ES2278566T3 - Reactivo y metodo para analizar componentes solidos en la orina. - Google Patents

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Abstract

Un reactivo capaz de diferenciar al menos en la orina componentes cristalinos, eritrocitos, hongos semejantes a las levaduras y leucocitos, que comprende: (I) un agente amortiguador del pH para mantener el pH entre 5, 0 y 9, 0, (II) un agente compensador de la presión osmótica para mantener la presión osmótica entre 100 mOsm/kg y 600 mOsm/kg, (III) un colorante capaz de ser excitado por una luz de longitud de onda en el rojo, y (IV) un agente quelante, en el que el colorante se selecciona del grupo que consiste en: NK-321 NK-1590 NK-529 NK-2780 NK-2782 Oxazina 4 NK-138 Verde básico Azul capri GON Verde básico 4 NK-2783 Azul básico 1 NK-375 NK-1954 Azul básico 20 Azul básico 24 Oxazina 720 NK-1836 NK-136 Cloruro de azul de nilo NK-1511 NK-376 NK-2711 Verde de yodo NK-96 Azul rodnilo, Azul capri BB, y Azul básico 124.

Description

Reactivo y método para analizar componentes sólidos en la orina.
Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a un reactivo para analizar los componentes sólidos de la orina y a un método para analizar componentes sólidos en la orina empleando el reactivo, y más particularmente a un reactivo empleado para un análisis óptico de componentes sólidos en la orina aplicando citometría de flujo y a un método para analizar los mismos.
2. Técnica relacionada
En las enfermedades renales y urinarias tales como las enfermedades infecciosas, lesiones inflamatorias, lesiones degenerativas, calculosis, tumores y semejantes, aparecen varias clases de componentes sólidos en la orina dependiendo de la enfermedad. Ejemplos de componentes sólidos incluyen eritrocitos, leucocitos, células epiteliales, desechos urinarios, bacterias, hongos, cristales e hilos de mucosidad. Analizar estos componentes en la orina es de gran importancia para el descubrimiento temprano de enfermedades renales y urinarias y la presunción de sitios anormales. Por ejemplo, la medida de los eritrocitos es importante para determinar si existe pérdidas de sangre en el camino desde el glomérulo néfrico a la uretra. La aparición de leucocitos sugiere la sospecha de una enfermedad renal tal como pielonefritis, que conduce al descubrimiento temprano de inflamación y una enfermedad infecciosa. Investigando los desechos urinarios y las características morfológicas de los eritrocitos también se puede inferir los sitios de los que derivan.
Convencionalmente, los componentes sólidos de la orina se han analizado por microscopia visual utilizando un microscopio. Esto se realiza concentrando la orina a ensayar por centrifugación, a continuación, algunas veces, después de teñir los sedimentos obtenidos, poniéndolos en un portaobjetos para clasificarlos y contarlos en el microscopio.
En años recientes, se ha desarrollado un aparato de medida automática en el que se combinan un flujo plano de revestimiento y una técnica de procesado de imágenes. La muestra de orina ajustada para fluir en una corriente extremadamente plana con un líquido de revestimiento que sirve como capa externa se transforma en una película mediante un grabador de vídeo y la foto fija así obtenida se somete a procesado de imágenes, cortando separadamente y mostrando de este modo las imágenes de los componentes sólidos en el líquido muestra. Observando la pantalla, un examinador distingue y cuenta los componentes sólidos contenidos en la misma.
Además, clasificando y contando automáticamente los componentes sólidos de la orina, la publicación de Patente Japonesa sin examinar n° Hei 4(1992)-337459 describe un reactivo (empleado) para el análisis de células en la orina aplicando citometría de flujo y un método para su análisis. El reactivo empleado en el mismo contiene un colorante fluorescente, un agente compensador de la presión osmótica y un agente amortiguador del pH. Se describen en la misma varias clases de colorantes fluorescentes, agentes compensadores de la presión osmótica y agentes amortiguadores del pH, y en una realización se describe un reactivo que emplea Rojo Neutro o Auramina O como colorante fluorescente.
El documento EP-A-0513762 describe un reactivo o un método para analizar eritrocitos, leucocitos, células epiteliales y bacterias en la orina, que comprende los siguientes componentes: (i) uno o más colorantes fluorescentes tales como bromuro de etidio, bromuro de etidio, 3,3'-dimetiltiocarbocianina, amarillo básico 11,..., (ii) un agente compensador de la osmolaridad y (iii) un agente amortiguador del pH a pH 8,5. Sin embargo, dicho reactivo no es capaz de distinguir adicionalmente en la orina entre cristales y hongos semejantes a las levaduras.
Incidentalmente, se desea ensayar la muestra de orina tan pronto como sea posible después de que la muestra se haya extraído del sujeto porque los componentes sólidos degeneran y el número de bacterias aumenta conforme pasa el tiempo.
La microscopía visual por microscopio requiere mucho tiempo y mucho trabajo para el pretratamiento de la muestra de orina, tal como centrifugación y concentración. Además, la microscopía es una gran carga para el examinador. Asimismo, la exactitud de la microscopía es baja porque el número de células observadas es pequeño.
Un aparato automático de medida que use una técnica de procesado de imágenes es ventajoso respecto a la microscopía porque se alivia la carga de la microscopía. Sin embargo, cuando se tienen que analizar muchas muestras no es lo suficientemente satisfactorio porque los componentes sólidos necesitan distinguirse mediante un examinador y la velocidad de procesado no es rápida.
Por otra parte, distinguir los componentes sólidos requiere destreza tanto en la microscopía visual como en el examen mediante un aparato automático de medida que use una técnica de procesado de imágenes.
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Un método descrito en la publicación de Patente Japonesa sin examinar n° Hei 4(1992)-337459 en el que se aplica la citometría de flujo al análisis de la orina tiene la ventaja de una rápida medida. Sin embargo, tras más investigación, se encontró que el método tenía los siguientes problemas:
(1) La aparición de cristales en la orina hacía difícil distinguir entre los cristales y los eritrocitos contenidos en la misma.
(2) Cuando aparecen muchas sales amorfas en la muestra, llega a ser difícil clasificar las otras células.
(3) Medir una muestra de orina que contiene hemoglobina o una proteína usando el reactivo que contiene Auramina O que tiene un pH de 8,5 mostrado en un ejemplo de la publicación de Patente Japonesa sin examinar nº Hei 4(1992)-337459 puede ser imposible de medir exactamente la muestra de orina debido al enlace de la hemoglobina o de la proteína al colorante y a la deposición de minúsculos sedimentos.
(4) Aunque el problema del apartado (3) se resuelve dejando el pH en un valor ácido, la capacidad de tinción del reactivo disminuye a tal valor de pH y, cuando aparecen en la muestra hongos semejantes a las levaduras, es difícil distinguir los eritrocitos de los hongos.
(5) Cuando la orina se analiza por citometría de flujo es necesario reprimir la relación de dilución para que sea baja porque la cantidad de componentes sólidos contenidos en la orina es pequeña. Sin embargo, cuando la relación de dilución es baja y se excreta en la orina una sustancia fluorescente, por ejemplo un agente farmacéutico tal como una vitamina o una sustancia antibiótica, puede ser difícil obtener una intensidad suficiente de la señal fluorescente de los componentes sólidos contenidos en la misma porque la fluorescencia de fondo (ruido de fondo) de la orina en sí misma no es despreciable. Cuando se usa Rojo Neutro, existirá una gran influencia de la fluorescencia de fondo provocada por el colorante que no se enlaza a las células.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un reactivo para analizar los componentes sólidos de la orina, que comprende: (I) un agente amortiguador del pH para mantener el pH entre 5,0 y 9,0, (II) un agente compensador de la presión osmótica para mantener la presión osmótica entre 100 mOsm/kg y 600 mOsm/kg, (III) un colorante capaz de ser excitado por una luz de longitud de onda en el rojo según la reivindicación 1, y (IV) un agente quelante.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para analizar los componentes sólidos de la orina mezclando la orina con el reactivo anterior para teñir los componentes sólidos deseados de la orina, aplicar una luz de excitación a los componentes sólidos en la orina anterior teñida y medir la luz dispersada y la luz fluorescente emitida por los componentes sólidos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un diagrama de dispersión obtenido siguiendo la luz dispersada emitida y la luz fluorescente emitida cuando los componentes sólidos de la orina se tiñen empleando el reactivo para analizar los componentes sólidos de la orina según la presente invención.
La Fig. 2 es una vista aumentada de la Fig. 1.
La Fig. 3 es una vista modelo del diagrama de dispersión obtenido midiendo la luz dispersada emitida y la luz fluorescente emitida cuando los componentes sólidos de la orina se tiñen empleando el reactivo para analizar los componentes sólidos de la orina según la presente invención.
La Fig. 4 es una vista modelo del diagrama de dispersión que ilustra la relación entre la anchura del pulso de luz dispersada y el valor de la altura del pulso de resistencia de la señal de resistencia eléctrica medida después de que los componentes sólidos de la orina se hayan teñido empleando el reactivo para analizar los componentes sólidos de la orina según la presente invención.
La Fig. 5 es una vista modelo del diagrama de dispersión que ilustra la relación entre la anchura del pulso de luz dispersada y la anchura del pulso de luz fluorescente de la señal de resistencia eléctrica medida después de que los componentes sólidos de la orina se hayan teñido empleando el reactivo para analizar los componentes sólidos de la orina según la presente invención.
La Fig. 6 es una vista modelo esquemática que ilustra un citómetro de flujo preferiblemente utilizado para medir los componentes sólidos de la orina empleando el reactivo para analizar los componentes sólidos de la orina según la presente invención.
La Fig. 7 es un diagrama de dispersión obtenido midiendo la intensidad de la luz dispersada emitida y intensidad de la luz fluorescente emitida cuando los componentes sólidos de la orina se tiñen empleando el reactivo que contiene auramina O para analizar los componentes sólidos de la orina.
La Fig. 8 es una vista aumentada de la Fig. 7.
La Fig. 9 es un diagrama de dispersión obtenido midiendo la intensidad de la luz dispersada emitida y la intensidad de luz fluorescente emitida cuando los componentes sólidos de la orina que tienen fluorescencia de fondo se tiñen empleando el reactivo que contiene auramina O para analizar los componentes sólidos de la orina.
La Fig. 10 es una vista aumentada de la Fig. 9.
Descripción de las realizaciones preferidas
Ejemplos de componentes sólidos de la orina que tienen que medirse según la presente invención incluyen, especialmente, eritrocitos, leucocitos, células epiteliales, desechos urinarios, bacterias y hongos semejantes a las levaduras.
El agente amortiguador del pH en el reactivo analizante de la presente invención se puede utilizar para mantener el pH dentro de un cierto intervalo que sea capaz de obtener una intensidad de fluorescencia estable de la muestra que ha de medirse. El valor del pH se puede ajustar para que esté dentro del intervalo de pH 5,0 a 9,0 con el fin de impedir la hemolisis de los eritrocitos. Entre los componentes cristalinos contenidos en la orina, especialmente las sales amorfas se pueden disolver por dilución con una disolución acuosa tal como una disolución salina fisiológica, una disolución de ácido clorhídrico diluido, una disolución de ácido acético diluido, y una disolución acuosa de hidróxido de potasio. Sin embargo, algunos de los componentes cristalinos contenidos en la orina precipitan en una disolución ácida y otros precipitan en una disolución alcalina. Por lo tanto, es preferible un valor de pH de 6,5 a 7,5 y es más preferible un valor de pH de 6,8 al 7,2 porque la sales amorfas que precipitan en una disolución ácida o alcalina se disuelven más rápidamente alrededor de pH neutro. Como agentes amortiguadores del pH se pueden utilizar los convencionalmente conocidos. Por ejemplo, se puede utilizar un agente amortiguador del pH de Good tal como Tris y MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricina, Bicina y Taps. Entre éstos, es preferible el HEPES. La concentración se controla dependiendo de la capacidad amortiguadora del agente amortiguador del pH que se utilice para que el valor de pH permanezca entre un cierto intervalo cuando la muestra de orina se diluya. Generalmente, la concentración es 20 a 500 mM, preferiblemente 50 a 200 mM.
El agente compensador de la presión osmótica se puede añadir para impedir la hemolisis de los eritrocitos y obtener una intensidad de fluorescencia estable. La presión osmótica de la orina se distribuye ampliamente desde 50 a 1300 mOsm/kg. Cuando la presión osmótica del agente analizante es demasiado baja se produce la hemolisis de los eritrocitos en una etapa temprana. Cuando es demasiado alta las células son excesivamente dañadas. Por lo tanto, la presión osmótica es preferiblemente de 100 a 600 mOsm/kg, más preferiblemente de 150 a 500 mOsm/kg. Como agente compensador de la presión osmótica se puede utilizar una sal inorgánica, una sal orgánica, tal como un propionato, o un azúcar. Ejemplos de sales inorgánicas comprenden cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de litio o semejantes. Ejemplos de propionatos comprenden propionato de sodio, propionato de potasio, propionato de amonio o semejantes. Ejemplos de otras sales orgánicas comprenden oxalatos, acetatos o semejantes. Ejemplos de azúcares comprenden sorbitol, glucosa, manitol o semejantes.
En la presente invención se usan colorantes capaces de ser excitados por una luz de longitud de onda en el rojo. En tal caso, el colorante de análisis se puede preparar utilizando un colorante o una mezcla de dos o más colorantes seleccionados del grupo que consiste en:
1
2
3
4
5
6
7
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9
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26
Azul rodnilo,
Azul capri BB,
Azul básico 124 y
Azul básico 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En los colorantes anteriores, la serie NK se puede obtener de Nippon Kankoh Shikiso Kenkyusho, Ltd.; la oxazina 4, el perclorato de oxazina 750 y la oxazina 720 se pueden obtener de Exciton Inc.; el verde básico y el verde yodo se pueden obtener de E. Merck Darmstadt; el azul de Capri GON se puede obtener de Tokyo Kasei Kogyo Industry Co., Ltd.; el cloruro de azul de nilo se puede obtener de Nacarai Tesque, Inc.; el azul de rodnilo se puede obtener de Aldrich Chemical Company Inc.; y el azul de Capri BB se puede obtener de Chloma Gesellshaft Schmid & Co. La concentración del colorante se ajusta para que la concentración final se pueda usar dentro del intervalo de 1 a 300 ppm, entre las cuales es preferible 5 a 100 ppm.
El agente quelante se puede usar para disolver sales amorfas (por ejemplo, fosfato de amonio y magnesio, y carbonato de calcio) que aparecen en la orina. Se puede usar cualquier clase de agente quelante en tanto y cuanto sea un agente descalcificante o desmagnesificante. Por ejemplo, se pueden usar sal de EDTA, CyDTA, DHEG, DPTA-OH, EDDA, EDDP, GEDTA, HDTA, HIDA, Metil-EDTA, NTA, NTP, NTPO O EDDPO. Preferiblemente se usa sal de EDTA, CyDTA o GEDTA. La concentración del agente quelante puede usarse dentro del intervalo de 0,05 a 5% en peso, preferiblemente 0,1 a 1% en peso. Aquí, el agente descalcificante o desmagnesificante quiere decir un agente capaz de enlazarse con iones calcio y magnesio para formar compuestos solubles en agua.
El reactivo según la presente invención puede consistir en una disolución que contiene el agente amortiguador del pH, el agente compensador de la presión osmótica, los colorantes y el agente quelante. Alternativamente, el reactivo puede consistir en dos disoluciones en las que una es una disolución colorante que contiene los colorantes y la otra es una disolución diluyente que contiene el agente amortiguador del pH, el agente compensador de la presión osmótica y el agente quelante.
Cuando el reactivo consiste en dos disoluciones, es decir, una disolución colorante y una disolución diluyente, se puede mejorar la estabilidad para conservar la disolución de colorante disolviendo los colorantes en un disolvente orgánico soluble en agua, porque con frecuencia los colorantes son inestables en una disolución acuosa. La disolución colorante puede además comprender un agente estabilizante de estos colorantes. El disolvente orgánico soluble en agua que se puede utilizar en este caso es, preferiblemente, un alcanol inferior, un alquilenglicol inferior o un alquilenglicol inferior-mono-alquilo inferior-éter. Por ejemplo, se pueden utilizar metanol, etanol, n-propanol, etilenglicol, dietilenglicol, trietilenglicol, etilenglicol-mono-metil-éter o etilenglicol-mono-etil-éter. Entre éstos, son preferibles el etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol. Considerando la influencia sobre las células de la orina y la viscosidad, el más preferido es el etilenglicol. La disolución diluyente también puede comprender un agente antibacteriano para impedir la proliferación de las bacterias durante la conservación a largo plazo. Los agentes antibacterianos a utilizar no están específicamente limitados. Se puede utilizar un agente antibacteriano tipo triazina, un agente antibacteriano tipo tiazol tal como BIT (benzisotiazolona) y un agente antibacteriano tipo piridina tal como PTO (piritiona). El agente antibacteriano también se puede añadir en una concentración razonable que no tenga una mala influencia sobre el sistema de medida. El agente estabilizante y el agente antibacteriano anteriormente mencionados se pueden añadir al reactivo que consiste en una disolución.
Convenientemente, la conductividad eléctrica del reactivo según la presente invención se ajusta dentro del intervalo de 1 a 10 mS/cm, preferiblemente 4 a 7 mS/cm, para detectar desechos urinarios midiendo la señal de la resistencia eléctrica. Cuando el agente amortiguador del pH o el agente compensador de la presión osmótica tienen un alto grado de disociación electrolítica, ajustar la conductividad eléctrica dentro del intervalo anterior disminuye la presión osmótica, lo cual puede provocar hemolisis de los eritrocitos en la orina. Sin embargo, usando como agente amortiguador del pH un ácido orgánico o utilizando una sal orgánica o un no electrólito (tal como un azúcar) como agente compensador de la presión osmótica o combinando apropiadamente los dos agentes anteriores, la presión osmótica se puede elevar deseablemente a la vez que se impide el aumento de la conductividad eléctrica.
\newpage
Para analizar los componentes sólidos de la orina con el reactivo de la presente invención se mezcla la orina original con el reactivo.
Usando un reactivo que consiste en una disolución que contiene los componentes (I) a (IV) la orina original se diluye de 2 a 20 veces mediante mezclado y los componentes sólidos contenidos en la orina se tiñen. La relación de dilución de la orina original es preferiblemente de 2 a 16 veces, especialmente de 4 a 10 veces. Aquí, el reactivo anterior se calienta antes, preferiblemente de 30 a 40°C, deseablemente de 33 a 37°C, para disolver rápidamente las sales amorfas contenidas en la orina. Es deseable mezclar la orina original con el reactivo en intervalo de temperatura ambiente a 40°C, preferiblemente de 33 a 37°C, durante 5 a 60 segundos, preferiblemente 10 a 30 segundos. Si el reactivo consiste en dos disoluciones, es decir, una disolución colorante y una disolución diluyente, la orina original se añade después de que la disolución colorante se mezcle con la disolución diluyente o, alternativamente, la disolución colorante se añade después de que la orina se mezcle con la disolución diluyente. En el caso del reactivo que consiste en dos disoluciones, la relación de dilución final de la orina es preferiblemente de 4 a 10 veces. Además, la disolución diluyente se calienta antes, preferiblemente de 30 a 40°C, deseablemente de 33 a 37°C, para disolver rápidamente las sales amorfas contenidas en la orina.
La orina así mezclada con el anterior reactivo se hace pasar a través de una celda de flujo como una muestra de orina. A continuación, se aplica una luz de excitación a la muestra de orina que se mueve a través de la celda de flujo para medir las intensidades de la luz dispersada emitida y de la luz fluorescente emitida, emitidas por los componentes sólidos de la muestra de orina. De esta forma pueden analizarse los componentes sólidos contenidos en la orina. En el caso de medir desechos urinarios, también es deseable medir la intensidad de la señal de resistencia eléctrica (información de volumen) de la muestra de orina porque debería aumentar la sensibilidad de detención de los desechos. Por lo tanto, es deseable que el método para analizar orina según la presente invención emplee un citómetro de flujo capaz de medir tanto la señal de resistencia eléctrica como la información óptica. En la figura 6 se muestra un ejemplo de citómetro de flujo que es adecuado para utilizar en la presente invención.
En primer lugar, abriendo las válvulas 1 y 2 durante un cierto período de tiempo, el líquido muestra se introduce por la tobera de succión 3 mediante la presión negativa de la cámara de líquido agotado y rellena las válvulas 1 y 2. El líquido muestra se lanza por la tobera de muestras 6 mediante la operación de la jeringa 4 que fuerza hacia afuera el líquido con un caudal constante. Al mismo tiempo, abriendo la válvula 8 se suministra a la cámara 7 de la celda de flujo 5 un líquido de revestimiento. Mediante este procedimiento la muestra se estrecha a lo largo de la superficie interior de la cámara 7 para formar un flujo de revestimiento y pasa a través del orificio 11 como se muestra en la fig. 6. La forma del orificio 11 es prismática, siendo la longitud de cada lado interno de 100 a 300 \mum. El orificio 11 se fabrica de vidrio óptico (incluyendo vidrio de cuarzo). El flujo de revestimiento así formado permite que las partículas fluyan una por una ordenadas en línea a través del centro del orificio 11. El líquido muestra y el líquido de reves-
timiento que han pasado a través del orificio 11 se descargan a través del tubo colector 14 asegurado a la cámara 25.
Dentro de la cámara 25 se proporciona el electrodo 13 fabricado de platino y sirve como electrodo positivo. Dentro de la cámara 7 se proporciona el electrodo 12 fabricado de acero inoxidable y sirve como electrodo negativo. La resistencia eléctrica entre los electrodos 12 y 13 se determina mediante la resistividad (conductividad eléctrica) del líquido de revestimiento, la dimensión del agujero (sección transversal del agujero), la longitud del agujero del orificio, la resistividad del líquido muestra y el diámetro del líquido muestra que fluye.
Mediante la fuente de alimentación 15 se suministra una corriente continua constante entre los electrodos 12 y 13. Proporcionar una corriente continua constante entre los electrodos 12 y 13 genera un voltaje de corriente continua determinado por la resistencia eléctrica y la magnitud de la corriente eléctrica entre los electrodos 12 y 13. Cuando las partículas pasan a través del orificio 11, la resistencia eléctrica entre los extremos del orificio 11 cambia. Así, mientras las partículas están pasando, el voltaje generado entre los electrodos 12 y 13 aumenta. Asimismo, se genera un voltaje semejante a un pulso en proporción al tamaño de las partículas que pasan a través del orificio 11. Por lo tanto, este voltaje se añade al voltaje de corriente continua anterior y el voltaje resultante aparece entre los electrodos 12 y 13. Este se detecta mediante un amplificador 16, que produce como salida una señal de resistencia 29.
Mediante las lentes condensadoras 18 se estrecha una luz láser irradiada desde un láser 17 para que tenga forma elíptica y se aplica al flujo de muestra 26, generalmente en el centro de orificio 11. La forma de la luz láser es como sigue. Su longitud a lo largo del flujo de muestra es aproximadamente la misma que el diámetro de partícula de las células sanguíneas, por ejemplo, tan estrecho como aproximadamente 10 \mum. La longitud a lo largo de la dirección perpendicular tanto al flujo de muestra como al eje óptico de la luz aplicada es considerablemente mayor que el diámetro de partícula de las células sanguíneas, por ejemplo, aproximadamente de 150 a 300 \mum. Parte de la luz láser aplicada al flujo de muestra 26 no golpea a las células (componentes sólidos) y se transmite a través de la célula de flujo 5. Esta luz transmitida se interrumpe mediante un interceptor de rayos 19. La otra luz aplicada al flujo de muestra 26 golpea a las células, produciendo una luz dispersada emitida y una la luz fluorescente emitida en un estrecho intervalo de ángulos. La luz dispersada y la luz fluorescente emitidas se recogen mediante unas lentes colectoras 20 y a continuación pasan a través del orificio de 21 de la pantalla 30 para alcanzar el espejo dicroico 22. Teniendo una longitud de onda mayor que la de la luz dispersada, la luz fluorescente se transmite a través del espejo dicroico 22 en una relación de alta transmitancia. Después de que la luz dispersada se separa más mediante un filtro 23, la luz fluorescente se detecta mediante un tubo fotomultiplicador (PMT) 24 y se transforma en señales eléctricas 27 para su salida. La luz dispersada se refleja mediante el espejo dicroico 22 y es recibida por un fotodiodo 31 para ser transformada en señales eléctricas 28 para su salida.
El reactivo de la presente invención para analizar componentes sólidos de la orina proporciona el efecto de que mezclando el reactivo con la orina las sales amorfas se disuelven y los componentes sólidos de la orina se tiñen para poder clasificarlos adecuadamente.
Generalmente, la mayoría de las sales amorfas con frecuencia observadas en los sedimentos urinarios son fosfatos y uratos. La mayoría de los fosfatos son sales de calcio y, añadiendo un agente quelante, las sales de calcio forman compuestos quelatos solubles en agua que se pueden disolver. Los uratos se disuelven por dilución y calentamiento. Estas sales amorfas también se observan en la orina de un ser humano normal y son de baja importancia clínica. Por lo tanto, con el fin de detectar exactamente otros componentes sólidos clínicamente significativos (eritrocitos, leucocitos, bacterias, hongos semejantes a las levaduras, desechos urinarios, y otros) es necesario disolver las sales amorfas. Sin embargo, los cristales grandes y el oxalato de calcio son lentos de disolver incluso por adición de un agente quelante o por tratamiento térmico y algunos de ellos permanecen sin disolver cuando se lleva a cabo la medida por citometría de flujo. Por otra parte, los cristales mórbidos tales como los de cistina, leucina, tirosina, colesterina y 2,8-DHA no se disuelven fácilmente incluso mediante estas operaciones. Debido a esta razón, los cristales que permanecen solapan el dominio de los eritrocitos, haciendo algunas veces difícil medir exactamente los eritrocitos. Por lo tanto, es especialmente necesario teñir fuertemente los eritrocitos para que estos cristales no tengan una mala influencia sobre la medida de otros componentes sólidos.
Mientras tanto, la intensidad de fluorescencia exhibida por los componentes sólidos de la orina varía en un amplio intervalo desde el débil al fuerte dependiendo de la clase de componentes sólidos. Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia de los eritrocitos es mucho más débil que la de los leucocitos. Hasta ahora, el caso de medir leucocitos en la sangre, no era necesario prestar mucha atención a los eritrocitos o a la fluorescencia de fondo que exhibe sólo una intensidad de fluorescencia extremadamente débil, porque los leucocitos se tiñen fuertemente. Sin embargo, para analizar componentes sólidos en la orina, es necesario detectar sustancias tales como los eritrocitos que sólo exhiben una intensidad débil de fluorescencia. Con el fin de conseguir esto, necesita ajustarse la sensibilidad del detector (PMT) a una mayor que en el caso de medir leucocitos en la sangre. Sin embargo, aumentar la sensibilidad del detector conlleva una mala influencia debido a la fluorescencia de fondo de la orina en sí misma o a la fluorescencia de fondo de los colorantes fluorescentes que no se enlazan a las células, de modo que algunas veces es difícil obtener una intensidad suficiente de la señal de fluorescencia con eritrocitos para realizar medidas de los mismos.
A través de investigaciones, se ha encontrado que los anteriores problemas se pueden resolver utilizando un colorante fluorescente tal como DiOCn(3) (n = l a 6) capaz de teñir la membrana celular de los eritrocitos.
El primer colorante, especialmente, DiOCn(3) (n = l a 6), se enlaza mediante enlace iónico a todas las clases de membranas, núcleos y gránulos celulares. Por otra parte, como se describe en el ejemplo de la memoria descriptiva de la publicación de patente japonesa sin examinar n° Hei 4 (1992)-337459, la Auramina O se enlaza a los RNAs de una célula. Por lo tanto, la Auramina O tiñe sólo un poco la membrana celular de los eritrocitos y la intensidad de la fluorescencia obtenida es tan pequeña como la exhibida por otros componentes sólidos tales como cristales y hongos semejantes a las levaduras, de modo que es difícil distinguir a los eritrocitos de los otros componentes sólidos cuando están contenidos en la misma muestra. Sin embargo, el DiOCn(3) (n=1 a 6) se enlaza a y se adsorbe sobre todas las clases de membranas celulares y al mismo tiempo mejora la capacidad de tinción de los eritrocitos y de los hongos semejantes a las levaduras, haciendo así posible distinguir cristales, eritrocitos y hongos semejantes a las levaduras mediante la diferencia de la intensidad de fluorescencia. Mientras tanto, los leucocitos se tiñen mucho más fuertemente que los eritrocitos. Además, la mejora de la capacidad de tinción aumenta la intensidad de la fluorescencia, de modo que la influencia de la fluorescencia de fondo se torna pequeña.
Como segundo colorante fluorescente se utiliza un colorante convencional que se sabe tiñe a las células dañadas. Aunque el primer colorante puede teñir leucocitos, la capacidad de tinción de los leucocitos dañados es peor que la de los leucocitos vivos y es del mismo nivel que la intensidad de la señal de fluorescencia de las bacterias colonizadas, de modo que era difícil distinguir leucocitos dañados en estos componentes sólidos cuando están contenidos en la misma muestra. Con el fin de compensar los defectos anteriormente mencionados, se ha encontrado que se puede utilizar un colorante tal como EB que es capaz de teñir células dañadas. Empleando el segundo colorante fluorescente, los leucocitos dañados se tiñen más fuertemente que las bacterias, haciendo posible distinguirlos de las bacterias.
Además, se ha encontrado que los colorantes según la presente invención capaces de ser excitados por una luz de longitud de onda en el rojo dan resultados similares a los anteriormente descritos incluso si sólo se utiliza una sola clase de colorante.
Además, la detección de desechos urinarios se facilita ajustando al intervalo anterior la conductividad eléctrica del reactivo según la presente invención. Es decir, para detectar exactamente desechos urinarios es deseable medir la luz dispersada emitida y la señal de resistencia eléctrica exactamente. En la publicación de patente japonesa sin examinar Hei 4(1992)-337459, los desechos urinarios se detectan midiendo la luz dispersada emitida y la luz fluorescente emitida. Según el método, se detectan desechos urinarios que contienen un cuerpo de inclusión, pero algunas veces cuando aparecieron simultáneamente en la muestra otros componentes sólidos diferentes de los desechos urinarios no se detectaron desechos de hialina tan exactamente. En particular, es difícil distinguir desechos hialina y e hilos de mucosidad porque sus intensidades de fluorescencia son ambas muy débiles y sus longitudes son similares. Sin embargo, los desechos de hialina y los hilos de mucosidad se pueden detectar exactamente midiendo además la señal de resistencia eléctrica así como la luz dispersada emitida y la luz fluorescente emitida y combinando los parámetros de medida de la anchura del pulso de luz dispersada (que refleja la información de longitud) y el valor de la altura del pulso de resistencia (que refleja la información de volumen). Los desechos urinarios que contienen un cuerpo de inclusión tales como desechos epiteliales, desechos granulares, desechos de eritrocitos, desechos de leucocitos, etc. se pueden detectar combinando la anchura del pulso de luz dispersada y la anchura del pulso de luz fluorescente.
Ejemplos
De aquí en adelante se describirán el reactivo para analizar componentes sólidos de la orina según la presente invención y ejemplos de métodos para analizar células que emplean el reactivo. Sin embargo, no se pretende que limiten el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1
Se prepararon una disolución diluyente y una disolución colorante según la prescripción descrita más adelante.
27
Se diluyeron 400 \mul de orina en 1160 \mul de la anterior disolución diluyente y se añadieron 40 \mul de la anterior disolución colorante (relación de dilución 4) para teñir a 35°C durante 10 segundos. Se midieron la luz dispersada emitida, la luz fluorescente emitida y la señal de resistencia eléctrica mediante un citómetro de flujo utilizando un láser de argón como fuente de luz. Aquí, se puede medir una luz fluorescente lateral (90°). Las Figuras 1 y 2 muestran los diagramas de dispersión obtenidos midiendo la luz dispersada emitida y la luz fluorescente emitida utilizando una muestra en la que aparecían hongos semejantes a las levaduras, leucocitos y eritrocitos. Como se ve claramente en las Figuras 1 y 2, los hongos semejantes a las levaduras, los leucocitos y los eritrocitos se clasifican bien cuando se usa el reactivo del ejemplo anterior. La Figura 3 muestra una vista modelo del diagrama de dispersión cuando se miden componentes sólidos en la orina empleando el reactivo de la presente invención.
Incluso cuando se midió una muestra con fluorescencia de fondo, el reactivo del ejemplo anterior permitió medidas sin que fueran influenciadas por la fluorescencia de fondo porque las células se tiñeron fuertemente.
Además, fue posible detectar y clasificar comparativamente componentes sólidos grandes tales como desechos urinarios (desechos de hialina y desechos urinarios que contenían un cuerpo de inclusión), hilos de mucosidad, y células epiteliales midiendo las señales de la resistencia eléctrica y observando la relación entre la anchura del pulso de luz dispersada y el valor de la altura del pulso de resistencia. En la figura 4 se muestra una vista modelo del diagrama de dispersión. Además, cuando aparecieron desechos urinarios que contenían gránulos, eritrocitos, leucocitos y semejantes fue posible medir los desechos urinarios más fiablemente combinando la anchura del pulso de luz fluorescente con la anchura del puso de luz dispersada. En la figura 5 se muestra una vista modelo del diagrama de dispersión.
Ejemplo 2
Se usó el reactivo que tenía la misma composición que en el Ejemplo 1 y se repitieron las mismas operaciones excepto que para ajustar la presión osmótica a 210 mOsm/kg se añadió propionato de sodio y la conductividad eléctrica fue de 7 mS/cm.
El resultado fue similar al del Ejemplo 1.
Ejemplo 3
Se utilizó el reactivo que tenía la misma composición que en el Ejemplo 1 y se repitieron las mismas operaciones excepto que para ajustar la presión osmótica a 310 mOsm/kg se añadió propionato de sodio y la conductividad eléctrica fue de 10 mS/cm.
El resultado fue similar al del Ejemplo 1.
Ejemplo 4
28
Se diluyeron 400 \mul de orina en 1184 \mul de la anterior disolución diluyente y se añadieron 16 \mul de la anterior disolución colorante para teñir a 35°C durante 50 segundos. Se midieron la luz dispersada emitida y la luz fluorescente lateral mediante un citómetro de flujo utilizando un láser semiconductor rojo fuente de luz. Se obtuvo un diagrama de dispersión similar al del Ejemplo 1.
Ejemplo Comparativo 1
29
30
Se diluyeron 400 \mul de orina en 1160 \mul de la anterior disolución diluyente y se añadieron 40 \mul de la anterior disolución colorante (relación de dilución 4) para teñir a 35°C durante 10 segundos. Se midieron la luz dispersada emitida, la luz fluorescente emitida y la señal de resistencia eléctrica mediante un citómetro de flujo utilizando un láser de argón como fuente de luz. Las figs. 7 y 8 muestran los diagramas de dispersión obtenidos midiendo la luz dispersada emitida y la luz fluorescente emitida. Como se ve claramente en las Figs. 7 y 8, cuando se utilizó el reactivo del anterior ejemplo comparativo la capacidad de tinción de los hongos semejantes a las levaduras y de los eritrocitos fue mala de modo que fue imposible distinguirlos.
Además, cuando se midió una muestra que tenía fluorescencia de fondo usando el reactivo del anterior ejemplo comparativo aparecía una región en alguna parte en la que la medida era totalmente imposible debido a la influencia de la fluorescencia de fondo, como se ilustra en las Figs. 9 y 10, haciendo el análisis imposible.
Cuando en el anterior ejemplo 1 se midieron la luz dispersada emitida y la luz fluorescente emitida, la medida se llevó a cabo con una sensibilidad de detección que era aproximadamente 16,6% en comparación con el Ejemplo Comparativo 1. Por lo tanto, se confirmó que los hongos semejantes a las levaduras, los leucocitos y los eritrocitos se pueden clasificar bien usando un detector con menor sensibilidad. En otras palabras, en el Ejemplo Comparativo 1 es necesario elevar la sensibilidad del detector porque la fluorescencia de los eritrocitos es muy débil, mientras que en el Ejemplo 1 de la presente invención se puede usar un detector con menor sensibilidad porque los eritrocitos también se tiñen fuertemente. Por lo tanto, la sensibilidad del detector para medir puede disminuirse en tal extensión que la fluorescencia de fondo es casi despreciable.
Según el reactivo de la presente invención para analizar componentes sólidos en la orina y el método para analizar células que emplean el reactivo:
(1) Se mejoró la capacidad de tinción de los eritrocitos y ha llegado a ser posible distinguir los eritrocitos de los cristales.
(2) Se mejora la capacidad de tinción de varios componentes sólidos que aparecen en la orina, de modo que la sensibilidad del tubo fotomultiplicador (PMT) para detectar la fluorescencia puede reducirse en tal extensión que la influencia de la fluorescencia de fondo de la orina en sí misma es casi despreciable.
(3) Incluso cuando aparecen simultáneamente muchas clases de componentes sólidos en la orina, es posible distinguirlos más exactamente.
(4) Se ha mejorado la capacidad de distinguir los desechos urinarios.

Claims (7)

1. Un reactivo capaz de diferenciar al menos en la orina componentes cristalinos, eritrocitos, hongos semejantes a las levaduras y leucocitos, que comprende:
(I)
un agente amortiguador del pH para mantener el pH entre 5,0 y 9,0,
(II)
un agente compensador de la presión osmótica para mantener la presión osmótica entre 100 mOsm/kg y 600 mOsm/kg,
(III)
un colorante capaz de ser excitado por una luz de longitud de onda en el rojo, y
(IV)
un agente quelante,
en el que el colorante se selecciona del grupo que consiste en:
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Azul rodnilo,
Azul capri BB, y
Azul básico 124.
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2. Un reactivo según la reivindicación 1, cuya conductividad eléctrica se ajusta de 1 mS/cm a 10 mS/cm.
3. Un reactivo según la reivindicación 1, en el que el agente quelante es una sal de EDTA.
4. Un reactivo según la reivindicación 1, que consiste en las siguientes dos disoluciones independientes:
(a)
una disolución colorante que comprende un colorante capaz de ser excitado por una luz de longitud de onda en el rojo, y
(b)
una disolución diluyente que comprende la disolución amortiguadora del pH, el agente compensador de la presión osmótica y el agente quelante.
5. Un método para analizar componentes sólidos en la orina mezclando la orina con un reactivo para analizar en la orina componentes sólidos, que comprende:
(I)
un agente amortiguador del pH para mantener el pH entre 5,0 y 9,0,
(II)
un agente compensador de la presión osmótica para mantener la presión osmótica entre 100 mOsm/kg y 600 mOsm/kg,
(III)
un colorante capaz de ser excitado por una luz de longitud de onda en el rojo, y
(IV)
un agente quelante,
para teñir los componentes sólidos deseados de la orina, aplicar una luz de excitación a los componentes sólidos en la orina anterior teñida y medir la luz dispersada y la luz fluorescente emitida por los componentes sólidos.
en el que el colorante se selecciona del grupo que consiste en:
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Azul rodnilo,
Azul capri BB, y
Azul básico 124.
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6. Un método según la reivindicación 5, en el que la señal de resistencia eléctrica se mide después de que se tiñan los componentes sólidos de la orina.
7. Un método según la reivindicación 5, en el que el reactivo para analizar se mezcla con la orina después de que el reactivo se haya calentado previamente.
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Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5976896A (en) * 1994-06-06 1999-11-02 Idexx Laboratories, Inc. Immunoassays in capillary tubes
DE19621312A1 (de) 1996-05-28 1997-12-04 Bayer Ag Maskierung der Hintergrundfluoreszenz und Signalverstärkung bei der optischen Analyse biologisch medizinischer Assays
US7494816B2 (en) 1997-12-22 2009-02-24 Roche Diagnostic Operations, Inc. System and method for determining a temperature during analyte measurement
US8071384B2 (en) * 1997-12-22 2011-12-06 Roche Diagnostics Operations, Inc. Control and calibration solutions and methods for their use
JP3867880B2 (ja) * 1998-04-08 2007-01-17 シスメックス株式会社 尿中赤血球の鑑別装置および方法
IL126881A0 (en) * 1998-11-04 1999-09-22 Dan Gottlieb Image analysis of urine
JP3886271B2 (ja) * 1998-11-27 2007-02-28 シスメックス株式会社 赤芽球の分類計数用試薬及び分類計数方法
US6413778B1 (en) * 1999-01-21 2002-07-02 Idexx Laboratories Methods for the detection and identification of crystals in biological fluids
US7678836B2 (en) * 1999-11-04 2010-03-16 Fxs Ventures, Llc Method for rendering a contact lens wettable
US6784981B1 (en) * 2000-06-02 2004-08-31 Idexx Laboratories, Inc. Flow cytometry-based hematology system
US7309581B2 (en) * 2000-11-01 2007-12-18 Sysmex Corporation Method of staining, detection and counting bacteria, and a diluent for bacterial stain
US8557868B2 (en) * 2000-11-04 2013-10-15 Fxs Ventures, Llc Ophthalmic and contact lens solutions using low molecular weight amines
EP1339418B1 (en) 2000-11-08 2009-09-23 FXS Ventures, LLC Improved ophthalmic and contact lens solutions containing simple saccharides as preservative enhancers
US20060148665A1 (en) * 2000-11-08 2006-07-06 Bioconcept Laboratories Ophthalmic and contact lens solutions containing forms of vitamin b
ES2337446T3 (es) * 2000-11-08 2010-04-26 Fxs Ventures, Llc L-histidina en soluciones oftalmicas.
US20070110782A1 (en) * 2000-11-08 2007-05-17 Fxs Ventures, Llc L-histidine in ophthalmic solutions
US9308264B2 (en) 2000-11-08 2016-04-12 Fxs Ventures, Llc Ophthalmic contact lens solutions containing forms of vitamin B
US20070104744A1 (en) * 2000-11-08 2007-05-10 Fxs Ventures, Llc Ophthalmic and contact lens solutions containing forms of vitamin b
US20070098813A1 (en) * 2000-11-08 2007-05-03 Fxs Ventures, Llc Ophthalmic and contact lens solutions with a peroxide source and a preservative
US9492582B2 (en) * 2000-11-08 2016-11-15 Fxs Ventures, Llc Ophthalmic and contact lens solutions containing simple saccharides as preservative enhancers
DE10212960A1 (de) * 2002-03-22 2003-10-23 Gnothis Holding Sa Ecublens Verwendung von Oxazin-Farbstoffen als Markierungsgruppen für die Einzelmolekülanalyse
EP1348943A3 (en) * 2002-03-25 2003-12-17 Sysmex Corporation Sheath liquid for particle analyzer
ATE339687T1 (de) * 2002-05-22 2006-10-15 Sysmex Corp Immunologische verfahren, vorrichtungen und reagenzien
AU2003243945A1 (en) * 2002-06-24 2004-01-06 Sysmex Corporation Method of classifying and counting leucocytes
US7939501B2 (en) * 2003-04-15 2011-05-10 Smith Francis X Ophthalmic and contact lens solutions containing peptides as preservative
JP4413120B2 (ja) * 2004-09-30 2010-02-10 シスメックス株式会社 検体中粒子分析方法及び分析装置
US7678578B2 (en) * 2005-02-07 2010-03-16 Beckman Coulter, Inc. Cell permeabilization and stabilization reagent and method of use
JP4794334B2 (ja) * 2006-03-22 2011-10-19 シスメックス株式会社 尿試料分析用試薬及び尿試料の分析方法
JP4759438B2 (ja) * 2006-05-17 2011-08-31 シスメックス株式会社 尿中有形成分分析装置
EP1857805B1 (en) * 2006-05-17 2017-03-01 Sysmex Corporation Apparatus for analyzing particles in urine and method thereof
JP4918281B2 (ja) 2006-05-18 2012-04-18 シスメックス株式会社 尿中有形成分分析装置
EP2037281B1 (en) 2007-09-13 2018-10-10 Sysmex Corporation Sample analyzer
CN105092454B (zh) * 2010-12-28 2018-05-01 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 计数器及流式细胞分析仪
EP4220158A3 (en) 2013-02-28 2023-08-09 Sysmex Corporation Urine specimen analysis device and urine specimen analysis method
KR102055474B1 (ko) 2013-03-15 2019-12-12 아이리스 인터내셔널 인크. 혈액 샘플에서의 입자 분석을 위한 플로우셀 시스템 및 방법
US9857361B2 (en) 2013-03-15 2018-01-02 Iris International, Inc. Flowcell, sheath fluid, and autofocus systems and methods for particle analysis in urine samples
JP6116502B2 (ja) 2014-02-28 2017-04-19 シスメックス株式会社 検体分析装置および検体分析方法
SG11201607145VA (en) * 2014-02-28 2016-10-28 Sysmex Corp Method for urine sample analysis, reagent for urine sample analysis, and reagent kit for urine sample analysis
ES2696836T3 (es) * 2014-02-28 2019-01-18 Sysmex Corp Método para el análisis de muestras de orina, la utilización de un reactivo para el análisis de muestras de orina y la utilización de un kit de reactivos para el análisis de muestras de orina
JP6228085B2 (ja) * 2014-08-27 2017-11-08 シスメックス株式会社 検体分析装置及び検体分析方法
JP6680492B2 (ja) * 2015-09-11 2020-04-15 シスメックス株式会社 細胞分析装置および細胞分析方法
CA3094373C (en) 2018-03-30 2023-10-17 Idexx Laboratories, Inc. Flow cytometer, laser optics assembly thereof, and methods of assembling the same
JP7352365B2 (ja) 2019-03-22 2023-09-28 シスメックス株式会社 細胞の分析方法、深層学習アルゴリズムの訓練方法、細胞分析装置、深層学習アルゴリズムの訓練装置、細胞の分析プログラム及び深層学習アルゴリズムの訓練プログラム
DE102020000677B4 (de) 2020-02-01 2023-01-12 Hochschule Anhalt Universaldurchflussmessgerät und Verfahren zur Steuerung eines Universaldurchflussmessgeräts
EP4168773A1 (en) 2020-06-17 2023-04-26 Idexx Laboratories, Inc. Flow cytometer and laser optics assembly thereof
JP2022051447A (ja) 2020-09-18 2022-03-31 シスメックス株式会社 細胞分析方法及び細胞分析装置
JP2022051448A (ja) 2020-09-18 2022-03-31 シスメックス株式会社 細胞分析方法及び細胞分析装置

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1024048A (en) * 1973-10-29 1978-01-10 Richard Sternheimer Urinary sediment stain
US4193980A (en) * 1978-01-05 1980-03-18 Corning Glass Works Dry preparation for reticulocyte staining
DE2832491A1 (de) * 1978-07-24 1980-02-07 Merck Patent Gmbh Mittel und verfahren zur anfaerbung von zellabstrichen
IT1123573B (it) * 1979-09-10 1986-04-30 Anic Spa Composizione adatta al controllo di tessuti e/o liquidi biiologici e metodo impiegante la stessa
US4400370A (en) * 1980-03-12 1983-08-23 Lawrence Kass Metachromatic dye sorption means for differential determination of leukocytes
US4581223A (en) * 1980-03-12 1986-04-08 Lawrence Kass Individual leukocyte determination by means of differential metachromatic dye sorption
CA1155041A (en) * 1980-04-21 1983-10-11 Michael E. Jolley Fluorescent nucleic acid stains
DE3238353A1 (de) * 1982-10-15 1984-04-19 Max Planck Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen Verfahren zur simultanen quantitativen bestimmung der blutzellen und reagenz hierfuer
DE3309544A1 (de) * 1983-03-17 1984-09-20 Macherey-Nagel & Co Chemikalienhandel, 5160 Düren Teststreifen zum nachweis von leukozyten im harn
GB8410500D0 (en) * 1984-04-25 1984-05-31 Orbec Ltd Monitoring particles in liquids
US4622298A (en) * 1984-08-09 1986-11-11 Becton, Dickinson And Company Detection and quantitation of microorganisms, leukocytes and squamous epithelial cells in urine
DE3677916D1 (de) * 1985-11-01 1991-04-11 Becton Dickinson Co Nachweis von retikulozyten.
US4810487A (en) * 1986-01-02 1989-03-07 Cytocolor, Inc. Method of identifying polymethine stained lymphocyte subpopulations and compositions thereof
JPH06100596B2 (ja) * 1986-09-10 1994-12-12 東亜医用電子株式会社 フロ−サイトメトリ−による白血球の分類方法
US4783401A (en) * 1986-10-31 1988-11-08 Smithkline Beckman Corporation Viable cell labelling
FR2628531B1 (fr) * 1988-03-08 1992-10-02 Chemunex Sa Procede de recherche, de detection specifique et de numeration de micro-organismes, installation pour la mise en oeuvre dudit procede
US5057413A (en) * 1988-06-13 1991-10-15 Becton, Dickinson And Company Method for discriminating between intact and damaged cells in a sample
JPH02187661A (ja) * 1989-01-13 1990-07-23 J M L:Kk 網状赤血球の新染色法
JP2941041B2 (ja) * 1990-11-16 1999-08-25 シスメックス株式会社 フローサイトメトリーによる白血球の分類方法
JP3070968B2 (ja) * 1991-05-14 2000-07-31 シスメックス株式会社 尿中の細胞分析用試薬及び方法
JP3048260B2 (ja) * 1991-07-29 2000-06-05 シスメックス株式会社 白血球分類計数用試料調製方法
US5350695A (en) * 1991-12-05 1994-09-27 Miles Inc. Methods for the identification and characterization of reticulocytes in whole blood
US5407794A (en) * 1992-09-08 1995-04-18 Cytocolor Inc. Oxazine stained lymphocytes and method
DE69424079T2 (de) * 1993-02-22 2000-09-07 Sysmex Corp Ein Reagenz zum Nachweis von malariainfizierten Zellen und ein Nachweis-Verfahren für malariainfizierte Zellen unter Verwendung desselben

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Publication number Publication date
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