JPH06100596B2 - フロ−サイトメトリ−による白血球の分類方法 - Google Patents

フロ−サイトメトリ−による白血球の分類方法

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JPH06100596B2
JPH06100596B2 JP61213715A JP21371586A JPH06100596B2 JP H06100596 B2 JPH06100596 B2 JP H06100596B2 JP 61213715 A JP61213715 A JP 61213715A JP 21371586 A JP21371586 A JP 21371586A JP H06100596 B2 JPH06100596 B2 JP H06100596B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、臨床検査分野における血球の分類測定法に
関するものであり、さらに詳しくは、フローサイトメー
ターを用いて、螢光染色処理された血球を光学的に測定
し、白血球を分類する方法に関するものである。
（従来の技術） 健常人の末梢血中の白血球には、リンパ球、単球、好中
球、好酸球、好塩基球の種類がある。これらの各々その
機能が異つており、血液中の白血球を種類別に計数する
ことによつて、病気の診断に貢献することができる。た
とえば、好中球の増加は、炎症、心筋梗塞、白血病など
にみられ、好中球の減少は、ウイルス性疾患、再性不良
性貧血、無顆粒球症などに見られる。好酸球の増加は、
寄生虫症、ホドキン病、アレルギー疾患などにみられ
る。単球の増加は、感染症の快復期、単球性白血病など
にみられる。
白血球を分類−計数するために従来から最も良く実施さ
れている方法は、血液像鑑定（視算法、用手法）と呼ば
れるものである。
この方法は、血液をスライドグラス上に塗抹し、血球を
固定し、さらに染色したのち、顕微鏡で観察し、一つず
つの白血球の形態的特徴（白血球の大きさ、核の形態、
細胞質の形態、顆粒の有無等）や染色度合から測定者が
いずれの血球であるかを判定し、分類−計数するもので
ある。このとき、一般の検査室では100〜200個の白血球
を計数し、白血球全体の数の中に占める各々の血球の百
分率（％）を測定値としている。
この方法は、顕微鏡による観察の前に、血液の塗抹、固
定、染色等の繁雑な標本作成操作が必要であることと、
顕微鏡を用いた分類−計数は、血球のわずかな差を見分
けなければならないこととのために、測定者に大きな負
担をかけるものとなつている。さらに、計数する白血球
数が少い上に、塗抹試料上の血球が不均一な分布となつ
ている場合もあり、熟練した測定者でも再現性のある測
定値を出すことは難しい。
このために、白血球の分類−計数が自動的に行なえる方
法が強く求められており、現在のところ、大きく分けて
二種類の方法が実現されている。
そのうちの一つの方法は、血球像をビデオカメラ等でと
らえ、コンピュータによる画像処理によつて白血球を分
類するものである。この方法は従来の視算法に原理的に
は近い方法であるが、コンピューターによる処理では分
類できない血球も多く、完全には視算法に取つてかわる
ものとはなつていない。また、装置が複雑で大型にな
り、価格が高くなるという問題もある。
白血球を自動的に分類−計数するもう一つの方法は、フ
ローシステムを利用した方法である。この方法は、血球
を希釈液中に浮遊させた試料を用い、血球が一個ずつ細
い検出器中を通過するようにこの試料を流し、このとき
検出器で発生する信号を分析することにより白血球を分
類するものである。このフローシステムを利用した方法
は、さらに、二つの方法に細分される。
第１の方法は、赤血球を溶解剤で破壊し、白血球のみが
浮遊した電解液を細孔中に流し、血球が細孔を通過した
ときの細孔部のインピーダンス変化を検出し、検出信号
の大きさによつて白血球を分類するものである。
第２の方法は、光源と、試料中の細胞が１個ずつ細い流
路を流れるようにしたフローセルと、細胞から発せられ
た光を検出する測光部と、検出信号を解折する解析装置
とを備えたフローサイトメーターを使用するものであ
る。この方法では、血球を染色し、染色された血球を光
で照射し、そのとき血球から発する螢光および場合によ
つては散乱光を一緒に検出し、検出信号の強度によつて
白血球を分類しようとするものである。
この第２の方法に属するものとしては、例えば特公昭59
−853号公報およびエル・エイ・カメンツキー（L.A.Kam
entsky）「ブラツド・セルズ（Blood Cells）」、第６
巻、121〜140頁、1980年に記載された方法がある。この
方法は、血液に10倍量のアクリジンオレンジ染料液を加
え、１分間インキュベートしたのち、アルゴンイオンレ
ーザー等の光源で照射したとき血球から発する緑色螢光
と赤色螢光を測定し、その二次元分布から、白血球を分
類・計数するものである。
第２の方法に属する他の例としては、特開昭50−20820
号公報およびエイチ・エム・シヤピロ（H.M.Shapiro）
他「ザ・ジヤーナル・オブ・ヒストケミストリー・アン
ド・サイトケミストリー（The Journal of Histochemis
try and Cytochemistry）第24巻第１号、396〜411頁、1
976年；同じく第25巻第８号、976〜989頁、1977年に記
載された方法がある。この方法は、血液に４倍量の染色
液Ｉを加え、３分間インキュベートした後、血液と等容
の20％ホルムアルデヒドを加え、５分間固定を行ない、
希釈用の染色液IIで15〜20倍に希釈し、フローサイトメ
ーターで測定するものである。この測定に用いられるフ
ローサイトメーターは、光源として光を３分割した水銀
アークランプ又は三本のレーザーを備え、染色液に含ま
れる３種の螢光染料を各々励起し、その３種の螢光と前
方散乱光、側方散乱光、吸光の６つのパラメーターを測
定し、４段階の二次元分布解析により白血球を分類・計
数する装置である。
（発明が解決しようとする問題点） フローシステムを利用して白血球を分類・計数する方法
のうち第１の方法においては、赤血球を破壊しなければ
ならないが、血液によつては赤血球の溶解が完全に行な
われ得ない場合もあり、このときには測定値の正確さが
損なわれるという問題がある。
フローシステムを利用した第２の方法のうちの特公昭59
−853号公報等に記載された方法は、細胞による染料の
吸収が平衡に達する前に、すなわち、染色の途中で各白
血球の螢光強度の差が最大となる時間に測定することを
特徴としている。しかしながら、白血球数が極端に多い
か、または少い検体については、染色強度が適正レベル
となる染色時間は正常な検体とは異なることになり、検
体ごとに適切な染色時間を選定しなければならない。ま
た、この方法は螢光強度の差のみによつて白血球を分類
しようとしているため、リンパ球と単球との分離等各血
球の分離が必ずしも良くないという問題がある。
フローシステムを利用した第２の方法のうちの他の例す
なわち特開昭50−20820号公報等に記載された方法は、
操作手順が多く、染色時間が長くかかる上に、複雑な試
薬を使用しなければならない。また、光源が３種必要で
あることに加え、６つのパラメーターを測定しなければ
ならないため装置が非常に複雑な高価なものとなる。さ
らに、このように多くのパラメーターを測定しているた
め解析が複雑となり、大容量の解析装置を必要とすると
いう問題もある。
この発明は、上記従来の問題点を解決するためになされ
たもので、簡単な手順と構成で、白血球を正確に分類・
計数するための方法と装置を提供するものである。
（問題点を解決するための手段） この発明の白血球の分類方法は以下の各工程から構成さ
れる。
（ａ） pHを3.5〜10.0に保つための緩衝剤と、白血球
が極端に変形しないように染色液の浸透圧を生理的浸透
圧の1/2〜２倍に保つための無機塩類と、 白血球をその細胞化学的特性に応じて染め分ける螢光染
料とからなる染色液に、 抗凝固処理を施した新鮮な血液を加えて、平衡状態に達
つするまで染色された測定用試料を作製する工程。
（ｂ） 前記測定用試料をフローサイトメーターに流
し、白血球と他の血球とを螢光強度によつて区別し、白
血球の側方（90゜）散乱光信号と、少くとも一つの螢光
信号とを測定する工程。
（ｃ） 白血球より発せられた前記複数の信号により、
各白血球の種類を判別し、計数し、各白血球の比率を算
出する工程。
白血球より発せられる前記複数の信号のうち、側方散乱
光信号は細胞内情報を反映するものである。すなわち、
細胞内の細胞核が大きいほど、また、顆粒が多いほど細
胞内での光の反射が強まり、側方散乱光強度は増大す
る。したがつて、リンパ球は、その内部に顆粒が存在し
ないかあるいは少いので、散乱光強度は一番小さく、好
中球は、その内部に顆粒が多く存在し、また、大きな核
を持つので、散乱光強度は大きくなる。好酸球の散乱光
強度は好中球のそれにほぼ匹敵する。単球、好塩基球に
よる散乱光強度はリンパ球と好中球の中間にある。この
ような理由により、各白血球の側方散乱光の相対強度
は、第２図に示すものとなる。
一方、螢光信号は、細胞化学的特性を反映するものであ
り、染料と各白血球との相互作用により、各白血球から
異なる強度の信号が得られる。
したがつて、側方散乱光信号に、染料に応じて、少くと
も一つの螢光信号を、組み合わせることにより、白血球
をさらに良く分類できるようになる。
この発明の方法は、前述のように、複雑な前処理等の操
作を必要とせず、一段階の簡単な染色のみで、フローサ
イトメーターにより血液中の白血球だけを分類・計数す
るものである。
この発明に使用されるフローサイトメーターの光学系の
一具体例を第１図に示された図面に基いて説明する。第
１図は側方散乱光と赤螢光と緑螢光とを測定する場合を
示している。このフローサイトメーターの光学系10に使
用された光源は、波長;488nm、出力;10mWのアルゴンイ
オンレーザー12である。レーザー12から発せられた光
は、シリンドリカルレンズ16によつて絞られ、フローセ
ル14中を流れる測定用試料を照射する。
測定用試料中の染色された白血球がレーザー光によつて
照射されると、白血球からは散乱光と螢光が発せられ
る。
このうち、側方へ発せられた散乱光と螢光はコンデンサ
レンズ18によつて集められ、アパーチヤ20を通過したの
ち、ダイクロイツクミラー22に達する。
ダイクロイツクミラー22は側方散乱光24を反射し、螢光
26を透過させる。ダイクロイツクミラー22によつて反射
された側方散乱光24は光電子増倍管28によつて測定され
る。ダイクロイツクミラー22を透過した螢光26のうち赤
螢光32はダイクロイツクミラー30によつて反射させら
れ、緑螢光38のみが透過させられる。反射された赤螢光
32はカラーフイルター34を通過したのち、光電子増倍管
36によつて測定される。透過した緑螢光38はカラーフイ
ルター40を通過したのち光電子増倍管42によつて測定さ
れる。
ところで、測定用試料中の赤血球は非常に弱い螢光しか
発しないので、螢光強度を測定する限りにおいては、赤
血球が白血球と同時に検出部を通過（同時通過）して
も、白血球の測定には妨害を与えない。しかし、散乱光
を測定する場合には、赤血球は白血球と同レベルの強度
の散乱光を発するため、白血球の計数に対して妨害を与
える。このとき、螢光と散乱光を同時に測定し、一定レ
ベル以上の強度の螢光を発したもののみを白血球とする
ことはできるが、白血球と赤血球が同時通過したときに
は、白血球による散乱光に赤血球による散乱光が重畳さ
れるので、正しい白血球の散乱光強度を測定することが
できない。第１図に示したフローサイトメーターの光学
系10では、希釈倍率をたとえば20倍とし、赤血球と白血
球との同時通過が起る確率を減少させ、赤血球による妨
害の程度を実用上無視できる程度におさえた測定用試料
をフローセル14に流すようにしている。
なお、フローサイトメーターで測定する白血球数は、測
定値の再現性を向上させるために、一検体あたり約1000
0個以上とすることが望ましい。
さて、第１図に示した光学系を備えたフローサイトメー
ターを使用して前記試料を測定すると、表１に示した６
つの群の17種の螢光染料により白血球を４分類以上に分
類できることがわかつた。
これら６つの群の染料は、各白血球をその細胞化学的特
性に基づき染め分ける。そこで、染料に応じた染色条
件、測定条件、測定パラメーターを適切に選択すると、
フローサイトメーターで測定したとき、第３図ａ〜ｄに
示される様な分類結果が得られる。ただし、第３図中の
１はリンパ球、３は単球、３は好中球、４は好酸球、５
は好塩基球の集合を表わしている。また、Side Sc.は側
方散乱光の相対強度、FL、は螢光の相対強度、Red FL、
は赤螢光の相対強度、Green FL、は緑螢光の相対強度を
表わしている（以下の図においても同じ）。
表１中の第１、第２群の染料は、螢光と側方散乱光を測
定パラメーターとすると、第３図ａに示される様に白血
球を４種類以上に分類する（実施例１、２参照）。
第３群の染料は、緑螢光と赤螢光を測定パラメーターと
すると、第３図ｂに示される様に白血球を４種類以上に
分類する（実施例３参照）。
第４群の染料は、赤螢光と側方散乱光を測定パラメータ
ーとすると、第３図ｃに示される様に白血球を４種類以
上に分類する（実施例４参照）。
第５、第６群の染料は、螢光と側方散乱光を測定パラメ
ーターとすると、第３図ｄに示される様に白血球を４種
類以上に分類する（実施例５、６参照）。
各染料の具体的な染色条件、測定条件、測定パラメータ
ーの例を表２に示した。
表２の17種の染料のうち、アクリジン・オレンジ、ロー
ダリン・オレンジでは一種の染料で白血球が５種類に分
類できる。しかし、この他の染料では、例えば第４群の
染料と第６群の染料を組み合せ、螢光と側方散乱光を測
定パラメーターとして測定してはじめて第３図ｅに示さ
れるように、白血球の５分類が可能となる（実施例７参
照）。
次に、表３に示す染料では、488nmという制限された励
起光では白血球を４分類以上することはできないが、リ
ンパ球、単球、顆粒球への３分類は可能である。このう
ち特に表４に示す染料では、表４に示された条件で測定
し、螢光と側方散乱光を測定パラメーターとすると、第
３図ｆに示されるように、リンパ球、単球、顆粒球の分
離が非常に良い二次元分布パターンが得られる（実施例
８参照）。
ここで、表１に示す17種の染料またはそれらの組み合わ
せに対し、さらに表４に示す染料を加え、螢光と側方散
乱光を測定パラメーターとすると、第３図ｇに示される
ように、一層明確に各白血球を区別することが可能とな
る（実施例９参照）。
（作用） このように、螢光に加えて側方散乱光をも測定パラメー
ターとしたことと、細胞を染めわける作用が強い染料及
びその組み合わせを見いだし、使用したこととにより、
リンパ球と単球との分離をはじめ、各白血球の分離が非
常に良くなつた。
（実施例） 以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明は何らそれらに限定されるものではない。
実施例 1. 第１群の染料フルオレセインによる染色例 EDTA抗凝固新鮮血80μを表２に示した組成のフルオレ
セイン染色液（即ち、10mMクエン酸緩衝液pH 4.5、NaCl
150mM、フルオレセイン100μg/ml）2mlに添加し、８分
間インキユベートした後、第１図に示した光学系10を備
えたフローサイトメーター、第１図において、ダイクロ
イツクミラー30に600nmの赤反射型のものを用い、カラ
ーフイルター34及び40にそれぞれ580nm、520nmのロング
パス（Long Pass）フイルターを使用している）のフロ
ーセル部14のレーザー光照射部へ層流原理に基づき、細
胞を流し、ある一定の螢光強度を有する細胞のみの側方
散乱光及び520〜600nmの螢光を測定し、解析を行なつ
た。
解析結果を第４図に示す。
実施例 ２〜6. 表１記載の第２群ないし第６群の染料を使用し、実施例
１と同様に、表２の条件で白血球を測定した。
実施例 7. 表１中の第４群の染料と第６群の染料との混合による５
分類染色例（第10図） アストラゾン・オレンジG10μg/ml、ニユートラルレツ
ド１μg/ml、NaCl 75mM、10mMホウ酸緩衝液、pH 9.0の
染色液を使い、染色時間１分で560nm以上の赤螢光と側
方散乱光を測定パラメーターとして実施例１と同様に白
血球を測定した。
実施例 8. 表４中の染料による３分類染色例（第11図） TA−２を用い、表４の条件で実施例１と同様に白血球を
測定した。
実施例 9. 表１の第４群の染料と第６群の染料と表４中の染料との
３種類の染料混合による５分類染色例 アストラゾンオレンジG10μg/ml、ニユートラルレツド
１μg/ml、TA−２ 10μg/ml、NaCl 70mM、10mMホウ酸
緩衝液pH 9.0の染色液を使い、染色時間１分で、540〜6
00nmの緑螢光、600nm以上の赤螢光及び側方散乱光を測
定パラメーターとして、実施例１と同様に白血球を測定
した。
第12図は赤螢光と側方散乱光による白血球の５分類例を
示している。
第13図は赤螢光と緑螢光により好塩基球５と好酸球４と
を分画した（第13図ａ）のち、第２回の解析として緑螢
光と側方散乱を用いてリンパ球１、単球２、好中球３を
分画した（第13図ｂ）例を示している。
なお、以上述べた実施例は、すべて、完全に染色が終了
したのちに（すなわち染色が平衡状態に達つしたのち
に）、測定を開始するものであるから、測定中に試料が
経時変化することはなく、また、白血球が極端に多い
か、または、少い検体についても、常に、一定時間で適
正な強度にまで染色レベルが達している。したがつて、
安定な測定が可能となるとともに、比較的低出力の光源
を使用しても、充分な螢光強度の信号が得られる。たと
えば、この実施例では、すべて、10mWのアルゴンイオン
レーザーをフローサイトメーターの光源として使用して
いる。
しかし、この発明に使用されるフローサイトメーターの
光源は、前述の低出力のアルゴンイオンレーザーに限ら
ず、他の光源、たとえば、水銀アークランプ、クセノン
アークランプ、He−Cdレーザー、He−Neレーザー、クリ
プトンイオンレーザー、大出力のアルゴンイオンレーザ
ー等の光源であつてもかまわない。そのときには、各光
源に応じた最適染料、染色条件、測定条件を設定すれば
良い。
（発明の効果） この発明の方法によつて血液を測定し、白血球を分類・
計数すると、以下に述べる様な効果が得られる。
（１） 染色液に抗凝固処理を施した血液を加えるとい
う一段階の染色のみで測定用試料が得られるので、試料
の前処理が非常に簡単にできる。
（２） 染料によつては、１分程度の染色時間で測定す
ることが可能であるため、測定迄に要する時間が短くて
済む。
（３） 完全に染色が終了した状態で測定するため、測
定中の試料の経時的変化が無く、また、正常な検体のみ
ならず、白血球が極端に多いか、または少い検体につい
ても、一定時間で常に適正な強度に染色がなされてい
る。このため検体によつて染色時間を変えるという必要
は生じない。
（４） 完全に染色が終了し、強い染色強度に達つした
のち測定するので、光源は低出力のもので良い。さらに
光源は一個しか必要とせず、測定パラメーターも螢光２
チヤンネル、側方散乱光１チヤンネルの中から２つのパ
ラメーターを選択して測定し、分析するだけで良いの
で、この発明の方法を実施するための装置は、構成が簡
単で低価格のものとなる。
（５） 螢光に加えて、側方散乱光も一緒に測定してい
ること、および、細胞を染め分ける作用が強い染料と、
その組み合わせを見いだし、使用したことにより、リン
パ球と単球の分離をはじめとして、分離度の非常に良い
各白血球の分類結果が得られる。
（６） 赤血球、血小板、および幼若赤血球は、螢光強
度が白血球に比べて非常に弱いので、これらは白血球と
完全に区別できる。このため、測定前にあらかじめ赤血
球を溶解させる必要がない。
本発明の方法において、 赤血球と白血球との同時通過の確率が充分に少なくなる
ような希釈倍率で血液を薄めると、側方散乱光を測定す
る上においても、赤血球による妨害は無視できる程度に
おさえられる。
又、一検体につき10000個以上の白血球を測定すると、
正確度および再現性にすぐれた測定値が得られる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、この発明に使用されるフローサイトメータの
光学系の一具体例を示す概略図。第１図中の符号は次の
とおりに説明される： 10……フローサイトメーターの光学系 12……レーザー 14……フローセル 16……シリンドリカルレンズ 18……コンデンサーレンズ 20……アパーチヤー 22……ダイクロイツクミラー 24……側方散乱光 26……螢光 28……光電子増倍管 30……ダイクロイツクミラー 32……赤螢光 34……カラーフイルター 36……光電子増倍管 38……緑螢光 40……カラーフイルター 42……光電子増倍管 第２図は、各白血球の側方散乱光相対強度を示すグラ
フ。 第3a〜ｇ図は、二つの信号を使用して、白血球を分類し
たときの二次元分布図。図面中の符号１はリンパ球、２
は単球、３は好中球、４は好酸球、５は好塩基球の集合
を表わしている。 第４〜13図は、二つの信号を使用して、白血球を分類し
たときの二次元分布の測定例を示す図。第３〜13図中Si
de Scは側方散乱光の相対強度、FLは螢光の相対強度、R
ed FLは赤螢光の相対強度、Green FLは緑螢光の相対強
度を表わす。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下（ａ）〜（ｃ）の各工程からなること
    を特徴とする、フローサイトメトリーによる白血球の分
    類方法。 （ａ） pHを3.5〜10.0に保つための緩衝剤と、白血球
    が極端に変形しないように染色液の浸透圧を生理的浸透
    圧の1/2〜２倍に保つための無機塩類と、 白血球をその細胞化学的特性に応じて染め分ける螢光染
    料とからなる染色液に、抗凝固処理を施した新鮮な血液
    を加えて、平衡状態に達するまで染色して測定用試料を
    調製する工程。 （ｂ） 前記測定用試料をフローサイトメーターに流
    し、白血球と他の血球とを螢光強度によって区別し、白
    血球の側方（90゜）散乱光信号と、少くとも一つの螢光
    信号とを測定する工程。 （ｃ） 白血球より発せられた前記複数の信号により、
    各白血球の種類を判別し、計数し、各白血球の比率を算
    出する工程。
  2. 【請求項２】工程（ａ）において使用する染料が下記に
    示すものであり、白血球を４以上に分類する特許請求の
    範囲第１項の方法。 第１群：キサンテン系染料 ピロニンＹ ローダミン3GO フルオレセイン 第２群：オキサカルボシアニン系染料 DiOC1（３） DiOC2（３） DiOC3（３） DiOC5（３） DiOC6（３） 第３群：アクリジン系染料 アクリジンオレジ ブリリアントホスフィン ローダリンオレンジ ユークリジン3RX フラボホスフィンＲ コリホスフィンＯ 第４群：アジン系染料 ニュートラルレッド 第５群：ジフエニルメタン系染料 オーラミンＯ 第６群：メチン系染料 アストラゾンオレンジＧ
  3. 【請求項３】工程（ａ）に於いて使用する染料が下記に
    示すものであり、白血球を３以上に分類する特許請求の
    範囲第１項の方法。 第１群：キサンテン系染料 アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン6G ローダミンＢ ローダミン19ペルクロレート ローダミン123 エオシンＹ シアノシン 第７群：オキサジン系染料 クレジルファーストバイオレット ダロウレッド 第８群：シアニン系染料 アクロノールフロキシンFFS 1,1′−ジメチルチオカルボシアニン 1,1′−ジエチルチオカルボシアニン 1,1′−ジエチル−９−メチルチオカルボシアニンブロ
    ミド ２−〔γ−（１′−エチル−４′,5′−ベンゾチアゾリ
    リデン）プロペニル〕−１−エチル−4,5−ベンゾオキ
    サゾリウムヨージド 第９群：スチリル系染料 アストラゾンレッド6B ベイシックバイオレット16 ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−4,
    5−ベンゾチアゾリウムヨージド 2,4−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチ
    ルピリジニウムヨジド 2,6−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチ
    ル−ピリジウムヨージド TA−２
  4. 【請求項４】工程（ａ）に於いて使用する染料が下記に
    示すものの組み合わせであり、白血球を５以上に分類す
    る特許請求の範囲第１項の方法。 第１群：キサンテン系染料 ピロニンＹ ローダミン3GO フルオレセイン 第２群：オキサカルボシアニン系染料 DiOC1（３） DiOC2（３） DiOC3（３） DiOC5（３） DiOC6（３） 第３群：アクリジン系染料 アクリジンオレンジ ブリリアントホスフィン ローダリンオレンジ ユークリジン3RX フラボホスフィンＲ コリホスフィンＯ 第４群：アジン系染料 ニュートラルレッド 第５群：ジフェニルメタン系染料 オーラミンＯ 第６群：メチン系染料 アストラゾンオレンジＧ
  5. 【請求項５】さらに下記の染料を組み合せて白血球を５
    以上に分類する特許請求の範囲第４項の方法。 ローダミンＳ ローダミン19ペルクロレート アクロノールフロキシンFFS ２−〔γ−（γ′−エチル−４′,5′−ベンゾチアゾリ
    リデン）プロペニル〕−１−エチル−4,5−ベンゾオキ
    サゾリウムヨージド 1,1′−ジエチル−９−メチルカルボシアニンブロミド
    アストラゾンレッド6B TA−２
  6. 【請求項６】工程（ｂ）に於いてフローサイトメーター
    の光源としてArイオンレーザー、He−Neレーザー、クリ
    プトンイオンレーザー、He−Cdレーザー、Hg−アークラ
    ンプ、Xe−アークランプのいづれかを用いた特許請求の
    範囲第１項の方法。
  7. 【請求項７】下記染料のうちの一つ又は２つ以上を組み
    合せた染料を用いる特許請求の範囲第６項の方法。 アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン6G ローダミンＢ ローダミン19ペルクロレート ローダミン123 エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット タロウレッド アクロノールフロキシンFFS;1,1′,3,3,3′,3′−ヘキ
    サメチルインドカルボシアニン 1,1′−ジメチルチオカルボシアニン 1,1′−ジエチルチオカルボシアニン 1,1′−ジエチル−９−メチルチオカルボシアニンブロ
    ミド；（９−Me−DiSC2（３）） ２−〔γ−（１′−エチル−４′,5′−ベンゾチアゾリ
    デン）プロペニル〕−１−エチル−4,5−ベンゾオキサ
    ゾリウムヨージド アストラゾンレッド6B ベイシックバイオレット16 ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−4,
    5−ベンゾチアゾリリウムヨージド 2,4−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチ
    ルピリジウムヨージド 2,6−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチ
    ルピリジウムヨージド TA−２ ピロニンＹ ローダミン3GO フルオレセイン DiOC1（３） DiOC2（３） DiOC3（３） DiOC5（３） DiOC6（３） アクリジンオレンジ ブリリアントホスフィン ローダリンオレンジ ユークリジン3RX フラボホスフィンＲ コリホスフィンＯ ニュートラルレッド オーラミンＯ アストラゾンオレンジＧ
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