DE69927871T2

DE69927871T2 - Vorrichtung und Verfahren zur Unterscheidung von Erythrozyten in Urin

Info

Publication number: DE69927871T2
Application number: DE69927871T
Authority: DE
Inventors: Kazuyuki Kasai-shi Kanai; Masakazu Kobe-shi Fukuda
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1998-04-08
Filing date: 1999-04-07
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2019-04-08
Also published as: EP0949498B1; CN1237707A; DE69927871D1; EP0949498A2; US6118522A; JP3867880B2; JPH11295207A; EP0949498A3; CN1123769C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Klassifizieren von Erythrozyten in Urin und insbesondere einen Apparat und ein Verfahren, welche Durchflusszytometrie verwenden, um Erythrozyten in Urin zu differenzieren, um den Ursprung und die Art der Erythrozyten zu bestimmen.
2. BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN STANDES DER TECHNIK
Es gibt zwei Fälle, welche Hämaturie, worin Erythrozyten mit Urin vermischt sind, hervorrufen. Hämaturie glomerulären Ursprungs tritt bei einer internen Krankheit wie Nephritis auf, wohingegen Hämaturie von nichtglomerulärem Ursprung bei Harnwegserkrankungen wie Blasenkrebs, Nierenkrebs und urethrale Konkremente auftritt. Wenn Hämaturie festgestellt wird, ist es notwendig, nach dem Grund dafür zu suchen.
Bekannte herkömmliche Verfahren zur Bestimmung ob Erythrozyten im Urin glomerulären Ursprungs (eine interne Krankheit) oder nichtglomerulären Ursprungs (eine Harnwegserkrankung) sind, umfassen:

(a) ein Verfahren zur Klassifizierung von Erythrozyten gemäß ihrer morphologischen Unterschiede unter Verwendung eines Mikroskops, und
(b) ein Verfahren zur Klassifizierung von Erythrozyten gemäß Unterschieden in der Größe der Erythrozyten unter Verwendung eines automatischen Blutzellzählapparates.

Jedoch hat das Verfahren gemäß (a) den Nachteil, dass die Nachweismethode kompliziert ist und viel Zeit in Anspruch nimmt. Darüber hinaus ist es schwierig, einen verlässlichen Nachweis zu erhalten, da dieser auf einer Beurteilung durch das menschliche Auge beruht, welche Fachwissen bedarf.
Das Verfahren gemäß (b) hat den Nachteil, dass eine Vorbehandlung wie Zentrifugationstrennung erforderlich ist, da es notwendig ist, die Messungen bei einer auf einem konstanten Niveau gehaltenen elektrischen Leitfähigkeit der Urinprobe durchzuführen. Darüber hinaus besteht auch die Sorge, dass die Genauigkeit der Beurteilung durch fehlerhafte Bestimmung von Nichterythrozyten (z.B. einem Bakterium oder einer kristallinen Komponente) als Erythrozyten abnimmt.
Um die oben genannten Probleme zu lösen, ist (c) ein neuer Apparat bekannt zur Klassifizierung von Erythrozyten, Leukozyten, Epithelialzellen, hyaliner Zylinder, und Bakterien durch Prozessierung der optischen Singalintensitäten von gestreutem Licht und Fluoreszenzlicht der Partikel wie von einem Durchflusszytometer erhalten, und Analysieren der Erythrozyten in Urin gemäß eines Bias einer bestimmten Größenverteilung der differenzierten Erythrozyten (siehe japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. Hei 8(1996)-240520).
Dieser Apparat verwendet die Tatsache, dass die Erythrozyten von glomerulärem Ursprung im allgemeinen eine geringere Teilchengröße aufweisen als jene von nichtglomerulärem Ursprung, wodurch die Gruppe von Erythrozyten, deren Teilchengrößenverteilung zu einer geringeren Größe verschoben ist, als Erythrozyten von glomerulärem Ursprung klassifiziert wird, und die Gruppe von Erythrozyten, deren Teilchengrößenverteilung zu größerer Größe verschoben ist als Erythrozyten von nichtglomerulärem Ursprung klassifiziert wird.
Insbesondere berechnet ein Berechnungsteil des Apparats eine Anzahl Raz von Erythrozyten, welche in einen Bereich von La bis Lz fallen, eine Anzahl Ra2 von Erythrozyten, welche in einen Bereich von La bis L2 fallen, und eine Anzahl R1z von Erythrozyten, welche in einen Bereich von L1 bis Lz fallen, wobei La eine untere Grenze der Partikelgröße in der Erythrozytengrößenverteilung darstellt, Lz eine obere Grenze davon darstellt, und L1 und L2 voreingestellte Werte darstellen, welche das Verhältnis La < L1 < L2 < Lz erfüllen.
Ein Bestimmungsteil des Apparats bestimmt, dass die Erythrozyten glomerulären Ursprungs sind, wenn Ra2/Raz größer als ein erster vorbestimmter Wert ist und bestimmt, dass Erythrozyten von nichtglomerulärem Ursprung sind, wenn R1z/Raz größer als ein zweiter vorbestimmter Wert ist. Wenn keiner der obigen Ungleichheitsverhältnisse erfüllt ist, werden die Erythrozyten als vom gemischten Typ bestimmt. Wenn beide der obigen Ungleichheitsverhältnisse erfüllt sind, werden die Erythrozyten als von nichtglomerulärem Ursprung bestimmt.
Die Beurteilung in dem Stand der Technik-Verfahren (c) ist entwickelt worden unter Berücksichtigung der Tatsache, dass, obwohl die Partikelgrößenverteilung von Erythrozyten von nichtglomerulärem Ursprung ein Maximum aufweist, welches gegen größere Größe verschoben ist und die Partikelgrößenverteilung von Erythrozyten von glomerulärem Ursprung ein Maximum, welches gegenüber kleineren Größen verschoben ist, eine überlappende Region besteht (eine Region, in der die beiden Partikelgrößenverteilungen miteinander überlappen). In anderen Worten werden die Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs durch Verwendung des Verhältnisses von Erythrozyten mit einer Teilchengröße, welche größer ist als ein vorbestimmter Wert, umfassend den überlappenden Teil, erfasst, und die Erythrozyten von glomerulärem Ursprung werden durch Verwendung des Verhältnisses von Erythrozyten mit einer Partikelgröße, welche geringer ist als ein vorbestimmter Wert, umfassend den überlappenden Teil, erfasst, um den Ursprung der Erythrozyten zu bestimmen.
Jedoch stimmte die Beurteilung, welche tatsächlich in Untersuchungszimmer erhalten wurde, oft nicht mit dem durch Mikroskopie erhaltenen Beobachtungsergebnis überein.
Dies könnte den folgenden Grund haben. Bei dieser Beurteilung werden Erythrozyten, welche ein Signal ergeben, das eine geringe Größe anzeigt, als Erythrozyten glomerulären Ursprungs bestimmt, unter der Annahme, dass die Erythrozyten von nichtglomerulärem Ursprung eine Morphologie ähnlich jener in Blut aufweisen. Jedoch können die Erythrozyten im Urin beschädigt sein, um ein Signal, welches eine geringere Größe anzeigt, zu ergeben. Der Begriff „beschädigt" wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Beschädigung von Erythrozyten, die in Azidurie, Hyposthenurie oder dergleichen auftritt, während die Erythrozyten in einer Blase oder in einer Urinprobe nach dem Harnlassen verweilen.
Hier bezieht sich der Begriff „glomerulären Ursprungs" auf Urin, enthaltend einen großen Anteil deformierter Erythrozyten. Die deformierten Erythrozyten sind rote Blutzellen, welche durch das Hindurchtreten durch einen Glomerulus einer Niere deformiert sind, sodass sie eine charakteristische Form aufweisen, und eine andere Morphologie haben als jene der beschädigten Erythrozyten, welche in Azidurie, Hyposthenurie oder dergleichen auftreten. In anderen Worten können die Erythrozyten durch das Verfahren gemäß dem Stand der Technik nur unter der Voraussetzung klassifiziert werden, dass die Erythrozyten im Urin nicht beschädigt wurden.
EP 0 138 591 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Erythrozytenabnormalitäten unter Verwendung der Größenverteilung, gemessen durch eine durchflusszytometrische Technik.
EP 0 780 680 offenbart einen Urinprobenanalyzer gemäß der Präambel von Ansprüchen 1 und 5.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf diese Umstände gemacht, und der Zweck davon ist, ein Verfahren zur genauen Bestimmung des Ursprungs und der Art der Erythrozyten in Urin zur Verfügung zu stellen, selbst wenn der Urin unter Azidurie, Hyposthenurie oder dergleichen leidet.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Klassifizierung von Erythrozyten in Urin gemäß Anspruch 1 zur Verfügung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird besser verstanden werden durch die folgende detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen, in welchen:
1 eine Ansicht ist, die die Konstruktion eines optischen Systems, anwendbar in einem Verfahren gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung illustriert,
2 ein Flussdiagramm ist, welches die grundlegenden Operationen eines Verfahrens gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung illustriert,
3 eine Ansicht ist, die ein Beispiel eines Scattergramms der Intensitäten von „Fluoreszenzlicht-gestreutes Licht", erhalten durch das Verfahren einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, zeigt,
4 eine Ansicht ist zur Erklärung der Größe X von Erythrozyten als Bestimmungsparameter gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
5 eine Ansicht ist, die ein Beispiel eines Erythrozytengrößenverteilungsdiagramms zeigt, erhalten durch das Verfahren gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
6 eine Ansicht ist, die ein Beispiel eines Erythrozytengrößenverteilungsdiagramms zeigt, erhalten durch das Verfahren gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
7 eine Ansicht ist, die ein Beispiel eines Erythrozytengrößenverteilungsdiagramms zeigt, erhalten durch das Verfahren gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
8 eine Ansicht ist, welche ein Beispiel eines Erythrozytengrößenverteilungsdiagramms zeigt, erhalten durch das Verfahren gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
9 eine Ansicht ist zur Erklärung der Breite Y des Erythrozytengrößenverteilungsdiagramms als einem anderen Bestimmungsparameter gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, und
10 eine Grafik ist, erhalten durch Auftragen der Größe X der Erythrozyten und der Breite Y des Erythrozytengrößenverteilungsdiagramms als Bestimmungsparameter gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Urinprobe der vorliegenden Erfindung kann eine Probe sein, wie eine solche erhalten durch Färben mit einem Fluoreszenzfarbstoff, ursprünglicher Urin oder mit einem Verdünnungsmittel verdünnter Urin.
Die Umhüllungsflusszelle für die Bildung des Urinprobenflusses kann eine Durchflusszelle sein, welche in der Lage ist, einen schmalen Probenfluss durch einen hydrodynamischen Effekt durch Umgeben einer Urinprobe, enthaltend Teilchen, mit einer Umhüllungsflüssigkeit zum Fluss zu generieren. Zu diesem Zweck können allgemein bekannte Umhüllungsflusszellen verwendet werden.
Lichtanwendungsmittel zum Anwenden von Licht auf einen Urinprobenfluss können Mittel zur kontinuierlichen Bestrahlung des Urinprobenflusses mit Licht sein. Zu diesem Zweck kann eine Lichtquelle wie ein Laser, eine Halogenlampe oder eine Tungstenlampe verwendet werden.
Teilchen in einem Urinprobenfluss können feste, im Urin enthaltene Komponenten sein, nämlich Erythrozyten, Leukozyten, Epithelialzellen, Bakterien, hefeähnliche Pilze, Spermien, und dergleichen.
Als Lichtdetektionsmittel zum Detektieren der Intensität des von einem Teilchen ausgesandten Lichts kann z.B. eine Photodiode oder ein Phototransistor verwendet werden zur Detektion der Intensität von gestreutem Licht, und eine Fotoverstärkerröhre kann zur Detektion der Intensität von Fluoreszenzlicht verwendet werden.
Die Identifikationsmittel zur Identifikation von Erythrozyten unter den Teilchen in einem Urinprobenfluss kann z.B. ein Mittel sein zur Herstellung eines zweidimensionalen Scattergramms (Verteilungsdiagramm) unter Verwendung von Intensitäten des gestreuten Lichts und des Fluoreszenzlichts, detektiert von jedem der Teilchen, als Parameter und zur Bestimmung der Teilchen, welche in eine vorbestimmte Verteilungsregion fallen, als Erythrozyten.
In anderen Worten, da es dem Fachmann bekannt ist, dass Teilchen in einer Urinprobe Eigenschaften bezüglich ihres gestreuten Lichts und der Fluoreszenzlichtintensitäten wie in Tabelle 1 und 3 gezeigt haben, können jene, welche in den Bereich in einem Scattergramm mit der Intensität des gestreuten Lichts im Bereich von 40 bis 140ch und mit der Intensität des Fluoreszenzlichts im Bereich von 20 bis 30ch als Erythrozyten identifiziert werden. Hier stellt die Einheit „ch" eine relative Frequenz der Intensität von gestreutem Licht dar, und 100ch, umgewandelt in eine Erythrozytengröße, entspricht etwa 5 μm. Verfahren zur Identifizierung von Erythrozyten sind nicht auf das oben beschriebene begrenzt. TABELLE 1

(Einheiten: ch)

Das Teilchengrößenverteilungsherstellungsmittel zur Herstellung eines Teilchengrößenverteilungsdiagramms von Erythrozyten, basiert auf den Lichtsignalintensitäten der identifizierten Erythrozyten kann ein Mittel sein zur Herstellung eines Histogramms der Teilchengrößenverteilung, unter Verwendung der Intensität des gestreuten Lichts als Parameter, da die Intensität des gestreuten Lichts, insbesondere die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts, im allgemeinen der Querschnittsfläche (Teilchendurchmesser) des Teilchens entspricht. Hier kann seitwärts gestreutes Licht anstelle von vorwärts gestreutem Licht verwendet werden, obwohl seitwärts gestreutes Licht anfällig ist, durch die Form oder die Oberflächenbedingung der Erythrozyten beeinflusst zu sein.
Die Bestimmungsmittel zur Bestimmung des Ursprungs von Erythrozyten gemäß einem Erythrozytengrößenwert, bei welchem die akkumulierte Frequenz von Erythrozyten, gezählt von der kleinsten Größe in dem Teilchengrößenverteilungsdiagramm, mit einem voreingestellten Wert, größer als die Hälfte der gesamten akkumulierten Frequenz in dem Teilchengrößenverteilungsdiagramm, übereinstimmt, kann ein Mittel zur Bestimmung sein, ob die Erythrozyten in dem Urin von glomerulärem Ursprung oder nichtglomerulärem Ursprung sind, in Übereinstimmung mit einem Erythrozytengrößenwert bei einer voreingestellten Position, größer als der Median des Verteilungsdiagramms.
Diese Beurteilung basiert auf der Vorstellung, dass manche der Erythrozyten ihre ursprüngliche Form oder eine Form ähnlich der ursprünglichen Form beibehalten. Dies beruht auf der Tatsache dass, da die Schäden der Erythrozyten im Urin auftreten während der Urin in der Blase oder dergleichen ist, die Bedingungen, unter welchen die Schäden auftreten, von den Erythrozyten abhängen, und die Widerstandsfähigkeit der Membran von Erythrozyt zu Erythrozyt variiert. In anderen Worten überwacht das Bestimmungsmittel, ob die Erythrozyten, welche ihre ursprüngliche Form beibehalten, in der Urinprobe bleiben oder nicht, durch Untersuchen eines Erythrozytengrößenwerts an einer vorbestimmten Stelle, größer als der Median des Erythrozytengrößenverteilungsdiagramms.
Das heißt, wenn dieser Erythrozytengrößenwert größer ist als der voreingestellte Standard, bestimmt das Bestimmungsmittel, dass die Erythrozyten von nichtglomerulärem Ursprung sind, da manche der Erythrozyten ihre ursprüngliche Form beibehalten. Andererseits bestimmt das Bestimmungsmittel, wenn dieser Erythrozytengrößenwert kleiner als der voreingestellte Standard ist, dass die Erythrozyten von glomerulärem Ursprung sind, da keine Erythrozyten ihre ursprüngliche Form beibehalten.
Es können auch zwei voreingestellt Standards für die Erythrozytengröße verwendet werden, um zu bestimmen, dass die Erythrozyten, welche zwischen diese beiden voreingestellten Standards fallen, von einem gemischten Typus sind, welcher nicht als einer der beiden oben genannten Typen klassifiziert werden kann (nichtglomerulär oder glomerulär).
Insbesondere kann ein voreingestellter Wert A% (50 < A < 100) verwendet werden, um eine Position zu berechnen, an welcher die akkumulierte Frequenz, gezählt von der geringsten Erythrozytengröße in dem Erythrozytengrößenverteilungsdiagramm, mit A% der gesamten Erythrozyten übereinstimmt, wodurch die Erythrozytengröße Xch an dieser Position berechnet wird. Dann kann ein voreingestellter Standard Qch der Erythrozytengröße zur Verfügung gestellt werden, wodurch die Erythrozyten als von glomerulärem Ursprung bestimmt werden können, wenn X < Q, und als von nichtglomerulärem Ursprung, wenn X ≥ Q, und das Ergebnis der Bestimmung wird auf dem Ausgabegerät ausgegeben.
Des weiteren kann ein erster voreingestellter Standard Q1ch und ein zweiter voreingestellter Standard Q2ch zur Verfügung gestellt werden (Q1 < Q2), wodurch die Erythrozyten als von glomerulärem Ursprung bestimmt werden können, wenn X < Q1, als von nichtglomerulärem Ursprung, wenn X ≥ Q2, und als von einem gemischten Typus, welcher nicht als glomerulärer Typus oder nichtglomerulärer Typus klassifiziert werden kann, wenn Q1 ≤ X < Q2.
Um die Art der Erythrozyten gemäß eines Verteilungsbreitenwerts eines zentralen Bereichs des Erythrozytengrößenverteilungsdiagramms zu bestimmen heißt, den Verteilungsbreitenwert des zentralen Bereichs des Erythrozytengrößenverteilungsdiagramms zu überwachen um zu bestimmen, ob die Erythrozyten im Urin dem einfachen Typus oder multiplen Typus angehören. Dies dient der Bestimmung, ob die Erythrozyten im Urin Singeltyp-Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs, welche nicht beschädigt worden sind, oder multipler Typus Erythrozyten sind, welche beschädigt worden sind.
Die multipler Typus Erythrozyten, welche beschädigt worden sind, umfassen nicht nur Erythrozyten glomerulären Ursprungs, wie dellenähnliche Erythrozyten und ringähnliche Erythrozyten, sondern auch konfettiähnliche Erythrozyten und lysierte Erythrozyten, welche durch Veränderungen im osmotischen Druck geschaffen wurden.
Insbesondere kann als Breite der Teilchengrößenverteilung ein Bereich enthaltend B% der gesamten Erythrozyten in der Mitte des Teilchengrößenverteilungsdiagramms gesetzt werden, und die Breite Ych des Bereichs kann berechnet werden. Des weiteren kann ein eingestellter Breitenstandard Wch verwendet werden um zu bestimmen, dass die Erythrozyten vom Singeltypus sind, wenn Y < W, und vom multiplen Typus sind, wenn Y ≥ W.
Der Ursprung der Erythrozyten kann auch bestimmt werden basierend auf dem Verteilungsbreitenwert des zentralen Bereichs des Erythrozytengrößenverteilungsdiagramms.
Insbesondere kann als die Breite des Partikelgrößenverteilungsdiagramms ein Bereich enthaltend B% der gesamten Erythrozyten in der Mitte des Teilchengrößenverteilungsdiagramms gesetzt werden, und die Breite Ych des Bereichs kann berechnet werden. Des weiteren können eingestellt Breitenstandards Wch1 und Wch2 (W1 < W2) verwendet werden um zu bestimmen, dass die Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs sind, wenn Y < W1, von glomerulärem Ursprung sind, wenn W1 ≤ Y < W2, oder vom gemischten Typus sind, welcher nicht als glomerulärer oder nichtglomerulärer Typus klassifiziert werden kann, wenn W2 ≤ Y.
Des weiteren kann durch Kombinieren der Erythrozytengröße Xch und der Verteilungsbreite Ych der Ursprung und Typus der Erythrozyten mit verbesserter Genauigkeit bestimmt werden auf Basis der Information, welche die Morphologie der Erythrozyten widerspiegelt.
Insbesondere kann der Bereich dargestellt durch die Gleichung Q2 ≤ X unterteilt werden in einen Bereich repräsentiert durch Y < W und einen Bereich repräsentiert durch W < Y. Die Erythrozyten, welche die Gleichung Q2 ≤ X und Y < W erfüllen, können als Singeltyp-Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs, welche ihre Morphologie ohne sehr beschädigt zu sein bestimmt werden. Die Erythrozyten, welche die Gleichung Q2 ≤ X und W < Y erfüllen, können als multipler Typus-Erythrozyten, welche Gemischttyp-Erythrozyten sind, die nicht als Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs klassifiziert werden können, da sie beschädigte Erythrozyten zusätzlich zu Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs, welche ihre Morphologie ohne sehr beschädigt zu sein beibehalten, enthalten. Diese Kombination kann den Bedürfnissen entsprechend in verschiedenen Weisen eingestellt werden.
BEISPIELE
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail auf Basis der Ausführungsformen davon mit Bezug auf die angefügten Zeichnungen erklärt werden. Jedoch sollen diese Ausführungsformen den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht begrenzen.
Konstruktion der Vorrichtung, anwendbar in einem Verfahren zur Klassifizierung von Erythrozyten
1 ist eine Ansicht, die die Konstruktion eines optischen Systems in einem Durchflusszytometer, welches eine Vorrichtung, anwendbar in einem Verfahren zum Klassifizieren von Erythrozyten in Urin gemäß der vorliegenden Erfindung, ist, illustriert.
In 1 bildet eine Umhüllungsflusszelle (sheath flow cell) 1 einen Urinprobenfluss, indem eine Urinprobe vorbehandelt durch ein Flureszenzfärbungsverfahren und aus einer Probendüse 2 injeziert, durch eine Hüllflüssigkeit umgeben wird. Ein Argonlaserstrahl 3 bestrahlt ein Teilchen 4 in dem Urinprobenfluss durch eine Linse 11. Das Licht, welches direkt durch den Urinprobenfluss transmittiert wird, wird durch einen Strahlstopper 5 gestoppt. Vorwärts gestreutes Licht und Vorwärtsfluoreszenzlicht, ausgestrahlt durch das Teilchen 4, werden durch die Sammellinse 6 gesammelt, um durch das Loch 12 hindurch zu treten. Dann wird das vorwärts gestreute Licht durch einen dichroiden Filter 7 reflektiert, um durch die Linse 13 durchzutreten, um durch die Fotodiode 8 detektiert zu werden, wohingegen das Vorwärtsfluoreszenzlicht durch den dichroiden Filter 7 hindurch transmittiert wird, um durch den Filter 14 hindurch zu treten, um durch die Fotoverstärkerröhre detektiert zu werden. Signale, welche durch die Fotodiode 8 und die Fotoverstärkerröhre 9 empfangen wurden, werden durch die Verstärker 15 bzw. 16 verstärkt, um in die Signalverarbeitungseinrichtung 10 eingegeben zu werden.
Die grundlegenden Operationen der Vorrichtung mit einer derartigen Konzeption werden nun mit Bezug auf das Flussdiagramm, das in 2 gezeigt wird, erklärt.
Zunächst wird eine Urinprobe durch Verdünnen von Urin mit einem Verdünnungsmittel und Hinzufügen einer Färbelösung vorbereitet. Die Urinprobe wird dann aus der Probendüse 2 in die Hüllflusszelle 1 zusammen mit einer Hüllflüssigkeit injeziert, um den Urinprobenfluss zu bilden (Schritt 1).
Zur selben Zeit wird ein Argonlaserstrahl 3 auf den Urinprobenfluss gerichtet. Das vorwärtsgestreute Licht und das Vorwärtsfluoreszenzlicht, ausgestrahlt von jedem Teilchen 4, werden durch die Fotodiode 8 bzw. die Fotoverstärkerröhre 9 detektiert. Die Intensitäten des vorwärtsgestreuten Lichts und des Vorwärtsfluoreszenzlichts, die so detektiert wurden, werden in der Signalverarbeitungseinheit 10 gespeichert (Schritt 2).
Als nächstes bereitet die Signalverarbeitungseinrichtung 10 ein zweidimensionales Scattergramm unter Verwendung der Intensitäten des vorwärtsgestreuten Lichts und des Vorwärtsfluoreszenzlichts als Parameter und zeigt das Scattergram auf einer Darstellungsvorrichtung (nicht gezeigt) (Schritt 3).
3 zeigt ein Beispiel eines zweidimensionalen Verteilungsdiagramms (Scattergramm) der Intensitäten des „Fluoreszenz und gestreuten Lichts", dargestellt auf der Darstellungsvorrichtung der gegenwärtigen Vorrichtung. FSC stellt die Intensität des vorwärtsgestreuten Lichts dar, welches die Querschnittsfläche jeder Zelle widerspiegelt. FL stellt die gefärbte Intensität des Fluoreszenzlichts dar. Bei einer Kernfärbung spiegelt es den Gehalt an DNA und RNA wieder. In der Färbung wird auch eine Membranfärbung durchgeführt, da es nicht möglich ist, Kristalle, Zellen ohne Kern und Erythrozyten durch Kernfärbung allein zu klassifizieren. Somit ist es möglich, die Teilchen deutlich in Erythrozyten, Leukozyten, Epithelialzellen, Bakterien, Pilze, hyaline Zylinder und Kristallkomponenten gemäß der Größe der Teilchen und der Intensität des Fluoreszenzlichts zu klassifizieren, wodurch die jeweiligen Anzahlen davon gezählt werden können (Schritt 4).
Ein Teilchengrößenverteilungsdiagramm der identifizierten Erythrozyten (in diesem Fall ein Histogramm, unter Verwendung der Intensität des vorwärtsgestreuten Lichts als Parameter), wird dann hergestellt (Schritt 5).
Dann werden in Bezug auf die vorwärtsgestreute Lichtintensität der erste und zweite Standard Q1ch und Q2ch für die Erythrozytengröße und ein dritter Standard Wch für die Erythrozytengrößenverteilungsbreite gesetzt (Schritt 6).
Die Erythrozytengröße Xch, bei welcher eine akkumulierte Frequenz von Erythrozyten, gezählt von der kleinsten Größe in dem Teilchengrößenverteilungsdiagramm, mit A% (50 < A ≤ 100) der gesamten Erythrozyten übereinstimmt, wird berechnet. Des weiteren wird ein Bereich, enthaltend B% der gesamten Erythrozyten, in der Mitte des Teilchengrößenverteilungsdiagramms gesetzt, und die Breite Ych des Bereich wird berechnet (Schritt 7).
Als nächstes, wenn die Standards Q1ch, Q2ch und Wch gesetzt wurden, werden die Erythrozyten, welche die Gleichung X < Q1 erfüllen als von glomerulärem Ursprung bestimmt, jene welche die Gleichung Q1 ≤ X < Q2 erfüllen als vom gemischten Typ (d.h. nichtglomerulär und glomerulär), jene welche die Gleichung Q2 ≤ X und Y < W erfüllen als von nichtglomerulärem Ursprung, und jene welche die Gleichung Q2 ≤ X und W < Y als von gemischtem Typus (d.h. nichtglomerulär und glomerulär) bestimmt. Die Ergebnisse der Beurteilung werden auf der Ausgabevorrichtung dargestellt (Schritt 8).
Als Proben zur Klassifizierung wurden 66 Urinproben, gesammelt am Tag der Untersuchung (umfassend jene enthaltend Erythrozyten von glomerulärem Ursprung, jene enthaltend Erythrozyen von nichtglomerulärem Ursprung, und jene enthaltend Erythrozyten eines gemischten Typs) mittels der oben beschriebenen Vorrichtung in einem Untersuchungszimmer eines Spitals gemessen. Die Urinproben wurden am Tag der Messung gesammelt.
Zur Überprüfung der Klassifikationsergebnisse wurde ein Lasermikroskop verwendet, und die Urinproben, enthaltend 70% oder mehr deformierter Erythrozyten als von glomerulärem Ursprung, jene enthaltend 30% oder mehr oder weniger als 70% deformierte Erythrozyten als von gemischtem Typus und jene enthaltend weniger als 30% deformierter Erythrozyten als von nichtglomerulärem Ursprung bestimmt.
Zunächst wurden die Erythrozyten in diesen Urinproben durch das konventionelle Verfahren klassifiziert. Als Klassifizierungsbedingung wurden L1 und L2 auf 84ch bzw. 126ch gesetzt, welches die festgesetzten Werte sind, die in den Beispielen der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. Hei 8(1996)-240520 angegeben sind. Unter Verwendung dieser Einstellungen wurden jene, die die Gleichung Ra2/Raz ≥ 0,8 erfüllten als von glomerulärem Ursprung bestimmt, jene die die Gleichung Ra1/Raz ≥ 0,8 erfüllten als von nichtglomerulärem Ursprung, jene welche keine der beiden obigen Gleichungen erfüllten als vom gemischten Typ bestimmt, und jene welche beide der obigen zwei Gleichungen als von nichtglomerulärem Ursprung bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
Von den 34 Urinproben, welche durch Mikroskopieren als von nichtglomerulärem Ursprung bestimmt wurden, wurden 14 Urinproben durch das konventionelle Verfahren fälschlich als von glomerulärem Ursprung identifiziert.
TABELLE 2
BEISPIEL 1
Um das Vorhandensein von Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs, welche ihre ursprüngliche Form beibehalten, darzustellen, wurde der Teilchengrößenverteilungswert an eine Stelle gesetzt, an der die akkumulierte Frequenz von Erythrozyten, gezählt von der kleinsten Größe in dem Teilchengrößenverteilungsdigramm mit A% (50 < A ≤ 100) der gesamten Erythrozyten übereinstimmt. Wenn der Wert A nahe 50% ist, ist er etwa gleich dem Median des Teilchengrößenverteilungsdiagramms, sodass der Wert anfällig ist von den beschädigten Erythrozyten beeinflusst zu werden. Auf der anderen Seite, wenn der Wert A nahe 100% ist, wird er durch das Vorhandensein einer extrem kleinen Menge von Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs beeinflusst, wodurch eine schlechte Genauigkeit erzielt wird. Daher ist der Wert A vorzugsweise im Bereich von 60 bis 90%.
4 zeigt die Erythrozytengröße Xch als den Teilchengrößenverteilungswert, wenn der Wert A auf 70% gesetzt ist.
Tabelle 3 zeigt Beurteilungsergebnisse, wenn der erste Standard Q1 zur Bestimmung des glomerulären Ursprungs auf 80ch gesetzt wird, der zweite Standard Q2 zur Bestimmung des nichtglomerulären Ursprungs auf 100ch gesetzt wird, und die Erythrozyten, welche zwischen den ersten und zweiten Standard Q1 und Q2 fallen als von gemischtem Typ bestimmt werden.
Im konventionellen Verfahren wurden 14 Proben der 34 Proben vom nichtglomerulären Ursprung irrtümlicherweise als von glomerulärem Ursprung identifiziert. Gemäß der Beurteilung dieses Beispiels wurden nur vier Proben fälschlich als von glomerulärem Ursprung identifiziert, wodurch sich eine große Verbesserung der Genauigkeit zeigt.
TABELLE 3
5 zeigt ein typisches Teilchengrößenverteilungsdiagramm von Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs gemäß einer Analyse durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung. In dieser Probe sind Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs im Urin nicht beschädigt worden, sodass der Mittelwert des Verteilungsdiagramms zu einer größeren Größe verschoben ist, und die Breite der Teilchengrößenverteilung gering ist. Da die Teilchengrößenverteilung dieser Probe zu einer größeren Größe verschoben ist, ergibt das konventionelle Verfahren die korrekte Identifikation der Probe als von nichtglomerulärem Ursprung, da Ra2/Raz = 0,07 und Ra1/Raz = 0,99. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung gibt auch die korrekte Identifikation der Probe als von nichtglomerulärem Ursprung, da X = 148ch.
6 zeigt ein typisches Teilchengrößenverteilungsdiagramm von Erythrozyten glomerulären Ursprungs gemäß der Analyse durch die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung. In dieser Probe ist der Mittelwert des Verteilungsdiagramms zu einer geringeren Größe verschoben, und die Teilchengrößenverteilungsbreite ist groß. Da die Teilchengrößenverteilung dieser Probe zu einer geringen Größe verschoben ist, gibt das konventionelle Verfahren die korrekte Identifikation der Probe als von glomerulärem Ursprung, da Ra2/Raz = 0,97 und Ra1/Raz = 0,14. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung gibt auch die korrekte Identifikation der Probe als von glomerulärem Ursprung, da X = 61ch.
7 zeigt ein Beispiel eines Teilchengrößenverteilungsdiagramms von Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs, welche im Urin beschädigt wurden, gemäß der Analyse durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung. In dieser Probe ist die Gesamtteilchengrößenverteilung zu einer geringen Größe verschoben.
Da die Teilchengrößenverteilung dieser Probe zu einer geringeren Größe verschoben ist, ergibt das konventionelle Verfahren fälschlicherweise eine Identifizierung der Erythrozyten als von glomerulärem Ursprung, da Ra2/Raz = 0,92 und Ra1/Raz = 0,70. Da jedoch die Probe noch Erythrozyten enthält, welche ihre Morphologie in einem gewissen Maß behalten, ergibt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die korrekte Identifizierung der Erythrozyten als von nichtglomerulärem Ursprung, da X = 113ch.
8 zeigt ein anderes Beispiel eines Teilchengrößenverteilungsdiagramms von Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs, welche im Urin beschädigt worden sind, gemäß der Analyse durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung. In dieser Probe erscheinen zwei Gipfel in dem Teilchengrößenverteilungsdiagramm, da der Grad der erhaltenen Beschädigung zwischen jedem der Erythrozyten variiert. Da die Teilchengrößenverteilung dieser Probe zu einer geringeren Größe verschoben ist, liefert das konventionelle Verfahren fälschlich die Identifikation der Erythrozyten als von glomerulärem Ursprung, da Ra2/Raz = 0,89 und Ra1/Raz = 0,44. Da die Probe jedoch noch Erythrozyten enthält, die ihre Morphologie zu einem gewissen Grad beibehalten, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung die korrekte Identifikation der Erythrozyten als von nichtglomerulärem Ursprung liefern, da X = 103ch.
BEISPIEL 2
Um die Art der Erythrozyten zu bestimmen, wurde ein Bereich, umfassend B% der gesamten Erythrozyten in der Mitte des Teilchengrößenverteilungsdiagramms als eine Breitenangabe des Erythrozytengrößenverteilungsdiagramms gesetzt. Die Verteilungsbreite Y des Bereichs wurde zur Bestimmung der Art der Erythrozyten verwendet. Um die Gesamtteilchengrößenverteilung widerzuspiegeln, ist der Wert von B vorzugsweise in einem Bereich von 50 bis 90%. 9 zeigt die Erythrozytenverteilungsbreite Ych als den Teilchengrößenverteilungswert, wenn der Wert B auf 60% gesetzt wird.
Tabelle 4 zeigt die Beurteilungsergebnisse, wenn der Standard W zur Bestimmung der Art der Erythrozyten als 40ch gesetzt wird um die Erythrozyten, welche die Gleichung Y ≥ 40 als vom multiplen Typ, und die Erythrozyten, welche die Gleichung Y < 40 erfüllen, als vom einfachen Typ zu bestimmen.
Diese Beurteilung macht es möglich zu bestimmen, ob die Erythrozyten vom einfachen Typus sind, welche entweder als Erythrozyten von glomerulärem Ursprung oder nichtglomerulärem Ursprung klassifiziert werden können, oder von einem gemischten Typ der nicht als eine der beiden oben genannten Arten (glomerulär und nichtglomerulär) klassifiziert werden kann.
Manche Proben von nichtglomerurlärem Ursprung werden als von dem multiplen Typ bestimmt, da die Erythrozyten beschädigt worden sind und ihre ursprüngliche Morphologie verlieren, obwohl sie Erythrozyten von nichtglomerulärem Ursprung sind.
TABELLE 4
BEISPIEL 3
Des weiteren ist es durch Kombinieren der Breite Y und der Größe X der Teilchengrößenverteilung möglich, eine genauere Bestimmung des Ursprungs und der Art der Erythrozyten durchzuführen, basierend auf Daten, die die Morphologie der Erythrozyten widerspiegeln. 10 ist ein Graph, erhalten durch Auftragen der Größe Xch der Erythrozyten in Beispiel 1 und der Breite Ych der Erythrozytengrößenverteilung.
Insbesondere kann durch Verwendung der Erythrozytengrößenverteilungsbreite Ych, der Bereich nichtglomerulären Ursprungs in welchem die Erythrozytengröße Xch die Gleichung X ≥ 100ch erfüllt, in einen Bereich unterteilt werden, dargestellt durch Y < 50ch und einen Bereich dargestellt durch Y ≥ 50ch. Die Erythrozyten, welche die Gleichung X ≥ 100ch und Y < 50ch erfüllen, können als einfacher Typus Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs bestimmt werden, welche ihre Morphologie beibehalten ohne sehr stark beschädigt zu sein. Die Erythrozyten, welche die Gleichung X ≥ 100ch und Y ≥ 50ch erfüllen, können als multipler Typus Erythrozyten bestimmt werden, welche gemischte Erythrozyten sind, die beschädigte Erythrozyten umfassen. Hier wird die Probe, welche in 8 gezeigt wird, als vom multiplen Typ bestimmt, welcher ein gemischter Typ ist, da die Erythrozytengrößenverteilungsbreite Y = 68ch ist. Die Ergebnisse der so durchgeführten Beurteilung werden in Tabelle 5 gezeigt.
TABELLE 5
Für die klinische Anwendung kann eine effiziente und akkurate Untersuchung durchgeführt werden durch Untersuchen der Morphologie der Erythrozyten mittels Lasermikroskop, basierend auf den Daten erhalten durch Bestimmung der Proben, welche in den Bereich, der X ≥ Q2 und Y < W erfüllt, als Erythrozyten von nichtglomerulärem Ursprung, welche ihre Morphologie beibehalten und durch Bestimmung der Proben, welche in den anderen Bereichen erscheinen, als Erythrozyten, welche ihre Morphologie nicht beibehalten.
BEISPIEL 4
Des weiteren kann durch Beobachten des Verhältnisses zwischen der Verteilungsbreite Y und dem Ursprung der Erythrozyten der Ursprung der Erythrozyten mittels der Verteilungsbreite Y allein bestimmt werden. Bei weiterer Untersuchung der Proben, welche als vom einfachen Typ bestimmt wurden, zeigen die Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs eine kleinere Verteilungsbreite Y als die Erythrozyten glomerulären Ursprungs. Insbesondere kann als Standard zur Bestimmung des Ursprungs der Erythrozyten ein erster Standard W1 auf 40ch gesetzt werden und ein zweiter Standard W2 auf 32ch gesetzt werden, um den Bereich Y ≥ W1 als vom gemischten Typ zu bestimmen, den Bereich W1 > Y ≥ W2 als von glomerulärem Ursprung und den Bereich W2 > Y als von nichtglomerulärem Ursprung zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt.
TABELLE 6
Hier sind die Bestimmungsstandards in der Mikroskopie gegenwärtig noch nicht vereinheitlicht und es gibt viele Verhältnisse von deformierten Erythrozyten, die als Standard zur Bestimmung ihres Ursprungs verwendet werden können. Daher können die Bestimmungswerte gemäß der beabsichtigten Sensitivität im Bestimmungsprozess verändert werden.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, den Ursprung und die Art der Erythrozyten in Urin mit guter Genauigkeit zu bestimmen durch Beobachten der Morphologie der Erythrozyten selbst wenn die Erythrozyten durch Azidurie, Hypostenurie oder dergleichen beschädigt sind.
Obwohl die vorliegende Erfindung durch die Beispiele mit Bezug auf die beigefügten Abbildungen vollständig beschrieben worden ist, sind für den Fachmann verschiedene Veränderungen und Modifizierungen naheliegend. Daher sollen sie als zum Bereich der Erfindung zählend angesehen werden, es sei denn solche Veränderungen und Modifikationen weichen anderweitig von der Erfindung ab.

Claims

Verfahren zur Klassifizierung von Erythrozyten in Urin umfassend die Schritte Bildung eines Urinprobenflusses durch Umgeben einer Urinprobe mit einer Hüllflüssigkeit in einer Umhüllungsflusszelle, wobei die Urinprobe Teilchen enthält, Applizieren von Licht auf den Urinprobenfluss durch Lichtapplizierungsmittel, Detektieren eines Lichtsignals ausgestrahlt von jedem Teilchen in dem Urinprobenfluss durch Lichtdetektionsmittel, Identifizieren von Erythrozyten aus den Teilchen in dem Urinprobenfluss gemäß dem detektierten Lichtsignal durch Identifizierungsmittel, und Herstellen eines Teilchengrößenverteilungsdiagramms der identifizierten Erythrozyten durch Teilchengrößenverteilungsherstellungsmittel, gekennzeichnet dadurch, dass es weiter umfasst Bestimmen ob die Erythrozyten im Urin glomerulären Ursprungs sind oder nicht, gemäß einem Erythrozytengrößenwert, bei welchem die akkumulierte Frequenz von Erytzrozyten, gezählt von der geringsten Größe in dem Teilchengrößenverteilungsdiagramm, mit einem vorbestimmten Wert, größer als die Hälfte der gesamten akkumulierten Frequenz in dem Teilchengrößenverteilungsdiagramm, übereinstimmt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Bestimmungsschritt weiter umfasst Bestimmen des Typus der Erythrozyten im Urin und ob besagte Erythrozyten von glomerulärem Ursprung sind oder nicht gemäß besagtem Erythrozytengrößenwert und einem Verteilungsbreitenwert eines zentralen Bereichs des Teilchengrößenverteilungsdiagramms, wobei der zentrale Bereich durch eine vorbestimmte Prozentzahl der gesamten Erythrozyten definiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Schritt des Bestimmens, ob die Erythrozyten im Urin von glomerulärem Ursprung oder von nichtglomerulärem Ursprung sind, umfasst Vergleichen des besagten Erythrozytengrößenwerts mit einem ersten vorbestimmten Standard und einem zweiten vorbestimmten Standard, größer als besagter erster vorbestimmter Standard, und: wenn besagter Erythrozytengrößenwert kleiner ist als besagter erster vorbestimmter Standard, Bestimmen dass die Erythrozyten glomerulären Ursprungs sind, wenn besagter Erythrozytengrößenwert größer ist als besagter zweiter vorbestimmter Standard, Bestimmen dass die Erythrozyten nichtglomerulären Ursprungs sind.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der Schritt des Bestimmens des Typus der Erythrozyten im Urin und ob besagte Erythrozyten von glomerulärem Ursprung oder nichtglomerulärem Ursprung sind umfasst Vergleichen von besagtem Erythrozytengrößenwert mit einem ersten vorbestimmten Standard und einem zweiten vorbestimmten Standard, größer als besagter erster vorbestimmter Standard, und: wenn besagter Erythrozytengrößenwert kleiner ist als besagter erster vorbestimmter Standard, Bestimmen dass die Erythrozyten von glomerulärem Ursprung sind, wenn besagter Erythrozytengrößenwert größer ist als besagter zweiter vorbestimmter Standard und besagter Verteilungsbreitenwert kleiner ist als ein vorbestimmter Breitenstandard, Bestimmen dass die Erythrozyten vom einfachen Typ und nichtglomerulären Ursprungs sind.