃度１
００〜２００ppmでは好酸球が測定可能となり、染料濃
度の増加とともに蛍光強度は増大する。

アストラゾンイエロー３Ｇのみの染料では蛍光を使用し
ては全白血球を測定できないため、アストラゾンイエロ
ー３Ｇの染色性能を損わずに全白血球の核を染色する染
料を加える必要があるが、本発明では赤血球を溶血する
ので、前方散乱光を使用して、他の血球と区別して白血
球のみを測定できるため、必ずしも蛍光を測定する必要
はない。ただし、赤血球を溶血した場合でも白血球の核
を染色する染料を加えて蛍光を測定すると、よりよく白
血球を他の血球から区別できるようになる。前述の白血
球の核を染色する染料は、いずれもこの目的に合致する
ものであるが、特に、フローサイトメーターの光源１２
にアルゴンイオンレーザーを使用する場合には励起極大
が４８８nm付近にある染料が好ましい。このように選定
された染料がアストラゾンオレンジＲである。

アストラゾンオレンジＲの化学構造式は次のとおりであ
る。

アストラゾンオレンジＲの励起・蛍光特性として、励起
極大は４９０nm、蛍光極大は５２０nmである。

アストラゾンイエロー３ＧとアストラゾンオレンジＲと
を組み合わせた白血球分類試薬を使用して白血球を分類
したときの、蛍光と側方散乱光とによる二次元分布図を
第２（ａ）図に示す。図において、ＦＬ、は蛍光相対強
度、Ｓｉｄｅ Ｓｃ、は側方散乱光相対強度を、また１
はリンパ球、２は単球、３は好中球、４は好酸球、５は
好塩基球の各集団を示す。

これに対し、第２（ｂ）図に示すように前方散乱光強度
と側方散乱光強度によっても白血球を明確に５分類でき
る。

通常、蛍光染色しない白血球試料を前方散乱光強度と側
方散乱光強度によって測定しても、第２（ｂ）図の様な
明確な５分類を得ることはできない。本発明のように好
酸球および好塩基球による前方散乱光の強度を選択的に
低下させることによって初めて前方散乱光強度と側方散
乱光強度のみによって白血球が５分類されることを見出
した。

次に、本発明方法に使用される溶液の組成、pH、浸透圧
について詳細に述べる (a)色素濃度 蛍光を使用して好酸球および好塩基球の他の白血球から
分離するためには、アストラゾンイエロー３Ｇ濃度を１
５０〜２００ppm以上とすれば良いが、また、この濃度
によれば、好酸球および好塩基球による前方散乱光の強
度が選択的に低下させられることもわかった。

アストラゾンイエロー３Ｇ濃度３００ppmにおけるリン
パ球、好中球の蛍光強度とノイズの強度のアストラゾン
オレンジＲ濃度への依存性をしらべたところ、アストラ
ゾンオレンジＲ濃度１００ppm以上でリンパ球、好中球
の蛍光強度とノイズとが分離できるようになり、２００
ppm以上で分離が良好になる。３００ppm以上ではリンパ
球・好中球とノイズとの分離は、ほぼ一定となるので、
アストラゾンオレンジＲを添加する場合には、その濃度
は300ppm程度が好ましい。

(b)第１液pH 第１液pHは、赤血球を溶血させるために5.0以下が良い
が、血小板の凝集を防ぐためには3.5以上が必要であ
る。特にpH4.5が適している。

(c)第１液緩衝剤 第１液緩衝剤としては、クエン酸、マレイン酸、ジグリ
コール酸などｐＫａが4.5付近の緩衝剤なら使用可能で
ある。たとえばジグリコール酸の場合、５０mM以上では
赤血球の溶血不良が見られる。最適なジグリコール酸濃
度は約１０mMである。

(d)第２液浸透圧 第２液に添加する浸透圧補償剤（たとえば塩化ナトリウ
ム）の量を変化させて、最終浸透圧を１６７〜３８７mO
sm/kgの間に変えても、分画パターンに変化は無い。第
２液浸透圧は最終浸透圧がほぼ等張（２８０mOsm/kg）
となるようにすれば良い。

(e)第２液緩衝剤 第２液緩衝剤としては、ホウ酸、トリス、トライシンな
どｐＫａが8.5〜9.0の付近のものが使用できる。たとえ
ばトライシンを用いた場合には、好ましいトライシン濃
度は３００mMである。

（実施例） 本発明を、前述した組成範囲の中で最も好適な条件のも
とで実施した例を以下に示す。

実施例１． 試薬組成 第１液 アストラゾンイエロー３Ｇ ３８５ppm （好塩基球および好酸球による前方散乱光強度を選択的
に低下させる物質） アストラゾンオレンジＲ ３３０ppm （白血球の核の蛍光染色用試料） ジグリコール酸水酸化ナトリウム（緩衝剤）１０mM pH4.5，浸透圧 ５０mOsm/kg 第２液 トライシン水酸化ナトリウム ３００mM （緩衝剤） 塩化ナトリウム ７５０mM （浸透圧調整剤） pH9.8〜9.9 浸透圧２２００mOsm/kg 反応方法 １容量部のＥＤＴＡ２Ｋ抗凝固血液に１８容量部の第１
液を加え、攪拌後２５°で２０秒間インキュベートした
のち、２容量部の第２液を加え、攪拌後２５°で４０秒
間インキュベートする。最終反応条件はpH8.6〜8.7、浸
透圧２８６mOsm/kg（等張）となる。

フィルター、ダイクロイックミラーの選定 ダイクロイックミラー２２ ５１０nm （５１０nm以下の波長を反射し、反射しなかった
光は透過する） カラーフィルター４０ ５２０nm （５２０nm以上の波長を透過するもの） 分析結果 上記条件にて、フローサイトメーターで測定し、蛍光強
度と側方散乱光強度による二次元分布図を描くと第２
(a)図のように白血球が５分類されている。

第２(a)図で表わされた白血球の各分画を前方散乱光強
度と側方散乱光強度とで分類すると第２(b)図のように
なる。なお、第２(a)図、２(b)図ともに、白血球とノイ
ズおよび赤血球のゴーストを含む他の血球との弁別は蛍
光信号を使用して行なった。

第３(a)図は、第２(a)図のリンパ球分画を包囲した図で
ある。第３(b)図はその分画内の信号のみを前方散乱光
強度と側方散乱光強度とで表わした図である。同様に、
第４(a)、５(a)、６(a)、７(a)図は各々第２(a)図の単
球、好中球、好酸球および好塩基球分画を包囲した図で
あり、第４(b)、５(b)、６(b)、７(b)図は各々それらの
対応する（ａ）図の分画を前方散乱光強度と側方散乱光
強度とで分類した図である。

図面中の符号ＦＬは蛍光相対強度、Ｓｉｄｅ Ｓｃ．は
側方散乱光相対強度、Ｆｏｗａｒｄ Ｓｃ．は前方散乱
光相対強度を示し、１はリンパ球、２は単球、３は好中
球、４は好酸球、５は好塩基球を表わす。

第８図は、全白血球数中のリンパ球数の比率（％）につ
いて、前方散乱光と側方散乱光とで測定する本発明の方
法の結果と、視算法との相関関係を示すものである。横
軸（Ｘ軸）は視算法によるリンパ球比率を、たて軸（Ｙ
軸）は本発明の方法によるリンパ球比率を示す。図中の
直線は回帰直線を、式はＹに対するＸの回帰式を示す。
また、ｒは相関係数を、ｎは検体数を示す。第９〜１２
図は、それぞれ単球、好中球、好酸球、好塩基球比率に
ついて、第８図と同様に示したものである。いずれも良
好な相関関係を示しているが、好塩基球比率（第１２
図）について本発明の方法と視算法との相関が悪いのは
血液中の好塩基球の絶対数が少いため、視算法の正確
度、再現性がもともと良くないためである。

なお、本実施例では、赤血球を溶血させたうえさらに蛍
光を使用したため、白血球と他の血球とをより良く弁別
できたが、前方散乱光信号によっても白血球と他の血球
とは弁別できる。この場合には白血球の核を染色する染
料アストラゾンオレンジＲは添加する必要はなく、蛍光
を測定する必要がないため、装置は簡単で安価となる。

実施例においては、完全に反応が終了したのちに（すな
わち反応が平衡状態に達っしたのちに）測定を開始する
ものであるから、測定中に試料が経時変化することはな
く、また、白血球が極端に多いか、または、少い検体に
ついても、常に、一定時間で適正な強度にまで反応レベ
ルが達している。したがって、安定な測定が可能となる
とともに、比較的低出力の光源を使用しても、充分な強
度の信号が得られる。たとえば、この実施例では１０mW
のアルゴンイオンレーザーをフローサイトメーターの光
源として使用している。

しかし、この発明に使用されるフローサイトメーターの
光源は、前述の低出力のアルゴンイオンレーザーに限ら
ず、他の光源、たとえば、水銀アークランプ、クセノン
アークランプ、Ｈｅ−Ｃｄレーザー、Ｈｅ−Ｎｅレーザ
ー、クリプトンイオンレーザー、大出力のアルゴンイオ
ンレーザー等の光源であってもかまわない。そのときに
は、各光源に応じた反応物質とその反応条件、測定条件
を設定すれば良い。

（発明の効果） この発明の方法によって血液を測定し、白血球を分類・
計数すると、以下に述べる様な効果が得られる。

(1)抗凝固処理を施した血液に第１液を加え、次に第２
液を加えるという二段階の反応のみで測定用試料が得ら
れるので、試料の前処理が簡単である。

(2)１分程度の試料調製時間で測定することが可能であ
るため、測定迄に要する時間が短くて済む。

(3)完全に反応が終了した状態で測定するため、測定中
の試料の経時的変化が無く、また、正常な検体のみなら
ず、白血球が極端に多いか、または少い検体について
も、一定時間で常に適正な強度に反応が成されている。
このため検体によって反応時間を変えるという必要は生
じない。

(4)蛍光を測定しない場合には、光源は低出力のもので
良い。さらに光源は一個しか必要とせず、測定パラメー
ターも前方散乱光１チャンネル、側方散乱光１チャンネ
ルを測定し、分析するだけで良いので、さらに蛍光を測
定しない場合には励起波長に制限がないためこの発明の
方法を実施するための装置は、構成が簡単で低価格のも
のとなる。

(5)酸性低張処理により赤血球のみを溶血させてしまう
ので、赤血球と白血球の同時通過が無くなったため、側
方散乱光信号によるリンパ球と単球と好中球との分離が
著しく良くなった。

(6)前方散乱光と側方散乱光を測定するだけで良い。蛍
光は強度が小さいので、測定しようとすると高感度の光
電子増倍管が必要でコスト高となる。側方散乱光は、蛍
光よりは強度が大きいので、比較的低感度の光電子増倍
管で良い。前方散乱光は、強度が非常に大きくフォトダ
イオードで充分測定できる。

したがって、装置はコストの低い簡単なもので充分とな
る。

本発明の方法において、一検体につき10000個以上の白
血球を測定すると、正確度および再現性にすぐれた測定
値が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明に使用されるフローサイトメーター
の光学系の一具体例を示す概略図。第１図の符号は次の
とおりに説明される： １０……フローサイトメーターの光学系 １２……レーザー １４……フローセル １６……シリンドリカルレンズ １８……コンデンサーレンズ ２０……アパーチャー ２２……ダイクロックミラー ２４……側方散乱光 ２６……蛍光 ２８……光電子増倍管 ３０……ビームストッパ ３２……コンデンサーレンズ ３４……フォトダイオード ３６……前方散乱光 ４０……カラーフィルター ４２……光電子増倍管 第２(a)図は白血球を蛍光強度と側方散乱光強度とで分
類した場合の各白血球の分布図である。 第２(b)図は白血球を前方散乱光強度と側方散乱光強度
とで分類した場合の各白血球の分布図である。 第３(a)図は、第２(a)図のリンパ球分画を包囲した図で
ある。第３(b)図はその分画内の信号のみを前方散乱光
強度と側方散乱光強度とで表わした図である。 同様に、第４(a)、５(a)、６(a)、７(a)図は各々第２
(a)図の単球、好中球、好酸球および好塩基球分画を包
囲した図であり、第４(b)、５(b)、６(b)、７(b)図は各
々それらの対応する(a)図の分画を前方散乱光強度と側
方散乱光強度とで表わした図である。 第２(a)ないし７(b)図中の符号は次のとおりである： ＦＬ．：蛍光相対強度、Ｓｉｄｅ Ｓｃ．：側方散乱光
相対強度、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃ．：前方散乱光相対強
度、１：リンパ球、２：単球、３：好中球、４：好酸
球、５：好塩基球。 第８図は、リンパ球比率についての前方散乱光と側方散
乱光とで測定した結果と視算法による結果との相関図で
ある。同様に第９〜１２図は、各々、単球、好中球、好
酸球、好塩基球比率についての相関図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下(a)〜(d)の各工程からなることを特徴
   とする、フローサイトメトリーによる白血球の分類方
   法。 (a)好酸球および好塩基球による前方散乱光の強度を選
   択的に低下させる物質と、pHを酸性域に保つための緩衝
   剤とからなる低張な第１液に、抗凝固処理を施した血液
   を加えて、赤血球を溶血させる工程。 (b)第１液の緩衝剤中の酸を中和し、溶液pHを反応pHに
   保つための緩衝剤と、溶液を白血球の形態を保持する浸
   透圧に調整するための浸透圧補償剤とからなる第２液
   を、前記（ａ）で得られた溶血させた第１液で処理され
   た血液試料に加えて、白血球を反応させる工程。 (c)前記反応させた試料をフローサイトメーターに流
   し、白血球の前方散乱光信号と側方散乱光信号とを測定
   する工程。 (d)白血球より発せられた前記前方散乱光信号および側
   方散乱光信号により、各白血球の種類を判別し、計数
   し、各白血球の比率を算出する工程。
2. 【請求項２】好酸球および好塩基球による前方散乱光の
   強度を選択的に低下させる物質がアストラゾンイエロー
   ３Ｇである特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】以下(a)〜(d)の各工程からなることを特徴
   とする、フローサイトメトリーによる白血球の分類方
   法。 (a)好酸球および好塩基球による前方散乱光の強度を選
   択的に低下させる物質と、白血球の核を蛍光染色する染
   料と、pHを酸性域に保つための緩衝剤とからなる低張な
   第１液に、抗凝固処理を施した血液を加えて、赤血球を
   溶血させる工程。 (b)第１液の緩衝剤中の酸を中和し、溶液pHを反応pHに
   保つための緩衝剤と、溶液を白血球の形態を保持する浸
   透圧に調整するための浸透圧補償剤とからなる第２液
   を、前記（ａ）で得られた溶血させた第１液で処理され
   た血液試料に加えて、白血球を反応させる工程。 (c)前記反応させた試料をフローサイトメーターに流
   し、蛍光により白血球を他の血球と区別したのち白血球
   の前方散乱光信号と側方散乱光信号とを測定する工程。 (d)白血球より発せられた前記前方散乱光信号および側
   方散乱光信号により、各白血球の種類を判別し、計数
   し、各白血球の比率を算出する工程。
4. 【請求項４】好酸球および好塩基球による前方散乱光の
   強度を選択的に低下させる物質がアストラゾンイエロー
   ３Ｇである特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. 【請求項５】白血球の核を蛍光染色する染料が下記に示
   す染料のうちの一つである特許請求の範囲第３項記載の
   方法。 アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ ペルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンＦＦＳ １，１′−ジメチルチオカルボシアニン １，１′−ジエチルチオカルボシアニン １，１′−ジエチル−９−メチルチオカルボシアニンブ
   ロミド ２−［γ−（１′−エチル−４′，５′−ベンゾチアゾ
   リリデン）プロペニル］−１−エチル−４，５−ベンゾ
   オキサゾリウムヨージド アストラゾンレッド６Ｂ ベイシックバイオレット１６ ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−
   ４，５−ベンゾチアゾリウムヨージド ２，４−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
   チル−ピリジニウムヨージド ２，６−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
   チル−ピリジニウムヨージド ＴＡ−２ アストラゾンオレンジＲ