DE69535413T2

DE69535413T2 - Reagenz und Verfahren zur Analyse fester Bestandteile im Harn

Info

Publication number: DE69535413T2
Application number: DE69535413T
Authority: DE
Inventors: Junya Ono-shi Inoue
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1994-10-20
Filing date: 1995-10-19
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2015-10-20
Also published as: DE69535413D1; CA2160962C; US5891733A; EP0708334A3; EP1089078B1; EP1089078A1; AU701948B2; EP0708334A2; EP0708334B1; AU3436695A; CA2160962A1; ES2278566T3; DE69521006T2; DE69521006D1; ES2156927T3

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagenz zur Analyse von festen Bestandteilen in Urin und ein Verfahren zur Analyse von festen Bestandteilen in Urin, welches das Reagenz einsetzt, und genauer gesagt ein Reagenz, das verwendet wird für eine optische Analyse von festen Bestandteilen in Urin durch Anwenden von Durchflußzytometrie und ein Verfahren zum Analysieren desselben.
2. Stand der Technik
In Nieren- und Harnwegserkrankungen, wie Infektionserkrankungen, inflammatorischen Läsionen, degenerativen Läsionen, Steinleiden, Tumoren und dergleichen, erscheinen verschiedene Arten von festen Bestandteilen im Urin in Abhängigkeit von der Erkrankung. Beispiele von festen Bestandteilen umfassen Erythrozyten, Leukozyten, Epithelzellen, Harnzylinder, Bakterien, Pilze, Kristalle und Schleimfäden. Die Analyse dieser Bestandteile in Urin ist von großer Bedeutung für die frühe Entdeckung von Nieren- und Harnwegserkrankungen und dem Auffinden von abnormalen Stellen. Zum Beispiel ist die Messung von Erythrozyten wichtig bei der Bestimmung, ob Blutungen in der Passage von den nephritischen Glomeruli zur Harnröhre vorhanden sind. Das Auftreten von Leukozyten legt den Verdacht von Nierenerkrankungen wie Pyelonephritis nahe, was dazu führt, Entzündung und Infektionserkrankungen früh zu entdecken. Durch die Untersuchung von Harnzylindern und morphologischen Merkmalen der Erythrozyten kann auch darauf geschlossen werden, wo sie herstammen.
Konventionell wurden feste Bestandteile des Urins visuell durch Mikroskopie analysiert. Dies wird durchgeführt durch Konzentrieren des zu untersuchenden Urins durch Zentrifugation, manchmal gefolgt von Färben des erhaltenen Sediments, und Auftragen auf einen Objektträger, um sie unter einem Mikroskop zu klassifizieren und zu zählen.
In den vergangenen Jahren ist eine automatische Meßvorrichtung entwickelt worden, in welcher ein flacher Umhüllungsfluß und Bildverarbeitungstechnik kombiniert sind. Die Urinprobe, welche in einem extrem dünnen Strom fließt, wobei eine Hüllflüssigkeit als eine äußere Schicht dient, wird durch einen Videorekorder gefilmt und das unbewegte Bild, das so erhalten wird, wird einer Bildverarbeitung unterworfen, wodurch die Bilder von festen Bestandteilen in der Probenflüssigkeit herausgeschnitten und angezeigt werden. Durch Beobachten der Anzeige unterscheidet ein Untersuchender die darin enthaltenen festen Bestandteile und zählt sie.
Des weiteren offenbart die ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. Hei 4(1992)-337459 ein Reagenz (verwendet) für die Analyse von Zellen in Urin durch Anwendung von Durchflußzytometrie und ein Verfahren zur Analyse davon, für die automatische Klassifizierung und Zählung der festen Bestandteile in Urin. Das darin verwendete Reagenz enthält einen Fluoreszenzfarbstoff, ein Kompensationsmittel für osmotischen Druck und einen Puffer. Verschiedene Arten von Fluoreszenzfarbstoffen, Kompensationsmitteln für osmotischen Druck und Puffer sind darin offenbart, und ein Reagenz, welches Neutralrot oder Auramin O als Fluoreszenzfarbstoff verwendet, wird in einer Ausführungsform beschrieben.
EP-A-0 513 762 offenbart ein Reagenz oder Verfahren zur Analyse von Erythrozyten, Leukozyten, Epithelzellen und Bakterien in Urin, umfassend die folgenden Komponenten: (i) einen oder mehrere Fluoreszenzfarbstoffe wie Ethidiumbromid, Propidiumbromid, 3,3'-Dimethylthiocarbocyanin, Basic Yellow 11, ..., (ii) ein Mittel zur Kompensation der Osmolarität und (iii) einen Puffer, um den pH auf 8,5 einzustellen. Besagtes Reagenz ist jedoch nicht in der Lage, weiter zwischen Kristallen und hefeähnlichen Pilzen in Urin zu unterscheiden.
Im übrigen ist es erwünscht, die Urinprobe möglichst bald nach der Probenentnahme von dem Subjekt zu untersuchen, da die festen Bestandteile degenerieren und die Anzahl von Bakterien mit dem Verstreichen von Zeit zunimmt.
Die visuelle mikroskopische Untersuchung benötigt viel Zeit und Aufwand für die Vorbehandlung der Urinprobe, wie das Zentrifugieren und Konzentrieren. Darüber hinaus ist Mikroskopie eine große Belastung für den Untersuchenden. Die Genauigkeit von Mikroskopie ist auch gering, da die Anzahl von untersuchten Zellen klein ist.
Eine automatische Meßvorrichtung, welche eine Bildverarbeitungstechnik verwendet, ist gegenüber der Mikroskopie vorteilhaft, da die Belastung durch die Mikroskopie nicht weiter besteht. Wenn jedoch eine Vielzahl von Proben untersucht werden sollen, ist sie nicht befriedigend genug, da feste Bestandteile durch einen Untersuchenden unterschieden werden müssen und die Verarbeitungszeit nicht rasch ist.
Darüber hinaus bedarf die Unterscheidung von festen Bestandteilen Fachwissen sowohl in der visuellen Mikroskopie als auch Untersuchung durch eine automatische Meßvorrichtung, welche Bildverarbeitungstechniken verwendet.
Ein Verfahren, welches in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. Hei 4(1992)-337459 offenbart ist, worin Durchflußzytometrie auf die Urinanalyse verwendet wird, hat den Vorteil einer schnellen Messung. Bei der weiteren Untersuchung zeigte sich jedoch, daß dieses Verfahren die folgenden Probleme aufweist.

(1) Auftreten von Kristallen in Urin macht es schwierig, zwischen den Kristallen und den Erythrozyten, die darin enthalten sind, zu unterscheiden.
(2) Wenn eine große Menge amorphen Salzes in der Probe auftritt wird es schwierig, andere Zellen zu klassifizieren.
(3) Beim Messen einer Urinprobe enthaltend Hämoglobin oder Protein unter Verwendung des Reagenz enthaltend Auramin O mit einem pH von 8,5, welches in einem Beispiel der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. Hei 4(1992)-337459 gezeigt wird, dürfte es unmöglich sein, die Urinprobe infolge der Bindung von Hämoglobin oder des Proteins an den Farbstoff und der Ablagerung von winzigen Sedimenten genau zu messen.
(4) Obwohl das Problem von (3) durch Belassen des pH bei einem sauren Wert gelöst wird, nimmt die Färbbarkeit des Reagenz bei einem solchen pH-Wert ab, und wenn hefeähnliche Pilze in der Probe auftreten ist es schwierig, Erythrozyten von den Pilzen zu unterscheiden.
(5) Wenn Urin durch Durchflußzytometrie analysiert wird ist es nötig, das Verdünnungsverhältnis niedrig zu halten, da die Menge von festen Bestandteilen, die in Urin enthalten sind, gering ist. Wenn jedoch das Verdünnungsverhältnis gering ist und eine fluoreszierende Substanz, z.B. ein pharmazeutischer Wirkstoff wie ein Vitamin oder eine antibiotische Substanz im Urin ausgeschieden wird, kann es schwierig sein, eine ausreichende Fluoreszenzsignalintensität der festen Bestandteile, die darin enthalten sind, zu erhalten, da die

Hintergrundfluoreszenz (Hintergrundlärm) des Harns selbst nicht vernachlässigbar ist. Wenn Neutralrot verwendet wird, wird ein großer Einfluß der Hintergrundfluoreszenz auftreten, verursacht durch den Farbstoff, welcher nicht an die Zellen bindet.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Reagenz zur Analyse von festen Bestandteilen in Urin zur Verfügung, umfassend: (I) einen Puffer zum Beibehalten des pH bei 5,0 bis 9,0, (II) ein Kompensationsmittel für osmotischen Druck zum Beibehalten des osmotischen Drucks bei 100 mOsm/kg bis 600 mOsm/kg, (III) einen Farbstoff, der in der Lage ist, von Licht mit einer roten Wellenlänge angeregt zu werden gemäß Anspruch 1, und (IV) einen Komplexbildner.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Analyse von festen Bestandteilen in Urin zur Verfügung durch Mischen des Urins mit dem obigen Reagenz, um die erwünschten festen Bestandteile im Urin zu färben, Anwenden eines Anregungslichts auf die festen Bestandteile auf den obigen gefärbten Urin und Messen des gestreuten Lichts und des Fluoreszenzlichts, welchen von den festen Bestandteilen ausgestrahlt wird.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist ein Scattergramm erhalten durch Messen des vorwärts gestreuten Lichts und des Vorwärts-Fluoreszenzlichts, wenn feste Bestandteile in Urin gefärbt werden, durch Verwenden des Reagenz zum Analysieren von festen Bestandteilen in Urin gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine vergrößerte Ansicht von 1.
3 ist eine Modellansicht des Scattergramms erhalten durch Messen des vorwärts gestreuten Lichts und des Vorwärts-Fluoreszenzlichts, wenn feste Bestandteile in Urin gefärbt werden, durch Verwenden des Reagenz zum Analysieren von festen Bestandteilen in Urin gemäß der vorliegenden Erfindung.
4 ist eine Modellansicht des Scattergramms, welches das Verhältnis zwischen der gestreuten Lichtpulsweite und dem Wert der Widerstandspulshöhe des elektrischen Widerstandssignals, gemessen nachdem die festen Bestandteile in Urin gefärbt werden durch Verwendung des Reagenz zum Analysieren von festen Bestandteilen in Urin gemäß der vorliegenden Erfindung, illustriert.
5 ist eine Modellansicht des Scattergramms, welches das Verhältnis zwischen der gestreuten Lichtpulsweite und der Fluoreszenzlichtpulsweite des elektrischen Widerstandssignals, gemessen nachdem die festen Bestandteile in Urin gefärbt werden durch Verwendung des Reagenz zum Analysieren von festen Bestandteilen in Urin gemäß der vorliegenden Erfindung, illustriert.
6 ist eine schematische Modellansicht, welche ein Durchflußzytometer, welches vorzugsweise verwendet wird zum Messen von festen Bestandteilen in Urin durch Verwenden des Reagenz zum Analysieren von festen Bestandteilen in Urin gemäß der vorliegenden Erfindung, illustriert.
7 ist ein Scattergramm, erhalten durch Messen der vorwärts gestreuten Lichtintensität und der Vorwärts-Fluoreszenzlichtintensität, wenn feste Bestandteile in Urin gefärbt werden durch Verwendung des Reagenz, welches Auramin O enthält, zum Analysieren von festen Bestandteilen in Urin.
8 ist eine vergrößerte Ansicht von 7.
9 ist ein Scattergramm, erhalten durch Messen der vorwärts gestreuten Lichtintensität und der Vorwärts-Fluoreszenzlichtintensität, wenn feste Bestandteile in Urin mit Hintergrundfluoreszenz gefärbt werden durch Verwendung des Reagenz, welches Auramin O enthält, zum Analysieren von festen Bestandteilen in Urin.
10 ist eine vergrößerte Ansicht von 9.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Beispiele von festen Bestandteilen in Urin, welche gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen werden sollen, umfassen insbesondere Erythrozyten, Leukozyten, Epithelzellen, Harnzylinder, Bakterien und hefeähnliche Pilze.
Der Puffer in dem Analysierreagenz der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um innerhalb eines bestimmten pH-Bereichs zu bleiben, welcher in der Lage ist, eine stabile Fluoreszenzintensität der zu messenden Probe zu erhalten. Der pH-Wert kann eingestellt werden auf einen Bereich von pH 5,0 bis 9,0, um die Hämolyse von Erythrozyten zu verhindern. Unter den kristallinen Bestandteilen, die in Urin enthalten sind, können insbesondere amorphe Salze aufgelöst werden durch Verdünnung mit einer wäßrigen Lösung, wie einer physiologischen Salzlösung, verdünnter Salzsäure und verdünnter Essigsäure, einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid. Jedoch präzipitieren manche der kristallinen Bestandteile, die in Urin enthalten sind, in einer sauren Lösung und andere präzipitieren in einer alkalischen Lösung. Daher ist ein pH-Wert von 6,5 bis 7,5 vorzuziehen, und ein pH-Wert von 6,8 bis 7,2 ist noch mehr vorzuziehen, da amorphe Salze, welche in einer sauren oder alkalischen Lösung präzipitieren, bei einem etwa neutralen pH schneller aufgelöst werden. Als Puffer können allgemein bekannte verwendet werden. Zum Beispiel können ein Goods-Puffer wie Tris und MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricin, Bicin und Taps verwendet werden. Unter diesen ist HEPES vorzuziehen. Die Konzentration wird kontrolliert in Abhängigkeit der Pufferkapazität des zu verwendenden Puffers, so daß der pH-Wert innerhalb eines bestimmten Bereichs bleibt, wenn die Urinprobe verdünnt wird. Im allgemeinen liegt die Konzentration bei 20 bis 500 mM, vorzugsweise 50 bis 200 mM.
Das Kompensationsmittel für den osmotischen Druck kann hinzugefügt werden, um die Hämolyse von Erythrozyten zu verhindern und um eine stabile Fluoreszenzintensität zu erhalten. Der osmotische Druck von Urin ist weit verteilt zwischen 50 bis 1.300 mOsm/kg. Wenn der osmotische Druck des Analysierreagenz zu niedrig ist, tritt die Hämolyse von Erythrozyten in einer frühen Phase auf. Wenn er zu hoch ist, werden Zellen sehr beschädigt. Daher ist der osmotische Druck vorzugsweise 100 bis 600 mOsm/kg, noch bevorzugter 150 bis 500 mOsm/kg. Als Kompensationsmittel für osmotischen Druck kann ein anorganisches Salz, ein organisches Salz wie Propionat oder ein Zucker verwendet werden. Beispiele von anorganischen Salzen umfassen Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumchlorid oder dergleichen. Beispiele von Propionaten umfassen Natriumpropionat, Kaliumpropionat, Ammoniumpropionat oder dergleichen. Beispiele von anderen organischen Salzen umfassen Oxalat, Acetat oder dergleichen. Beispiele von Zuckern umfassen Sorbit, Glucose, Mannit oder dergleichen.
In der vorliegenden Erfindung werden Farbstoffe, die in der Lage sind, durch Licht mit einer roten Wellenlänge angeregt zu werden, verwendet. In solch einem Fall kann der Farbstoff zur Analyse hergestellt werden durch Verwendung eines Farbstoffs oder durch Mischen von zwei oder mehr Farbstoffen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Unter den obigen Farbstoffen kann die NK-Serie erhalten werden von Nippon Kankoh Shikiso Kenkyusho Co., Ltd.; Oxazin 4, Oxazin 750 Perchlorat und Oxazin 720 können erhalten werden von Exciton, Inc.; Basic Green und Iodine Green können erhalten werden von E. Merck Darmstadt; Capri Blue GON kann erhalten werden von Tokyo Kasei Kogyo Industrie Co., Ltd.; Nile Blue Chlorid kann erhalten werden von Nacarai Tesque, Inc.; Rhodnile Blue kann erhalten werden von Aldrich Chemical Company Inc.; und Capri Blue BB kann erhalten werden von Chloma Gesellschaft Schmid & Co. Die Konzentration des Farbstoffs wird eingestellt, so daß die Endkonzentration im Bereich von 1 bis 300 ppm sein kann, worunter 5 bis 100 ppm vorzuziehen ist.
Der Komplexbildner kann verwendet werden zum Auflösen von amorphen Salzen (z.B. Ammoniummagnesiumphosphat, Calciumcarbonat), welche in Urin auftreten. Jede Art von Mittel kann verwendet werden, so lange es ein entkalkendes oder magnesiumentfernendes Mittel ist. Zum Beispiel kann EDTA-Salz, CyDTA, DHEG, DPTA-OH, EDDA, EDDP, GEDTA, HDTA, HIDA, Methyl-EDTA, NTA, NTP, NTPO oder EDDPO verwendet werden. Vorzugsweise wird EDTA-Salz, CyDTA oder GEDTA verwendet. Die Konzentration des Komplexbildners kann im Bereich von 0,05 bis 5 Gew.% liegen, vorzugsweise 0,1 bis 1 Gew.%. Hier bedeutet ein entkalkendes oder magnesiumentfernendes Mittel ein Mittel, welches in der Lage ist, mit Calcium- und Magnesiumionen eine Bindung einzugehen, um wasserlösliche Verbindungen zu bilden.
Das Reagenz gemäß der vorliegenden Erfindung kann aus einer Lösung, enthaltend den Puffer, das Kompensationsmittel für osmotischen Druck, die Farbstoffe und den Komplexbildner, bestehen. Alternativ kann das Reagenz aus zwei Lösungen bestehen, worin eine die Färbelösung ist enthaltend die Farbstoffe und die andere eine Verdünnungslösung enthaltend den Puffer, das Kompensationsmittel für osmotischen Druck und den Komplexbildner.
Wenn das Reagenz aus zwei Lösungen besteht, nämlich einer Färbelösung und einer Verdünnungslösung, kann die Lagerstabilität der Färbelösung durch Auflösen der Farbstoffe in einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel verbessert werden, da Farbstoffe oft in wäßriger Lösung instabil sind. Die Färbelösung kann des weiteren einen Stabilisator enthalten für diese Farbstoffe. Ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel, das in diesem Fall verwendet werden kann, ist vorzugsweise ein niedriger Alkohol, ein niedriges Alkylenglycol oder ein niedriges Alkylenglycol-mono-niedriger Alkylether. Zum Beispiel kann Methanol, Ethanol, n-Propanol, Ethylenglycol, Diethylenglycol, Triethylenglycol, Ethylenglycol-mono-methylether oder Ethylenglycol-mono-ethylether verwendet werden. Unter diesen sind Ethylenglycol, Diethylenglycol und Triethylenglycol bevorzugt. Unter Berücksichtigung der Auswirkung auf Zellen im Urin und der Viskosität ist Ethylenglycol am bevorzugtesten. Die Verdünnungslösung kann auch ein antibakterielles Mittel enthalten, um das Wachstum von Bakterien während einer langen Lagerung zu verhindern. Antibakterielle Mittel, die verwendet werden können, sind nicht besondere limitiert. Es kann ein Triazinantibakterielles Mittel, ein Thiazol-antibakterielles Mittel wie BIT (Benzisothiazolon) und ein Pyridin-antibakterielles Mittel wie PTO (Pyrithion) verwendet werden. Antibakterielle Mittel können in einer angemessenen Konzentration, welche keinen negativen Einfluß auf das Meßsystem hat, hinzugefügt werden. Das oben erwähnte Stabilisiermittel und das antibakterielle Mittel können zu einem Reagenz, welches aus einer Lösung besteht, hinzugefügt werden.
Die elektrische Leitfähigkeit des Reagenz gemäß der vorliegenden Erfindung ist praktischerweise eingestellt auf einen Bereich von 1 bis 10 mS/cm, vorzugsweise 4 bis 7 mS/cm, zum Detektieren von Harnzylindern durch Messen des elektrischen Widerstandssignals. Wenn der Puffer oder das Kompensationsmittel für osmotischen Druck einen hohen Grad an elektrolytischer Dissoziation aufweisen, verringert das Einstellen der elektrischen Konduktivität auf den obigen Bereich den osmotischen Druck, was die Hämolyse von Erythrozyten in Urin zur Folge haben kann. Es kann jedoch durch Verwendung einer organischen Säure als Puffer oder durch Verwendung eines organischen Salzes oder eines Nichtelektrolyten (wie einem Zucker) als Kompensationsmittel für osmotischen Druck oder durch eine geeignete Kombination der obigen zwei Mittel der osmotische Druck in der erwünschten Weise erhöht werden, während das Ansteigen der elektrischen Leitfähigkeit verhindert wird.
Beim Analysieren von festen Bestandteilen in Urin mit dem Reagenz der vorliegenden Erfindung wird der ursprüngliche Urin mit dem Reagenz gemischt.
Durch Verwendung des Reagenz, welches aus einer Lösung enthaltend die Komponenten (I) bis (IV) besteht, wird der ursprüngliche Urin 2- bis 20-fach durch Mischen verdünnt und die in dem Urin enthaltenen festen Bestandteile werden gefärbt. Das Verdünnungsverhältnis des ursprünglichen Urins ist vorzugsweise 2- bis 16-fach, insbesondere 4- bis 10-fach. Hier wird das obige Reagenz im vorhinein vorzugsweise auf 30 bis 40°C erwärmt, wünschenswerterweise 33 bis 37°C, um so die im Urin enthaltenen amorphen Salze rasch aufzulösen. Es ist wünschenswert, den ursprünglichen Urin mit dem Reagenz im Bereich von Raumtemperatur bis 40°C zu mischen, vorzugsweise 33 bis 37°C, für 5 bis 60 Sekunden, vorzugsweise 10 bis 30 Sekunden. Falls das Reagenz aus zwei Lösungen besteht, nämlich einer Färbelösung und einer Verdünnungslösung, wird der ursprüngliche Urin hinzugefügt nachdem die Färbelösung mit der Verdünnungslösung gemischt wurde, oder alternativ wird die Färbelösung hinzugefügt nachdem der Urin mit der Verdünnungslösung gemischt wurde. In dem Fall, daß das Reagenz aus zwei Lösungen besteht, ist das Endverdünnungsverhältnis des Urins vorzugsweise 4- bis 10-fach. Auch wird die Verdünnungslösung vorzugsweise zuvor auf 30 bis 40°C aufgewärmt, vorzugsweise 33 bis 37°C, so daß im Urin enthaltene amorphe Salze sich rasch auflösen.
Der so mit dem obigen Reagenz gemischte Urin wird als Urinprobe durch eine Durchflußzelle fließen gelassen. Dann wird ein Anregungslicht auf die durch die Durchflußzelle fließende Urinprobe angewandt zum Messen der Intensitäten des vorwärts gestreuten Lichts und Fluoreszenzlichts, das von den festen Bestandteilen in der Urinprobe ausgestrahlt wird. In dieser Weise können die festen Bestandteile, die im Urin enthalten sind, analysiert werden. In dem Fall, daß Harnzylinder gemessen werden, ist es wünschenswert, auch die Intensität des elektrischen Widerstandssignals der Urinprobe zu messen (Volumeninformation), da es die Detektionssensitivität für Zylinder erhöht. Daher ist es wünschenswert, daß das Verfahren zum Analysieren von Urin gemäß der vorliegenden Erfindung ein Durchflußzytometer verwendet, welches in der Lage ist, sowohl das elektrische Widerstandssignal als auch die optische Information zu messen. Ein Beispiel eines Durchflußzytometers, welches für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird in 6 gezeigt.
Zunächst wird durch öffnen der Ventile 1 und 2 für eine bestimmte Zeitdauer die Probenflüssigkeit aus der Saugdüse 3 durch negativen Druck der Ausstoßflüssigkeitskammer eingeführt und füllt die Ventile 1 und 2. Die Probenflüssigkeit wird aus der Probendüse 6 ausgestoßen durch das Wirken der Spritze 4, welche die Flüssigkeit mit einer konstanten Flußrate hinausdrückt. Zur selben Zeit wird die Hüllflüssigkeit in die Kammer 7 in der Flußzelle 5 durch öffnen des Ventils 8 zur Verfügung gestellt. Durch diesen Vorgang wird entlang der inneren Oberfläche der Kammer 7 die Probe schmäler gemacht, um einen Hüllfluß zu bilden, und tritt durch die Öffnung 11 hindurch, wie in 6 gezeigt. Die Form der Öffnung 11 ist prismatisch, wobei die Länge von jeder inneren Seite 100 bis 300 μm ist. Die Öffnung 11 ist aus optischem Glas (umfassend Quarzglas) hergestellt. Der Hüllfluß, der so geformt wird, ermöglicht den Teilchen in einer Reihe angeordnet eines nach dem anderen durch das Zentrum der Öffnung 11 zu fließen. Die Probenflüssigkeit und die Hüllflüssigkeit, welche durch die Öffnung 11 hindurchgetreten sind, werden ausgestoßen durch die Kollektorröhre 14, welche an der Kammer 25 befestigt ist.
Die Elektrode 13, hergestellt aus Platin, wird innerhalb der Kammer 25 zur Verfügung gestellt und dient als positive Elektrode. Die Elektrode 12, hergestellt aus Edelstahl, wird innerhalb der Kammer 7 zur Verfügung gestellt und dient als negative Elektrode. Der elektrische Widerstand zwischen den Elektroden 12 und 13 wird durch den Widerstand (elektrische Leitfähigkeit) der Hüllflüssigkeit, den Ausmaßen der Öffnung (Öffnungsquerschnitt), der Länge der Öffnung, dem Widerstand der Probenflüssigkeit und dem Durchmesser der fließenden Probenflüssigkeit bestimmt.
Die Stromquelle 15 stellt einen konstanten Gleichstrom zwischen den Elektroden 12 und 13 zur Verfügung. Das Zurverfügungstellen eines konstanten Gleichstroms zwischen den Elektroden 12 und 13 erzeugt eine Gleichspannung, bestimmt durch den elektrischen Widerstand und die Größe des elektrischen Stroms zwischen den Elektroden 12 und 13. Wenn Teilchen durch die Öffnung 11 hindurchtreten, ändert sich der elektrische Widerstand zwischen den Enden der Öffnung 11. Somit steigt, während die Teilchen hindurchtreten, die zwischen den Elektroden 12 und 13 generierte Spannung. Darüber hinaus wird eine pulsähnliche Spannung generiert im Verhältnis zur Größe der Teilchen, die durch die Öffnung 11 hindurchtreten. Daher wird diese Spannung hinzugefügt zu der obigen Gleichspannung, und die resultierende Spannung tritt zwischen den Elektroden 12 und 13 auf. Diese wird detektiert durch einen Verstärker 16, welcher als Ausgabe ein Widerstandssignal 29 produziert.
Ein vom Laser 17 ausgestrahltes Laserlicht wird zu einer elliptischen Form durch eine Kondensierlinse 18 verengt und wird im allgemeinen im Zentrum der Öffnung 11 auf den Probenfluß 26 angewandt. Die Form des Laserlichts ist wie folgt. Die Länge davon entlang des Probenflusses ist etwa gleich wie der Teilchendurchmesser der Blutzellen, z.B. so schmal wie etwa 10 μm. Die Länge entlang der Richtung im rechten Winkel zu sowohl dem Probenfluß als auch der optischen Achse des angewandten Lichts ist wesentlich größer als der Teilchendurchmesser der Blutzellen, z.B. etwa 150 bis 300 μm. Ein Teil des auf den Probenfluß 26 angewandten Lichts trifft nicht die Zellen (feste Bestandteile) und wird durch die Flußzelle 5 hindurchgestrahlt. Dieses hindurchgestrahlte Licht wird durch einen Strahlstopper 19 unterbrochen. Das übrige Licht, welches auf den Probenfluß 26 angewandt wird, trifft die Zellen, produziert vorwärts gestreutes Licht und Vorwärts-Fluoreszenzlicht in einem engen Bereich von Winkeln. Das vorwärts gestreute Licht und Fluoreszenzlicht werden durch eine Sammellinse 20 gesammelt und treten dann durch das Nadelloch 21 des Schilds 30 hindurch, um den dichroiden Spiegel 22 zu erreichen. Mit einer Wellenlänge, die länger ist als jene des gestreuten Lichts, wird das Fluoreszenzlicht durch den dichroiden Spiegel 22 mit einem hohen Transmissionsverhältnis transmittiert. Nachdem das gestreute Licht weiter durch einen Filter 23 entfernt wurde, wird das Fluoreszenzlicht durch eine Fotoverstärkerröhre (PMT) 24 detektiert und in ein elektrisches Signal 27 für die Ausgabe umgewandelt. Das gestreute Licht wird durch den dichroiden Spiegel 22 reflektiert und durch eine Fotodiode 31 aufgefangen, um in die elektrischen Signale 28 für die Ausgabe umgewandelt zu werden.
Das Reagenz der vorliegenden Erfindung zum Analysieren von festen Bestandteilen in Urin hat zur Folge, daß durch Mischen des Reagenz mit dem Urin amorphe Salze aufgelöst werden und die festen Bestandteile in Urin in geeigneter Weise zum Klassifizieren gefärbt werden.
Im allgemeinen sind die meisten amorphen Salze, die oft in Harnsedimenten beobachtet werden, Phosphate und Urate. Die meisten der Phosphate sind Calciumsalze und, durch Hinzufügen eines Komplexbildners, bilden die Calciumsalze wasserlösliche Komplexverbindungen zum Auflösen. Urate werden auflöst durch Verdünnen und Aufwärmen. Diese amorphen Salze werden auch im Urin von normalen Menschen beobachtet und sind von geringer klinischer Signifikanz. Daher ist es zum genauen Bestimmen von anderen klinisch signifikanten festen Bestandteilen (Erythrozyten, Leukozyten, Bakterien, hefeähnlichen Pilzen, Harnzylindern und anderen) nötig, die amorphen Salze aufzulösen. Große Kristalle und Calciumoxalat lösen sich jedoch nur langsam auf, selbst beim Hinzufügen eines Komplexbildners oder einer Hitzebehandlung, und manche von ihnen bleiben unaufgelöst wenn die durchflußzytometrische Messung durchgeführt wird. Darüber hinaus werden morbide Kristalle wie Cystin, Leucin, Tyrosin, Cholesterin und 2,8DHA selbst durch diese Vorgehensweisen nicht leicht aufgelöst. Aus diesem Grund überlappen die verbleibenden Kristalle mit der Erythrozytenfraktion, was es manchmal schwierig macht, die Erythrozyten genau zu bestimmen. Daher ist es besonders nötig, Erythrozyten stark zu färben, so daß diese Kristalle keinen negativen Einfluß auf die Messung der anderen festen Bestandteile haben.
Die Fluoreszenzintensität von festen Bestandteilen in Urin ist in einem weiten Bereich von schwach bis stark variabel, in Abhängigkeit von der Art der festen Bestandteile. Zum Beispiel ist die Fluoreszenzintensität von Erythrozyten viel schwächer als jene von Leukozyten. Bisher war es im Fall des Messens von Leukozyten im Blut nicht nötig, Erythrozyten oder der Hintergrundfluoreszenz, welche nur eine extrem schwache Fluoreszenzintensität aufweisen, große Aufmerksamkeit zu schenken, da Leukozyten stark gefärbt sind. In der Analyse von festen Bestandteilen in Urin ist es jedoch nötig, Substanzen wie Erythrozyten zu detektieren, welche nur eine schwache Fluoreszenzintensität aufweisen. Um dies zu erreichen muß die Detektor-(PMT)-sensitivität höher eingestellt werden als beim Messen von Leukozyten im Blut. Das Erhöhen der Sensitivität des Detektors bringt jedoch einen nachteiligen Einfluß infolge der Hintergrundfluoreszenz des Urins selbst oder Hintergrundfluoreszenz vom Fluoreszenzfarbstoff, der nicht an Zellen gebunden ist, so daß es manchmal schwierig war, eine ausreichende Fluoreszenzsignalintensität von Erythrozyten zu erhalten, um sie zu messen.
Durch Untersuchungen ist gefunden worden, daß die obigen Probleme gelöst werden können durch Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs wie DiOCn(3) (n=1 bis 6), welcher in der Lage ist, Zellmembranen von Erythrozyten zu färben.
Der erste Farbstoff, insbesondere DiOCn(3) (n=1 bis 6), bindet durch ionische Bindung an alle Arten von Zellmembranen, Nuklei und Granula. Auf der anderen Seite bindet Auramin O, beschrieben in einem Beispiel in der Beschreibung der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. Hei 4(1992)-337459, an RNAs in einer Zelle. Daher färbt Auramin O die Zellmembran von Erythrozyten nur schwach und die erhaltene Fluoreszenzintensität ist so gering wie jene, die von anderen festen Bestandteilen wie Kristallen und hefeähnlichen Pilzen aufgewiesen wird, so daß es schwierig war, die Erythrozyten von den anderen festen Bestandteilen zu unterscheiden, wenn sie in derselben Probe enthalten waren. Jedoch bindet DiOCn(3) (n=1 bis 6) an und wird adsorbiert an alle Arten von Zellmembranen und verbessert die Färbbarkeit von Erythrozyten und hefeähnlichen Pilzen zur gleichen Zeit, wodurch es möglich wird, Kristalle, Erythrozyten und hefeähnliche Pilze durch den Unterschied an Fluoreszenzintensität zu unterscheiden. Inzwischen werden Leukozyten viel stärker gefärbt als Erythrozyten. Darüber hinaus erhöht die verbesserte Färbbarkeit die Fluoreszenzintensität, so daß der Einfluß der Hintergrundfluoreszenz gering wird.
Als ein zweiter Fluoreszenzfarbstoff wird ein herkömmlicher Farbstoff verwendet, von dem bekannt ist, daß er beschädigte Zellen färbt. Obwohl der erste Farbstoff Leukozyten färben kann, ist die Färbbarkeit von beschädigten Leukozyten schlechter als jene von lebendigen Leukozyten und ist auf demselben Niveau wie die Fluoreszenzsignalintensität von kolonisierten Bakterien, so daß es schwierig war, beschädigte Leukozyten von jenen festen Bestandteilen zu unterscheiden, wenn sie in derselben Probe vorhanden waren. Es ist gefunden worden, daß ein Farbstoff wie EB, welcher in der Lage ist, beschädigte Zellen zu färben, verwendet werden kann, um die oben erwähnten Nachteile zu kompensieren. Durch Verwenden des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs werden beschädigte Leukozyten stärker gefärbt als Bakterien, was es möglich macht, Bakterien zu unterscheiden.
Des weiteren ist gefunden worden, daß die Farbstoffe, die durch Licht mit einer roten Wellenlänge angeregt werden können, gemäß der vorliegenden Erfindung ähnliche Ergebnisse geben zu jenen, die oben beschrieben sind, selbst wenn nur eine Art von Farbstoff verwendet wird.
Auch wird die Detektion von Harnzylindern durch Einstellen auf den obigen Bereich der elektrischen Leitfähigkeit des Reagenz gemäß der vorliegenden Erfindung erleichtert. Es ist nämlich wünschenswert, das vorwärts gestreute Licht und das elektrische Widerstandssignal zu messen, um Harnzylinder genau zu detektieren. In der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. Hei 4(1992)-337459 werden Harnzylinder detektiert durch Messen des vorwärts gestreuten Lichts und des Vorwärts-Fluoreszenzlichts. Gemäß diesem Verfahren werden Harnzylinder, die einen Inklusionskörper enthalten, detektiert, aber hyaline Zylinder wurden manchmal nicht so genau detektiert wenn andere feste Bestandteile als Harnzylinder gleichzeitig in der Probe auftraten. Insbesondere war es schwierig, hyaline Zylinder und Schleimfäden zu unterscheiden, da ihre Fluoreszenzintensitäten beide sehr schwach sind und ihre Längen ähnlich sind. Hyaline Zylinder und Schleimfäden können jedoch genau bestimmt werden durch weiteres Messen des elektrischen Widerstandssignals sowie des vorwärts gestreuten Lichts und Vorwärts-Fluoreszenzlichts und Kombinieren der Meßparameter des gestreuten Lichtpulsweite (was die Längeninformation widerspiegelt) und den Wert der Widerstandshöhe (was das Volumen widerspiegelt). Harnzylinder, die einen Einschlußkörper enthalten, wie epitheliale Zylinder, granuläre Zylinder, erythrozytische Zylinder, leukozytische Zylinder etc., können durch Kombinieren der gestreuten Lichtpulsweite und der Fluoreszenzlichtpulsweite detektiert werden.
Beispiele
Das Reagenz zum Analysieren von festen Bestandteilen in Harn gemäß der vorliegenden Erfindung und Beispiele von Methoden zum Analysieren von Zellen unter Verwendung des Reagenz werden im folgenden beschrieben. Diese sind jedoch nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung limitierend gedacht.
Beispiel 1
Eine Verdünnungslösung und eine Färbelösung wurden gemäß der nachfolgenden Beschreibung hergestellt.
400 μl Urin wurden in 1.160 μl der obigen Verdünnungslösung verdünnt und 40 μl der obigen Färbelösung wurde hinzugefügt (Verdünnungsverhältnis von 4) zum Färben bei 35°C für 10 Sekunden. Das vorwärts gestreute Licht, das Vorwärts-Fluoreszenzlicht und das elektrische Widerstandssignal wurden durch ein Durchflußzytometer gemessen unter Verwendung eines Argonlasers als Lichtquelle. Hier kann ein Seiten-Fluoreszenzlicht (90°) gemessen werden. 1 und 2 zeigen Scattergramme erhalten durch Messen des vorwärts gestreuten Lichts und des Vorwärts-Fluoreszenzlichts unter Verwendung einer Probe, in welcher hefeähnliche Pilze, Leukozyten und Erythrozyten auftraten. Wie klar in 1 und 2 zu sehen ist, werden hefeähnliche Pilze, Leukozyten und Erythrozyten gut klassifiziert, wenn das Reagenz des obigen Beispiels verwendet wird. 3 zeigt eine Modellansicht des Scattergramms, wenn feste Bestandteile im Urin unter Verwendung des Reagenz der vorliegenden Erfindung gemessen werden.
Selbst wenn eine Probe mit Hintergrundfluoreszenz gemessen wurde, ermöglichte das Reagenz des obigen Beispiels Messungen ohne Beeinflussung durch die Hintergrundfluoreszenz, da die Zellen stark gefärbt waren.
Des weiteren war es möglich, relativ große feste Bestandteile zu detektieren und klassifizieren, wie Harnzylinder (hyaline Zylinder und Harnzylinder, welche einen Einschlußkörper enthalten), Schleimfäden, epitheliale Zellen, durch Messung von elektrischen Widerstandssignalen und Beobachten des Verhältnisses zwischen der gestreuten Lichtpulsweite und dem Wert der Widerstandspulshöhe. Eine Modellansicht des Scattergramms wird in 4 gezeigt. Des weiteren war es möglich, wenn Harnzylinder enthaltend Granula, Erythrozyten, Leukozyten und dergleichen auftraten, die Harnzylinder zuverlässiger durch Kombinieren der Fluoreszenzlichtpulsweite mit der gestreuten Lichtpulsweite zu messen. Eine Modellansicht des Scattergramms wird in 5 gezeigt.
Beispiel 2
Das Reagenz mit derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 wurde verwendet und die gleichen Schritte wurden wiederholt, außer daß Natriumpropionat hinzugefügt wurde, um den osmotischen Druck auf 210 mOsm/kg einzustellen, und die elektrische Leitfähigkeit betrug 7 mS/cm.
Das Ergebnis war ähnlich zu jenem von Beispiel 1.
Beispiel 3
Das Reagenz mit derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 wurde verwendet und die gleichen Schritte wurden wiederholt, außer daß Natriumpropionat hinzugefügt wurde, um den osmotischen Druck auf 310 mOsm/kg einzustellen, und die elektrische Leitfähigkeit betrug 10 mS/cm.
Das Ergebnis war ähnlich zu jenem von Beispiel 1.
Beispiel 4
400 μl Urin wurden in 1.184 μl der obigen Verdünnungslösung verdünnt und 16 μl der obigen Färbelösung wurden hinzugefügt zum Färben bei 35°C für 50 Sekunden. Das vorwärts gestreute Licht und das Seiten-Fluoreszenzlicht wurden gemessen durch ein Durchflußzytometer unter Verwendung eines roten Halbleiterlasers als Lichtquelle. Ein Scattergramm, das ähnlich ist zu jenem von Beispiel 1, wurde erhalten.
Vergleichsbeispiel 1
400 μl Urin wurden in 1.160 μl der obigen Verdünnungslösung verdünnt und 40 μl der obigen Färbelösung wurden hinzugefügt (Verdünnungsverhältnis von 4) zum Färben bei 35°C für 10 Sekunden. Das vorwärts gestreute Licht, Vorwärts-Fluoreszenzlicht und das elektrische Widerstandssignal wurden gemessen durch ein Durchflußzytometer unter Verwendung eines Argonlasers als Lichtquelle. 7 und 8 zeigen Scattergramme, die durch Messen des vorwärts gestreuten Lichts und des Vorwärts-Fluoreszenzlichts erhalten wurden. Wie in 7 und 8 klar zu sehen ist, war die Färbbarkeit von hefeähnlichen Pilzen und Erythrozyten schlecht, wenn das Reagenz des obigen Vergleichsbeispiels verwendet wurde, so daß es unmöglich war, diese zu unterscheiden.
Auch trat, wenn eine Probe mit Hintergrundfluoreszenz gemessen wurde unter Verwendung des Reagenz des obigen Vergleichsbeispiels, eine Region in einem Bereich auf, wo die Messung komplett unmöglich war durch den Einfluß der Hintergrundfluoreszenz, wie in 9 und 10 illustriert wird, was die Analyse unmöglich machte.
Wenn das vorwärts gestreute Licht und Vorwärts-Fluoreszenzlicht gemessen wurden in dem obigen Beispiel 1, wurde die Messung durchgeführt mit einer Detektionsgenauigkeit von etwa 16,6 % im Vergleich zum Vergleichsbeispiel 1. Daher wurde bestätigt, daß hefeähnliche Pilze, Leukozyten und Erythrozyten gut klassifiziert werden können unter Verwendung eines Detektors mit einer geringeren Sensitivität. In anderen Worten ist es nötig, die Detektorsensitivität im Vergleichsbeispiel 1 zu erhöhen, da die Fluoreszenz von Erythrozyten sehr schwach ist, wohingegen ein Detektor mit geringerer Sensitivität verwendet werden kann im Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung, da Erythrozyten auch stark gefärbt sind. Daher kann die Detektorsensitivität zur Messung abgesenkt werden in einem solchen Maß, daß Hintergrundfluoreszenz beinahe vernachlässigbar ist.
Gemäß dem Reagenz der vorliegenden Erfindung zum Analysieren von festen Bestandteilen in Urin und dem Verfahren zum Analysieren von Zellen, welches das Reagenz verwendet:

(1) Wurde die Färbbarkeit von Erythrozyten verbessert und es wurde möglich, Erythrozyten von Kristallen zu unterscheiden.
(2) Ist die Färbbarkeit von verschiedenen festen Bestandteilen, die in Urin auftreten, verbessert, so daß die Sensitivität der Fotoverstärkerröhre (PMT) zum Detektieren von Fluoreszenz auf ein solches Maß reduziert werden kann, daß der Einfluß der Hintergrundfluoreszenz in Urin selbst beinahe vernachlässigbar ist.
(3) Selbst wenn viele Arten von festen Bestandteilen gleichzeitig im Urin auftreten ist es möglich, diese genauer zu unterscheiden.
(4) Die Fähigkeit, Harnzylinder zu unterscheiden, ist verbessert worden.

Claims

Reagenz geeignet zur Unterscheidung von zumindest kristallinen Bestandteilen, Erythrozyten, hefeähnlichen Pilzen und Leukozyten in Urin, umfassend: (I) einen Puffer zum Halten des pH bei 5,0 bis 9,0, (II) ein Kompensationsmittel für osmotischen Druck, um den osmotischen Druck bei 100 mOsm/kg bis 600 mOsm/kg zu halten, (III) einen Farbstoff, der in der Lage ist, durch Licht mit einer roten Wellenlänge erregt zu werden, und (IV) einen Komplexbildner, worin der Farbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

Rhodnile Blue Capri Blue BB, und Basic Blue 124.
Reagenz gemäß Anspruch 1, dessen elektrische Leitfähigkeit auf 1 mS/cm bis 10 mS/cm eingestellt ist.
Reagenz gemäß Anspruch 1, worin der Komplexbildner ein EDTA-Salz ist.
Reagenz gemäß Anspruch 1, welches aus den folgenden zwei unabhängigen Lösungen besteht: (a) eine Färbelösung umfassend den Farbstoff, der in der Lage ist, von Licht mit einer roten Wellenlänge erregt zu werden, und (b) eine Verdünnungslösung enthaltend die Pufferlösung, das Kompensationsmittel für den osmotischen Druck und den Komplexbildner.
Verfahren zum Analysieren von festen Bestandteilen in Urin durch Mischen des Urins mit einem Reagenz zum Analysieren von festen Bestandteilen im Urin umfassend: (I) einen Puffer zum Halten des pH bei 5,0 bis 9,0, (II) ein Kompensationsmittel für osmotischen Druck, um den osmotischen Druck bei 100 mOsm/kg bis 600 mOsm/kg zu halten, (III) einen Farbstoff, der in der Lage ist, durch Licht mit einer roten Wellenlänge erregt zu werden, und (IV) einen Komplexbildner, um die gewünschten festen Bestandteile im Urin zu färben, Anwenden eines Erregungslichts auf feste Bestandteile in dem obigen gefärbten Urin und Messen des gestreuten Lichts und des Fluoreszenzlichts, welches von den festen Bestandteilen ausgesandt wird, worin der Farbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Verfahren gemäß Anspruch 5, worin ein elektrisches Widerstandssignal gemessen wird, nachdem die festen Bestandteile im Urin gefärbt wurden.
Verfahren gemäß Anspruch 5, worin das Reagenz zum Analysieren mit dem Urin gemischt wird, nachdem das Reagenz zuvor erwärmt wird.