JP2003515724A - デュアル広角（ｄｕａｌｌａｒｇｅａｎｇｌｅ）光散乱検出 - Google Patents

デュアル広角（ｄｕａｌｌａｒｇｅａｎｇｌｅ）光散乱検出

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JP2003515724A JP2000606986A JP2000606986A JP2003515724A JP 2003515724 A JP2003515724 A JP 2003515724A JP 2000606986 A JP2000606986 A JP 2000606986A JP 2000606986 A JP2000606986 A JP 2000606986A JP 2003515724 A JP2003515724 A JP 2003515724A
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    • G01N21/21—Polarisation-affecting properties

Abstract

(57)【要約】 平面液体サンプルフローセルとの使用に特に適切な配置を有する光学アナライザーは、偏光光源、ならびにそれぞれ精確に、そして入射光ビームに対して直角または斜角に配置される、少なくとも２個の広角散乱光光検出器を備えて、提供される。２個の光検出器で測定される光の強度における差異は、このサンプル成分を定量するために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、２個の広角光散乱チャンネルを使用する、白血球の分類のための装
置および方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 光学フローサイトメトリーは、流体サンプル内に含まれる粒子を算定および分
類する確立した手段である（Ｓｈａｐｉｒｏ．Ｈ．Ｍ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｆ
ｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ発行、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９５）。ある適用は、単位体積あたりの血小板、赤血球（ＲＢＣ
）、および白血球（ＷＢＣ）の数を決定する目的での、血液サンプルの分析を含
む。これは、一般的な臨床的測定であり、そして、光学サイトメトリーは、多く
の市販の血液学アナライザーに組み込まれてきた。最近、ミクロ流体技術が、サ
イトメータを発展する目的で利用されおり、それは、より微小なサンプルおよび
試薬体積を要求する（Ａｌｔｅｎｄｏｒｆ，Ｅら、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ
ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ ｂａｓｅｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」 Ｓ
ｅｎｓｏｒｓ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ（１９９７）１：５３１−５３４；Ｓｏｂｅ
ｋ，Ｄら、「Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｆｕｓｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｆ
ｌｏｗ ｃｈａｍｂｅｒｓ ｆｏｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、Ｓｏｌ
ｉｄ−Ｓｔａｔｅ Ｓｅｎｓｏｒ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒ Ｗｏｒｋｓｈｏ
ｐ，Ｈｉｌｔｏｎ Ｈｅａｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ（
１９９４）；Ｍｉｙａｋｅ，Ｒら、「Ａ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉ
ｃｒｏ ｓｈｅａｔｈ ｆｌｏｗ ｃｈａｍｂｅｒ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ ｔｈｅ ＩＥＥＥ ｍｉｃｒｏ ｅｌｅｃｔｒｏ ｍｃｈａｎｉｃａｌ
ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｎａｒａ，Ｊａｐａｎ（１９９１）２６
５−２７０）。これらの努力に基づく分析機器は、従来の装置よりも、より小さ
くそしてより軽便である。
【０００３】 血球の数および性質の知識は、疾患診断について重要である。この理由のため
、全血球算定および白血球分画が、血液学アナライザーを使用して実施される一
般的な臨床診断テストである。前角光散乱（Ｆｏｒｗａｒｄ ａｎｇｌｅ ｌｉ
ｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（ＦＡＬＳ）は、粒子サイズに感受性であり、
そして血小板を赤血球と区別するのに使用され得る。ＦＡＬＳと組み合わせの小
角光散乱（ＳＡＬＳ）または広角光散乱（ＬＡＬＳ）は、ＷＢＣ内で、顆粒球、
リンパ球、および単球を区別し得る（Ｓａｌｚｍａｎ，Ｇ．Ｃら（１９７５）、
「Ｃｅｌｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｌａｓｅｒ Ｌｉｇｈｔ
Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｐａｒａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ」、Ａｃｔａ Ｃ
ｙｔｏｌｏｇｉｃａ １９：３７４−３７７）。しかし、顆粒球内で、ＳＡＬＳ
およびＦＡＬＳは、好酸球と、好中球および好塩基球のような残りの顆粒球とを
明確に区別し得ない。
【０００４】 ｓ−偏光光とｐ−偏光光との散乱光の強度の差は、顆粒球間でさらに区別する
ために使用され得る。小角で２個の偏光の散乱は、区別不可である。広角で、内
部構造を有さないＷＢＣサイズの構造は、２個の偏光の散乱された光強度間で、
微小な差しか示さない。顆粒球ＷＢＣは、非常に小さな顆粒を含む内部構造を有
するが、偏光間の散乱強度における差を示す。好酸球において、顆粒は、複屈折
であり、そして散乱光の偏光をなくすように働き、そのため、２個の偏光間の散
乱強度における差は減少する。この偏光をなくすことは、細胞のタイプを区別す
るために使用されてきた（Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ，Ｌ．Ｗ．Ｍ．Ｍ．ら（１９８
８）、「Ｆｏｕｒ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｗｈｉｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｌｉｇｈｔ
Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
９：３９−４３；ｄｅ Ｇｒｏｏｔｈら、米国特許第５，０１７，４９７号；Ｍ
ａｒｓｈａｌｌ，米国特許第５，５１０，２６７号）。偏光をなくすことは、偏
光光がサンプルに衝突し、単一の広角での広角散乱光を収集し、収集光を２個の
ビームに分割し、そして２個の検出器を使用して２個のビームにおける散乱光を
測定することによって、測定された。１個は、全ての偏光の直交光散乱に対して
のであり、そして第２は、偏光をなくした直交光散乱を測定するために偏光フィ
ルターの前に配置されたものである。
【０００５】 （発明の要旨） 本発明は、偏光フィルターを要求することなしに、偏光維持粒子と、偏光をな
くした粒子とを区別する、アナライザーおよび方法を提供する。このアナライザ
ーは、特に、平面フローセルに有用であるが、従来の丸いフローサイトメータに
も使用され得る。本アナライザーは、フローセル内の液体フローサンプルを交差
する光ビームを作製するために配置される、偏光源を備える。サンプル内での粒
子による光散乱は、第１および第２広角光散乱チャンネルによって測定され、こ
れは、それぞれ広角θ1およびθ2で散乱光を受容するように配置される。各々の
ＬＡＬＳチャンネルは、光検出器および集光オプティクス（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｐｔｉｃｓ）を備える。偏光または波長フィルターは、ＬＡＬＳ検出チャ
ンネルの一部として要求されない。各々のチャンネルでの散乱強度が得られ、そ
して相対強度は、粒子を分類するために使用される。本発明は、流れる粒子の任
意のタイプで使用され得るが、血球、特に好酸球を算定しそして分類するために
使用される、血液学アナライザーに特に適している。好ましくは、θ1は、約１
５°と約５０°の間であり、さらに好ましくは、約３０°±１０°であり、そし
て最も好ましくは、約３９°±１０°であり、ここでフローセルは、光ビームに
対して斜角に配置される。好ましくは、θ2は、約５０°と約１３０°との間で
あり、さらに好ましくは、約９０°±１５°、または１１５°±１０°であり、
そして最も好ましくは、約７３°±１０°であり、ここでフローセルは、光ビー
ムに対して斜角に配置される。
【０００６】 フローセルは、好ましくは平面であり、光ビームに対してＢｒｅｗｓｔｅｒ角
で配置され、これは、フローセルにおけるガラスおよびプラスチック窓について
は、約５６°である。アナライザーは、さらに小角および前角散乱チャンネルを
備え得、サイズおよび形状に基づいて粒子間の区別をするために使用され得る。
前角光散乱（ＦＬＡＳ）検出器は、好ましくは、約０．５°と約３°との間の角
θFで配置されるが、それは吸収測定のために０°角に配置され得る。ＦＡＬＳ
検出器がレーザー光源を用いる吸収測定に使用される場合、光ビームの強度のた
めに当該分野で公知のようにフィルターが要求される。小角光散乱（ＳＡＬＳ）
検出器は、好ましくは、約２°と約１０°との間である、θFより大きい角θSに
配置される。アナライザーは、吸光化学種（例えば、色素、ヘモグロビン、およ
びビリルビン）を含む粒子を測定するための、吸光チャンネルをさらに備え得る
。この吸光測定は、散乱測定と同じ流れ（ｓｔｒｅａｍ）で、同じまたは異なる
測定帯で、あるいは別個の流れで、実施され得る。この吸光チャンネルは、サン
プル流を照射するために配置される光源、透過光を収集するために配置される集
光オプティクス、および光検出器を備える。集光オプティクスは、波長フィルタ
ーを備え得る。アナライザーは、第２波長フィルターを有する集光オプティクス
および光検出器を備える、第２吸光チャンネルのような、さらなる検出器をさら
に備え得る。アナライザーは、さらに蛍光チャンネルを備え得、これは蛍光検出
器および蛍光集光オプティクスを備える。この蛍光チャンネルは、散乱光源また
は分離光源を利用し得る。
【０００７】 本発明はまた、偏光維持粒子と偏光をなくした粒子を区別する方法を提供し、
この方法は、以下の工程：ｐ−偏光光ビームを通して粒子を流動させる工程；第
１広角θ1での散乱光強度Ｉ（θ1）を測定する工程；第２広角θ2での散乱光強
度Ｉ（θ2）を測定する工程（ここでθ2＞θ1）；およびＩ（θ1）とＩ（θ2）
とを比較して、それによって偏光維持粒子と偏光をなくした粒子とを区別する工
程、を含む。
【０００８】 （発明の詳細な説明） 平面フローセルに対してＢｒｅｗｓｔｅｒ角で配向されるレーザービームを用
いるデュアルＬＡＬＳ検出を備えるアナライザーが、図１に示される。アナライ
ザーは、フローセル１に限定される実施態様において、サンプル流と共に使用さ
れる。アナライザーは、偏光光ビーム１５を指示するための偏光光源１０を備え
、この実施態様においてサンプル流でｐ−偏光である。光ビームがこの流動を衝
突する領域は、散乱測定帯である。光源は、レーザー、好ましくは、Ｈｅ−Ｎｅ
レーザーであり得、またはそれはアークランプのような非レーザー光源であり得
る。それは、レーザーであるかのように、本質的に偏光され得、または外部偏光
器を備え得る。フローセル窓での反射損失を最小化するために、光ビームは、Ｂ
ｒｅｗｓｔｅｒ角θbで、フローセルに対して仮想の法線へ配向される。ガラス
またはプラスチック窓について、θbは約５６°である。
【０００９】 レーザービームが、ビームがセル表面に対して法線であるような、平面フロー
セルにおける入射である場合、内部反射に起因して、約５０°より大きく約１４
０°より小さい散乱角は、受容されない。入射ビームに対してフローセルを傾斜
させることによって、広角での光散乱が検出されることを容易にする。ビームが
Ｂｒｅｗｓｔｅｒ角θbでさらに入射される場合、そしてこの入射レーザービー
ムが面（反射および屈折ビームを含む）に対して平行に偏光される（ｐ−偏光）
場合、界面での反射に起因する損失は、最小化され得る。この角は、フローセル
窓界面からの反射される光量を最小化し、より多いレーザー光がサンプル流と交
差するのを可能にする。この光学的性質を利用するために、光は示されるように
ｐ−偏光される。このことは、光損失、ならびに内部および外部界面での反射を
最小化する要求である。
【００１０】 角配向は、本明細書中で、他に記載されなければ、ビーム１５の伝搬方向に関
係する。ビームはセルによって屈折されるので、散乱測定帯内の伝搬方向は、フ
ローセル前の方向と異なる、ということに留意する。アナライザーは、さらに、
第１ＬＡＬＳ検出器２０および第２ＬＡＬＳ検出器３０を備える。この実施態様
はまた、ＳＡＬＳ検出器５０、およびＳＡＬＳを検出器に向けるＳＡＬＳミラー
５５を備える。それはまた、ＦＡＬＳ検出器４０、およびビーム１５がＦＡＬＳ
検出器に衝突するのを防止するビームブロック４５を備える。光検出器は、好ま
しくはフォトダイオードである。各々の検出器は、検出レンズを使用して、散乱
測定帯と接続され得る。各々の検出チャンネルについてのオプティクスは、典型
的に、光を収集するための１個以上のレンズ、および所望の収集角外の散乱光を
遮断するための視野絞り（ｆｉｅｌｄ ｓｔｏｐ）を備える。本発明のある局面
は、２個のＬＡＬＳ検出器の使用によって、集光オプティクス内に偏光または波
長フィルターを備える必要がない、ということである。ＬＡＬＳ検出器が配置さ
れる角度は、好ましくは第１ＬＡＬＳ検出器２０については約２８°〜約５０°
、そして第２ＬＡＬＳ検出器３０については約６５°と約８１°との間である。
【００１１】 デュアルＬＡＬＳアナライザーは、無顆粒性粒子間の区別をつけるために使用
され得、それらは、１個以上の偏光維持顆粒を有する顆粒性粒子、および１個以
上の偏光をなくした顆粒を有する顆粒性粒子である。用語、粒子は、本明細書中
では、光を反射し得る液体サンプル中に不溶性の任意の化学種について使用され
、そしてこれは、細胞、細胞フラグメント、蛍光ビーズ、細菌および他の生物学
的な粒子、ポリマー、塵、微結晶などを包含する。アナライザーは、特に、リン
パ球識別に適しており、ここで、無顆粒性リンパ球はリンパ球および単球を含み
、偏光維持顆粒性リンパ球は、好中球および好塩基球を含み、そして偏光をなく
した顆粒性リンパ球は好酸球を含む。ＷＢＣ光散乱は、以下のようにモデル化さ
れた。
【００１２】 血球は、３個の部分からなる系として、図２に示されるようにモデル化され、
それは、本明細書中で細胞成分と呼ばれる外部細胞膜および封じ込められる細胞
質、核成分、ならびに顆粒成分である。全ての３個の成分は、Ｍｉｅ散乱分析が
光散乱をモデル化するために使用される得るように、相同の球としてモデル化さ
れた。３個の代表的球の光散乱性質のみを考慮する必要があるように、独立した
粒子散乱（すなわち複数−粒子散乱事象でない）が想定された。全ての膜効果は
無視され、よって大部分の散乱が大量の散乱粒子から生じる。
【００１３】 分子間媒体は、ｎs＝１．３３５で与えられる屈折率を有する生理食塩水（０
．８５％）であるが、分子内媒体は、ｎs＝１．３５の率を有する細胞質、なら
びに核および顆粒物質からなる。生理食塩水および血漿についての指数は、Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｈ．Ｍ．Ｓｈａｐｉｒｏ著、
第３版、１４９頁から得られた。核および顆粒物質は、タンパク質からなり、そ
してこれらの物質の屈折率は、ＲＢＣタンパク質ヘモグロビン後にモデル化され
る。ＲＢＣ屈折率は、波長６６０ｎｍにおいて、ｎ＝１．３８９（Ｐ．Ｗｉｎｇ
−Ｐｏｏｎ Ｃｈｅｕｎｇによる提唱、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓ
ｃａｔｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ Ｏｘｉｍｅｔｒｙ，
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１９７３）である。核お
よび顆粒屈折指数は、それゆえ、ｎs、ｎg＝１．３８９である。図２は、使用さ
れるモデルおよび粒子寸法を示す。この入射光の波長は、λ＝６８５ｎｍが用い
られる。
【００１４】 このモデルにおいて、複屈折−誘起散乱が、好酸球についてのみ起こり、そし
てｓ−およびｐ−偏光光の同等の成分への入射ｐ−偏光光の偏光を解消すること
が起ると想定された。次いで、Ｍｉｅ散乱計算は、これらの成分の散乱の角分布
を決定するために、使用された。本明細書中でＷＢＣについて想定された複屈折
の程度は、正確であるという意味でなく、そしてデュアルＬＡＬＳアプローチの
基礎をなす原理を論証するために選択された。
【００１５】 デュアルＬＡＬＳモデルからの結果は、図３、４、および５で示され、それは
、３個の細胞成分のそれぞれについての計算されたＭｉｅ散乱を示す。これらの
図は、多くの広角散乱、および広角での偏光に対する感度が、顆粒に起因すると
いうことを示唆する。このため、このモデルの目的に対して、顆粒性質のみが広
角でのＷＢＣ散乱を表すために使用された。表１は、ｓ−偏光、ｐ−偏光、およ
び偏光をなくした（等価の、ｓ−偏光およびｐ−偏光）光に対して、構成される
光学構成の特徴的な、両方の広角おけるＬＡＬＳ強度を示す。好酸球は、それら
の複屈折の顆粒と共に、光が偏光がなくされた光であるかのように挙動すると仮
定される。これは、複屈折および散乱機構はデカップルされ得る、すなわち複屈
折は次いで散乱される新しい入射光を作ることを仮定する。非顆粒球（すなわち
リンパ球および単球）は、これらの細胞内に顆粒が存在しないことに起因して、
表１中のものよりも弱い散乱強度を有する。
【００１６】
【表１】 表１によって示唆される計算散乱プロットは、図６に示され、好酸球が残余で
ある白血球から区別され得る方法を実証する。プロット内の散乱は、細胞内の顆
粒の数およびサイズにおける非均質性によって生じる。この散乱プロットの形状
は、単に可能な形状の表示に過ぎない。本発明の粒子を区別する方法において、
２個のＬＡＬＳ強度は比較され、そして粒子は、図６中のように計算されたまた
は測定されたデータに基づいて、タイプを指定される。図によって示唆されるよ
うに、２個の強度の割合は、粒子を指定するときに使用され得る、特性である。
【００１７】 図３〜５に示される計算結果は、ＬＡＬＳ検出器について角を選択するために
使用され得る。図５に示されるように、顆粒からの散乱は、約１５°より大きい
ところで偏光−感応性となり、そして最大差異は９０°で生じる。図５を図３お
よび４と比較すると、約１５°より大きいところでの顆粒散乱は、細胞および核
散乱よりも優勢である。顆粒を同定するために、約１５°より大きい散乱角が選
択される。さらに偏光をなくした顆粒を区別するために、ｓ−偏光およびｐ−偏
光の散乱において明らかな差異がある第２角でもまた、散乱が測定される。確立
された実施態様において、ＬＡＬＳ検出器は、θ1＝３９°およびθ2＝７３°に
配置された。
【００１８】 用語、広角光散乱は、本明細書中で、顆粒散乱が優勢である角での散乱につい
て、使用され、一般的に約１５°より大きい。本発明のアナライザーにおいて、
２個のＬＡＬＳ検出器は、異なる広角にある。図５に示唆されるように、第１は
約１５°と５０°との間に配置され、そして第２は約５０°と１３０°との間に
配置される。偏光をなくした粒子の最適な識別のために、検出器は約３０°±１
０°および９０°±１５°にある。好ましくは、ＬＡＬＳ検出器は、光ビームに
対して斜角に配置される。検出器配置における第２の考慮は、組み立ての易さで
ある。角度をつけたフローセルを有する図１の実施態様において、ＬＡＬＳ検出
器は、光散乱をθ1＝３９°±１０°およびθ2＝７３°±１０°の角で、最も都
合よく適応し得る。
【００１９】 デュアルＬＡＬＳ検出器に加えて、本発明のアナライザーは、ＳＬＡＳ検出器
およびＦＡＬＳ検出器を備え得る。本明細書中で使用される用語ＦＡＬＳは、主
に粒子をカウントするために使用され得る角度で散乱される光のことを言う。Ｆ
ＡＬＳ角における低い方の限界は、入射ビームの形状およびサイズによって決定
される。ＦＡＬＳ検出器は、入射光が直接検出器に衝突するのを妨げるために、
覆設バー（ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ ｂａｒ）のような、ビームストップによっ
て先行される。ＦＡＬＳ角は、吸光および粒子サイズを測定するのを可能にする
角であり、そして好ましくは、約０°と約３°との間、より好ましくは約０．５
°および約３°の間である。用語ＳＡＬＳは、主に顆粒と無顆粒性粒子とを区別
するためにＦＡＬＳシグナルと組み合わせて使用され得る、角度に対して本明細
書中で使用される。ＳＡＬＳ角は、その光散乱性質によって示されるような、粒
子の内部構造に関する情報を提供する角であり、ＦＡＬＳ角よりも大きく、そし
て好ましくは約２°と約１０°との間である。
【００２０】 デュアルＬＡＬＳアナライザーはまた、サンプルが蛍光染料で標識されている
場合、あるいはそれが蛍光ビーズまたは他の蛍光粒子を含有する場合の使用のた
めの蛍光測定を備える得る。蛍光励起に対して、アナライザーは、光散乱光源を
使用し得るか、または代替に分離光源を備え得る。蛍光励起に対する好ましい光
源は、レーザー、特にアルゴンイオンレーザーである。蛍光励起は、散乱測定帯
において、またはサンプル流の異なる領域で、生じ得る。蛍光測定は、散乱測定
と同一のサンプル流、または分離流を使用し得る。蛍光は、散乱光を避けるため
に広角で、好ましくは約３０°より大きい角度で検出される。検出器の前の波長
フィルターは、さらに蛍光を散乱光から分離するために使用され得る。蛍光検出
器は、集光オプティクスをＬＡＬＳ検出器の１つで共用し得、そして収集レンズ
が続き、光は波長感応性ビームスプリッターで分離され得る。
【００２１】 アナライザーはまた、染料で標識された細胞、あるいはヘモグロビンまたはビ
リルビンを有する細胞のような、吸光粒子と共に使用するための、吸光測定を含
み得る。蛍光測定に関して、吸光測定は、散乱測定と同じまたは異なる光源を使
用し得、そしてそれは、同じまたは異なるフロー域に配置される。好ましい光源
は、ＬＥＤ（複数）を備える。吸光は、光源からのサンプル流の反対側に配置さ
れる検出器を用いて測定される。実用の構成を考慮すると、吸光測定は、好まし
くは、分離フロー域で、分離検出チャンネルおよび散乱からの光源を用いて、実
施され、そのため両方のＦＡＬＳおよびＳＡＬＳ検出器が、吸光検出器と同様に
、収納され得る。検出器は、吸光バンドを選択するために波長フィルターによっ
て先行され得る。１個以上の検出器は、それぞれ異なる波長フィルターを有し、
利用され得る。
【００２２】 図７は、２個の広角光散乱検出器、前方角光散乱検出器、小角光散乱検出器、
および吸光測定手段を有する、アナライザーの実施態様の概略を示す。レーザー
１０は、散乱測定のための光源のために使用される。光ビーム１５は、第１焦点
レンズ１１および第２焦点レンズ１３を使用して焦点を合わせられ、そしてミラ
ー１４によってセル１内のサンプル流に方向づけられる。光ビームは、反射性お
よび透過性の両方である材料を備える部材（例えばカバースリップ１６およびフ
ォトダイオード１９）によって、部分的に反射される。フォトダイオード１９は
、フォトダイオードレンズ１７およびフォトダイオード視野絞り１８によって先
行される（レーザーパワーのモニタリングのため）。レーザービームは、光散乱
測定帯を規定するために、セル１内のサンプル流を遮断する。散乱光は、２個の
広角で収集される。第１の広角で、光は第１ＬＡＬＳレンズ２２によって収集さ
れ、そして第１ＬＡＬＳ検出器２０によって検出され、これは第１ＬＡＬＳ視野
絞り２１によって先行される。第２広角で、光は第２ＬＡＬＳレンズ３２によっ
て収集され、そして第２ＬＡＬＳ検出器３０によって検出され、これは第２ＬＡ
ＬＳ視野絞り３１によって先行される。小角散乱は、ＳＡＬＳレンズ５２と組み
合わせてＳＡＬＳ／ＦＡＬＳレンズ５３によって収集され、そしてＳＡＬＳ検出
器５０によって検出され、これはＳＡＬＳ視野絞り５１によって先行される。そ
れは、ミラー５５によってＳＡＬＳ検出器５０へ向けられる。前方角散乱は、Ｆ
ＡＬＳレンズ４２と組み合わせてＳＡＬＳ／ＦＡＬＳレンズ５３によって収集さ
れ、そしてＦＡＬＳ検出器４０によって検出され、これはＦＡＬＳ視野絞り４１
によって先行される。ミラー５５は、ミラー５５は、前方角散乱光の透過を可能
にするために、中央に穴を有する。ビームブロック（覆設バー）４５は、レーザ
ービームが直接ＦＡＬＳ検出器４０に当たるのを妨げる。サンプル吸光は、光散
乱測定帯からのサンプル流の異なる位置において測定される。ＬＥＤ６０からの
光は、ＬＥＤ視野絞り６１と組み合わせてＬＥＤレンズ６２によって焦点を合わ
されるが、吸光測定帯を規定するためにフローセル１を遮断する。ビーム−スプ
リッティングミラー７４は、第１吸光検出器７０へのいくらかの光を透過し、そ
して残りを第２吸光検出器８０へ反射する。第１吸光検出器７０は、フィルター
７３（これは光の第１波長を選択する）、吸光レンズ７２および吸光視野絞り７
１を組み合わせて、使用される。第２吸光検出器８０は、フィルター８３（これ
は光の第２波長を選択する）、ＬＥＤレンズ８２およびＬＥＤ視野絞り８１を組
み合わせて、使用される。
【００２３】 （実施例） 流体力学的集束が組み込まれるミクロ流体積層ベース（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ
ｉｃ ｌａｍｉｎａｔｅ−ｂａｓｅｄ）構造、および１ｍｍよりずっと小さい寸
法を有するフローチャンネルは、血液サンプルを運搬しそして分析するために、
製作して使用した。フローチャンネルに必須の光学的に透明な窓は、きつく集束
させたダイオードレーザープローブビームを用いて、サンプル流を遮断するため
に使用した。レーザービームを通って通過する血液細胞のサイズおよび構造は、
発生する散乱光の強度および方向性分散（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｔｒ
ｉｂｕｔｉｏｎ）を決定した。前方および小角度光散乱チャンネルは、血小板、
赤血球、および白血球の種々の集団を数えて区別するために使用した。使用した
全ての血液サンプルは、比較および確認の目的で、市販の血液学アナライザーを
用いて特徴づけた。
【００２４】 上述の方法で、血液細胞を数えて分類するために、細胞は、入射レーザービー
ムを通り１個ずづ通過するように作成されなければならない。慣用的には、これ
は、流体力学集束によってなされ（ここで血液細胞サンプル流が取り囲まれ、そ
して適切な割合でシース流体流（ｆｌｕｉｄ ｓｔｒｅａｍ）と結合する）、そ
して両方の流体は、テーパー状のオリフィスまたはフローチャンネルを通過する
ように作成される。シース流体を流動させて狭窄する流体力学的力に次いで、サ
ンプル流が細胞を流動する狭いスレッドを形成するようにする。
【００２５】 ミクロ流体構造は、シース流体の必要なしに、血液細胞を非常に狭く精密に形
成されたチャンネル内に、空間的に封じこめるために使用され得る。しかし、こ
のようなミクロ構造は、発生する剪断応力に起因して、高い流速には典型的に対
応し得ない。本発明中で使用されるミクロサイトメーター（ｍｉｃｒｏｃｙｔｏ
ｍｅｔｅｒ）は、意図したアッセイに対して適切な寸法のミクロチャンネル内に
、サンプルとシース流両方を封じ込める。
【００２６】 全ての実施態様は、米国特許第０８／８２３，７４７号（１９９７年３月２６
日出願）、および同第０９／０８０，６９１号（１９９８年５月１８日出願）（
これらを本明細書と相反しない程度に参照として本明細書中で援用した）に記載
のように、Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｒｅｄｍｏｎｄ ワシントン州によっ
て製造された積層ベース平面ミクロ構造において実施した。あるこのような装置
は、１００μ厚の接着層（この中へフローチャンネルは切断される）で隔てられ
る２個の薄いガラス窓を備えられる。この装置は、１面内にのみサンプル流の集
束を作製し、そしてそのため、本明細書中で、２−Ｄフローセルとして呼ばれる
。集束したセル流を含むチャンネルの断面寸法は、１ｍｍで１００μであった。
第２構造は、ＭｙｌａｒおよびＭｙｌａｒ−積層シート（３Ｍ、Ａｕｓｔｉｎ、
テキサス州）から形成した。ＣＯ2レーザーシステムを用いて、チャンネルを切
断した（ＵＬＳ−２５Ｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、
Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ アリゾナ州）。この装置は、シース流体流でサンプル流
を完全に取り囲むことによって、サンプル流の集束を形成し、そして本明細書中
で３−Ｄフローセルとして呼ばれる。この装置内に集束させたセル流を含むチャ
ンネルの断面寸法は、５００μで１００μであった。２個のコンピュータ制御シ
リンジポンプからなるカスタム制御ステーション（Ｋｌｏｅｈｎ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ，Ｌｔｄ．，Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ ネバダ州）を、ミクロ構造内の一定のシー
スおよびサンプル流速を提供するために使用した。サンプル流速は、２−Ｄフロ
ーセル内で９５ｎｌ／ｓであり、そして３−Ｄフローセル内で４００ｎｌ／ｓで
あった。９ｍｗ、６８５ｎｍ波長ダイオードレーザーモジュール（Ｍｅｌｌｅｓ
Ｇｒｉｏｔ、Ｂｏｕｌｄｅｒ コロラド州）を、これはほぼ円形の視準化した
４ｍｍ直径ビームを生成するが、光源として使用した。レーザービームは、サン
プル流で１０５μで１３μの伝搬の方向に垂直である寸法を有する、集束された
楕円ビームを生成するために、２個の交差する円柱形レンズを通過した。２個の
高速狭式走査フォトダイオード検出器（Ｃｅｎｔｒｏ Ｖｉｓｉｏｎ、Ｎｅｗｂ
ｕｒｙ Ｐａｒｋ カリフォルニア州）を、ＦＡＬＳ（１．４°〜２．２°）お
よびＳＡＬＳ（２．２°〜８．４°）シグナルを収集するために使用した。覆設
バーを、ダイレクトレーザービームが検出器に当たることを防ぐために使用し、
そして３個のレンズおよび中央開口（穴）を有するカスタムミラーを、検出器へ
散乱光を向けるために使用した。電子シグナルを、２−Ｄフローセルを使用する
場合、ＡＴ−ＭＩＯ−１６Ｅ−１データ収集ボード（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ テキサス州）を用いて、そして３−Ｄフロー
セルを使用する場合、カスタム高速データ収集システムを用いて、収集した。
【００２７】 全ての血液サンプル（ヒト）は、抗凝固因子ＥＤＴＡを含有するバキュテイナ
ー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ニュ
ージャージー州）チューブを用いて収集し、予備的処理をし、そして希釈した。
ＲＢＣおよび血小板アッセイに対して、サンプルのリン酸塩緩衝生理食塩水での
希釈を、外部手動混合によって行い、そしてフローシステムへ導入した。白血球
アッセイに対して、血液サンプルを市販の軟溶解試薬（ｓｏｆｔ ｌｙｓｉｎｇ
ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｓｔｒｅｃｋ−Ｓｈｅａｔｈ、Ｓｔｒｅｃｋ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｍａｈａ ニューイングランド州）で外部混合し、そして、
装置に導入した。両方の場合における混合と分析との間の時間は、白血球の過剰
溶解、またはＲＢＣおよび血小板の浸透歪みを避けるために、最小値に保持され
る。全ての最初のサンプルのアリコート、ならびに可能であるところの混合され
て希釈されたサンプルのアリコートを、比較およびコントロールの目的で、市販
の血液学アナライザー（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ３５００Ｒ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ，イリノイ州）を用いて分析した。
【００２８】 図８は、１：４００で予め希釈した全血サンプルおよび２−Ｄフローセルを使
用して得られた結果を示す。ＳＡＬＳ光散乱パルス振幅のヒストグラムは、血小
板およびＲＢＣに対応する生物様式（ｂｉｏｍｏｄａｌ）の分布を示唆する。各
々のピーク下の面積の積分を、サンプル内のＲＢＣおよび血小板の相対百分率を
決定するために使用した。３個のさらなるサンプルから得られたデータに関する
これらの結果を、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ３５００Ｒを使用して得られたＲＢＣおよび
血小板の百分率に対して、図９にプロットした。図９は、２個の方法間の良い相
関を示唆する。
【００２９】 図１０は、市販の軟溶解剤中で１：５０で希釈した全血サンプルを使用して得
られた結果、ならびにＦＡＬＳおよびＳＡＬＳデータの２−Ｄヒストグラム形式
での３−Ｄフローセルを示す。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ３５００Ｒによる同じサンプル
のアリコートの分析が図１１に示される。各々のプロットにおける３個の主要ク
ラスターは、リンパ球（Ｌ）、単球（Ｍ）、および顆粒球（Ｇ）に対応する。ミ
クロサイトメーターおよび市販のアナライザーは、同程度のクラスター解像度を
作製する。ミクロサイトメーターを用いて得られる相対セルカウント（総白血球
カウントに対して）は、２７．０％（Ｌ）、９．３１％（Ｍ）、および６３．７
％（Ｇ）であり、それらはまた、２６．９％（Ｌ）、９．６８％（Ｍ）、および
６３．４％（Ｇ）のＣｅｌｌ−Ｄｙｎ百分率とよく一致する。
【００３０】 図１２は、装置性能を較正および検査するために使用された２．０および４．
５μのミクロスフェアを含有するフローサンプルに対する、広角光散乱データを
示す。
【００３１】 ミクロサイトメーターおよび本明細書中で記載される方法は、血小板、ＲＢＣ
、種々の白血球集団、および他の粒子を、層状のフロー−ベースミクロ流体フロ
ーチャンネルおよび光散乱オプティクスによって、数えそして分類する能力を証
明した。
【００３２】 本発明は、特定の成分に関して記載され、そして例示された；しかし、当業者
によって認識されるように、他の等価の成分は本明細書で記載したものと置きか
えられ得る。例えば、ＬＡＬＳおよび他の検出器は、吸光、蛍光、または他のシ
グナル、ならびにレーザー源からの散乱光を検出するために、使用され得、そし
て複合（２個以上）ＬＡＬＳ検出器が使用され得る。さらなるＳＡＬＳおよびＦ
ＡＬＳ検出器はまた、さらなる情報を収集するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、複合ＬＡＬＳ検出器を利用するアナライザーである。
【図２】 図２は、Ｍｉｅ散乱計算ために使用される白血球モデルである。
【図３】 図３は、モデル化白血球の外部細胞膜および細胞質に対する、散乱角関数とし
ての、計算散乱強度である。
【図４】 図４は、モデル化白血球の核に対する、散乱角関数としての、計算散乱強度で
ある。
【図５】 図５は、モデル化白血球内の顆粒に対する、散乱角関数としての、計算散乱強
度である。
【図６】 図６は、（Ａ）無顆粒性白血球、（Ｂ）偏光維持顆粒を有する顆粒性白血球、
および（Ｃ）偏光をなくした複屈折顆粒を有する顆粒性白血球に対する、計算散
乱プロットである。
【図７】 図７は、複合ＬＡＬＳ、ＳＡＬＳ、ＦＡＬＳおよび吸光検出を有するアナライ
ザーである。
【図８】 図８は、赤血球および血小板に対する、小角光散乱パルス振幅をプロットする
。
【図９】 図９は、本発明の方法を使用して決定される赤血球および血小板測定の結果を
、市販の血液学アナライザーを使用する結果と比較する。
【図１０】 図１０は、１：５０に希釈された全血サンプルからのＦＡＬＳおよびＳＡＬＳ
データの２−Ｄヒストグラムであり、これは、リンパ球（Ｌ）、単球（Ｍ）、お
よび顆粒球（Ｇ）を示す。
【図１１】 図１１は、市販の血液学アナライザーを使用する図１０のサンプルの分析を示
す。
【図１２】 図１２は、２．０および４．５μミクロスフェアについての、広角光散乱デー
タを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｆ 33/49 33/49 Ｈ Ｆターム(参考） 2G043 AA06 BA16 DA02 DA05 DA06 EA01 EA13 EA14 GA07 GB19 HA01 HA02 HA09 JA02 KA02 KA05 KA09 LA01 2G045 AA03 AA25 CA11 CA25 FA11 FA12 FA37 GC10 GC11 2G057 AA01 AA02 AA04 AB04 AB06 AB07 AC01 BA05 2G059 AA01 AA10 BB04 BB13 CC16 DD12 DD13 EE01 EE02 EE05 EE07 EE11 FF12 GG01 GG03 GG10 HH02 JJ11 JJ13 JJ22 KK01 KK03

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 光学アナライザーであり、以下： サンプル流を交差する光ビームを作製するために配置されたｐ−偏光源（該交
    差は散乱測定帯を定義する）； 第１角θ1で該散乱測定帯から散乱された光を受容するために配置される、第
    １角光散乱光検出器；および 第２角θ2（ここでθ2＞θ1）で該散乱測定帯から散乱された光を受容するた
    めに配置される、第２広角光散乱光検出器 を備える、光学アナライザー。
  2. 【請求項２】 θ2は約５０°と１３０°との間であり、そしてθ1が約１５
    °と５０°との間である、請求項１に記載のアナライザー。
  3. 【請求項３】 θ2が約９０°±１５°である、請求項２に記載のアナライ
    ザー。
  4. 【請求項４】 θ1が約３０°±１０°である、請求項３に記載のアナライ
    ザー。
  5. 【請求項５】 請求項２に記載のアナライザーであって、前記サンプル流が
    、前記光ビームに関して斜角で配置されるサンプルフローセル内に収容され、こ
    こでθ2が約７３°±１０°であり、そしてθ1が約３９°±１０°である、アナ
    ライザー。
  6. 【請求項６】 前記サンプル流が、前記光ビームに関してＢｒｅｗｓｔｅｒ
    角で配置されるサンプルフローセル内に収容される、請求項１に記載のアナライ
    ザー。
  7. 【請求項７】 前記第１および第２光検出器内へカップリング散乱光のため
    の第１および第２集光オプティクス（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｐｔｉｃｓ）を
    さらに備える、請求項１に記載のアナライザー。
  8. 【請求項８】 前記第１または前記第２集光オプティクスのどちらも偏光フ
    ィルターを備えていない、請求項７に記載のアナライザー。
  9. 【請求項９】 前記第１または前記第２集光オプティクスのどちらも波長フ
    ィルターを備えていない、請求項８に記載のアナライザー。
  10. 【請求項１０】 角θFで前記散乱測定帯から散乱される光を受容するため
    に配置される、前部角光散乱光検出器をさらに備える、請求項１に記載のアナラ
    イザー。
  11. 【請求項１１】 角θS（ここでθF＜θS）で前記散乱測定帯から散乱され
    る光を受容するために配置される、小角光散乱光検出器をさらに備える、請求項
    １０に記載のアナライザー。
  12. 【請求項１２】 θsが約２°と１０°との間であり、そしてθFが約０°と
    約３°との間である、請求項１１に記載のアナライザー。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載のアナライザーであって、サンプル流を照
    射するために配置される吸収光源ビームを放射する吸収光源（該吸収光源ビーム
    および該サンプル流の交差は、吸収測定帯を定義する）、ならびに該吸収測定帯
    を通して透過される光を受容するために配置される第１吸収光検出器、をさらに
    備える、アナライザー。
  14. 【請求項１４】 前記吸収測定帯を通して透過された光を受容するために配
    置される、第２吸収光検出器をさらに備える、請求項１３に記載のアナライザー
    。
  15. 【請求項１５】 前記散乱測定帯からの蛍光を受容するために配置される、
    蛍光光検出器をさらに備える、請求項１に記載のアナライザー。
  16. 【請求項１６】 偏光−維持粒子と偏光をなくした粒子とを区別するための
    方法であって、以下の工程： ｐ−偏光した光ビームを通して該粒子を流す工程； 第１広角θ1で散乱される光強度Ｉ（θ1）を測定する工程； 第２広角θ2で散乱される光強度Ｉ（θ2）を測定する工程（ここでθ2＞θ1）
    ；および Ｉ（θ1）とＩ（θ2）とを比較し、それによって偏光維持粒子と偏光をなくし
    た粒子とを区別する工程を含む、方法。
  17. 【請求項１７】 光学アナライザーであって、以下： サンプル流を交差する光ビームを作製するために配置された偏光光源（該交差
    は、散乱測定帯を定義する）； 本質的に以下からなる広角光散乱光検出器： 第１角θ1で該散乱測定帯から散乱される光を受容するために配置される、
    第１広角光散乱光検出器；および 第２角θ2（ここでθ2＞θ1）で該散乱測定帯から散乱される光を受容する
    ために配置される、第２広角光散乱光検出器 を備える、光学アナライザー。
  18. 【請求項１８】 θ2が約５０°と１３０°との間であり、そしてθ1が約１
    ５°と５０°との間である、請求項１７に記載のアナライザー。
  19. 【請求項１９】 θ2が約９０°±１５°である、請求項１７に記載のアナ
    ライザー。
  20. 【請求項２０】 θ1が約３０°±１０°である、請求項１７に記載のアナ
    ライザー。
  21. 【請求項２１】 請求項１７に記載のアナライザーであって、前記サンプル
    流が、前記光ビームに関する斜角で配置されるサンプルフローセル内に収容され
    、ここでθ2が約７３°±１０°であり、そしてθ1が約３９°±１０°である、
    アナライザー。
  22. 【請求項２２】 請求項１７に記載のアナライザーであって、前記サンプル
    流が、前記光ビームに関してＢｒｅｗｓｔｅｒ角で配置されるサンプルフローセ
    ル内に収容される、アナライザー。
  23. 【請求項２３】 前記第１および第２光検出器内へカップリング散乱光のた
    めの第１および第２集光オプティクスをさらに含む、請求項１７に記載のアナラ
    イザー。
  24. 【請求項２４】 前記第１または前記第２集光オプティクスのどちらも偏光
    フィルターを備えていない、請求項２３に記載のアナライザー。
  25. 【請求項２５】 前記第１または前記第２集光オプティクスのどちらも波長
    フィルターを備ていない、請求項２４に記載のアナライザー。
  26. 【請求項２６】 角θFで前記散乱測定帯から散乱される光を受容するため
    に配置される、前部角光散乱光検出器をさらに備える、請求項１７に記載のアナ
    ライザー。
  27. 【請求項２７】 角θS（ここでθF＜θS）で前記散乱測定帯から散乱され
    る光を受容するために配置される、小角光散乱光検出器をさらに備える、請求項
    ２６に記載のアナライザー。
  28. 【請求項２８】 前記θsが約２°と１０°との間であり、そしてθFが約０
    °と約３°との間である、請求項２７に記載のアナライザー。
  29. 【請求項２９】 請求項１７に記載のアナライザーであって、サンプル流を
    照射するために配置される吸収光源ビームを放射する吸収光源（該吸収光源ビー
    ムおよび該サンプル流の交差は、吸収測定帯を定義する）、ならびに該吸収測定
    帯を通して透過される光を受容するために配置される第１吸収光検出器、を備え
    る、アナライザー。
  30. 【請求項３０】 前記吸収測定帯を通して透過された光を受容するために配
    置される、第２吸収光検出器を本質的にさらに含む、請求項２９に記載のアナラ
    イザー。
  31. 【請求項３１】 前記散乱測定帯からの蛍光を受容するために配置される、
    蛍光光検出器をさらに備える、請求項１７に記載のアナライザー。
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