JPH1183724A - フローサイトメトリーの標準およびキャリブレーターとして使用するための合成ポリマー粒子 - Google Patents

フローサイトメトリーの標準およびキャリブレーターとして使用するための合成ポリマー粒子

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JPH1183724A
JPH1183724A JP10192381A JP19238198A JPH1183724A JP H1183724 A JPH1183724 A JP H1183724A JP 10192381 A JP10192381 A JP 10192381A JP 19238198 A JP19238198 A JP 19238198A JP H1183724 A JPH1183724 A JP H1183724A
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signal
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David Zelmanovic
デイヴィド、ズェルマノヴィク
William Moskalski
ウイリアム、マスカルスキ
Ronny Declercq
ロニ、デクレルク
Frank Louwet
フランク、ロウヴェット
Eberhard Dr Kuckert
エーベルハルト、クッケルト
Wolfgang Dr Podszun
ヴォルフガング、ポスズン
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Bayer Corp
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Bayer AG
Bayer Corp
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 フローサイトメトリー装置を、該装置にて使
用すると利点をもたらす物理特性を有する合成ポリマー
粒子又はビーズを用いて較正／標準化する。 【解決手段】 較正または標準合成粒子は、所定の体積
および屈折率値を有しており、装置は、光散乱関連信号
を生じるものであり、a)検定される粒子について、較正
または標準合成粒子を光の入射束に通す工程、b)光の入
射束を通過する較正または標準合成粒子からの第１およ
び第２の測定可能な信号を検出する工程、c)第１および
第２の信号の強度を測定し、信号強度の対を生成させる
工程、d)信号強度の対を体積および屈折率値に換算し、
標準化された信号利得をフローサイトメーターに付与す
る工程、及びe)(i)体積および屈折率の測定および(ii)
適当な体積および屈折率の範囲内に信号を有する分析可
能な粒子の計数に対してフローサイトメーターを較正す
る工程を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体粒子（biolog
ical particle）または細胞を分析するためのフローサ
イトメトリー装置において用いられる生成物および方法
に関する。より特定的には、本発明は、前記粒子、例え
ば全血中の細胞成分を分析するためにフローサイトメト
リー装置を用いる前に、該装置を標準化または較正する
ための合成ポリマー材料および方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】粒子、特に生体粒子、および細胞の分析
は、装置を通過するかかる粒子の特性を１以上の光関連
信号に基づいて測定する種々の市販の装置を用いて、ル
ーチン的に行われている。フローサイトメーターは、粒
子を液体流中で移動させるか、または粒子が懸濁液中で
運搬される技術を用いて粒子の特性の測定を可能にす
る。典型的には、フローサイトメトリー装置において
は、細胞またはその他の生体粒子は、該粒子の物理的特
性または化学的特性を測定することが可能な検出領域を
各粒子が実質的に一度に１細胞ずつ通過するように、液
体流中を流動する。
【０００３】分析中、粒子の種々の特性に関連した様々
な信号が検出され得る。そのような信号としては、電気
信号、音響学的信号、光信号および放射性信号が挙げら
れる。フローサイトメーターは、一般的に、該装置を通
過する粒子の分析に関して、光信号に依存している。装
置が静的状態にある粒子を分析するものであろうが、動
的状態にある粒子を分析するものであろうがいずれにせ
よ、当業者は、粒子の分析前に行なう較正および標準化
が必要であるということは認識しているであろう。正常
環境下においては、較正は、適正な使用および測定のた
めに、そして正確で信頼できる検定結果を確保するため
に装置を準備することにおける１以上の予備工程として
存在する。細胞またはその他の生体粒子は極端に小さ
く、そしてその細胞または粒子の大きさに関連して検出
される信号の大きさが小さいことが多いので、較正は特
に重要である。
【０００４】フローサイトメーター、ならびにその他の
生体粒子および細胞分析装置は、通常、分析する予定の
粒子または細胞の型を模倣する（simulate）か、または
似ている（approximate）粒子を用いて較正される。し
たがって、較正粒子は、その装置で試験される粒子また
は細胞の特性およびパラメーターとかなり類似している
特性およびパラメーターを有するように選択され、設計
されるべきである。特性およびパラメーターの具体例と
しては、大きさ、体積、表面特性、粒度特性、および必
要な場合には染色剤、染料、免疫蛍光タグなどの色特性
における類似性が挙げられる。よって、アナライザーの
較正または標準化後に分析される粒子は、生物細胞に限
定する必要がないということが理解されるであろう。例
えば、検定される粒子は、水中油型（oil-in-water）懸
濁液、ミルク、または別の非生物媒体中に見出され得
る。
【０００５】血液学的アナライザーは、全血中の細胞お
よび生体粒子の特性を決定および測定するために設計さ
れ、用いられている単に一つの特別な型の装置である。
特定の、しかし限定するものではない例として、Bayer
社から市販されている血液学的システムは、光学的に、
全血試料中の赤血球、網状赤血球（未成熟赤血球）、白
血球および血小板を分析し、それらの特性を決定し、そ
してそれらを測定する。
【０００６】血液学的アナライザーを含むフローサイト
メトリー装置の過去および現在の較正手順は、その較正
工程および光散乱などの光信号の標準化に対して、固定
化および／または球状（sphered）赤血球、例えば、ヒ
トおよびニワトリ赤血球の使用に関与している。例え
ば、米国特許第4,489,162号(Hawkinsら）および米国特
許第4,777,139号(S.-C.Wongら）を参照されたい。哺乳
類およびヒトから得られた赤血球の使用は、較正手順の
いくつかの側面において信頼性があり得るが、このよう
な型の「天然の」キャリブレーター細胞の使用には不都
合が存在する。例えば、球状および固定化赤血球の調製
には、バイオハザードの可能性のある材料との接触を含
む血液抜き出しプロセス（blood-drawing process）お
よびその他の血液操作が必要である。さらに、光学標準
としての赤血球の安定性は限定されている、すなわち約
６ヶ月であるので、この細胞標準は、定期的に、典型的
には１年に２回以上、再調製しなければならない。
【０００７】較正および標準化の目的のための生体試料
に加えて、微小球（microsphere）または微小ビーズも
細胞分析装置の較正に用いられている。例えば、米国特
許第4,331,862号(W.L.Ryan)には、粒子計数装置の較正
のために、ラテックス材料からなるビーズが記載されて
いる。米国特許第4,704,891号(D.J.Recktenwaldら）に
は、フローサイトメーターおよび細胞分析装置の較正の
ために、プラスチック製の微小ビーズが開示されてい
る。フローサイトメトリー装置を較正するための較正ビ
ーズは、Flow Cytometry Standards社（ノースカロライ
ナ州、Research Triangle Park）から市販されている。
一般に、そのような微小球ビーズは、実際の細胞および
生体粒子の適正な屈折率値を考慮して製造されてはいな
い。
【０００８】米国特許第5,093,445号(W.Podszunら）に
は、写真記録材料におけるつや消剤およびスペーサーと
して使用するための、0.5〜10μｍの平均粒径を有し、
化学的に結合したフッ素を１％〜60％含有する非生体ビ
ーズポリマーが開示されている。この特許は、フローサ
イトメトリー用の粒子キャリブレーターに関するもので
はなく、そして屈折率をそのような使用に対する重要な
パラメーターと認めるものではない。実際、本発明者ら
は、この特許に例示されたポリマービーズは、1.45（特
に、屈折率は下記にさらに示したように血球に関係して
いるので、1.45は、屈折率の上限であるかまたは上限に
近いと考えられる）よりも有意に高い屈折率を有すると
いうことを確認した。
【０００９】蛍光フローサイトメーターなどのその他の
型のフローサイトメトリー装置は、光信号を標準化する
ためにポリスチレンなどの材料から作られたポリマービ
ーズを用いている。信号は、典型的には、前方散乱光
（０〜２度）、側方散乱光（90度）、および蛍光強度を
含む。このポリマービーズ材料は、約５年以上安全で安
定であるが、特に光散乱フローサイトメトリー装置には
不十分である。より特定的には、所与の体積の粒子に対
して、現在利用可能なポリマー粒子は、たとえ赤血球が
球状であっても、同体積の赤血球のものとは異なる散乱
信号を生ずる。これは、ポリスチレンなどのポリマー材
料の屈折率（r.i.）が赤血球のものとは全く異なるとい
う理由によるものである。ポリスチレンのr.i.は高い、
すなわち、約1.59であるのに対して、赤血球のr.i.は約
1.40〜1.42である。小球体の光散乱特性がそのr.i.の値
によって有意に影響されるということは、ミー散乱理論
(MieScattering Theory)から周知である。したがって、
フローサイトメトリー装置に現在用いられているポリマ
ービーズの散乱パターンは、実際の赤血球の散乱パター
ンを正確に表すものではない。結果として、前方および
側方散乱信号は、細胞密度および活性化状態に関係し
た、細胞の大きさや屈折率などの重要な情報を与えるも
のではない。
【００１０】さらに、血小板光散乱信号は、現在、いく
つかの型のアナライザー、例えば、市販の血液学的アナ
ライザーの場合においては球状および固定化赤血球を用
いて、または蛍光フローサイトメーターの場合には適当
に一定の大きさに作ったポリマービーズを用いて標準化
される。しかしながら、血小板の散乱信号は、典型的
に、赤血球のものよりも非常に小さい（すなわち、10倍
（factor）以上）。また、血小板の屈折率も、わずか約
1.35〜約1.40である。したがって、本発明は、実際の血
小板に関連した光散乱特性、ならびにフローサイトメト
リー分析のための非生体ポリマー材料の安定性および安
全性を有する材料を都合よく提供する。
【００１１】さらに、白血球光散乱信号は、現在、球状
および固定化赤血球、またはポリマービーズのどちらか
を用いて標準化されている。白血球散乱信号は、典型的
に、赤血球のものよりも大きく、そして、白血球の屈折
率は小さく、典型的には約1.37〜約1.40である。したが
って、本発明は、実際の白血球に関連した光散乱特性、
ならびにフローサイトメトリー分析のための非生体ポリ
マー材料の安定性および安全性を有する材料も提供す
る。
【００１２】さらに特定的な例として、いくつかの市販
の血液学的アナライザーは、その光散乱特性とオキサジ
ン(Oxazine) 750などのカチオン性染料への結合能との
組合せに基づいた網状赤血球（未成熟赤血球）を挙げて
おり、この場合、染料の吸収波長の光を吸収する。現
在、吸収チャンネルは、染料を含まない固定化および球
状赤血球を用いて標準化されている。この標準化は、吸
収検出器の収集円錐角(collection cone-angle)の外側
に散乱した光に依存して、真の光吸収を模倣する「疑似
吸収（pseudo-absorption）」信号を発生させるもので
ある。しかしながら、この疑似吸収信号は、多数の網状
赤血球によって生じる真の吸収信号よりも有意に小さい
ので、この方法は最適ではない。よって、用いられる光
学標準は、実際に生じた真の信号を最適に表すものでは
ない。また、ポリスチレンなどの材料から作られた適当
に着色されたポリマービーズも、そのr.i.値が高いこと
から散乱信号検出器のレンジ外の散乱信号を生じるの
で、かかる目的には有用ではない。したがって、網状赤
血球の光散乱および吸収の測定値の標準化のために、網
状赤血球の光散乱（および吸収）特性を有し、また安全
で、安定でもある材料の製造が望まれている。散乱およ
び蛍光特性を組み合わせて血球の分析に用いる蛍光フロ
ーサイトメトリーの場合、分析される特定の細胞の光散
乱および蛍光特性を有し、非生体ポリマー材料の安全性
および安定性を有する材料の製造が望まれている。
【００１３】このように、現在、血液学的アナライザー
を含む種々の分析装置における非生体粒子および生体粒
子ならびに細胞の特性の決定において、正確で再現性の
ある結果をもたらす標準化および較正粒子ならびに手順
が必要とされており、所望されている。また、フローサ
イトメトリー装置を標準化するための安全で安定な較正
粒子の製造も、現在必要とされている。このような粒子
は、最も望ましくは、長い保存寿命を有し、そして粒度
および屈折率などの、較正／標準化プロセス中にかかる
粒子が表す天然粒子および細胞の特性と実質的に同一の
特性を有する必要がある。
【００１４】さらに、血液学的分析のために、フローサ
イトメーターを標準化するための非生体ポリマー粒子の
開発が必要とされており、ここで、用いられる標準化ポ
リマー粒子は、装置の較正／標準化後、分析される代表
的な成分である血球の必須のパラメーター全てを正確に
表現するものである。本発明は、本分野におけるこれら
の現在の要求および目標を都合よく満たすことを指向す
るものである。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、フローサイトメーター、特に血液学的アナライ
ザーを、非生体粒子もしくは生体粒子または細胞を分析
する前に較正または標準化するのに使用するための新規
合成ポリマー粒子を提供することである。ここで、その
キャリブレーター／標準化粒子は、分析される実際の粒
子または血球、例えば真正の赤血球、網状赤血球、血小
板および／または白血球の光学的および物理学的性質を
実質的に全て有し、且つ非生体ポリマー材料の安定性お
よび安全性を有する。本発明によれば、新規較正粒子
は、分析される種々の媒体中の真正の粒子または血液試
料などの生体試料中の細胞型のものと実質的に同一の狭
い平均粒径分布、明確な平均粒径および明確な屈折率値
を有するように設計される。
【００１６】本発明の別の目的は、フローサイトメトリ
ー装置を、生体粒子または細胞の分析前に、特に全血試
料の構成細胞の分析に関して、較正または標準化するた
めの新規試薬および方法を提供することである。
【００１７】本発明の別の目的および利点は、本分野で
公知であり、使用されているものの実質的な改良である
較正方法および材料を提供することである。本発明は、
当業者に、予め決定されており、簡単に操作され、使用
者が利用しやすい較正標準（および／または閾値）を用
い、それに依存することによって粒子分析装置を較正す
る能力を付与する。フローサイトメトリー装置の標準化
および較正中、本発明の標準および方法を用いると、装
置の適正な標準化および較正、装置の光学成分の適正な
アラインメント、ならびに細胞の大きさおよび前方散乱
光と側方散乱光の測定から得られる屈折率の測定を含む
その後の粒子および細胞の分析のための装置の性能の最
適化が可能になる。
【００１８】本発明のさらに別の目的は、一つの測定パ
ラメーターとしての光散乱と、光散乱（すなわち散乱−
散乱検出）、電気インピーダンス（すなわち散乱−イン
ピーダンス検出）、高周波（すなわち散乱−ＲＦ検出）
などのもう一つの公知のパラメーターの測定との組合せ
に基づいた、いくつかの異なる粒子の分析および検出系
に用いるための較正／標準化方法ならびに合成粒子を提
供することである。さらに、本発明ならびに本発明によ
る利点および特徴は、蛍光セルソーターなどのその他の
フローサイトメトリー分析装置においても利用し得るも
のであり、そして画像アナライザー、自動顕微鏡、定量
顕微鏡、蛍光顕微鏡などの装置まで広げ得るということ
が理解されるであろう。本発明の材料および技術は、正
常な状態および異常な状態の両方を同定し、決定するた
めの医学および臨床診断用途を含む種々の用途に品質保
証を与えるものである。
【００１９】本発明によって提供される目的および利点
は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明は、生体粒子または細胞の
分析のためのフローサイトメトリー装置を較正または標
準化する方法において使用するための合成ポリマー粒子
（本明細書においてはビーズまたは粒子ビーズともい
う）を提供する。本発明のポリマー粒子は、生体粒子お
よび細胞の分析に有用な装置を実際の生体粒子または細
胞自体の検定を行う前に正確に標準化し、較正すること
を可能にする特性およびパラメーターを有するように設
計されている。
【００２１】また、本発明のポリマー粒子を用いて、ミ
ルクまたは水中油型懸濁液などの非生物媒体中の非生体
粒子の分析に有用な装置を、該非生体粒子の分析を行う
前に正確に標準化および較正することもできる。
【００２２】本発明は、特に、全血試料中の細胞成分の
分析用血液学的アナライザーを較正または標準化するた
めの合成粒子に関する。本発明によれば、所与の細胞
型、特に血球に対して、標準化またはキャリブレーター
粒子の大きさ、形、体積および屈折率が、検定される実
際の細胞のこれらと同一のパラメーターを高度に再現す
るように作成される。本発明以前には、フローサイトメ
トリーおよび／または血液学的分析の分野においてキャ
リブレーター／標準化材料として使用するために、この
ような粒子は考えられておらず、また、特別に設計され
てもいなかった。
【００２３】より特定的には、本発明のポリマー粒子
は、実質的に球状のビーズであり、ハロゲン化物である
フッ素を含む。この粒子は、約１μｍ〜約10μｍ、好ま
しくは約１μｍ〜約８μｍ、より好ましくは約４μｍ〜
約６μｍの明確な平均粒径（粒度直径）、すなわち、塊
平均(mass average)を有する。特定の血球型の標準化／
較正材料としての本発明の合成ポリマー粒子の好ましい
平均粒径は、赤血球については約5.5μｍであり、血小
板については約2.5μｍであり、好中球については約8.0
μｍであり、リンパ球については約7.2μｍであり、単
球については約9.0μｍであり、好酸球については約8.5
μｍであり、好塩基球については約7.4μｍである。
【００２４】さらに、本発明の球状ポリマー粒子は、一
般的に約1.35〜約1.45、好ましくは約1.35〜1.42の屈折
率を有する。特定の血球型用の標準化／較正材料として
の本発明の合成ポリマー粒子の好ましい屈折率は、下記
のとおりである：赤血球については約1.410であり、血
小板については約1.380であり、好中球については約1.3
95であり、リンパ球については約1.385であり、単球に
ついては約1.375であり、好酸球については約1.395であ
り、好塩基球については約1.385であり、これらの細胞
型のそれぞれについて、約±0.01、より好ましくは約±
0.005の範囲を有する。本発明によれば、フッ素を含む
粒子が標準化／較正材料としての使用に最適の低い屈折
率値をもたらす。特定の限定するものではない例とし
て、本発明による赤血球分析用の血液学的アナライザー
を標準化および較正するのに使用するために最適な粒子
は、５〜5.5±0.1μｍの粒度を有し、約1.41±0.005の
屈折率を有する。
【００２５】本発明のポリマー較正粒子の単分散度は、
少なくとも約65％であり、好ましくは少なくとも約75％
であり、より好ましくは少なくとも約85％である。本明
細書で用いる場合、単分散度とは、その平均粒径が平均
粒径±33％の範囲にあるポリマー粒子の重量百分率をい
い、該粒子を製造するために用いた重合方法によって達
成される。単分散度特性のさらなる改良または改善、例
えば、粒度分布を狭くすることは、該粒子の調製中に分
子ふるいまたは超遠心分離などの物理的精製手順を適用
することによって達成することができる。
【００２６】フローサイトメトリーを用いた赤血球の分
析を含む一つの実施態様においては、本発明にしたがっ
て約5.5μｍの平均粒径を有し、1.4の屈折率を有する球
状ビーズポリマー粒子が調製される。そのような較正物
質によって、正確で再現性のある赤血球測定のためにア
ナライザー装置が最適に標準化および較正される。本発
明の別の実施態様は、網状赤血球、白血球および血小板
に対する標準化および較正材料としての球状ビーズポリ
マー粒子の合成および使用を含む。フローサイトメトリ
ーを用いた網状赤血球の分析の対しては、ポリマービー
ズは約5.5μｍの平均粒径を有し、約1.410の屈折率を有
するように調製される。フローサイトメトリーを用いた
白血球の分析に対しては、該ポリマービーズは前記の平
均粒径を有するように調製される。フローサイトメトリ
ーを用いた血小板の分析に対しては、ポリマービーズは
約2.5μｍの平均粒径を有し、約1.380の屈折率を有する
ように調製される。
【００２７】本発明の適当なポリマー粒子は、下記の一
般式Ｉ：
【化４】 （式中、Ｒ1 は水素（Ｈ）またはメチル（ＣＨ3 ）であ
り；Ａは−Ｏ−であり；ｎは１〜５、好ましくは１〜３
であり；Ｒ2 は１〜12個の炭素原子を含むフッ素含有
（Ｆ含有）アルキル基である。）で示されるような重合
モノマー単位を含む。Ｆ含有アルキル基としては、パー
フルオロアルキルおよび部分的にフッ素化されたアルキ
ルが挙げられる。Ｒ3 は、水素（Ｈ）またはＣ1 〜Ｃ6
アルキルである。当業者によって認識されているとお
り、パーフルオロアルキルは水素原子の全てがフッ素で
置換されたアルキル基である。 式： ＣＨ2ＣＨＲ1−ＣＯＯＣＨ2Ｒ2 （式中、Ｒ1 およびＲ2 は上記のとおりである。）で表
される重合モノマー単位を含む球状粒子またはビーズが
好ましい。また、本発明は、式：ＣＨ2＝ＣＲ1ＣＯＯＲ
2 またはＣＨ2＝ＣＨＣＨ2ＣＯＲ2 （ここで、Ｒ1 およ
びＲ2 も上記のとおりである）で表される重合モノマー
単位を有する粒子も含むものである。
【００２８】本発明によるフローサイトメトリー装置の
較正／標準化用のポリマー粒子の合成に適した上記式の
モノマーとしては、限定するものではないが、2-フルオ
ロエチルアクリレート、2,2,2-トリフルオロエチルアク
リレート、2,2,3,3-テトラフルオロプロピルアクリレー
ト、2,2,3,4,4,4-ヘキサフルオロブチルアクリレート、
1H,1H-ヘプタフルオロブチルアクリレート、1H,1H,5H-
オクタフルオロペンチルアクリレート、1H,1H-ペンタデ
カフルオロオクチルアクリレート、2-フルオロエチルメ
タクリレート、2,2,2-トリフルオロエチルメタクリレー
ト、2,2,3,3,3-ペンタフルオロプロピルメタクリレー
ト、1H,1H-ヘプタフルオロブチルメタクリレート、2,2,
3,4,4,4-ヘキサフルオロブチルメタクリレート、1H,1H,
5H-オクタフルオロペンチルメタクリレートおよび1H,1
H,11H-エイコサフルオロウンデシルメタクリレートが挙
げられる。本発明による好ましいポリマー粒子は、2,2,
2-トリフルオロエチルメタクリレートのホモポリマーを
含む。また、この合成ポリマー粒子は、モノマー単位の
混合物または組み合わせを含んでいてもよい。
【００２９】式Ｉの重合単位を含むポリマーは、好まし
くは、フッ素を、該ポリマー全重量に対して約22〜約65
重量％、好ましくは約30〜約55重量％の量で含有する。
粒子は、１種単独のフッ素置換モノマー、または２種以
上のフッ素置換モノマーの混合物を含有することができ
る。
【００３０】上記のフッ素含有モノマーに加えて、本発
明にしたがって使用するための合成ポリマー粒子は、例
えば、スチレン、α−メチルスチレン、ビニルトルエ
ン、ビニルベンジルクロリド、ブタジエン、イソブチレ
ン、エチルアクリレート、n-ブチルアクリレート、エチ
ルヘキシルアクリレートなどのアクリル酸エステル類、
メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、イソブ
チルメタクリレート、エチルヘキシルメタクリレート、
デシルメタクリレートおよびドデシルメタクリレート
を、他の共重合モノマーの最大約50重量％まで含有する
ことができる。好ましいのはメチルメタクリレートであ
る。さらに、コポリマーをフッ素含有モノマーと用いる
場合、フッ素を含まないコモノマーか、またはフッ素以
外のハロゲン化物を含むコモノマーが適している。
【００３１】較正／標準化材料として使用するための球
状ポリマー粒子は、少なくとも１種の式Ｉのモノマー
を、任意に少なくとも１種のその他のモノエチレン性不
飽和化合物と共に重合することによって製造される。モ
ノマーは、上記モノマーのための溶媒および生じるポリ
マー粒子のための沈殿化合物を含む極性媒体中、高分子
量の分散剤および開始剤としてのラジカル生成剤の存在
下で重合される。一般に、このポリマー粒子は、米国特
許第5.093,445号に記載されたようにして合成すること
ができる。
【００３２】使用に適した極性媒体としては、例えば、
ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホル
ムアミドおよびアルコール類などが挙げられる。低級ア
ルコール類、すなわち、１〜４個の炭素原子を有するア
ルコール類、特に、メタノール、エタノール、n-プロパ
ノール、イソプロパノール、n-ブタノール、イソブタノ
ールおよびtert-ブタノールが好ましい。種々の溶媒の
混合物も適しており、種々のアルコール類の混合物が好
ましい。好ましくは、溶媒と水の混合物が用いられる。
そのようなアルコール／溶媒混合物においては、アルコ
ール類は最大約25重量％までの水を含有することができ
る。
【００３３】極性媒体が水を含む場合、ペルオキソ二硫
酸ナトリウム（Na2Ｓ2Ｏ8）も調製スキームに含めるの
が適当であり得る。一般に、ラジカル生成剤は、モノマ
ーまたはモノマー混合物の全重量の約0.05〜約10重量
％、好ましくは約0.2〜約５重量％の量で添加される。
【００３４】粒子の調製に用いられる高分子量分散剤
は、用いられる極性媒体に可溶性であり、約５×103 〜
５×105 、好ましくは約１×104 〜２×105 の分子量Ｍ
w （ゲル浸透クロマトグラフィー）を有する天然または
合成高分子化合物であり得る。例えば、メチルセルロー
ス、エチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロ
ースなどのセルロース誘導体、ならびにポリ酢酸ビニル
が挙げられるが、これらに限定するものではない。好ま
しくはけん化の程度が約５％〜約25％の部分けん化ポリ
酢酸ビニルが特に適している。好ましくは、ポリビニル
ピロリドン、置換ポリビニルピロリドン類、ポリビニル
カプロラクタムおよびビニルコポリマーが、モノマーま
たはその混合物の全重量の約0.1〜約10重量％、好まし
くは約0.2〜約５重量％の量で用いられる。
【００３５】本発明による合成ビーズポリマーの調製に
おいて使用され得るその他の分散剤としては、イオン性
および非イオン性界面活性剤が挙げられる。適当なアニ
オン性界面活性剤としては、例えば、スルホコハク酸エ
ステル類のナトリウム塩が挙げられるが、これに限定す
るものではない。適当なカチオン性界面活性剤として
は、限定するものではないが、N-アルキル-アンモニウ
ム塩、例えばメチルカプリルアンモニウムクロリドが挙
げられる。使用に適した非イオン性界面活性剤の一例と
して、エトキシル化ノニルフェノールが挙げられる。界
面活性剤は、極性媒体に対して約0.1〜約５重量％、好
ましくは約0.2〜約２重量％の量で用いられ得る。
【００３６】モノマー単位の重合は、通常のラジカル生
成剤、特に、ペルオキシ化合物およびアゾ化合物、例え
ば、ジベンゾイルペルオキシド、ジラウリルペルオキシ
ド、ビス(p-クロロベンゾイルペルオキシド）、ジシク
ロヘキシルペルオキシジカーボネート、tert-ブチルペ
ルオクテート、2,5-ビス(2-エチルヘキサノイルペルオ
キシ)-2,5-ジメチルヘキサン、tert-アミルペルオキシ-
2-エチルヘキサン、2,2'-アゾ-ビス（イソブチロニトリ
ル）を用いて開始される。
【００３７】用いられる重合温度は、開始剤の分解温度
と溶媒の沸点に依存し、好ましくは約50℃〜140℃の範
囲である。重合は、溶媒の沸点で行うのが都合がよい。
重合時間は、一般的に、数時間（例えば約２〜12時間）
にわたって行われる。
【００３８】重合混合物は、通常、撹拌される。本発明
によるポリマーの単離は、濾過、または例えば遠心分離
を用いた沈殿によって行われる。本発明によるキャリブ
レーター粒子に対して、該粒子を含むモノマーによって
屈折率が測定される。平均粒径および単分散度（すなわ
ち狭い分布）は、当業者の有する技術（例えば、米国特
許第5,093,445号）を用いて、フローサイトメトリー分
析に望ましい型の較正／標準化粒子に基づいて、要求さ
れる特定の粒度および単分散度を得るために重合のパラ
メーターを適当に調節することによって得られる。
【００３９】本発明にしたがって調製されたポリマー粒
子の有意な特徴としての屈折率の測定は、下記のように
して行うことができる：ポリマー粒子の分散液を濾過し
て、約105℃のオーブン中で乾燥した。乾燥したポリマ
ーを溶媒、例えばアセトンに溶かし、ポリマーを溶解し
た溶液を１滴、屈折計（例えば、Abbe屈折計（実施例３
参照））のガラス板に載せ、次いでガラス板の表面全体
に連続被膜が形成されるまで乾燥した（例えば、ヘアー
ドライヤーを用いる）。次に、粒子の屈折率を、この乾
燥したポリマー被膜について屈折計を用いて測定した。
【００４０】本発明にしたがって製造した粒子ビーズの
特定の屈折率の調節は、該ビーズに低屈折率の物質を配
合する(load)ことによって行うことができる（実施例２
参照）。一般に、ポリマー粒子に有機化合物（すなわち
活性成分）を該ポリマーについての溶媒中で配合する
と、粒子は膨張する。溶媒を蒸発させた後、活性成分は
ポリマー粒子内に残留している。適当な配合可能な(loa
dable)成分化合物には、約1.45以下の屈折率を有する任
意の有機分子が含まれる。配合に適した有機分子として
は、例えば、フッ素含有化合物、特に上記のようなフッ
素含有モノマーが挙げられ、上記に記載したようにして
重合される。配合した物質がビーズから浸出するのを防
止するために、１種以上の低屈折率のエチレン−不飽和
モノマーをラジカル開始剤とともに添加することができ
る。その後の重合によって有機分子を粒子中に固定す
る。粒子の配合に用いる方法は、米国特許第5,270,354
号(J.T.Vermeerschら）に記載されている。
【００４１】被検者の血液試料中に存在する実際の血球
の種々の型全てを表す粒子を用いて所与の装置が較正／
標準化され得るように、異なる大きさおよび屈折率範
囲、ならびに異なる吸収および蛍光染料濃度範囲を有す
る粒子の混合物も本発明に含まれる。
【００４２】本発明は、例えば、光散乱／吸収、光散乱
／蛍光、光散乱／電気インピーダンス、光散乱／高周波
（ＲＦ）、光散乱／光散乱技術などの、単に１つの測定
パラメーターとしての光散乱に基づいた種々の検出機構
および技術が関与するフローサイトメトリーアナライザ
ー装置の標準化／較正に特に適用可能である。本明細書
において用いる場合、粒子および細胞の決定および測定
のために散乱光と別の測定パラメーターとの組み合わせ
に基づいたフローサイトメトリーが関与する技術は、
「散乱／Ｘ」測定という。例えば、散乱／散乱検出は、
粒子または細胞の分析が２つの異なる散乱角の粒子によ
って生じる光散乱を測定することによって行われること
を意味する。その他の系、例えば散乱／電気インピーダ
ンス、または散乱／ＲＦ検出などは、少なくとも１つの
角の光散乱を測定し、そしてそれぞれ、電気インピーダ
ンスまたは高周波などの異なる既知のパラメーターも測
定することによって細胞の分析を可能にする。
【００４３】一般的に、散乱／Ｘ法において、懸濁液中
の細胞は、一列で光学検出系を通過し、そしてインピー
ダンスおよびＲＦ測定のための電気検出系も通過する。
光学系は、光源、通常は平行(collimated)レーザービー
ム、細胞が通過し、光線を遮る細長い円筒形チューブ、
ならびにシリコンフォトダイオードまたは光電子増倍管
などの１以上の光学検出器（これらは、細胞によって伝
達され、散乱されまたは蛍光を発せられた光を集めるよ
うに配置されている）を含む。電気系は、細胞が通過す
るアパーチュア(aperture)と称する小さな開口部を通っ
て印加される、電場、電気インピーダンスの静電気(sta
tic)およびＲＦの振動を含む。散乱／インピーダンス法
においては、例えば、フローセルは、光学測定および電
気測定の両方に適した円筒形アパーチュアであり得る。
【００４４】したがって、本発明の側面の一つにおいて
は、本発明は、キャリブレーターまたは標準として実質
的に球状の粒子を用いて、粒子分析用のフローサイトメ
トリー装置を較正または標準化する方法を提供する。較
正または標準合成球状粒子の体積および屈折率値を予め
決定し、既知の体積および屈折率値を得る。フローサイ
トメトリー装置は、一般に、分析のために該装置を通過
する粒子由来の少なくとも１つの光散乱関連信号を生じ
る。
【００４５】球状合成ビーズに対して通常のアパーチュ
アインピーダンス測定値、例えば単チャンネルアパーチ
ュアインピーダンスを用いることによって合成球状粒子
の体積をルーチン的に決定し、既知体積の合成粒子を得
る。通常用いられている屈折率整合技術(index matchin
g teqnique)によって屈折率を測定し、所定(predetermi
ned)または既知の屈折率値を得る。簡単に言うと、屈折
率整合技術は、対象の合成粒子の屈折率値を一まとめに
扱う所定の（または既知の）屈折率値を有する一連の媒
体または溶液の調製を含む。粒子を媒体または溶液、例
えば血清アルブミンまたはナトリウムジアトリゾエート
(sodium diatrizoate)に懸濁し、懸濁した粒子を顕微鏡
で見て媒体中で粒子が「消える(disappear)」点、すな
わち粒子の屈折率が媒体または溶液の屈折率とほとんど
同様になる点を決定する。
【００４６】本発明による較正または標準化方法は、一
般に、液体フローの流れにおいて検定または分析される
粒子についての本質的に再現性のある平均粒径および屈
折率を有する較正または標準球状合成粒子を、一度に１
細胞ずつ光の入射束に通すことを含む。第１または第２
の測定可能な信号のどちらかは、光散乱である。第１お
よび第２の信号の量または強度を測定し、それによって
信号強度の対または信号対を生成させる。合成球状粒子
に対する上記の所定の体積および屈折率値を、信号強度
の対、例えば散乱を換算するための通常の数値表ととも
に用いて、信号強度の対を体積および屈折率値に換算
し、標準化された信号利得(signal-gain)をフローサイ
トメーターに付与する。標準化された信号利得を上記の
換算表とともに用いて、フローサイトメーターを体積お
よび屈折率値に対して較正する。さらに、所定の体積お
よび屈折率を有する球状粒子の懸濁液について既知の粒
子濃度を用いて、フローサイトメーターを適当な体積お
よび屈折率範囲内に信号を有する分析可能な粒子の計数
に対して標準化する。
【００４７】本発明による較正または標準化方法におい
ては、光散乱信号に加えてその他の測定可能な信号を用
いることができるということが理解されるであろう。し
たがって、この較正／標準化方法において、第１または
第２の測定可能な信号のどちらか光散乱であることがで
き、そして、その２つの測定可能な信号のもう一方が下
記に列挙したものの一つであることができる。また、第
１および第２の信号の両方が光散乱でありうる。第１も
しくは第２の信号のどちらか（どちらかが光散乱ではな
い）を構成することができる、または光散乱に加えて信
号として用いることができる、光散乱以外の適当な測定
可能な信号としては、例えば、電気インピーダンス、光
吸収、蛍光および高周波のあらゆる組み合わせが挙げら
れるが、これらに限定するものではない。例えば、第１
または第２の測定可能な信号のどちらかが光散乱であ
り、もう一方の非光散乱信号が別の種類の測定可能な信
号である場合、その測定された信号を用いて体積および
屈折率測定値が得られる。
【００４８】第１および第２の測定可能な信号の両方が
光散乱である場合、その光散乱信号に加えて別の測定可
能な信号を用いると、本発明による較正／標準化方法に
追加の有用な決定または測定値を付与することができ
る。例えば、限定するものではないが、蛍光測定を第１
および第２の光散乱測定に加えると、２つの散乱角から
得られる散乱測定値に加えて、蛍光強度の測定値を得る
ことができる。また、別の例として、吸収測定を第１お
よび第２の光散乱測定に加えると、２つの散乱角から得
られる散乱測定値に加えて、例えば、分析される粒子内
の一定の染料によって吸収された光の量の測定値が得ら
れる。
【００４９】典型的な散乱／インピーダンス分析におい
ては、赤血球、白血球および血小板を含有する全血のア
リコートを希釈し、等張媒体に懸濁する（したがって導
電性である）。細胞が二重検出系を一列で通過するよう
に希釈率を調節する。インピーダンス測定によって、全
血試料アリコート中の細胞型の全て（すなわち、赤血
球、白血球および血小板）に対する細胞の大きさについ
ての情報が得られる。ミー散乱理論を散乱信号に適用し
て屈折率を決定し得るので、散乱測定によって、細胞の
屈折率についての情報を得ることができ、したがって球
体として挙動する細胞に対する細胞密度についての情報
を得ることができる。大きさおよび／または屈折率につ
いての情報を用いて、３つの細胞型に信号を割り当て
る。各型のパルスの数を用いて細胞数を決定する。
【００５０】赤血球分析の散乱／Ｘ法を標準化および較
正するために、平均体積が正常な赤血球の平均体積（約
90fl）と等しい、すなわち約5.5μmの平均径を有し、平
均屈折率が正常な赤血球の屈折率（約1.41）と等しい球
状ビーズを本発明にしたがって調製し、用いる。既知濃
度のこれらのビーズの懸濁液を調製し、散乱／Ｘ検出系
に流す。標準化ビーズは正常な細胞集団によって占有さ
れる信号位置を決定するので、これらのビーズによって
生じた散乱／Ｘ信号を用いて赤血球測定用の検出器を標
準化する。このビーズの体積および屈折率値を用いて、
平均赤血球体積（ＭＣＶ）および平均細胞ヘモグロビン
濃度（ＭＣＨＣ）などの数値測定のための検出系も較正
することができる。屈折率とヘモグロビン濃度は正比例
関係にあるので、後者のパラメーターは、屈折率の測定
値から得ることができる。単位時間または単位体積当た
りのビーズによって生じた信号の数を用いて、平均赤血
球体積（ＭＣＶ）および平均細胞ヘモグロビン濃度（Ｍ
ＣＨＣ）などの赤血球数測定用の系を較正することがで
きる。屈折率とヘモグロビン濃度は正比例関係にあるの
で、後者のパラメーターは屈折率の測定値から得られ得
る。単位時間または単位体積当たりのビーズによって生
じた信号の数を用いて、赤血球数（ＲＢＣ）用の系を較
正することができる。
【００５１】全く類似の方法において、血小板分析を行
うための装置の標準化および較正のために、本発明によ
る合成ビーズを調製し、用いることができる。約2.5μ
ｍの径および約1.38の屈折率を有する球状粒子を適当な
希釈度で懸濁した懸濁液を系に流す。粒子の信号を用い
て血小板測定用の検出系を標準化する。粒子の信号を用
いて、平均血小板体積（ＭＰＶ）測定、ならびに血小板
屈折率測定用の系も較正することができる。単位時間ま
たは単位体積当たりの信号の数を用いて、血小板数（Ｐ
ＬＴ）を較正することができる。
【００５２】類似の方法において、白血球分析用の装置
の標準化および較正に使用するために、本発明による合
成粒子を調製し、選択することができる。この場合、一
般的に白血球分析用の検出系を標準化および較正するた
めに、例えば、約8.0μｍの平均径および約1.385の屈折
率を有し、適当に希釈された１群の粒子を調製し、選択
することができる。あるいは、選択された平均径、屈折
率および濃度を有する多数の粒子群を別々に、または組
み合わせて用いて、白血球の型に基づいた白血球分析用
の検出系を標準化および較正し得る。
【００５３】白血球分析について記載したように、各血
球型の分析用の系を個々に標準化および較正するよりは
むしろ、赤血球、血小板および各白血球型の同時分析に
適したビーズの組み合わせを適当な濃度の１種単独の懸
濁液に調製することができる。このことは、正常な血液
試料に関し、血球型の全てが大きさ／屈折率空間内の固
有の位置を占有するということから可能である。
【００５４】さらに、本発明による粒子を、全血中の網
状赤血球の分析用の装置を標準化および較正するために
調製し、選択することができる。赤血球の標準化／較正
用の粒子と同様に、網状赤血球の標準化／較正用の粒子
は、約5.5μｍの径と、約1.41の屈折率を有する。網状
赤血球が、選択的に結合した染料、例えばオキサジン75
0などのカチオン性染料の光学吸収特性に基づいて成熟
赤血球と識別される場合、粒子は染料を網状赤血球の濃
度を表す濃度で含有するように調製される。網状赤血球
が、選択的に結合した染料の蛍光に基づいて赤血球と識
別される場合、ビーズは、当業者に通常公知であり、用
いられているような適当な蛍光染料を含有する。適当な
染料化合物を含有させるためのポリマー粒子の調製は、
上記および実施例２に記載したような、粒子にフッ素含
有化合物を配合することに関して記載した調製と類似の
方法で行うことができる。粒子にＦ含有化合物を配合す
るかわりに、粒子に顔料化合物または疎水性染料（例え
ば、米国特許第5,270,354号も参照）を配合することが
できる。
【００５５】本発明にしたがって調製した球状粒子をフ
ローサイトメトリーにおける標準／キャリブレーターと
して用いるために、粒子の大きさおよび屈折率値を決定
する必要がある。大きさは、予め較正したアパーチュア
インピーダンスカウンターに基づいて粒子を単に該カウ
ンターに流して、その体積を記録することによって決定
され得る（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００５６】粒子についての上記のような屈折率測定に
加えて、屈折率値は、上述し、さらに以下に記載したよ
うな屈折率整合の方式によって決定され得る：ビーズ
を、その屈折率がポリマー粒子ビーズの屈折率値にわた
る連続流動媒体(fluid media)中に懸濁する。該懸濁液
を顕微鏡で観察する。ビーズの屈折率は、ビーズが顕微
鏡では肉眼で見えなくなる値である（その屈折率が媒体
の屈折率と「整合」するためである）。媒体の屈折率
は、例えば、Abbe屈折計による測定によって決定するこ
とができる。選択された媒体はビーズと不混和性でなけ
ればならない。さもなければ、ビーズは媒体の一部を吸
収し、これがその屈折率値に影響を及ぼすことになる。
適当な媒体としては、限定するものではないが、デキス
トランなどの糖類の水溶液が挙げられる。屈折率の分解
能は、調製された媒体溶液の屈折率増分の分解能によっ
て支配される。実際には、屈折率は、0.0005単位ずつ増
大され得る。
【００５７】Abbe屈折計によれば、ほんの１滴または２
滴の試料を用いるだけで屈折率測定分析が可能であり、
約１〜２分内に、0.0001の精度で屈折率を測定すること
が可能である（McGraw-Hill Concise Encyclopedia of
Science and Technology、第２版、監修者：Sybil P.Pa
rker、McGraw-Hill出版、p.1582、1989）。
【００５８】
【実施例】本明細書に記載された下記の実施例は、本発
明を実施する上での種々の態様を例示するものであり、
いかなる場合においても本発明を限定するものではな
い。
【００５９】実施例１ 粒度約５μｍおよび屈折率1.41±0.01のフッ素化ポリマ
ー粒子ビーズの調製 赤血球用の較正標準として使用するために合成粒子を調
製した。粒子は、モノマーとしてのトリフルオロエチル
メタクリレートの重合モノマー単位からなるホモポリマ
ーであった。実施例１には粒子の製造に用いた手順を記
載する。
【００６０】室温で、分子量40,000のポリ-N-ビニルピ
ロリドン6.64ｇを、トリフルオロエチルメタクリレート
665.0ｇおよびArkopalN060（下記参照）13.3ｇととも
に、撹拌子および還流冷却器を備えた５リットル反応容
器中の脱イオン水33.69ｇおよびメタノール2670.53ｇに
溶解した。溶液を、全反応中、55rpmで絶えず撹拌し
た。反応混合物を65℃に加熱した。この温度で、110.83
ｇの30％ (w/w)の過硫酸ナトリウム溶液を一度に加え
た。反応混合物を65℃に保ち、さらに16時間撹拌した。
反応混合物を室温まで冷却し、濾過した。粒子の最終的
な径（Ｄｍｖ）は5.13であり、屈折率は1.413であっ
た。フッ素は、本発明による重合フッ素含有モノマーを
含む最終粒子中に、モノマーに対して35重量％の量で存
在していた。
【００６１】上記のフッ素化ポリマービーズの調製に用
いたポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は、安定剤として
役立つものである。ＰＶＰは、粒子の単分散性に都合が
よい。また、ＰＶＰは毒性が無いので、医学用途におい
て良好な結合剤である。反復エチレンオキシド単位を有
するポリエチレングリコールのモノイソノニルフェニル
エーテルであるArkopal N-060は、湿潤剤の一例であ
る。その他の適当な湿潤剤としては、例えば、４個の反
復エチレンオキシド単位を有するポリエチレングリコー
ルのモノイソノニルフェニルエーテルであるAkyporox N
P-40、ならびに９〜10個の反復エチレンオキシド単位を
有するポリエチレングリコールのモノイソノニルフェニ
ルエーテルであるAntarox CO-630が挙げられる。
【００６２】実施例２ 低屈折率の較正材料を得るための合成ポリマー粒子への
配合 合成ポリマー粒子を本発明にしたがって調製し、屈折率
を調節して低屈折率の較正生成物を得るために、配合材
料が浸出しないように配合した。
【００６３】パーフルオロアルキルエチルメタクリレー
ト２ｇを、酢酸エチル45mlに25℃で溶解した。得られた
溶液を、12,000rpmで撹拌しながら、n-ドデシルベンゼ
ンスルホン酸のナトリウム塩の10％水溶液９mlが添加さ
れた脱イオン水90mlに５分間かけて分散させた。得られ
たパーフルオロモノマーの分散液を、フッ素化ビーズ水
性分散液（20.6％、w/w、屈折率：1.413）97ｇに加え
た。得られた混合物を１時間撹拌した。酢酸エチルを減
圧下で除去した。疎水性パーフルオロモノマーが配合さ
れた単分散ポリマー粒子（屈折率：1.408）が得られ
た。分散液には、団塊または不溶性もしくは結晶化パー
フルオロモノマーは含まれていなかった。
【００６４】実施例３ 全血中の細胞集団の分析前の、本発明の合成ポリマー粒
子を用いたBayer H*1 ヘマトロジーアナライザーの標準
化および較正 上記の実施例１に記載した方法にしたがって合成ビーズ
を調製した。次いで、ビーズを50℃にて乾燥し、最終濃
度が生理食塩水１μl当たり23,500粒子になるまで等張
生理食塩水に再懸濁した。アパーチュアインピーダンス
カウンターによって得られた粒子数および粒度分布に基
づいて、ビーズ懸濁液は平均粒径4.89±0.17μｍの7,88
8粒子と、平均粒径2.0μｍ未満の15,612粒子とを含んで
いた。これらのビーズの平均屈折率は1.417±0.003であ
った。
【００６５】このビーズ懸濁液の試料を、Bayer H*1 ヘ
マトロジーアナライザーに直接サイトメトリーモードで
流した。すなわち、散乱／散乱光学検出系を通過させる
前に懸濁液はさらに希釈しなかった。これは、標準化／
較正粒子材料の消費を低減させるために行った。Bayer
H*1 装置の散乱／散乱系は、632.8ナノメートルの波長
で放出するヘリウム−ネオンレーザー光源、懸濁液が通
過する円筒形アパーチュア（このアパーチュアは、屈折
率が懸濁媒体の屈折率と整合した媒体におおわれてい
る）、ならびに２つのシリコン光検出器（一つは２〜３
°の粒子によって散乱された光を集めるために配置され
ており、もう一つは５〜15°の散乱された光を集めるた
めに配置されている）を含む。信号を直接散乱／散乱シ
トグラム（Ｘ軸は５〜15°散乱に対応する信号であり、
Ｙ軸は２〜３°散乱に対応する信号である）上に表示し
た（図２）。粒度を、真正の赤血球に関連した項に対応
するように平均細胞体積（ＭＣＶ、fl）として示した。
同様に、粒度分布を、赤血球分布幅（ＲＤＷ、％、（赤
血球分布のＳＤ／ＭＣＶ））として示した。ＭＣＶと径
は次のような関係を有する：ＭＣＶ＝π×径3 ／６。
【００６６】屈折率を細胞ヘモグロビン濃度平均（ＣＨ
ＣＭ、g/dl）として示し、その分布をヘモグロビン分布
幅（ＨＤＷ、g/dl、（分布のＳＤ））として示した。細
胞ヘモグロビン濃度（ＨＣ）と屈折率は次のような関係
を有する：ＨＣ＝（細胞屈折率−1.345）／0.001942
（ここで、1.345は赤血球細胞質の非ヘモグロビン部分
の屈折率であり、0.001942はヘモグロビンのg/dl当たり
の屈折率増分である）。
【００６７】関連した散乱信号値（図２の平均ｘおよび
平均ｙ）は、ミー散乱理論に基づいた表（この表は、入
射波長、粒子屈折率および粒径の関数として均一な球体
の角散乱強度パターンを予測するものである。）を用い
て決定した。この値を、それらの値が理論予測（Ｘ＝1
9.5およびＹ＝20.0）に一致するまで調節した。図２の
赤血球「ボックス」内のビーズの粒子数は、実際の数よ
りも625倍多い（すなわち、7,888×625＝4,930,000）。
これは、この系の通常の希釈率625/lを含む。
【００６８】本明細書に引用した全ての特許、特許出
願、発表論文、書籍、参考文献、マニュアル、および抄
録は、本発明が関係する分野の事情をより十分に説明す
るために、参照により本明細書に含まれるものである。
【００６９】上記の主題において本発明の範囲および精
神を逸脱することなく種々の変更がなされ得るので、上
記の説明に含まれ、または特許請求の範囲に規定された
全ての主題は説明的および例示的であると解釈されるも
のであり、限定するものではない。上記の技術に鑑み
て、本発明の多くの改変および変形が可能である。した
がって、特許請求の範囲内で、本発明は具体的に記載し
た以外の方法において実施され得ることが理解されるで
あろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アパーチュアインピーダンスカウンタ
ー（実施例３）に基づいた、本発明による標準化／較正
合成ポリマー粒子の粒子数および相対体積の測定を示す
ものである。図１Ａは、実施例１に記載されたようにし
て調製した粒子の数の度数分布を表すものである。図１
Ａにおいて、Ｘ軸は粒子の直径（ミクロン）を表し、Ｙ
軸は相対粒子数を表す。図１Ｂは、図１Ａのものと同じ
粒子の体積の度数分布を表すものである。図１Ｂにおい
て、Ｘ軸は粒子の直径（ミクロン）を表し、Ｙ軸は粒子
が占有する相対体積を表す。
【図２】図２は、図１に記載されたものと同じ粒子の散
乱／散乱サイトグラム(cytogram)を示すものである。Ｘ
軸は５°〜15°の粒子の散乱強度を表し、Ｙ軸は２°〜
３°の粒子の散乱強度を表す。ＸおよびＹ軸の値は、０
〜50の範囲である。サイトグラムに加えて、ＲＢＣボッ
クス中の粒子の分布の平均ならびにσｘおよびσｙと呼
ばれる標準偏差（ＳＤ）を示す。ＲＢＣ（106 ／μl)と
称する粒子数；ＭＣＶ(fl)と称する平均粒子体積；本明
細書に記載したように当量(equivalent)細胞ヘモグロビ
ン濃度平均ＣＨＣＭ（ｇ／dl）に数学的に換算された平
均屈折率；ならびにそれぞれＲＤＷ（％）およびＨＤＷ
（ＳＤ）と称する体積およびヘモグロビン濃度分布幅
が、それぞれ示されている（実施例３参照）。
フロントページの続き (72)発明者 ロニ、デクレルク ベルギー国ベ9880・アールタ、フェルトス トラート 33番ベ (72)発明者 フランク、ロウヴェット ベルギー国ベ3590・ディーペンビーク、プ ランテンラーン ５番ア (72)発明者 エーベルハルト、クッケルト ドイツ国デー51375・レーベルクーゼン、 アム・シェルフェンブランド 67番 (72)発明者 ヴォルフガング、ポスズン ドイツ国デー51061・コルン、ロッゲンド ルフストラート 55番

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 実質的に球状の合成粒子をキャリブレー
    ターまたは標準として用いて粒子分析用フローサイトメ
    トリー装置を較正または標準化する方法であって、該較
    正または標準合成粒子は、所定の体積および屈折率値を
    有しており、該装置は、分析のために該装置を通過する
    粒子からの少なくとも１つの光散乱関連信号を生じるも
    のであり、 ａ）液体の流れにおいて検定される粒子についての本質
    的に再現性のある平均粒径および屈折率を有する前記較
    正または標準合成粒子を、本質的に一度に１細胞ずつ光
    の入射束に通す工程、 ｂ）前記の光の入射束を通過する前記較正または標準合
    成粒子からの第１および第２の測定可能な信号を検出す
    る工程、 ｃ）前記の第１および第２の信号の強度を測定し、それ
    によって信号強度の対を生成させる工程、 ｄ）前記の信号強度の対を体積および屈折率値に換算
    し、標準化された信号利得をフローサイトメーターに付
    与する工程、及び ｅ）（ｉ）体積および屈折率の測定、および（ii）適当
    な体積および屈折率の範囲内に信号を有する分析可能な
    粒子の計数に対してフローサイトメーターを較正する工
    程を含む、前記方法。
  2. 【請求項２】 前記工程ｄ）中の換算が、数値換算表と
    ともに合成球状粒子の所定の体積および屈折率値を用い
    て行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記工程ｅ）中の（ｉ）に対する較正
    が、数値換算表とともに標準化された信号利得を用いて
    行われる、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記工程ｅ）中の（ii）に対する較正
    が、所定の体積および屈折率を有する球状粒子の所定粒
    子濃度の懸濁液を用いて行われる、請求項１に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 第１または第２の測定可能な信号のどち
    らかが光散乱を含み、第１または第２の測定可能な信号
    のうちのもう一方が光散乱、電気インピーダンス、光吸
    収、蛍光または高周波の少なくとも一つを含む、請求項
    １に記載の方法。
  6. 【請求項６】 追加の測定可能な信号が得られ、その追
    加の信号が、光散乱、電気インピーダンス、光吸収、蛍
    光または高周波のうちの１以上を含み、これらの組み合
    わせはいずれのものでもよい、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記較正粒子の平均粒径が、約１μｍ〜
    約８μｍである、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記較正粒子の平均粒径が、約４μｍ〜
    約６μｍである、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記較正粒子の屈折率が、約1.35〜約1.
    45である、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記較正粒子の屈折率が、約1.40〜約
    1.42である、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記較正または標準合成粒子が、約１
    ％〜約５％の粒度分布幅を有する、請求項１に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 前記合成ポリマー粒子が、少なくとも
    約60％〜約85％の単分散度を有する、請求項１に記載の
    方法。
  13. 【請求項１３】 前記較正粒子が、 【化１】 （式中、Ｒ1 は水素（Ｈ）またはメチル（ＣＨ3 ）であ
    り；Ａは−Ｏ−であり；ｎは約１〜５であり；Ｒ2 は１
    〜12の炭素原子を含むフッ素含有アルキル基であって、
    該アルキル基は、パーフルオロアルキルおよび部分的に
    フッ素化されたアルキルからなる群より選択されるもの
    であり；そしてＲ3 は、ＨまたはＣ1 〜Ｃ6 アルキルで
    ある。）からなる群より選択される式で表される重合モ
    ノマーを含む、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記較正粒子が、式： 【化２】 （式中、Ｒ1 は水素またはメチルであり、Ｒ2 は１〜12
    の炭素原子を含むフッ素含有アルキル基であって、該ア
    ルキル基は、パーフルオロアルキルおよび部分的にフッ
    素化されたアルキルからなる群より選択されるものであ
    る。）で表される、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記モノマーが、2-フルオロエチルア
    クリレート、2,2,2-トリフルオロエチルアクリレート、
    2,2,3,3-テトラフルオロプロピルアクリレート、2,2,3,
    4,4,4-ヘキサフルオロブチルアクリレート、1H,1H-ヘプ
    タフルオロブチルアクリレート、1H,1H,5H-オクタフル
    オロペンチルアクリレート、1H,1H-ペンタデカフルオロ
    オクチルアクリレート、2-フルオロエチルメタクリレー
    ト、2,2,2-トリフルオロエチルメタクリレート、2,2,3,
    3,3-ペンタフルオロプロピルメタクリレート、1H,1H-ヘ
    プタフルオロブチルメタクリレート、2,2,3,4,4,4-ヘキ
    サフルオロブチルメタクリレート、1H,1H,5H-オクタフ
    ルオロペンチルメタクリレート、1H,1H,11H-エイコサフ
    ルオロウンデシルメタクリレートおよびそれらの混合物
    を含む、請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記較正または標準化が、血液学的ア
    ナライザーにおいて行われる、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 分析される粒子が血球である、請求項
    １６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記血球が、赤血球、網状赤血球、白
    血球および血小板からなる群より選択される、請求項１
    ７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 約１μｍ〜約８μｍの塊(mass)平均粒
    径を有し、約1.35〜約1.45の屈折率を有する単分散性フ
    ッ素含有球状ポリマー粒子。
  20. 【請求項２０】 さらに少なくとも約65％〜約85％の単
    分散度を有する、請求項１９に記載の粒子。
  21. 【請求項２１】 前記平均粒径が約５μｍ〜約６μｍで
    あり、前記屈折率が約1.35〜約1.42であり、前記単分散
    度が少なくとも約75％である、請求項２０に記載の粒
    子。
  22. 【請求項２２】 【化３】 （式中、Ｒ1 は水素（Ｈ）またはメチル（ＣＨ3 ）であ
    り；Ａは−Ｏ−であり；ｎは約１〜５であり；Ｒ2 は１
    〜12の炭素原子を含むフッ素含有アルキル基であって、
    該アルキル基は、パーフルオロアルキルおよび部分的に
    フッ素化されたアルキルからなる群より選択されるもの
    であり；そしてＲ3 は、ＨまたはＣ1 〜Ｃ6 アルキルで
    ある。）からなる群より選択される式で表される重合モ
    ノマー単位を含む、請求項１９に記載の粒子。
  23. 【請求項２３】 フッ素が、ポリマーの全重量に対して
    約25重量％〜約65重量％の量で存在する、請求項１９に
    記載の粒子。
  24. 【請求項２４】 さらに、スチレン、α−メチルスチレ
    ン、ビニルトルエン、ビニルベンジルクロリド、ブタジ
    エン、イソブチレン、エチルアクリレート、n-ブチルア
    クリレート、エチルヘキシルアクリレートなどのアクリ
    ル酸エステル類、メチルメタクリレート、エチルメタク
    リレート、イソブチルメタクリレート、エチルヘキシル
    メタクリレート、デシルメタクリレートおよびドデシル
    メタクリレートからなる群より選択される重合モノマー
    単位を、ポリマーの全重量に対して最大約50重量％まで
    含有する、請求項２２に記載の粒子。
  25. 【請求項２５】 実質的に球状の合成粒子をキャリブレ
    ーターまたは標準として用いて粒子分析用フローサイト
    メトリー装置を較正または標準化する方法であって、該
    較正または標準合成粒子は、所定の体積および屈折率値
    を有しており、該装置は、分析のために該装置を通過す
    る粒子からの少なくとも１つの光散乱関連信号を生じる
    ものであり、 ａ）液体の流れにおいて検定される粒子についての本質
    的に再現性のある平均粒径および屈折率を有する前記較
    正または標準合成粒子を、本質的に一度に１細胞ずつ光
    の入射束に通す工程、 ｂ）前記の光の入射束を通過する前記較正または標準合
    成粒子からの第１の測定可能な光散乱信号を検出する工
    程、 ｃ）前記較正または標準合成粒子からの第２の測定可能
    な信号を検出する工程、 ｄ）前記第１の光散乱信号および前記第２の信号の強度
    を測定し、それによって信号強度の対を生成させる工
    程、 ｅ）前記の信号強度の対を、信号の対の範囲全体にわた
    って体積および屈折率値に換算し、標準化された信号利
    得をフローサイトメーターに付与する工程、及び ｆ）（ｉ）体積および屈折率の測定、および（ii）適当
    な体積および屈折率の範囲内に信号を有する分析可能な
    粒子の計数に対してフローサイトメーターを較正する工
    程を含む、前記方法。
  26. 【請求項２６】 前記工程ｅ）中の換算が、数値換算表
    とともに合成球状粒子の所定の体積および屈折率値を用
    いて行われる、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記工程ｆ）中の（ｉ）に対する較正
    が、数値換算表とともに標準化された信号利得を用いて
    行われる、請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記工程ｆ）中の（ii）に対する較正
    が、所定の体積および屈折率を有する球状粒子の所定粒
    子濃度の懸濁液を用いて行われる、請求項２５に記載の
    方法。
  29. 【請求項２９】 前記第２の測定可能な信号、または追
    加の測定可能な信号が、光散乱、電気インピーダンス、
    光吸収、蛍光または高周波を含む、請求項２５に記載の
    方法。
  30. 【請求項３０】 実質的に球状の合成粒子をキャリブレ
    ーターまたは標準として用いて粒子分析用フローサイト
    メトリー装置を較正または標準化する方法であって、該
    較正または標準合成粒子は、固有かつ既知の体積および
    屈折率値を有しており、該装置は、分析のために該装置
    を通過する粒子からの少なくとも１つの光散乱関連信号
    を生じるものであり、 ａ）液体の流れにおいて検定される粒子についての本質
    的に再現性のある平均粒径および屈折率を有する前記較
    正または標準合成粒子を、本質的に一度に１細胞ずつ光
    の入射束に通す工程、 ｂ）前記の光の入射束を通過する前記較正または標準合
    成粒子からの第１および第２の測定可能な光散乱信号を
    検出する工程、 ｃ）前記の第１および第２の光散乱信号の強度を測定
    し、それによって信号散乱強度の対を生成させる工程、 ｄ）前記の信号散乱強度の対を、信号の対の範囲全体に
    わたって体積および屈折率値に換算し、標準化された信
    号利得をフローサイトメーターに付与する工程、及び ｅ）（ｉ）体積および屈折率の測定、および（ii）適当
    な体積および屈折率の範囲内に信号を有する分析可能な
    粒子の計数に対してフローサイトメーターを較正する工
    程を含む、前記方法。
  31. 【請求項３１】 前記工程ｄ）中の換算が、数値換算表
    とともに合成球状粒子の所定の体積および屈折率値を用
    いて行われる、請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記工程ｅ）中の（ｉ）に対する較正
    が、数値換算表とともに標準化された信号利得を用いて
    行われる、請求項３０に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記工程ｅ）中の（ii）に対する較正
    が、所定の体積および屈折率を有する球状粒子の所定粒
    子濃度の懸濁液を用いて行われる、請求項３０に記載の
    方法。
  34. 【請求項３４】 追加の測定可能な信号が、光散乱、電
    気インピーダンス、光吸収、蛍光および高周波、または
    それらの組み合せを含む、請求項３０に記載の方法。 【０００１】
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