JPS61221633A - フローサイトメータ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は流体試料が流れるフローチャンネル？有し光学
的に透明なフローセル及びこれ４具備し上記試料の分析
測定？なすためのフローサイトメータに関するものであ
る。

本発明によるフローセル及びフローサイトメータは例え
ば臨床検査の分野において検体面数中の血球等有形成分
？光学的に分類測定する際にきわめて有益である。

従来の技術 版体または懸ＩＷｊ１ｇ試料がシース液に現まねてフロ
ーチャンネル内？流れこのチャンネルの一部に元？入射
し得るようにしたフローセルは、特に光学的粒子検出技
術において粒子径（または容積）情報？専ら散乱光によ
り与えろ、しかし、この散乱光自体はフローセルからの
挟角前方散乱光に近い光？受光して測定されるため、光
強度が本来比較的微弱であり、その反面励起光光源の光
強度？より大きくしたり広口径のレンズ？用いて大きな
立体角でフローセルに励起光馨入射してやる必要があっ
た。このため、フローセルの試料透過光やき光を遮断し
て、所要の散乱光のみ？受光し得るようにマスクまたは
遮蔽板（レンズビームストッパ）を光路に介在させろが
、励起光の立体角が大きいことに対応してマスクも大き
くなり挟角牧乱光の相当部分乞遮断してしまうのみなら
ず、フローセルの散乱光出射境界面で散乱光が反射され
て損失が大きくなり、こうして粒子径に関する散乱光情
報の悄細な、換言すれは粒径の高分解能測定が不可能で
あった。すなわち、従来のフローセルに関する第７図に
示すごとく、励起光の光軸に対してフローセル８０の出
射面はこれまで直交しており１反射元が散乱光ロス１６
０としてセル外に散逸し集光レンズ９０に到達しないこ
と、さらに前方散乱光の大部分が励起光？遮断する際に
太ぎな遮蔽板１００に遮ぎられて集光レンズ９０の光路
に入っていかないことに照応する難点であった。

もつとも拡散の小さい事実上平行なレーザビームを励起
光源とした場合、遮蔽板１００は小さくてもよく励起光
強度も大きくしやすいが、フローセル８０の出射境界面
の反射による散乱光損失も同様に大きいことは第６図よ
り明らかである。

上述したフローサイトメータは、細胞や各種粒子の有力
な分析手段となり、特に血液試料に関しては螢光染色し
た血球の放出する螢光の水平・垂直方向の異方性比を測
定するもの（特開昭５９−１０２１３９号）、細胞の螢
光強度分布より細胞の分類計数を行うもの（特公昭５４
−１４９５７号）。

細胞の螢光染色試薬として網状赤血球に対する選択性の
強いチオフラビンＴ’に用いるもの（特開昭５９−１４
２４６５号）、レーザ光源乞用い螢光と散乱光馨同時測
光して網状赤血球を同定計数するもの（米国特許第４，
５２５，７０６号）などが挙げられろ。これらのうち、
前二者は螢光強度の測定のみ乞行っているのに対し、後
二者は散乱光強度も螢光と同時に測定し各細胞の同定精
度？高めようとしている。レーザ光源？用いた場合、発
光波長が牟−であるため励起光源の波長幅２広げようと
すれば複数のレーザ？組み込むなど複雑な光学系乞構成
しなければならず、ある程度の光源波長幅が得られても
励起によって放出されろ螢光波長が特定され、多種類の
細胞の微妙な螢光強度差による応答が検出しにくくなり
一般的に多棟の細胞分類が難しいという問題がある。

水銀アークランプまたはキセノンアークランプは単一の
光源でもそれ自体が広い励起光波長範囲（２５０〜６３
０ｎｍ）を有し、フィルタ？多数段けかつ細胞別に複数
の染料を組合せれば多棟の螢光波長の同時検出により多
種の細胞分類が可能となる。しかしながら、前述し第７
図に示したように微弱な散乱光強度の同時検出はそのフ
ローセル境界面の反射損失が大きく事実上困難であり、
このため粒子径による異種粒子の弁別に細孔通過時の導
′亀率測定馨併行するかたちでランプ光源乞用いろとい
う光学的−電気的測定の組合せが必要であった（上場米
国特許第４，３２５，７０６号）。

本発明は、上記の問題点にかんがみ構想され実［’れた
もので、牟−のアークランプ光源で散乱光及び多種の螢
光波長を同時に測定することができこれによって赤＋ｔ
ｎ球、血小板、白血球の別は勿論、幼若（網状）赤面球
、成熟赤血球等の弁別？同時に可能となし得るフローセ
ル及びこれ？具備し臨床検査装置として好適なフローサ
イトメータ？提供することを目的とするものである。

問題点乞解決するための手段 本発明は上記の目的？達成するため、シース液が試料液
体の流れ２層流状に包み込んでフローチャンネル？流動
する際に励起光の光軸に対して事実上直交する励起光入
射面と、フローチャンネルに入射して光学的に刺激した
電域より放出されろ散乱光の出射面と乞、鋭角的に交差
せしめ得るフローセル馨具体化したものである。このフ
ローセルは、励起用光源と、励起光の元軸に対して事実
上１百交する励起光入射面と光学的刺激域から放出ねる
＃！１．乱光の測光光学系と、光学的刺隊域から放出さ
起６螢光の測光光学系とによって螢光−散乱光を同時測
定するフローサイトメータ？構成することができろ。こ
のフローサイトメータの励起用光源は水銀アークランプ
あるいはキセノンアークランプであってよい。また、フ
ローセルの横断面形状は、事実上中心部に微小孔からな
るフローチャンネル？貫設し励起光が入射して試料の光
学的応答ｆｆ：取出し得る少なくとも刺敏域の部分につ
いては三角形またはこれに近い形乞していることが好都
合であるっなお、上記フローセルのシース液おヨヒ試料
液入口、出口については元の入出射に無関係となるので
他の適宜形状であって差支えない。特に、シース敵およ
び試料液入口は、肢体？層流状態？保ちながら微小孔か
らなるフローチャンネルに移動させるためにこのフロー
チャンネルの口径よりも大きな直径の円孔を形成し得る
半球形状等にされていてよい。さらに、光学的刺激域乞
有するフローセル人出射面については、この入出射（８
）からフローチャンネルの微小孔までの距離？小さくす
る。すなわちフローセル構成材料の厚み馨薄くすること
が望ましい、試料液または粒子の分散媒が水などの場合
、フローセルの構成材料をガラスにすれば両者の屈折率
がほぼ近似しているので、微小孔とフローセル面との境
界におけろ光反射または屈折の影響が冶んど無祝し得る
程度であることは言５までもない。

上記の９口き、フローセルの励起光入出射面？鋭角的に
交差させた光学素子乞組込んだフローサイトメータは、
アークランプ光源からの選択された波長の励起光？フロ
ーセルに入射し、光学的刺徹域から出射した後方螢光お
よび前方の挟角散乱光？それぞれ測光しデータ？解析す
るように構成することにより、血球分類測定装置などに
利用し得る。この場合、前方散乱光と同時に粒子の寸法
情報を得るため側方散乱光ケ測光しデータ解析に用いる
ようにした１ｍ球分類測定装置も製作することができる
。

本発明によるフローセルはフローセル８の入射面？励起
光光軸とほぼ直角に、また出射面が入射面に対して鋭角
乞なすように交差して構成されるつ７０−チ’ｒンネル
に集束された励起光は遮蔽板１０で遮断し、Ｗ！Ｌａ光
馨集光レンズ９で受光する（第８図）。シース液および
試料液入口５０がほぼ半球状部からなる図示の三角フロ
ーセル８（家、励起光の人出射面の部分の横断面が三角
形乞している。

フローチャンネル４０はこの三角形の部分２貫通する微
小孔からなっている。（第９図）三角フローセル８馨光
路に配置したフローサイトメータは第１図に示すように
、水銀またはキセノン等のアークランプ光源１．コール
ドミラー６、励起光波長選択フィルタ４、スリット？穿
設したスリット板５．ダイクロイックミラー６、このダ
イクロイックミラー６の背後に設けた励起光モニタ１６
、三角フロ−セル８０入射前面に設けた集光レンズ７、
三角フローセル８の出射面後方の遮蔽板１０゜集光レン
ズ９、散乱光から迷光等馨カットするピンホール板１１
．散乱光受光部１２、ダイクロイックミラー６を透過し
た螢光に対するピンホール板１６．受光用フィルタ１４
．螢光受光部１５゜さらに散乱光受光部１２．螢光受光
部１５および励起光モニタ１６からのそれぞれの光強度
信号？データとして記憶し解析するデータ解析部２０馨
備えてなるものである。

作用 上記のフローセルおよびフローサイトメータは次のよう
に作用する。

三角フローセル８の励起光入射面が励起光光軸に直交し
てひると、集束された励起光束はフロ−セル８中央部の
フローチャンネル４０に到達した後、前方散乱光１８に
ついてはその伏角散乱光が出射面から集光レンズ９？経
て受光系に進むが。

この時フローセル８の出射面は挟角散乱光の光軸に対し
て比較的直角に近い角度？なしており、このためフロー
セル８の構成材料内部から出射境界向に当たって反射′
され受光系から外れていく挟角散乱光の損失６０は極め
て少なくなる。励起光の光軸に対して直角方向の側方散
乱光２０乞受光する場合（第５図）、フローセル８の側
方散乱光出射面？励起元元軸とほぼ平行になるように配
置すれば、側方散乱光の損失は最小になり微小粒子の散
乱状況も受光データとして入手できるっフローセル８の
透過光（前方）は迷光と共に遮蔽板１０がカットする。

フローセル８に入射されろ励起光１７は光源１の発光波
長から特定の波長域に綬ろため励起光波長選択フィルタ
４乞透過させスリット５で点光源にした後、グイクロイ
ックミラー６で吸光波長に達しない波長光を反射し吸光
波長？超えろ波長光？透過させて二分割する。ダイクロ
イックミラー乙の透過光は励起光モニタ１６に達し、こ
こでフローセル８に入射すべき励起光強度馨調節して最
適光量が設定される。

受光部１２．１５はいずれも光電増倍管のような変換機
能？有し、前者は挟角散乱光の後者は螢光の光強度信号
？受光する。第５図のものでは。

受光部２６が側方散乱光２０’Ｙ受光する。

上記受光部の検知した散乱光、螢光の強度信号は、例え
ば第２図および第６図に示すような強度−頻度分布？有
し、試料が１ｆｆＩ液である場合各血球毎の光応答？第
４図に示すように二次元表示することにより、公知の知
見に従って通常赤血球、［Ｉ１１小板、網状赤血球（幼
若赤血球）、白血球などに分類計数することができろ。

こうした光強度信号？記憶解析するのがデータ解析部２
０である。

発明の効果 本発明は次の如き特有の効果を有する。

＋＋、）　　フローセル？出射する際の散乱光の損失が
著しく小さくなるため、フローチャンネル？通過する粒
子の寸法・形態特性を高精度、高分解能の散乱光強度信
号によって確定し得る。

（２）微小な散乱光の変動も逃がさないからフローサイ
トメータによる判別可能な粒子の種類や弁別速度が増大
した。

（３）　　励起用光源としてアークランプなど広い波長
幅の光源？用い得るので、光刺激に用いる波長選択の融
通性が高くなり、フローサイトメータの操作範囲？拡大
すると共に容易化し、試料の種類や測定条件の変化に対
して追従性が高まった。

（４）レーザ光源？用いなくてもよいのでフローサイト
メータの製作保守が簡易化され、製作コストが低減され
た。

実施例 第８・９図及び第１．５図に示すものは本発明によるフ
ローセル及びフローサイトメータの実施例であって、フ
ローセルの光入出射域の横断面が三角形に形成されたも
のである。この三角フローセル８のシース液及び試料人
口５０は直径約１２Ｕの半球状部に直径約８．で開口し
一斗状に狭窄して約６００μ径のフローチャンネルにつ
ながり。

上端部に液流出口が開口している。シース液（食塩水な
ど）でオーラミン染色等した血液試料？民間するように
ｍＫ状に送り込みフローチャンネル？通過させる。この
時水銀アークランプ１．励起光波長選択フィルタ４．ス
リット５を通過した励起光１７を集光レンズ７で集束後
三角フローセル８の三角形横断面部に入射させフローチ
ャンネルの細流に交差結像させる。螢光染色された試料
中の各血球細肥かも発生する散乱光は、フローセル前方
の遮蔽板１０で伏角散乱光１８を残して遮断された後受
光部１２により前方散乱光強度信号として光電変換され
データ解析部２０に送入され。

粒子検出に伴う諸情報が集積１分類、計数等されろ。前
方散乱光及び後方赤色螢光の各強度信号データは第２〜
４図に表示され得る（単位は相対的）、。

第５図のフローサイトメータは、第１図の装置に細胞核
、顆粒等に関する内部情報？保持した側方散乱光の測光
系ケ付加したもので、側方散乱光２０はフローセル８を
出射し集光レンズ２１で集光されピンホール板２２上に
試料像として結像された後受光部２６に導かれ、前方散
乱光の受光部１２からの信号、さらにフローセル８の後
方螢光乞波長幅で２分割して受光し各螢光強度信号に変
換する受光部１５及び受光部２６からの信号や励起光モ
ニタ１６かもの制御データなどもデータ解析部に送り込
まれろ。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるフローセル馨使用した散乱光−螢
光フローサイトメータの基本構成図、第２図は第１図の
フローサイトメータで測定計数された血球の散乱光とス
トグラムを表わすグラフ。 第３図は同様の螢光ヒストグラムを表わすグラフ。 第４図はこれらのヒストグラム？二次元表示する光源の
励起光を入射したときの説明図、第７図は従来のフロー
セルにアークランプ光源の励起光２入射したときの説明
図、第８図は本発明によるフローセル（本例では三角フ
ローセル）にアークランプ光源の励起光を入射したとき
の説明図、第９図は三角フローセルの一例？示す斜視図
である。 特許出願人　東亜医用電子株式会社 （外５名） ｆｉｌｉ項 禅、、Ｌ　　化１光壓 槽ｙ、を色質尤揮炭 蛍−に、椋洩 第５図 第６図 第７図　　　　　第８図 第９図 試ギト図λ口

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、励起光の光軸に対して事実上直交する励起光入射面
   と、光学的刺激域から放出される散乱光の出射面とを、
   鋭角的に交差せしめ得ることを特徴とするフローセル。 ２、励起用光源と、励起光の光軸に対して事実上直交す
   る励起光入射面を光学的刺激域から放出される散乱光の
   出射面とを鋭角的に交差せしめ得るフローセルと、前記
   散乱光の測光光学系と、前記光学的刺激域から放出され
   る螢光の測光光学系とを具備したことを特徴とするフロ
   ーサイトメータ。 ３、特許請求の範囲２記載のフローサイトメータにおい
   て、前記励起用光源が水銀アークランプよりなることを
   特徴とするフローサイトメータ。 ４、特許請求の範囲２記載のフローサイトメータにおい
   て、前記励起用光源がキセノンランプよりなることを特
   徴とするフローサイトメータ。 ５、特許請求の範囲１または２に記載のフローサイトメ
   ータにおいて、前記フローセルの光学的刺激域に対応す
   る部分の横断面が実質的に三角形をしていることを特徴
   とするフローサイトメータ。