-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, die in Zusammenhang mit
Durchflusszytometriegeräten
zur Analyse von biologischen Teilchen oder Zellen eingesetzt werden.
Im Speziellen betrifft die Erfindung die Verwendung von synthetischen
Polymermaterialien zur Standardisierung oder Kalibrierung von Durchflusszytometriegeräten vor
Einsatz der Geräte
zur Analyse solcher Teilchen, beispielsweise der zellulären Komponenten
von Vollblut.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Die
Analyse von Teilchen, insbesondere biologischen Teilchen, und Zellen
wird routinemäßig unter
Einsatz verschiedenster im Handel erhältlicher Geräte durchgeführt, welche
die Eigenschaften solcher Teilchen basierend auf einem oder mehreren lichtbezogenen
Signalen bestimmen, die das Instrument passieren. Durchflusszytometer
ermöglichen die
Bestimmung der Eigenschaften von Teilchen unter Einsatz von Verfahren,
bei denen die Teilchen sich in einem Flüssigkeitsstrom bewegen oder
in einer Suspension getragen werden. Typischerweise fließen bei
Durchflusszytometriegeräten
Zellen oder andere biologische Teilchen in einem Flüssigkeitsstrom, sodass
jedes Teilchen, praktisch jede Zelle einzeln, eine Sensorregion
passiert, die in der Lage ist, die physikalischen oder chemischen
Eigenschaften der Teilchen zu messen.
-
Es
kann eine Vielfalt von Signalen, die mit verschiedenen Eigenschaften
der zu analysierenden Teilchen zusammenhängen, detektiert werden. Solche
Signale umfassen elektrische, akustische, optische und radioaktive
Signale. Durchflusszytometer basieren im Allgemeinen auf optischen
Signalen, um Teilchen zu analysieren, die das Gerät passieren. Egal,
ob ein Gerät
Teilchen in einem statischen oder dynamischen Zustand analysiert,
wird Fachleuten klar sein, dass eine Kalibrierung oder Standardisierung
erforderlich ist, bevor die Teilchenanalysen durchgeführt werden können. Unter
normalen Umständen
erfolgt eine Kalibrierung als ein oder mehrere vorbereitende Schritte
bei der Vorbereitung von Geräten
zur eigentlichen Anwendung und Messung und zur Sicherstellung von
genauen und sicheren Testergebnissen. Dies ist vor allem deshalb
wichtig, weil Zellen oder andere biologische Teilchen äußerst klein
sind und die zu detektierenden Signale im Verhältnis zur Größe der Zellen
oder Teilchen häufig
geringe Stärke
aufweisen.
-
Durchflusszytometer
und andere Analysegeräte
für biologische
Teilchen und Zellen werden herkömmlicherweise
mit Teilchen kalibriert, die jene Typen von Teilchen oder Zellen
stimulieren oder diesen ähneln,
die analysiert werden sollen. Folglich sollten Kalibrierungsteilchen
so gewählt
oder aufgebaut sein, dass sie Eigenschaften und Parameter aufweisen,
die jenen der Teilchen oder Zellen, die in den Geräten getestet
werden sollen, stark ähneln.
Beispiele für
Eigenschaften und Parameter umfassen ähnliche Größen, Volumina, Oberflächeneigenschaften,
Körnigkeitseigenschaften
und, falls erforderlich, Farbmerkmale, wie z.B. Färbungen,
Farbstoffe, Immunfluoreszenzmarkierungen und dergleichen. Demgemäß versteht
sich, dass die Teilchen, die nach einer Kalibrierung oder Standardisierung
eines Analysegeräts
analysiert werden sollen, nicht auf biologische Zellen beschränkt sein
müssen.
Zu testende Teilchen können
beispielsweise in Öl-in-Wasser-Suspensionen,
Milch oder einem anderen nichtbiologischen Medium vorliegen.
-
Hämatologische
Analysegeräte
stellen nur einen bestimmten Typ von Geräten dar, die für die Bestimmung
und Messung der Eigenschaften von Zellen und biologischen Teilchen
in Vollblut konstruiert sind und eingesetzt werden. Ein spezielles,
nicht einschränkendes
Beispiel für
hämatologische
Systeme ist im Handel von der Bayer Corporation erhältlich und
ermöglicht
eine optische Analyse, Bestimmung der Eigenschaften von und Messung
von Erythrozyten (roten Blutkörperchen),
Retikulozyten (unreifen roten Blutkörperchen), Leukozyten (weißen Blutkörperchen)
und Blutplättchen
in Vollblutproben.
-
Frühere und
derzeitige Kalibrierungsverfahren für Durchflusszytometriegeräte, einschließlich hämatologischer
Analysegeräte,
umfassen den Einsatz von fixierten und/ oder kugelförmigen roten
Blutkörperchen,
beispielsweise roten Blutkörperchen
von Menschen und Hühnern,
für den
Kalibrierungsschritt und für
die Standardisierung von optischen Signalen, wie z.B. Lichtstreuung.
Siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 4.489.162 von Hawkins et
al. und das US-Patent Nr. 4.777.139 von S.-C. Wong et al. Obwohl
der Einsatz roter Blutkörperchen
von Säugetieren
und Menschen in Bezug auf manche Aspekte von Kalibrierungsverfahren
verlässlich
sein mag, gibt es doch Nachteile bei der Verwendung dieser Arten
von „natürlichen" Kalibratorzellen.
Beispielsweise umfasst die Herstellung von kugelförmigen und
fixierten roten Blutkörperchen
den Vorgang der Blutabnahme und andere Blutmanipulationen, die den
Kontakt mit möglicherweise
biologisch gefährlichem
Material umfassen. Da die Stabilität roter Blutkörperchen
als optischer Standard beschränkt
ist, d.h. etwa sechs Monate beträgt,
müssen
die Zellstandards außerdem
in regelmäßigen Zeitabständen, üblicherweise
zweimal pro Jahr oder öfter,
neu erstellt werden.
-
Neben
biologischen Proben für
Kalibrierungs- und Standardisierungszwecke wurden auch Mikrokügelchen
zur Kalibrierung von Zellanalysegeräten eingesetzt. Das US-Patent Nr. 4.331.862
von W.L. Ryan beschreibt Kügelchen
aus Latexmaterial zur Kalibrierung eines Teilchenzählgeräts. Kunststoff-Mikrokügelchen
zur Kalibrierung von Durchflusszytometern und Zellanalysegeräten sind
im US-Patent Nr. 4.704.891 von D.J. Recktenwald et al. geoffenbart.
Kalibrierungskügelchen
zur Kalibrierung von Durchflusszytometriegeräten sind im Handel von der
Flow Cytometry Standards Corporation, Research Triangle Park, N.C.,
USA erhältlich.
Im Allgemeinen werden solche Mikrokügelchen jedoch nicht im Hinblick
auf die richtigen Brechungsindexwerte von tatsächlichen Zellen und biologischen
Teilchen hergestellt.
-
Nichtbiologische
Polymerkügelchen
mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,5 bis 10 Tm und 1
% bis 60 % chemisch gebundenem Fluor sind im US-Patent Nr. 5.093.445
von W. Podszun et al. zur Verwendung als Mattierungsmittel und Spacer in
fotografischen Aufzeichnungsmaterialien geoffenbart. Dieses Patent
bezieht sich jedoch nicht auf Teilchenkalibratoren für Durchflusszytometrie
und erkennt den Brechungsindex nicht als entscheidenden Parameter
für solch
eine Verwendung. Tatsächlich haben
die Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass die Poly merkügelchen,
die in diesem Patent als Beispiele angeführt sind, Brechungsindizes
aufweisen, die deutlich über
1,45 liegen, was als Obergrenze oder nahe Nähe der Obergrenze für den Brechungsindex
betrachtet wird, vor allem in Bezug auf rote Blutkörperchen,
wie hierin nachstehend erläutert
wird.
-
Andere
Arten von Durchflusszytometriegeräten, wie z.B. Fluoreszenz-Durchflusszytometer,
nutzen Polymerkügelchen
aus Materialien wie Polystyrol, um die optischen Signale zu standardisieren.
Die Signale umfassen typischerweise Vorwärtsstreuung (0–2 Grad);
Seitwärtsstreuung
(90 Grad) und Fluoreszenzintensität. Die Materialien der Polymerkügelchen
sind zwar sicher und etwa fünf
Jahre lang oder länger
stabil, für
Lichtstreuung-Durchflusszytometriegeräte aber äußerst unzufriedenstellend.
Genauer gesagt erzeugen derzeit verfügbare Polymerkügelchen
für Teilchen
mit einem bestimmten Volumen Streuungssignale, die sich von jenen
von roten Blutkörperchen
mit dem gleichen Volumen unterschieden, auch wenn die roten Blutkörperchen
kugelförmig
sind. Der Grund dafür
ist, dass sich der Brechungsindex (RI) eines Polymermaterials wie
Polystyrol stark von jenem von roten Blutkörperchen unterscheidet. Während der
RI von Polystyrol hoch ist, d.h. etwa 1,59 beträgt, beträgt der RI eines roten Blutkörperchens
etwa 1,40–1,42.
Anhand der Mie-Streuungstheorie ist allgemein bekannt, dass die Lichtstreuungseigenschaften
von kleinen Kügelchen stark
durch ihre RI-Werte beeinflusst werden. Somit sind die Streuungsmuster
von Polymerkügelchen, die
derzeit in Durchflusszytometriegeräten eingesetzt werden, nicht
wirklich repräsentativ
für die
Streuungsmuster von wirklichen roten Blutkörperchen. Folglich stellen
die Vorwärts-
und Seitwärtsstreuungssignale
keine wichtigen Informationen bereit, wie beispielsweise über Zellgröße und Brechungsindex,
die sich auf die Zelldichte und den Aktivierungszustand beziehen.
-
Außerdem werden
Lichtstreuungssignale von Blutplättchen
derzeit entweder unter Einsatz von kugelförmigen und fixierten roten
Blutkörperchen standardisiert,
wie dies bei manchen Arten von Analysegeräten der Fall ist, beispielsweise
bei handelsüblichen
hämatologischen
Analysegeräten,
oder unter Einsatz von Polymerkügelchen
mit geeigneter Größe, wie
dies bei Fluoreszenz-Durchflusszytometern der Fall ist. Die Streuungssignale
von Blutplättchen
sind jedoch typischerweise schwächer
als die von roten Blutkörperchen
(d.h. um mehr als einen Faktor von 10). Weiters beträgt der Brechungsindex von
Blutplättchen
nur etwa 1,35 bis etwa 1,40.
-
Außerdem werden
Lichtstreuungssignale von weißen
Blutkörperchen
derzeit entweder unter Einsatz von kugelförmigen und fixierten roten
Blutkörperchen
oder von Polymerkügelchen
standardisiert. Streuungssignale von weißen Blutkörperchen sind typischerweise
stärker
als die von roten Blutkörperchen,
und ihr Brechungsindex ist niedriger und beträgt typischerweise etwa 1,37
bis etwa 1,40.
-
Als
weiteres Beispiel sei erwähnt,
dass manche handelsübliche
hämatologische
Analysegeräte Retikulozyten
(unreife rote Blutkörperchen)
basierend auf einer Kombination aus ihren Lichtstreuungseigenschaften
und ihrer Fähigkeit,
an kationische Farbstoffe, wie z.B. Oxazin 750, zu binden und so Licht
mit der Absorptionswellenlänge
der Farbstoffe zu absorbieren, zählen.
Derzeit wird der Absorptionskanal unter Einsatz von fixierten und
kugelförmigen roten
Blutkörperchen
standardisiert, die keinen Farbstoff enthalten. Die Standardisierung
basiert auf dem Licht, das außerhalb
des Sammelkegelwinkels des Absorptionsdetektors gestreut wird, um
ein „Pseudoabsorptionssignal" bereitzustellen,
das die wahre Lichtabsorption nachahmt. Diese Methode ist jedoch nicht
optimal, da das Pseudoabsorptionssignal deutlich schwächer ist
als das echte Absorptionssignal, das von vielen Retikulozyten erzeugt
wird. Somit repräsentiert
der eingesetzte optische Standard die wahren Signale, die in der
Praxis auftreten, nicht am besten. Passend gefärbte Polymerkügelchen
aus Materialien wie Polystyrol sind für diesen Zweck ebenfalls nicht
geeignet, da ihre hohen RI-Werte
zu Streuungssignalen führen,
die außerhalb
der Streuungssignal-Detektorbereiche liegen. Deshalb ist es zur
Standardisierung von Lichtstreuungs- und Absorptionsmessungen von
Retikulozyten wünschenswert,
ein Material herzustellen, das die Lichtstreuungs- (und Absorptions-)
Eigenschaften von Retikulozyten aufweist und außerdem sicher und stabil ist. Im
Falle von Fluoreszenz-Durchflusszytometrie, bei der die Kombination
aus Streuungs- und Fluoreszenzeigenschaften genutzt wird, um Blutkörperchen
zu analysieren, ist es wünschenswert,
ein Material mit den Lichtstreuungs- und Fluoreszenzeigenschaften der
jeweiligen Zellen herzustellen, die analysiert werden sollen, und
das außerdem
die Sicherheit und Stabilität
von nichtbiologischen Polymermaterialien aufweist.
-
Somit
besteht derzeit Bedarf an und ein Wunsch nach Standardisierungs-
und Kalibrierungsmaterialien und -verfahren, die bei der Bestimmung der
Eigenschaften von sowohl nichtbiologischen als auch biologischen
Teilchen und Zellen in unterschiedlichen Analysegeräten, einschließlich hämatologischen
Analysegeräten,
genaue und reproduzierbare Ergebnissen liefern. Außerdem besteht
derzeit Bedarf an der Produktion von sicheren und stabilen Kalibrierungsteilchen
zur Standardisierung von Durchflusszytometriegeräten. Solche Teilchen weisen
optimalerweise eine lange Langerbeständigkeit und Eigenschaften,
wie Teilchengröße und Brechungsindex,
auf, die praktisch identisch mit denen von natürlichen Teilchen und Zellen
sind, die sie während
des Kalibrierungs-/Standardisierungsvorgangs repräsentieren.
-
Außerdem besteht
in Bezug auf hämatologische
Analysen Bedarf an der Entwicklung von Verfahren zur Standardisierung
von Durchflusszytometern, worin die eingesetzten Standardisierungspolymerteilchen
alle notwendigen Parameter der jeweiligen enthaltenen Blutkörperchen,
die nach der Gerätekalibrierung/-standardisierung
analysiert werden sollen, genau abbildet. Die vorliegende Erfindung
soll die derzeitigen Bedürfnisse
und Ziele auf dem Gebiet der Erfindung vorteilhaft erfüllen bzw.
erreichen.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Demgemäß besteht
ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von neuen
Anwendungen von synthetischen Polymerteilchen in Verfahren zur Kalibrierung
oder Standardisierung eines Durchflusszytometers, insbesondere eines
hämatologischen
Analysegeräts,
vor der Analyse von nichtbiologischen Teilchen oder biologischen
Teilchen oder Zellen, worin die Kalibrator-/Standardisierungsteilchen
praktisch alle optischen und physikalischen Eigenschaften von tatsächlichen
Teilchen oder Blutkörperchen,
d.h. echten roten Blutkörperchen, Retikulozyten,
Blutplättchen und/oder
weißen
Blutkörperchen,
die analysiert werden sollen, und die Stabilität und Sicherheit von nichtbiologischen
Polymermaterialien aufweisen.
-
Die
Kalibrierungsteilchen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt
werden sollen, sind so aufgebaut, dass sie eine enge Verteilung
des mittleren Teilchendurchmessers, einen genau definierten mittleren
Teilchendurchmesser und einen genau definierten Brechungsindexwert
aufweisen, die praktisch identisch mit jenen der echten Teilchen
in verschiedenen Medien oder Zelltypen in einer biologischen Probe,
wie z.B. einer Blutprobe, die analysiert werden soll, sind.
-
Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
von Verfahren zu Kalibrierung und Standardisierung eines Durchflusszytometriegeräts vor der
Analyse von biologischen Teilchen oder Zellen, insbesondere im Hinblick
auf die Analyse der in einer Vollblutprobe enthaltenen Zellen.
-
Die
Erfindung ermöglicht
es Fachleuten, ein Teilchenanalysegerät durch den Einsatz und das
Vertrauen auf Kalibrierungsstandards (und/oder Schwellenwerte),
die vorher bestimmt wurden und vom Benutzer leicht geändert und
ihm zugänglich
gemacht werden können,
zu kalibrieren. Der Einsatz der Standards und Verfahren der vorliegenden
Erfindung in Standardisierungs- und Kalibrierungsverfahren von Durchflusszytometriegeräten ermöglicht eine
geeignete Standardisierung und Kalibrierung eines Geräts, eine
geeignete Anordnung der optischen Komponenten des Geräts und die
Optimierung der Leistung des Geräts
bei nachfolgenden Teilchen- und Zellanalysen, einschließlich der
Bestimmung von Zellgröße und Brechungsindex
aus Vorwärts-
und Seitwärtsstreuungsmessungen.
-
Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
von Kalibrierungs-/Standardisierungsverfahren zur Verwendung in
verschiedenen Teilchenanalyse- und -detektionssystemen, die auf
einer Kombination von Lichtstreuung als ein gemessener Parameter
und der Messung eines anderen bekannten Parameters, wie z.B. Lichtstreuung (d.h.
Streuung-Streuung-Detektion), elektrische Impedanz (d.h. Streuung-Impedanz-Detektion),
Funkfrequenz (d.h. Streuung-RF-Detektion) und dergleichen basieren.
Weiters versteht sich, dass die vorliegende Erfindung und ihre Vorteile
und Merkmale auch in anderen Durchflusszytometrie-Analysegeräten, wie
z.B. Fluoreszenz-Zellsortierern, eingesetzt werden können und
auch für
Geräte,
wie z.B. Bildanalysegeräte,
automatische Mikroskope, quantitative Mikroskope, Fluoreszenzmikroskope
und dergleichen, geeignet sind. Die Materialien und Verfahren der
vorliegenden Erfindung stellen eine Qualitätssicherung für verschiedene
Anwendungen, einschließlich
medizinischer und klinischer Diagnoseanwendungen zur Identifikation
und Bestimmung sowohl normaler als auch anormaler Zustände, bereit.
-
Weitere
Ziele und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachstehenden Beschreibung
hervor.
-
KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
-
Die 1A und 1B zeigen
die Bestimmung der Teilchenzahl und des relativen Volumens der synthetischen
Standardisierungs-/Kalibrierungspolymerteilchen, basierend auf einem Öffnungsimpedanzzähler (Beispiel
3). 1A zeigt die numerische Frequenzverteilung von
Teilchen, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden.
In 1A stellt die X-Achse den Teilchendurchmesser
in μm und
die Y-Achse die relative Teilchenzahl dar. 1B zeigt die
Volumenfrequenzverteilung der gleichen Teilchen wie in 1A.
In 1B stellt die X-Achse den Teilchendurchmesser
in μm und
die Y-Achse das relative Volumen, das von den Teilchen eingenommen
wird, dar.
-
2 zeigt
ein Streuung/Streuung-Zytogramm der gleichen Teilchen wie in 1A und 1B.
Die X-Achse stellt die Streuungsintensität der Teilchen bei 5°–15° und die
Y-Achse die Streuungsintensität der Teilchen
bei 2°–3° dar. Die
X-Achsen- und Y-Achsenwerte reichen von 0 bis 50. Neben dem Zytogramm
sind der Mittelwert und die Standardabweichung (SA), Sigmax und
Sigmay genannt, der Verteilung der Teilchen in der RBC-Box angegeben.
Die Teilchenanzahl, mit RBC (106/μl) bezeichnet;
das mittlere Teilchenvolumen, mit MCV (fl) bezeichnet, der mittlere
Brechungsindex, ma thematisch in einen äquivalenten Mittelwert der
zelluläres
Hämoglobinkonzentration,
CHCM (g/dl), umgerechnet, wie hierin beschrieben ist; und das Volumen
und die Hämoglobinkonzentrationsverteilungsbreiten,
RDW (%) bzw. HDW (SA) sind ebenfalls angeführt (siehe Beispiel 3).
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung stellt neue Anwendungen von synthetischen
Polymerteilchen (hierin auch als Kügelchen oder Teilchenkügelchen
bezeichnet) in einem Verfahren zur Kalibrierung oder Standardisierung
von Durchflusszytometriegeräten zur
Analyse von biologischen Teilchen oder Zellen bereit. Die Polymerteilchen,
die verwendet werden, sind so aufgebaut, dass sie Eigenschaften
und Parameter aufweisen, die es ihnen erlauben, für Analysen von
biologischen Teilchen und Zellen bestimmte Geräte vor der Durchführung der
Tests an den tatsächlichen
biologischen Teilchen oder Zellen selbst genau zu standardisieren
und zu kalibrieren.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft insbesondere den Einsatz von synthetischen
Teilchen bei der Kalibrierung oder Standardisierung von hämatologischen
Analysegeräten
zur Analyse der zellulären Komponenten
von Vollblutproben.
-
Genauer
gesagt sind die Polymerteilchen im Wesentlichen kugelförmige Kügelchen
und umfassen das Halogen Fluor. Die Teilchen weisen einen genau
definierten mittleren Teilchendurchmesser (Teilchengrößendurchmesser),
d.h. im Massemittel, von etwa 1 μm
bis etwa 10 μm,
vorzugsweise etwa 1 μm
bis etwa 8 μm,
noch bevorzugter etwa 4 μm
bis etwa 6 μm,
auf. Bevorzugte mittlere Teilchendurchmesser für die synthetischen Polymerteilchen,
die in der vorliegenden Erfindung als Standardisierungs-/Kalibrierungsmaterialien
für bestimmte
Arten von Blutzellen eingesetzt werden, sind wie folgt: etwa 5,5 μm für rote Blutkörperchen;
etwa 2,5 μm
für Blutplättchen;
etwa 8,0 μm
für Neutrophilen;
etwa 7,2 μm für Lymphozyten;
etwa 9,0 μm
für Monozyten;
etwa 8,5 μm
für Eosinophilen
und etwa 7,4 μm
für Basophilen,
mit einer Teilchengrößenverteilung
von etwa +/– 0,25 μm, noch bevorzugter
etwa +/– 0,1 μm, für jede dieser
Zellarten. Im Allgemeinen beträgt
die Teilchengrößenverteilungsbreite
der synthetischen Standardisierungs-/Kalibrierungsteilchen etwa
1 % bis 5 %. Die Teilchengrößenverteilungsbreite
ist hierin als eine Standardabweichung der Verteilung der Teilchendurchmesser,
dividiert durch den mittleren Durchmesser definiert.
-
Außerdem weisen
die kugelförmigen
Polymerteilchen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden,
einen Brechungsindex von im Allgemeinen etwa 1,35 bis etwa 1,45,
vorzugsweise etwa 1,35 bis etwa 1,42, auf. Bevorzugte Brechungsindizes
für die
synthetischen Polymerteilchen, die in der vorliegenden Erfindung
als Standardisierungs-/Kalibrierungsmaterialien für bestimmte
Arten von Blutzellen eingesetzt werden, sind wie folgt: etwa 1,410
für rote
Blutkörperchen;
etwa 1,380 für
Blutplättchen; etwa
1,395 für
Neutrophilen; etwa 1,385 für
Lymphozyten; etwa 1,375 für
Monozyten; etwa 1,395 für
Eosinophilen und etwa 1,385 für
Basophilen, mit einem Bereich von etwa +/– 0,01, noch bevorzugter etwa +/– 0,005,
für jede
dieser Zellarten. Teilchen, die Fluor umfassen, sorgen für optimale
niedrige Brechungsindexwerte zur Verwendung als Standardisierungs-/Kalibrierungsmaterialien.
Ein spezielles, nicht einschränkendes
Beispiel für
Teilchen, die zur Verwendung bei der Standardisierung und Kalibrierung von
hämatologischen
Analysegeräten
für die
Analyse von roten Blutkörperchen
gemäß der vorliegenden Erfindung
optimal sind, sind solche, die einen Teilchengrößendurchmesser von etwa 5 bis
etwa 5,5 +/–;
0,1 μm und
einen Brechungsindex von etwa 1,41 +/– 0,005 aufweisen.
-
Die
Monodispersität
der Polymer-Kalibrierungsteilchen der vorliegenden Erfindung beträgt zumindest
etwa 65 %, vorzugsweise zumindest etwa 75 % und noch bevorzugter
zumindest etwa 85 %. Monodispersität bezieht sich hierin auf den
Prozentsatz an Polymerteilchen, deren mittlerer Teilchendurchmesser
im Bereich vom mittleren Teilchendurchmesser ± 33 %, bezogen auf das Gewicht,
liegt und durch den Polymerisationsvorgang erreicht wird, der zur Herstellung
der Teilchen eingesetzt wird. Weitere Verbesserungen oder Verfeinerungen
der Monodispersitätseigenschaft,
beispielsweise um die Teilchengrößendurchmesserverteilung
zu verengen, können durch
den Einsatz von physikalischen Reinigungsvorgängen, wie beispielsweise Sieben
oder Ultrazentrifugation, während
der Herstellung der Teilchen erreicht werden.
-
In
einer Ausführungsform,
welche die Analyse von Erythrozyten unter Einsatz von Durchflusszytometrie
umfasst, werden kugelförmige
Polymerteilchen mit einem mittleren Teilchendurchmesser von etwa
5,5 μm und
einem Brechungsindex von 1,4 hergestellt. Solche Kalibrierungssubstanzen
erreichen eine optimale Standardisierung und Kalibrierung des Analysegeräts für genaue
und verlässliche
Bestimmungen roter Blutkörperchen.
Andere Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung umfassen die Verwendung von kugelförmigen Polymerteilchen
als Standardisierungs- und Kalibrierungsmaterialien für Retikulozyten,
weiße
Blutkörperchen
und Blutplättchen.
Für die
Analyse von Retikulozyten unter Einsatz von Durchflusszytometrie
werden die Polymerkügelchen
so hergestellt, dass sie einen mittleren Teilchendurchmesser von
etwa 5,5 μm
und einen Brechungsindex von etwa 1,410 aufweisen. Für die Analyse
von weißen
Blutkörperchen
unter Einsatz von Durchflusszytometrie werden die Polymerkügelchen
so hergestellt, dass sie einen mittleren Teilchendurchmesser wie
oben beschrieben aufweisen. Für die
Analyse von Blutplättchen
unter Einsatz von Durchflusszytometrie werden die Polymerkügelchen so
hergestellt, dass sie einen mittleren Teilchendurchmesser von etwa
2,5 μm und
einen Brechungsindex von etwa 1,380 aufweisen.
-
Zum
Einsatz in der vorliegenden Erfindung geeignete Polymerteilchen
sind kugelförmige
Teilchen oder Kügelchen
aus polymerisierten Monomeren, die aus der aus 2-Fluorethylacrylat,
2,2,2-Trifluorethylacrylat, 2,2,3,3-Tetrafluorpropylacrylat, 2,2,3,4,4,4-Hexafluorbutylacrylat,
1H,1H-Heptafluorbutylacrylat, 1H,1H,5H-Octafluorpentylacrylat, 1H,1H-Pentadecafluoroctylacrylat,
2-Fluorethylmethacrylat, 2,2,2-Trifluorethylmethacrylat, 2,2,3,3,3-Pentafluorpropylmethacrylat,
1H,1H-Heptafluorbutylmethacrylat, 2,2,3,4,4,4-Hexafluorbutylmethacrylat,
1H,1H,5H-Octafluorpentylmethacrylat und 1H,1H,11H-Eicosafluorundecylmethacrylat
bestehenden Gruppe sind. Die synthetischen Polymerteilchen können auch
Gemische oder Kombinationen der Monomereinheiten umfassen.
-
Die
Polymere, welche die polymerisierten Einheiten der Formel I umfassen,
enthalten vorzugsweise Fluor in einer Menge von etwa 22 Gew.-% bis etwa
65 Gew.-%, vorzugsweise etwa 30 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-%, bezogen
auf das Gesamtgewicht des Polymers. Die Teilchen können ein
einziges fluorsubstituiertes Monomer oder Gemische zweier oder mehrerer
fluorsubstituierter Monomere umfassen.
-
Die
kugelförmigen
Polymerteilchen zur Verwendung als Kalibrierungs-/Standardisierungsmaterialien
werden durch Polymerisation zumindest eines Monomers, wie es oben
geoffenbart ist, zusammen mit zumindest einer anderen monoethylenisch
ungesättigten
Verbindung hergestellt. Die Monomere werden in einem polaren Medium,
das ein Lösungsmittel für das/die
oben beschriebenen Monomer(e) und eine Fällverbindung für die resultierenden
Polymerteilchen umfasst, in Gegenwart eines hochmolekularen Dispersionsmittels
und eines Radikalbildners als Initiator polymerisiert. Im Allgemeinen
können
die Polymerteilchen wie im US-Patent Nr. 5.093.445 beschrieben synthetisiert
werden.
-
Veranschaulichende
Beispiele für
polare Medien, die zur Verwendung geeignet sind, umfassen Lösungsmittel,
wie z.B. Dioxan, Aceton, Acetonitril, Dimethylformamid und Alkohole.
Niedere Alkohole, d.h. solche mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, sind
bevorzugt, insbesondere Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol,
n-Butanol, Isobutanol und tert-Butanol. Gemische unterschiedlicher
Lösungsmittel
sind ebenfalls geeignet; Gemische unterschiedlicher Alkohole sind
bevorzugt. Vorzugsweise wird ein Gemisch aus Lösungsmittel und Wasser eingesetzt.
In solchen Alkohol/Lösungsmittel-Gemischen enthalten die
Alkohole gegebenenfalls bis zu etwa 25 Gew.-% Wasser.
-
Wenn
das polare Medium Wasser enthält, kann
auch Natriumperoxodisulfat (Na2S2O8) zur Aufnahme
in das Herstellungsschema geeignet sein. Im Allgemeinen wird die
radikalische Form in einer Menge von etwa 0,05 Gew.-% bis etwa 10
Gew.-%, vorzugsweise
etwa 0,2 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht
des Monomers oder Monomergemischs, zugesetzt.
-
Die
hochmolekularen Dispersionsmittel, die zur Herstellung der Teilchen
eingesetzt werden, können
natürliche
oder synthetische makromolekulare Verbindungen sein, die im verwendeten
polaren Medium löslich
sind und ein Molekulargewicht Mw (Gelpermeationschromatographie)
von etwa 5 × 103 bis etwa 5 × 105,
vorzugsweise etwa 1 × 104 bis etwa 2 × 105,
aufweisen. Nichteinschränkende
Beispiele umfassen Cellulosederivate, wie z.B. Methylcellulose, Ethylcellulose
und Hydroxypropylcellulose, sowie Polyvinylacetat. Partiell verseifte
Polyvinylacetate, vorzugsweise mit einem Verseifungsgrad von etwa
5 % bis etwa 25 %, sind besonders gut geeignet. Polyvinylpyrrolidon,
substituierte Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylcaprolactam und Vinyl-Copolymere
werden vorzugsweise in Mengen von etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%, noch bevorzugter
etwa 0,2 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des
Monomers oder der Monomere oder Gemische daraus, eingesetzt.
-
Andere
Dispersionsmittel, die bei der Herstellung von synthetischen Polymerkügelchen
gemäß der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden können,
umfassen ionische und nichtionische oberflächenaktive Stoffe. Nichteinschränkende Beispiele für geeignete
Tenside sind die Natriumsalze von Sulfobernsteinsäureestern.
Geeignete kationische Tenside umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf N-Alkylammoniumsalze,
z.B. Methylcaprylammoniumchlorid. Ethoxyliertes Nonylphenol ist
ein Beispiel für
ein nichtionisches Tensid, das verwendet werden kann. Die oberflächenaktiven
Stoffe können
in einer Menge von etwa 9,1 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-%, vorzugsweise
etwa 0,2 Gew.-% bis etwa 2 Gew.-%, bezogen auf das polare Medium,
eingesetzt werden.
-
Die
Polymerisation der Monomereinheiten wird mit herkömmlichen
Radikalbildnern, insbesondere Peroxyverbindungen und Azoverbindungen,
wie z.B. Dibenzoylperoxid, Dilauroylperoxid, Bis(p-chlorbenzoylperoxid),
Dicyclohexylperoxydicarbonat, tert-Butylperoctoat, 2,5-Bis(2-ethylhexanoylperoxy)-2,5-dimethylhexan,
tert-Amylperoxi-2-ethylhexan,
2,2'-Azobis(isobutyronitril),
initiiert.
-
Die
Polymerisationstemperatur, die eingesetzt wird, hängt von
der Zersetzungstemperatur des Initiators und dem Siedepunkt des
Lösungsmittel
ab und liegt vorzugs weise im Bereich von etwa 50°C bis 1.400°C. Die Polymerisation wird vorteilhafterweise beim
Siedepunkt des Lösungsmittel
durchgeführt. Die
Polymerisationsdauer beträgt
im Allgemeinen mehrere Stunden (z.B. etwa 2 bis 12 Stunden).
-
Das
Polymerisationsgemisch wird üblicherweise
gerührt.
Die Isolierung des Polymers wird durch Filtration oder Fällung, beispielsweise
unter Verwendung einer Zentrifuge, erzielt. Für die Kalibratorteilchen gemäß der vorliegenden
Erfindung wird der Brechungsindex anhand des/der Monomers/-e bestimmt,
das/die die Teilchen bilden. Der mittlere Teilchendurchmesser und
die Monodispersität
(d.h. enge Verteilung) können
von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung leicht erzielt werden
(z.B. US-Patent
Nr. 5.093.445), indem die Parameter der Polymerisation so eingestellt
werden, dass die jeweils erforderliche Teilchengröße und Monodispersität erreicht
werden, bezogen auf die Arten) von Kalibrierungs-/Standardisierungsteilchen,
die für
durchflusszytometrische Analyen erwünscht sind.
-
Die
Bestimmung des Brechungsindex als signifikante Eigenschaft der Polymerteilchen,
die hergestellt werden, kann wie folgt durchgeführt werden: eine Dispersion
der Polymerteilchen wird filtriert und in einem Ofen bei etwa 105°C getrocknet.
Das getrocknete Polymer wird in einem Lösungsmittel, z.B. Aceton, gelöst, und
ein Tropfen der gelösten
Polymerlösung
wird auf die Glasplatte eines Refraktometers (d.h. eines Abbé-Refraktometers
(siehe Beispiel 3)) aufgebracht und dann getrocknet (z.B. mithilfe
eines Haarföns),
um einen kontinuierlichen Film auf der Oberfläche der Platte zu bilden. Der
Brechungsindex der Teilchen wird dann mithilfe des Refraktometers auf
diesem getrockneten Polymerfilm gemessen.
-
Eine
Einstellung des jeweiligen Brechungsindex der hergestellten Teilchenkügelchen
kann erfolgen, indem die Kügelchen
mit einer Substanz mit einem niedrigen Brechungsindex beladen werden
(siehe Beispiel 2). Im Allgemeinen werden bei der Beladung von Polymerteilchen
die Teilchen zwar zusammen mit einer organischen Verbindung (d.h.
einer aktiven Komponente) in einem Lösungsmittel für das Polymer
gequollen. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels verbleibt die
aktive Komponente im Polymerteilchen. Geeignete Verbindungen für die ladbare
Komponente umfassen beliebige organische Moleküle mit einem Brechungsindex
von etwa 1,45 oder darunter. Beispiele für organische Moleküle, die zur
Beladung geeignet sind, umfassen fluorhältige Verbindungen, insbesondere
fluorhältige
Monomere, wie sie hierin beschrieben wurden und wie oben beschrieben
polymerisiert werden. Um zu verhindern, das die geladene Substanz
aus den Kügelchen
austritt, können
ein oder mehrere ethylenisch ungesättigte Monomere mit einem niedrigen
Brechungsindex zusammen mit einem radikalischen Initiator zugesetzt
werden. Nachfolgende Polymerisation immobilisiert das/die organische(n)
Molekül(e)
in den Teilchen. Eine Beschreibung der Verfahren zur Beladung von
Teilchen findet sich im US-Patent Nr. 5.270.354 von J.T. Vermeersch
et al.
-
Weiters
betrifft die vorliegenden Erfindung ein Gemisch aus Teilchen mit
unterschiedlichen Größen- und
Brechungsindexbereichen, sowie unterschiedlichen Absorptions- und
Fluoreszenzfarbstoff-Konzentrationsbereichen, sodass ein bestimmtes
Gerät unter
Verwendung von Teilchen kalibriert/standardisiert werden kann, die
für alle
unterschiedlichen Arten von tatsächlichen
Blutzellen, die in der Blutprobe von einem Individuum vorhanden sind,
repräsentiert.
-
Die
vorliegende Erfindung ist vor allem für die Standardisierung/Kalibrierung
von Durchflusszytometrie-Analysegeräten geeignet, die verschiedene Detektionsmechanismen
und Technologien umfassen, welche auf Lichtstreuung als einem Messparameter
davon basieren, beispielsweise Lichtstreuung/Absorption-, Lichtstreuung/Fluoreszenz-,
Lichtstreuung/elektrische-Impedanz-, Lichtstreuung/Funkfrequenz-
(RF-), Lichtstreuung/Lichtstreuung-Technologien usw. Die Technologien,
die Durchflusszytometrie, basierend auf Streulicht in Kombination
mit einem anderen gemessenen Parameter zur Teilchen- und Zellbestimmung
und -messung umfassen, werden hierin als „Streuung/X"-Bestimmungen bezeichnet.
Zur Veranschaulichung sei erwähnt, dass
mit Streuung/Streuung-Detektion gemeint ist, dass eine Teilchen-
oder Zellanalyse durch Messung von Lichtstreuung durchgeführt wird,
die durch die Teilchen in zwei unterschiedlichen Streuungswinkeln bewirkt
wird. Andere Systeme, wie z.B. Streuunglelektrische-Impedanz- oder
Streuung/RF-Detektion ermöglichen
die Durchführung
einer Zellanalyse durch Messung der Lichtstreuung bei zumindest
einem Winkel und auch durch die Messung eines anderen bekannten
Parameters, wie z.B. der elektrischen Impedanz bzw. Funkfrequenz.
-
Im
Allgemeinen passieren bei Streuung/X-Verfahren in Suspension vorliegende
Zellen hintereinander ein optisches Detektionssystem, und für Impedanz-
und RF-Messung auch ein elektrisches Detektionssystem. Das optische
System umfasst eine Lichtquelle, üblicherweise einen kollimierten
Laserstrahl, eine enge zylindrische Röhre, durch welche die Zellen
durchlaufen und den Lichtstrahl abfangen, und einen oder mehrere
optische Detektoren, wie z.B. Siliciumphotodioden oder Photovervielfacherröhren, die
angeordnet sind, um Licht zu sammeln, das durch die Zellen übertragen,
von ihnen gestreut oder von ihnen aus fluoresziert. Das elektrische
System umfasst ein elektrisches Feld, das für elektrische Impedanz statisch
oder für
RF oszillierend ist und über
eine kleine Öffnung,
Apertur genannt, angelegt wird, durch welche die Zellen passieren.
Beim Streuung/Impedanz-Verfahren kann die Durchflusszelle beispielsweise
eine zylindrische Öffnung
sein, die sowohl für
optische als auch für
elektrische Messungen geeignet ist, die durch Messung der Lichtstreuung
bei zumindest einem Winkel und die Messung eines anderen bekannten
Parameters, wie z.B. der elektrischen Impedanz bzw. der Funkfrequenz,
durchgeführt
wird.
-
Im
Allgemeinen passieren bei Streuung/X-Verfahren in Suspension vorliegende
Zellen hintereinander ein optisches Detektionssystem, und für Impedanz-
und RF-Messung auch ein elektrisches Detektionssystem. Das optische
System umfasst eine Lichtquelle, üblicherweise einen kollimierten
Laserstrahl, eine enge zylindrische Röhre, durch welche die Zellen
durchlaufen und den Lichtstrahl abfangen, und einen oder mehrere
optische Detektoren, wie z.B. Siliciumphotodioden oder Photovervielfacherröhren, die
angeordnet sind, um Licht zu sammeln, das durch die Zellen übertragen,
von ihnen gestreut oder von ihnen aus fluoresziert. Das elektrische
System umfasst ein elektrisches Feld, das für elektrische Impedanz statisch
oder für
RF oszillierend ist und über
eine kleine Öffnung,
Apertur genannt, angelegt wird, durch welche die Zellen passieren.
Beim Streuung/Impedanz-Verfahren kann die Durch flusszelle beispielsweise
eine zylindrische Öffnung
sein, die sowohl für
optische als auch für
elektrische Messungen geeignet ist.
-
Demgemäß stellt
die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zur Kalibrierung
oder Standardisierung eines Durchflusszytometriegeräts zur Analyse
von Teilchen unter Verwendung von im Wesentlichen kugelförmigen synthetischen
Teilchen als Kalibratoren oder Standards bereit. Die Volumen- und
Brechungsindexwerte der synthetischen, kugelförmigen Kalibrierungs- oder
Standardisierungsteilchen sind so vorbestimmt, dass bekannte Volumen- und
Brechungsindexwerte erhalten werden. Das Durchflusszytometriegerät stellt
im Allgemeinen zumindest ein mit Streuung in Verbindung stehendes Signal
von den Teilchen bereit, die zur Analyse das Instrument passieren.
-
Das
Volumen der synthetischen, kugelförmigen Teilchen wird routinemäßig mithilfe
von herkömmlichen
Aperturimpedanzmessungen, z.B. Einkanalaperturimpedanz, für kugelförmige, synthetische
Kügelchen
bestimmt, um ein bekanntes Volumen der synthetischen Teilchen zu
erhalten. Der Brechungsindex wird durch herkömmliche Indexanpassungsverfahren
bestimmt, um einen vorbestimmten oder bekannten Brechungsindexwert
zu erhalten. Das Indexanpassungsverfahren umfasst, kurz gesagt,
die Herstellung einer Reihe von Medien oder Lösungen mit vorbestimmten (oder
bekannten) Brechungsindexwerten, die den Brechungsindex der synthetischen
Teilchen von Interesse eingrenzen. Die Teilchen werden im Medium
oder in der Lösung, z.B.
Serum, suspendiert.
-
Demgemäß stellt
die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zur Kalibrierung
oder Standardisierung eines Durchflusszytometriegeräts zur Analyse
von Teilchen unter Verwendung von im Wesentlichen kugelförmigen synthetischen
Teilchen als Kalibratoren oder Standards bereit. Die Volumen- und
Brechungsindexwerte der synthetischen, kugelförmigen Kalibrierungs- oder
Standardisierungsteilchen sind so vorbestimmt, dass bekannte Volumen- und
Brechungsindexwerte erhalten werden. Das Durchflusszytometriegerät stellt
im Allgemeinen zumindest ein mit Streuung in Verbindung stehendes Signal
von den Teilchen bereit, die zur Analyse das Instrument passieren.
-
Das
Volumen der synthetischen, kugelförmigen Teilchen wird routinemäßig mithilfe
von herkömmlichen
Aperturimpedanzmessungen, z.B. Einkanalaperturimpedanz, für kugelförmige, synthetische
Kügelchen
bestimmt, um ein bekanntes Volumen der synthetischen Teilchen zu
erhalten. Der Brechungsindex wird durch herkömmliche Indexanpassungsverfahren
bestimmt, um einen vorbestimmten oder bekannten Brechungsindexwert
zu erhalten. Das Indexanpassungsverfahren umfasst, kurz gesagt,
die Herstellung einer Reihe von Medien oder Lösungen mit vorbestimmten (oder
bekannten) Brechungsindexwerten, die den Brechungsindex der synthetischen
Teilchen von Interesse eingrenzen. Die Teilchen werden im Medium
oder in der Lösung, z.B.
Serumalbumin oder Natriumdiatrizoat, suspendiert, und die suspendierten
Teilchen werden unter einem Mikroskop betrachtet, um den Punkt zu
bestimmen, an dem die Teilchen im Medium „verschwinden", d.h. den Punkt,
an dem der Brechungsindex der Teilchen jenem des Mediums oder der
Lösung
am ähnlichsten
ist.
-
Das
Kalibrierungs- oder Standardisierungsverfahrne gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst im Allgemeinen das Hindurchführen der kugelförmigen,
synthetischen Kalibrierungs- oder Standardisierungsteilchen mit
einem mittleren Teilchendurchmesser und einem Brechungsindex, die
im Wesentlichen die Werte von zu untersuchenden oder analysierenden
Teilchen wiedergeben, in einem Flüssigkeitsstrom, und zwar im
Wesentlichen jede Zelle einzeln, durch einen einfallenden Lichtstrahl.
Ein erstes und ein zweites messbares Signal von den synthetischen
Kalibrierungs- oder
Standardisierungsteilchen, die den Lichtstrahl passieren, werden
detektiert. Entweder das erste oder das zweite messbare Signal ist Lichtstreuung.
Die Stärke
oder Intensität
des ersten und zweiten Signals werden bestimmt, wodurch ein Paar
von Signalintensitäten
oder ein Signalpaar erzeugt werden.
-
Unter
Einsatz der oben beschriebenen vorbestimmten Volumen- und Brechungsindexwerte
für die
synthetischen kugelförmigen
Teilchen zusammen mit herkömmlichen
Zahlentabellen zur Umrechnung des Paars von Signalintensitäten, beispiels weise Streuung,
wird das Paar von Signalintensitäten
in Volumen- und Brechungsindexwerte umgerechnet, um standardisierte
Signalverstärkungen
des Durchflusszytometers bereitzustellen.
-
Unter
Einsatz der standardisierten Signalverstärkungen zusammen mit den oben
genannten Umrechnungstabellen wird das Durchflusszytometer für Volumen-
und Brechungsindexmessungen kalibriert. Außerdem wird das Durchflusszytometer
mithilfe der bekannten Teilchenkonzentration für die Suspension von kugelförmigen Teilchen
mit einem vorbestimmten Volumen und Brechungsindex für die Zählung von analysierbaren
Teilchen mit Signalen innerhalb der geeigneten Volumen- und Brechungsindexbereiche standardisiert.
-
Es
versteht sich, dass beim Kalibrierungs- oder Standardisierungsverfahren
gemäß der vorliegenden
Erfindung neben den Lichtstreuungssignalen auch andere Messbare
Signale eingesetzt werden können.
Somit kann beim Kalibrierungs-/Standardisierungsverfahren entweder
das erste oder das zweite messbare Signal Lichtstreuung sein, und
das andere der beiden messbaren Signale kann eines der nachfolgend
angeführten
sein. Alternativ dazu können
sowohl das erste als auch das zweite Signal Lichtstreuung sein.
Nichteinschränkende
Beispiele für
andere geeignete messbare Signale als Lichtstreuung, die entweder
das erste oder das zweite Signal (jedes, das nicht Lichtstreuung
ist) umfassen können
oder die zusätzlich
zur Lichtstreuung als Signale eingesetzt werden können, umfassen
elektrische Impedanz, Lichtabsorption, Fluoreszenz und Funkfrequenz,
in beliebiger Kombination. In einem Beispiel für einen Fall, bei dem entweder
das erste oder das zweite messbare Signal Lichtstreuung ist und
das andere Signal, das nicht Lichtstreuung ist, eine andere Art
von messbarem Signal darstellt, werden die messbaren Signale verwendet,
um Volumen- und Brechungsindexmessungen durchzuführen.
-
Wenn
sowohl das erste als auch das zweite messbare Signal Lichtstreuung
sind, dann können die
andere messbaren Signale, die neben den Lichtstreuungssignalen verwendet
werden, weitere nützliche
Bestimmungen oder Messungen für
das Kalibrierungs-/Standardisierungsverfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung bereitstel len. In einem nichteinschränkenden Beispiel kann, wenn
neben der ersten und der zweiten Lichtstreuungsmessung noch eine Fluoreszenzmessung
durchgeführt
wird, außer
den Streuungsmessungen bei den beiden Streuungswinkeln noch die
Fluoreszenzintensität
bestimmt werden. Bei einem weiteren Beispiel kann, wenn eine Absorptionsmessung
neben der ersten und der zweiten Lichtstreuungsmessung durchgeführt wird,
außer der
Streuungsmessung bei den beiden Streuungswinkeln die absorbierte
Lichtmenge beispielsweise durch bestimmte Farbstoffe in den analysierten
Teilchen bestimmt werden.
-
In
einer typischen Streuung/Impedanz-Analyse wird eine Aliquote von
Vollblut, die rote Blutkörperchen,
weiße
Blutkörperchen
und Blutplättchen enthält, verdünnt und
in einem isotonischen Medium suspendiert (das daher elektrisch leitend
ist). Der Verdünnungsfaktor
wird so eingestellt, dass Zellen hintereinander das Doppeldetektionssystem
passieren. Die Impedanzmessung stellt Informationen über die
Zellgröße aller
Zelltypen (d.h. roter Blutkörperchen,
weißer
Blutkörperchen
und Blutplättchen)
in der Vollblutprobenaliquote bereit. Die Streuungsmessung kann
Informationen über
den Brechungsindex einer Zelle und somit über die Zelldichte von Zellen bereitstellen,
die sich wie Kügelchen
verhalten, da die Mie-Streuungstheorie zur Bestimmung des Brechungsindex
auf das Streuungssignal angewandt werden kann. Die Informationen über Größe und/oder
Brechungsindex werden verwendet, um den drei Zelltypen Signale zuzuordnen.
Die Anzahl an Impulsen der einzelnen Typen wird zur Bestimmung der
Zellanzahl genutzt.
-
Um
ein Streuung/X-Verfahren für
die Analyse von roten Blutkörperchen
zu standardisieren und zu kalibrieren, werden Kügelchen mit einem mittleren Volumen,
das dem von normalen roten Blutkörperchen
entspricht (etwa 90 fl), d.h. Kügelchen
mit einem mittleren Durchmesser von etwa 5,5 μm, und einem mittleren Brechungsindex,
der dem von normalen roten Blutkörperchen
entspricht (etwa 1,41), hergestellt und gemäß der Erfindung verwendet.
Suspensionen mit bekannten Konzentrationen dieser Kügelchen
werden hergestellt und durch das Streuung/X-Detektionssystem geschickt.
Die Streuung/X-Signale, die von diesen Kügelchen erzeugt werden, werden
zur Standardisierung der Detektoren für Messungen roter Blutkörperchen
verwendet, da die Standardisierungskügelchen die Signalpositionen bestimmen,
die von normalen Zellpopulationen eingenommen werden.
-
Die
Volumen- und Brechungsindexwerte der Kügelchen können außerdem zur Kalibrierung des Detektionssystems
für numerische
Messungen, wie z.B. das mittlere Volumen der roten Blutkörperchen (MCV)
und die mittlere zelluläre
Hämoglobinkonzentration
(MCHC), eingesetzt werden. Letzterer Parameter kann durch Brechungsindexmessungen
erhalten werden, da der Brechungsindex und die Hämoglobinkonzentration in linearer
Beziehung zueinander stehen. Die Anzahl an Signalen, die durch die
Kügelchen
pro Zeiteinheit oder pro Volumeneinheit erzeugt wird, kann verwendet
werden, um das System für
die Zählung
der roten Blutkörperchen
(RBC) zu kalibrieren.
-
Auf
völlig
analoge Weise können
synthetische Kügelchen
gemäß der Erfindung
hergestellt und zur Standardisierung und Kalibrierung eines Geräts zur Durchführung von
Analysen an Blutplättchen
eingesetzt werden. Kugelförmige
Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 2,5 μm und einem Brechungsindex von
etwa 1,38 in einer Suspension mit geeigneter Verdünnung werden
durch das System geschickt. Die Signale der Teilchen werden zur
Standardisierung des Detektionssystems für Blutplättchenmessungen eingesetzt.
Die Signale der Teilchen könne
außerdem
zur Kalibrierung des Systems für Messungen
des mittleren Blutplättchenvolumens (MPV)
genutzt werden, sowie für
Messungen des Blutplättchenbrechungsindex.
Die Anzahl an Signalen pro Zeiteinheit oder pro Volumeneinheit kann
zur Kalibrierung von Blutplättchenzählungen
(PLT) verwendet werden.
-
Auf
analoge Weise können
synthetische Kügelchen
zur Standardisierung und Kalibrierung von Geräten für Analysen an weißen Blutkörperchen
eingesetzt werden. In diesem Fall kann im Allgemeinen eine einzelne
Gruppe von Teilchen mit beispielsweise einem mittleren Durchmesser
von etwa 8,0 μm und
einem Brechungsindex von etwa 1,385, die auf geeignete Weise verdünnt sind,
hergestellt und für die
Standardisierung und Kalibrierung des Detektionssystem für Analysen
weißer
Blutkörperchen
ausgewählt
werden. Alternativ dazu können
mehrere Gruppen von Teilchen mit den gewählten mittleren Durchmessern,
Brechungsindizes und Konzentrationen separat oder gemeinsam zur
Standardisierung und Kalibrierung des Detektionssystems für Analysen
weißer
Blutkörperchen
auf Typ-für-Typ-Basis
der weißen
Blutkörperchen
eingesetzt werden.
-
Wie
für die
Analysen weißer
Blutkörperchen beschrieben
kann, anstatt ein System für
die Analyse jedes Blutzelltyps einzeln zu standardisieren und zu kalibrieren,
eine Kombination von Kügelchen,
die für die
gleichzeitige Analyse von roten Blutkörperchen, Blutplättchen und
weißen
Blutkörperchen,
in einer einzigen Suspension mit geeigneter Konzentration hergestellt
werden. Dies ist möglich,
weil bei normalen Blutproben alle dieser Blutzelltypen einzigartige Positionen
im Größen/Brechungsindex-Raum einnehmen.
-
Weiters
können
Teilchen zur Verwendung in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt
und für
die Standardisierung und Kalibrierung von Geräten zur Analyse von Retikulozyten
in Vollblut ausgewählt
werden. Ähnlich
wie jene für
die Standardisierung/Kalibrierung für rote Blutkörperchen,
weisen auch die Teilchen für
die Retikulozyten-Standardisierung/Kalibrierung einen Durchmesser
von etwa 5,5 μm
und einen Brechungsindex von etwa 1,41 auf. Wenn die Retikulozyten
von reifen roten Blutkörperchen
aufgrund der optischen Absorptionseigenschaften von selektiv gebundenen
Farbstoffen, z.B. kationischen Farbstoffen wie Oxazin 750, unterschieden
werden, dann werden die Teilchen so hergestellt, dass sie Farbstoffe
in Konzentrationen enthalten, die für die von Retikulozyten repräsentativ ist.
Wenn die Retikulozyten auf Basis der Fluoreszenz von selektiv gebundenen
Farbstoffen unterschieden werden, dann enthalten die Kügelchen
geeignete fluoreszierende Farbstoffe, wie sie herkömmlicherweise
bekannt sind und von Fachleuten eingesetzt werden. Die Herstellung
der Polymerteilchen, die geeignete Farbstoffverbindungen enthalten,
kann auf gleiche Weise erfolgen, wie für die Beladung der Teilchen
mit fluorhältigen
Verbindungen beschrieben, wie zuvor unter Detaillierte Beschreibung
und in Beispiel 2 beschrieben. Anstatt die Teilchen mit F-hältigen Verbindungen
zu beladen, können
die Teilchen beispielsweise auch mit Pigmentverbindungen oder hydrophoben
Teilchen beladen werden (siehe US-Patent Nr. 5.270.354).
-
Um
die kugelförmigen
Teilchen als Standards/Kalibratoren bei Durchflusszytometrie einzusetzen,
müssen
die Größe und der
Brechungsindex der Teilchen bestimmt werden. Die Größe kann
basierend auf vorher kalibrierten Aperturimpedanzzählern bestimmt
werden, indem die Teilchen einfach durch die Zähler geschickt und ihr Volumen
aufgezeichnet werden (1A und 1B). Neben
den oben beschriebenen Brechungsindexmessungen an den Teilchen können die
Brechungsindexwerte auch durch eine Art Brechungsindexanpassung
bestimmt werden, die oben erläutert
und nachfolgend genauer beschrieben wird: Kügelchen werden in einer Reihe von
flüssigen
Medien suspendiert, deren Brechungsindizes den Brechungsindexwert
der Polymerkügelchen überspannen.
Die Suspension wird unter einem Mikroskop untersucht. Der Brechungsindex
der Kügelchen
ist jener Wert, bei dem die Kügelchen
unter dem Mikroskop unsichtbar sind (da ihr Brechungsindex dem des
Mediums „angepasst" ist). Der Brechungsindex
des Mediums kann beispielsweise durch Messungen mit einem Abbé-Refraktometer
bestimmt werden. Das ausgewählte
Medium muss mit den Kügelchen
unmischbar sein. Ansonsten absorbieren die Kügelchen einen Teil des Mediums,
was sich auf ihre Brechungsindexwerte auswirkt. Geeignete Medien
umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf wässrige Lösungen von Zuckern, wie z.B.
Dextran. Die Brechungsindexauflösung
wird durch die Auflösung
von Brechungsindexinkrementen der vorbereiteten Medienlösung gesteuert.
In der Praxis kann der Brechungsindex in Einheiten von nur 0,0005
inkrementiert werden.
-
Das
Abbé-Refraktometer
ermöglicht
eine refraktometrische Analyse unter Verwendung von nur einem oder
zwei Tropfen einer Probe und erlaubt die Messung eines Brechungsindex
in etwa 1–2
Minuten mit einer Genauigkeit von 0,0001 (McGraw-Hill Concise Encyclopedia
of Science and Technology, S. 1582, 2. Aufl., Chefredakteurin: Sybil
P. Parker, McGraw-Hill Publishing Company (1989)).
-
BEISPIELE
-
Die
folgende Beispiele dienen als Beispiele für verschiedene Aspekte der
Durchführung
der Erfindung und sind keineswegs als Einschränkung gedacht.
-
BEISPIEL 1
-
Herstellung von Kügelchen
aus fluorierten Polymerteilchen mit einem Teilchengrößendurchmesser
von etwa 5 μm
und einem Brechungsindex von 1,41 ± 0,0
-
Synthetische
Teilchen wurden zur Verwendung als Kalibrierungsstandards für rote Blutkörperchen
hergestellt. Die Teilchen waren Homopolymere, die aus polymerisierten
Monomereinheiten von Trifluorethylmethacrylat als Monomer bestanden.
Das zur Herstellung der Teilchen eingesetzt Verfahren wird in Beispiel
1 beschrieben.
-
Bei
Raumtemperatur wurden 6,64 g Poly-N-vinylpyrrolidin mit einem Molekulargewicht
von 40.000 zusammen mit 665,0 g Trifluorethylmethacrylat und 13,3
g Arkopal N060 (siehe unten) in 33,69 g entmineralisiertem Wasser
und 2670,53 g Methanol in einem 5-l-Reaktionsbehälter, der mit einem Rührer und
einem Rückflusskühler ausgestattet war,
gelöst.
Die Lösung
wurde während
der gesamten Reaktion konstant mit 55 U/min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
auf 65°C
erhitzt. Bei dieser Temperatur wurden 110,83 g einer 30-gew.-%igen Lösung von
Natriumpersulfat auf einmal zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde
bei 65°C
gehalten und weitere 16 h lang gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch
auf Raumtemperatur abkühlen
gelassen und filtriert. Der schlussendliche Durchmesser der Teilchen
(Dmv) betrug 5,13 und der Brechungsindex 1,413. Fluor war in den
fertigen Teilchen, die polymerisierte fluorhältige Monomere gemäß der vorliegenden
Erfindung enthielten, in einer Menge von 35 Gew.-%, bezogen auf
die Monomere, vorhanden.
-
Polyvinylpyrrolidon
(PVP), das bei der oben beschriebenen Herstellung der fluorierten
Polymerkügelchen
eingesetzt wurde, dient als Stabilisator. PVP ist für die Monodispersität der Teilchen
von Vorteil. Da es nichttoxisch ist, stellt es außerdem ein
gutes Bindemittel für
medizinische Anwendungen dar. Arkopal N-060, ein Monoisononylphenylether
eines Polyethylenglykol mit Ethylenoxid-Grundeinheiten ist ein Beispiel
für ein
Netzmittel. Beispiele für
andere geeignete Netzmittel umfassen Akyporox NP-40, ein Monoisononylphenylether
eines Polyethylenglykols mit vier Ethylen oxid-Grundeinheiten, und
Antarox CO-630, ein Monoisononylphenylether eines Polyethylenglykols
mit neun bis zehn Ethylenoxid-Grundeinheiten.
-
BEISPIEL 2
-
Beladung von synthetischen
Teilchen, um Kalibrierungsmaterialien mit niedrigem Brechungsindex
zu erhalten
-
Synthetische
Polymerteilchen wurden gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt und beladen, um den Brechungsindex zu einzustellen,
sodass Kalibrierungsprodukte mit niedrigen Brechungsindizes erhalten
wurden, ohne dass das geladene Material austrat.
-
2
g Perfluoralkylethylmethacrylat wurden in 45 ml Ethylacetat bei
25°C gelöst. Die
resultierende Lösung
wurde 5 min lang unter Rühren
mit 12.000 U/min in 90 ml entmineralisiertem Wasser dispergiert,
zu dem 9 ml einer 10%igen wässrigen
Lösung des
Natriumsalzes von n-Dodecylbenzolsulfonsäure zugesetzt worden waren.
Die resultierende Dispersion von Perfluormonomer wurden zu 97 g
einer wässrigen
Dispersion von Fluorkügelchen
zugesetzt (20,6 Gew.-%; Brechungsindex 1,413). Das erhaltene Gemisch
wurde 1 h lang gerührt.
Ethylacetat wurde unter reduziertem Druck entfernt. Homodisperse
Polymerteilchen, die mit dem hydrophoben Perfluormonomer beladen
waren (Brechungsindex: 1,408), wurden erhalten. Die Dispersion enthielt
keine Konglomerate oder ungelösten
oder kristallisierten Perfluormonomere.
-
BEISPIEL 3
-
Standardisierung und Kalibrierung
des H*1 Hematology Analyzer von Bayer unter Verwendung der synthetischen
Polymerteilchen der vorliegenden Erfindung zur Analyse von Zellpopulationen
in Vollblut
-
Synthetische
Kügelchen
wurden gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Kügelchen
wurden dann bei 50°C
getrocknet und in isotonischer Salzlösung auf eine Endkonzentration von
23.500 Teilchen pro μl
Salzlösung
resus pendiert. Basierend auf der Teilchenanzahl und der Größenverteilung,
die mithilfe eines Aperturimpedanzzählers bestimmt wurden (1A und 1B),
umfasst die Kügelchensuspension
7.888 Teilchen mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 4,89
+/– 0,17
mm und 15.612 Teilchen mit einem mittleren Teilchendurchmesser von
weniger als 2,0 μm.
Der mittlere Brechungsindex dieser Kügelchen betrug 1,417 +/– 0,003.
-
Proben
dieser Kügelchensuspension
wurden auf dem H*1 Hematology Analyzer von Bayer im Direkt-Cytometry-Modus
laufen gelassen; d.h. die Suspension wurde nicht weiter verdünnt, bevor
sie durch das optische Streuung/Streuung-Detektionssystem geschickt
wurde. Dies erfolgte, um den Verbrauch des Standardisierungs-/Kalibrierungsteilchenmaterials
zu verringern. Das Streuung/Streuung-System des H*1-Geräts von Bayer
enthält
eine Helium-Neon-Laserlichtquelle, die bei einer Wellenlänge von 632,8
Nanometer emittiert; eine zylindrische Öffnung, durch welche die Suspension
hindurch lief (die Öffnung
ist mit einem Medium ummantelt, dessen Brechungsindex dem des Suspensionsmediums
entspricht); und zwei Silicium-Photodetektoren, von denen einer
so platziert ist, dass der das von den Teilchen bei 2°–3° gestreute
Licht empfängt,
und der andere so platziert ist, dass er das bei 5°–15° gestreute Licht
empfängt.
Die Signale wurden auf einem direkten Streuung/Streuung-Zytogramm dargestellt,
worin die X-Achsensignale der 5°–15°-Streuung
entsprachen und die Y-Achsensignale der 2°–3°-Streuung entsprachen (2).
Die Teilchengröße wurde
als mittleres Zellvolumen (MCV, fl) angegeben, um dem relevanten
Terminus für
echte rote Blutkörperchen
zu entsprechen. Gleichermaßen
wurde die Größenverteilung
als Verteilungsbreite der roten Blutkörperchen (RDW, %, (SA der roten
Blutkörperchenverteilung/MCV))
angegeben. Das MCV steht in folgender Beziehung zum Durchmesser: MCV = X × Durchmesser3/6.
-
Der
Brechungsindex wurde als mittlere zelluläre Hämoglobinkonzentration (CHCM,
g/dl) angegeben, und seine Verteilung wurde als Hämoglobinverteilungsbreite
(HDW, g/dl, (SA der Verteilung)) angegeben. Die zelluläre Hämoglobinkonzentration
(HC) steht in folgender Beziehung zum Brechungsindex: HC
= (zellulärer
Brechungsindex – 1,345)/0,001942,worin
1,345 der Brechungsindex des Nichthämoglobinanteils im Zytoplasma
der roten Blutkörperchen ist,
und 0,001942 die Brechungsindexsteigerung pro g/dl Hämoglobin
ist.
-
Die
zugehörigen
Streuungssignalwerte (in 2 als Meanx und Meany angegeben)
wurden unter Verwendung von Tabellen bestimmt, die auf der Mie-Streuungstheorie
basierten, welche das Streuungsintensität-Winkelmuster für homogene
Kügelchen
als Funktion der einfallenden Wellenlänge, des Teilchenbrechungsindex
und des Teilchendurchmessers voraussagt. Die Werte wurde eingestellt,
bis sie mit der theoretischen Voraussage übereinstimmten: X = 19,5 und
Y = 20,0. Die Teilchenanzahl für
Kügelchen
innerhalb der „RBC-Box" in 2 ist
625-mal höher
als die tatsächliche
Anzahl (d.h. 7,888 × 625
= 4.390.000). Dies inkludiert den normalen Verdünnungsfaktor des Systems von
625/1.
-
Der
Inhalt sämtlicher
Patente, Patentanmeldungen, veröffentlichten
Artikel, Bücher,
Literaturverweise, Handbücher
und Zusammenfassungen, die hierin angeführt sind, sind hiermit in ihrer
Gesamtheit durch Verweis hierin aufgenommen, um den Stand der Technik
umfassend zu beschreiben, auf den sich die Erfindung bezieht.
-
Da
am oben beschriebenen Gegenstand verschiedene Änderungen vorgenommen werden können, ohne
vom Schutzumfang und Geist der Erfindung abzuweisen, ist der Erfindungsgegenstand, wie
er in der obigen Beschreibung enthalten oder in den beiliegenden
Ansprüchen
definiert ist, als beschreibend und veranschaulichend, und nicht
als einschränkend
zu verstehen. Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden
Erfindung sind im Lichte der obigen Lehren möglich. Es versteht sich somit,
dass die Erfindung im Rahmen des Schutzumfangs der beiliegenden
Ansprüche
auch andres umgesetzt werden kann, als hierin speziell beschrieben wird.