JP2014508925A - 流体中の微粒子に関するマルチパラメータ測定のための装置および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
造血細胞に関して、当業者は、消炎現象および吸収現象を含む、容積測定または回折法によって得られた細胞の形態学的分析が、赤血球、血小板および白血球を含む主要細胞株間の識別を可能にすることを認識している。この最後の集団自体は、いくつかのカテゴリー、例えば、リンパ球、単球、好中球、好酸球および好塩基球に細分化される。
上述した細胞種の各々に対しては、異なる成熟度が分かっている。例えば、赤血球は、まず、前赤芽球の形態で、次いで、好塩基性赤芽球の形態、そして、多染性赤芽球の形態で作られる。多染性赤芽球は、好酸性赤芽球に成長した後、網状赤血球に成長する。循環血液中に入った時点で、最終的に赤血球に分化するのがそれらの網状赤血球である。
また、骨髄芽球が生じる多能性幹細胞は、その細胞株の一部、すなわち、Tリンパ細胞株が、胸腺でその成熟を続け、その他の部分は、Bリンパ細胞株を与えるために骨髄内に留まることになるリンパ幹細胞の形態での分化を経てリンパ細胞株を生じさせる。一旦、プラズマ細胞のかたちで活性化されたこれらのBリンパ球は、病原性抗原に対抗するための抗体を生成する。
本発明による装置は、より多くのパラメータ測定を可能にすることにより、血液サンプルを含む生体サンプル中に含まれる細胞の特性化、識別および確かな計数を可能にする。また、光源が分離されているため、これらを結合することまたは結合しないことが容易である。具体的には、この特徴は、蛍光色素に関して測定を行った場合に、潜在的な補正の問題を克服することを可能にする。
一つの有利な実施形態においては、毛細管が、マイクロオリフィスを備える集束ノズル内に細胞懸濁液を案内する。第2の流体は、測定オリフィスの交差部を通って、細胞懸濁液のセンタリングに入る。このオリフィスは、電気的方法、典型的には、抵抗率測定を用いた容積測定を実施するのに用いられる。一定の電流がこのオリフィスを流れる。細胞がオリフィスを通過すると、流路の抵抗率が変わって、計数オリフィスの端子において、電圧変動を生じさせる。この電圧は、細胞の容積に比例する。この測定法は、「コールター原理」として知られており、その実施のための電子的設備は、この文書には記載しない。
一般に、光学ベンチの寸法形状は、所望の光学ウィンドウのサイズに基づいており、計数細胞または測定チャンバ内でのビーム角に基づいている。レチクルの像は、典型的には、矩形状であり、また、その寸法は、2つの制約によって設定される。その最大寸法は、シース流体のサイズによって決まり、この直径は、実質的に、容積測定に用いられるオリフィスの直径である。そのため、直径は、約100μmに固定される。最小寸法は、2つの非常に近接した細胞を識別するための能力である、測定の空間分解能を決める。理想的には、この寸法は、可能な限り小さくなければならない。生物学的粒子が、速度vで、照明されたウィンドウを通過する場合、ウィンドウの最小寸法は、細胞の光の流れへの曝露時間、すなわち、光軸に沿った物理的吸光および回折現象に対応する電気的パルスの持続期間を決める。実際には、この寸法は、30μm程度である。そのため、分析ウィンドウのアスペクト比は、3程度になることに留意すべきである。また、受光光学系のビームの開口数は、照明ビームの開口数に等しいことに留意すべきである。このことは、ON2=ON1を示している。
したがって、本発明による装置は、レチクル像の波長フィルタリングを実行できるフィルタF1に関連する光学系OCと、光源S2によって放射された光と、観察している細胞との相互作用によって生じた広角回折SSCを集光し、光源S2の波長が中心である帯域通過フィルタF3に関連する光学系OEと、光学系ORと、蛍光ピークに中心を置き、かつ、光源S2によって放射された光と細胞との相互作用によって生じた蛍光を集光する帯域通過フィルタF2と、第一に、回折成分と吸光成分との分離を、第二には、蛍光成分と吸光成分との分離を可能にする2つのダイクロイックミラーMRおよびMEと、3つのフォトダイオードであるか、または好ましくは、それぞれ、2つのフォトダイオードと1つの可変利得アバランシェフォトダイオードである3つの検出器D1,D2およびD3とを具備している。
・有核細胞の8つの集団の計数および識別のための抵抗率RES、吸光度EXT、広角回折SSCおよび蛍光性FL1と、
・例えば、蛍光色素によって分かるようないくつかの特殊性の検出のための抵抗率RES、吸光度EXT、2つの蛍光性FL1およびFL2と、
・免疫表現型検査への適用のための抵抗率RES、吸光度EXTまたは1つの蛍光性FL2、広角回折SSC、および1つの蛍光性FL1と、
を含むことができる。
この観察を可能にする4つの通常のマトリクスは、一般に、RES×EXT,SSC×FL1,EXT×FL1およびEXT×SSCである。
図2は、何の病状も呈していない血液の場合の細胞分類を示す。しかし、これらの測定は、好塩基球、赤芽球、未熟顆粒球および未熟細胞の識別を可能にはしない。それらの集団は、多くの場合、特定の病状に関連しているため、それらを識別できること、および見込まれる最も正確な計数を得ることが重要である。
本発明による装置は、ここでもまた、チアゾールオレンジを伴う蛍光性測定によって、未熟細胞の正確な識別を可能にする。未熟細胞は、成熟細胞よりも多くのRNAを含んでいるため、より高い蛍光応答を示す。図6は、この利点を示している。丸で囲んだ粒子CIMの中で計数されている黒いドットによって示された未熟細胞は、図(ABS,RES)よりも図(SSC,TO)でより良好に識別されていることが図を見て分かる。しかし、採用されている2つの図は、ともに良好な識別を可能にしている。
・血液、骨髄および異なる臓器中の正常な集団の分類記載、
・白血球識別の抗原の分析、
・細胞の誕生、一生および死の研究、
・細胞情報伝達のメカニズムおよび異なる細胞機能の分類記載、
・免疫病理学がテーマの研究、すなわち、免疫不全症の診断およびモニタリング、自己免疫疾患の診断およびモニタリング、移植組織や移植片の免疫学、リンパ増殖性疾患、過敏性、
・多くの血液病の診断への寄与、および、
・がん腫学の分野における、腫瘍に対する宿主反応および免疫療法の経過観察の評価、
にとって重要である。
Claims (7)
- 特性化すべき流体の流れが循環する測定チャンバ(CUM)と、別々のスペクトルの少なくとも2つの光源(S1,S2)と、抵抗率を測定するための装置(RES)と、各々が、光学パラメータの測定を可能にする少なくとも3つの他の検出器(D1,D2,D3)であって、それらの光学パラメータは、蛍光性(FL)、吸光度(EXT)、広角回折(SSC)および小角回折(FSC)から選択されるようにした前記検出器とを具備する、微粒子の特性化のための電気光学流量測定装置であって、
前記電気光学流量測定装置は、
最長の波長を有し、かつ、最小のコヒーレントの第1の光源(S1)が、粒子の流れに直角な主光軸を画成し、前記主光軸は前記チャンバの両側に配置された2つの光学アセンブリを有し、そのうちの一方が、第1の光源(S1)によって放射されたビームを成形できる放射ガン(CE)であり、他方が、前記第1の光源(S1)によって放射された信号を集め、かつ、前記測定チャンバ(CUM)の後方に配置される受光ガン(CR)であり、
最短の波長を有し、かつ、最大のコヒーレントの第2の光源(S2)が、前記主光軸と交差するとともに、前記粒子の流れに垂直である第2の光軸を画成し、
第1の検出器(D1)が、前記受光ガン(CR)の先端において、前記第1の光源(S1)に対向して配置されて光照射野機能を有しており、
前記受光ガン(CR)が、前記第1の光源(S1)と前記第1の検出器(D1)に向かう前記流れ中の前記粒子との相互作用によって生じたビームを集める集光光学系(OC)を具備し、これらの集光光学系(OC)は、その光路の一部(CC)にわたって、伝達される光ビームが実質的に平行になるものであり、
第1のダイクロイックミラー(MR)が、前記第2の光源(S2)と、部分的に反射したビームの光路上に配置された前記第2の検出器(D2)に向かう前記流れの中の前記粒子との相互作用によって生じた前記光ビームを部分的に反射するように、前記光ビームが実質的に平行になる前記光路の部分(CC)に、前記第1のダイクロイックミラー(MR)が前記受光ガン(CR)内に配置され、
前記放射ガン(CE)は、前記第1の光源(S1)によって放射された前記ビームを成形するビーム成形光学系(OM)を具備し、これらのビーム成形光学系(OM)は、その光路の一部(CM)にわたって、前記光ビームが実質的に平行になり、
前記第2の光源(S2)と、前記部分的に反射したビームの光路上に配置された第3の検出器(D3)に向かう前記流れの中の前記粒子との相互作用によって生じたビームを部分的に反射するように、前記光ビームが実質的に平行になる前記光路の部分(CM)において、前記第1の光源(S1)と前記チャンバ(CUM)との間の前記放射ガン(CE)内に第2のダイクロイックミラー(ME)が配置される装置。 - 回折/散乱検出器が、前記測定チャンバ(CUM)の他方の側で前記第2の光源(S2)に対向して配置されることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記第1の検出器(D1)は、一方が吸光度測定(EXT)であり、他方が回折(SSC,FSC)および蛍光性(FL)の中から選択される2種類の測定を実行することを可能にする切り替え可能な利得を有することを特徴とする請求項1又は2に記載の装置。
- 前記第1の検出器(D1)は吸光度測定(EXT)を実行し、前記第2の検出器(D2)は広角回折測定(SSC)を実行し、前記第3の検出器(D3)は蛍光性測定(FL1)を実行することを特徴とする請求項1から3の何れか一項に記載の装置。
- 前記第1の検出器(D1)は吸光度測定(EXT)を実行し、前記第2の検出器(D2)は蛍光性測定(FL2)を実行し、前記第3の検出器(D3)は蛍光性測定(FL1)を実行することを特徴とする請求項1から請求項3の何れか一項に記載の装置。
- 前記2つのダイクロイックミラー(MR,ME)は、前記第2の光源(S2)の前記波長よりも長くかつ前記第1の光源(S1)の前記波長よりも短い波長の全反射を生じさせる同一の光学特性を有する請求項1から5の何れか一項に記載の装置。
- 少なくとも1つの他のダイクロイックミラーが、前記放射ガン(CE)および前記受光ガン(CR)のうちの少なくとも一方の内に付加されることを特徴とする請求項1から6の何れか一項に記載の装置。
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