CN102792146B - 用于流体中微颗粒的多参数测量的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对流体中存在的至少两个颗粒群体的折射进行分类和流量测量的方法。该方法使用的光源相干时间短、相干长度Lc<100μm，在根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的中心波长处并在消光条件下使用。该方法使用一种装置，该装置与光源一起形成会聚照射光束，其孔径角是根据在选定中心波长针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的。之后，让具有颗粒的流体流经测量孔口，以便在颗粒通过时测量阻抗变化（RES）。在所述颗粒通过所述测量窗时，由光束照明流经测量窗的具有颗粒的流体并在光束轴上测量所述光束的消光（EXT），利用具有会聚接收光束的装置或探测器进行测量，所述会聚接收光束的孔径角是根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的。该方法合并RES和EXT数据，以便形成事件，使得能够针对每个事件评估相对折射率并利用从RES、EXT和IDX中选择的至少一个参数对所有事件分类。

Description

用于流体中微颗粒的多参数测量的装置和方法

背景技术

本发明涉及用于执行流量测量以表征尤其是在生物学细胞中的微颗粒的装置和方法的一般领域。本发明更具体地涉及测量生物学微颗粒的折射以及在生物医学应用中有用的其他参数。

在当前语境中，大部分自动细胞学分析器，诸如血液病学分析器，被设计成测量细胞特性，使得化验室医生能够识别特定疾病的起因。例如，诊断特定的贫血、特定癌症或追踪特定的医学处置全都是通过观察每个细胞的物理特性来执行的。

本发明的目的是开发一种装置和方法，从而更好地区分以及由此更好地统计生物试样，尤其是血液中包含的颗粒群体中的每个。本发明还能够非常精确地测量每个红细胞群体的细胞内血红蛋白含量。通过扩展，本发明的装置和方法能够更好地分析样本中的白细胞群体。

至于红系细胞，最常见的分析器提供的常规参数如下：每单位体积的红细胞数(#RBC)、平均细胞容积(MCV，常规上按照立方微米给出(μm³))、红细胞分布指数(或宽度)(以％表示的RDW)、血细胞压积水平(以％单位的HT)、基本样本中的平均血红蛋白浓度(HB)、平均红细胞血红蛋白浓度(以每分升克(g/dL)为单位的MCHC)和平均红细胞血红蛋白量(以皮克(pg)为单位表示的MCH)。

大部分血液病学分析器测量如下参数：#RBC、HB和血细胞压积水平，通过计算获得所有其他参数。

尽管如此，应当观察到，能够利用特定类型的分析器来测量大部分不成熟的红细胞，其包含核糖核酸(RNA)的残渣并且被称为“网织红细胞”。然后使用染料或荧光标记器作为着色剂来揭示细胞质内RNA的存在。表达对RNA标记特有的荧光或衍射信号的红细胞的分数比例用于确定每单位容积的网织红细胞数(#RET)。

除了这些参数之外，诊断特定的贫血或跟踪对它们的处置情况需要知道每个红细胞和/或每个网织红细胞的红细胞血红蛋白浓度(CHC)(CHCr：网织红细胞的红细胞血红蛋白浓度)。与参数MCHC和MCH(它们是在红细胞的整个群体上计算的平均值)不同的是，CHC和CHCr是每个血细胞中红细胞血红蛋白浓度的值，并且它们被用于构造直方图，示出红细胞群体上的血红蛋白分布以及不成熟的条纹(网织红细胞)。例如，平均红细胞血红蛋白浓度相同的两个患者可能呈现出在红细胞和网织红细胞上非常悬殊的统计分布。这是细胞学中公知的。因此，在利用显微镜检查涂片时，红细胞的颜色与其血红蛋白含量强烈相关：血红蛋白浓度越大，光衰减越大。该发现是Beer-Lambert定律的结果，该定律表明，光密度与溶质的浓度成正比。关于不同细胞之内血红蛋白统计分布的知识提供了关于患者健康状态的信息。偏离常态是要由化验室医生解释的症状。例如，将血红蛋白含量低的红细胞说成“低色素性的”，而将血红蛋白含量高的红细胞说成“高色素性的”。在红细胞之间的血红蛋白分布变化强烈时，这是多染色性症状。含量异常的细胞常常呈现出异常的流变性质，并且导致其他生理症状，尤其是对于地中海贫血或镰状细胞病。在Onofrio等人于1995年Blood，Vol.85，第818-823页中发表的题为“Simultaneousmeasurementofreticulocytesandredbloodcellindicesinhealthysubjectsandpatientswithmicrocyticandmacrocyticanemia”的文章中阐述了这些参数对健康受治疗者和患者而言的血液学解释。

因此当前认为网织红细胞的血红蛋白含量是对于诊断中枢性贫血，或甚至追踪患者对治疗响应而言都非常有用的参数。此外，近年来已经在业内评论性刊物和众多专利申请中发表了很多公开，都是关于血红蛋白在所有红细胞内分布的临床解释以及关于为获得该信息要实施的方法的。

例如，缺铁性贫血涉及到群体的各种外围，尤其是进行透析的人，他们定期进行铁负载平衡。出血或流血的人、接受血液透析治疗的人，甚至营养不良的人都易于患缺铁性贫血。此外，利用促红细胞生成因子(EPO)治疗的受治疗者即使在他们的组织铁储备充分或甚至过多时仍可能发展成缺铁性贫血综合症，因为合成血红蛋白的机制受到铁固定代谢的反常的限制。在诊断那些生物失调时常常使用铁蛋白和铁传递蛋白饱和系数的化验，但认为在炎症性综合症或传染的情况下，那些特殊蛋白质的血浆浓度受到其他因素影响。

题为“Reticulocytehemoglobincontent(CHr)：earlyindicatorofirondeficiencyandresponsetotherapy”的文章(Brugnara等人，Blood1994，Vol.83，第3100-3101页)指出，可以通过测量网织红细胞的绝对计数和微粒子血红蛋白浓度来追踪对补充口服铁的响应。于是，对治疗做出正面响应的人从第一天开始就同时受益于网织红细胞数量增加和血红蛋白负载增加。然而，成熟红细胞指数不受影响，直到治疗之后很长时间，通常仅为几个星期。因此，测量#RET和CHCr直方图在事先确定治疗是否有效时非常重要。

因此，知道了血红蛋白浓度在红系细胞内的统计分布，甚至在其部分上的分布，对于可从大部分血液病学分析器获得的其他更多常规参数而言是最为有利的。

至于血小板，最有利的是医生能够统计和观察血小板活化，因为那可能表示形成血栓一开始的聚集现象。活化与非活化血小板之间的这种区别在血液病学分析器上较难观察到。

还在大尺寸血小板(宏血小板)与小红细胞(尺寸非常小的红细胞)之间进行区分的能力对于避免造成特定诊断错误而言是重要的。令人遗憾的是，在除了基于激光的那些血液病学分析器中，当前没有避免宏血小板与小红细胞之间这种可能混淆的简单而有效的解决方案。

至于白系血细胞，显然，在各种细胞之间进行精确区分对于化验医生能够做出高质量诊断是相当有利的。例如，文章“Thecytoplasmicrefractiveindexoflymphocytes,itssignificance,anditschangesduringactiveimmunization”(K.W.Keohane和W.F.Metcalf，1959年1月1日，ExperimentalPhysiology，44，第343-350页)指出，测量淋巴细胞的折射率能够确定它们在接种疫苗之后的活化水平。

为了测量红系细胞的血红蛋白含量，已经基于光学测量，主要是细胞反射或衍射的测量，提出了基于流式细胞术的很多方法，任选地将这种测量与通过测量微孔以连续或脉冲方式工作的电测量组合。

测量微粒血红蛋白的第一种方法归功于D.H.Tycko。在美国专利No.4735504中，作者描述了一种基于光衍射的光学方法，光衍射是在空间的两个区域中测量的，所述两个区域是由对应于通过计算获得的非常具体的角的两个参数标识的。应当发现，红细胞先前通过化学方式处理过，因此为其赋予了准球形形状。在该近似的极限之内，可以将红细胞视为半径为R且折射率为IDX的均匀球体。向该简化的红细胞模型应用米氏(Mie)理论能够确定在三维空间的每个区域中扩散的强度，并能够确定等浓度和等容积曲线不相交而是相反界定一组明确曲线的最佳配置。该组曲线使得能够解决逆问题，包括基于检测系统两个子光圈中衍射的光的两次测量确定球的体积和折射指数。

同一作者在美国专利No.5194909第4栏第39到57行中描述了该光学方法的复杂性。除了对衍射光进行两次测量之外，D.H.Tycko提出通过常规WallaceCoulter技术测量细胞的体积，包括测量生物学细胞通过微孔导致的阻抗变化。该电测量与光学系统单个光瞳中衍射的光的测量结果相关。再一次，Tycko基于两个角度(θ_L；θ_H)确定环形光瞳，所述两个角度用于界定一组曲线，唯一地基于光学系统光瞳中衍射的光的测量结果给出红细胞血红蛋白含量的单一解。

从如下发现开始：校准由Tycko提出的方法非常难以实施，因为不可能利用常规乳液珠进行校准，俄国的Novossibirsk团队发展出一种原创构思，能够测量微颗粒弥散指标。该系统被称为“扫描流式细胞仪(SFC)”。光源、微颗粒和探测器之间的角度是液流中微颗粒运动的函数。因此，微颗粒的运动使得能够扫描一定角度的扇形，使得能够在较大角度范围上记录衍射光指标。俄国团队的各成员应用SFC测量红细胞的体积和血红蛋白含量。

在题为“Calibration-freemethodtodeterminethesizeandhemoglobinconcentrationofindividualredbloodcellsfromlightscattering”的文章(Sem'yanov等人，AppliedOptics，Vol.39，No.31，2000年11月)中，作者指出红细胞产生的衍射图案给出一系列极大值和极小值。组合那些极值的位置和幅度特性以便获得计算算法，从而能够推断出红细胞的体积和血红蛋白浓度而无需进行事先的校准操作。

在美国专利No.5817519和6025201中，必须要使用激光以测量小角度下的衍射。该测量基于米氏理论，于是所用的原理类似于Tycko描述的装置中使用的原理。于是，在那些文献中，组合衍射测量与采集另一信号，可以是光信号或单个电信号，仅能够计算血小板的折射。通过所述电光装置不能区分其他细胞。

在BeckmanCoulterInc.名下的US2005/0134833中，D.L.Kramer认为基于测量前向光衍射的方法容易出错，因为它们依赖于细胞折射，其自身取决于细胞质内的折射率。他指出，折射率可能作为除血红蛋白之外的溶质，尤其是盐的存在而显著改变。他推荐了一种基于反射率测量的装置，以便避免其他系统的不精确。他的装置的操作被应用于测量红细胞血红蛋白。将反射率测量与细胞体积测量组合，细胞体积测量是基于Coulter原理通过基于测量微通道阻抗变化的技术获得的，所述微通道具有通过其的连续电流。尽管未证实该装置的有效性，但作者指出，反射率参数与血红蛋白含量相关。

在同一公司提交的专利WO97/26528中提出了一种非光学方法。在该专利中，通过执行两次电测量来确定血细胞血红蛋白含量：一次是连续测量，另一次在脉冲条件下。在连续条件下，测量细胞的外部体积，而在脉冲条件下，场与细胞质内提供导电性的含量相互作用，似乎受到血红蛋白浓度的控制。

还应当观察到，上述发明或公开仅涉及到测量红细胞的血红蛋白含量，未提到任何网织红细胞。

在流式细胞术中，仅能够在特殊标记核糖核酸之后检测网织红细胞，例如，如在申请人提交的专利FR2759166中所述。一项比较检测网织红细胞的各种方法的研究(“Reticulocyteenumeration：pastpresent”，Riley等人，LaboratoryMedicine，Vol.32，No.10，2001年10月)特别发现，荧光方法提供了最好的性能。更具体而言，发现噻唑橙化合物是核酸(DNA和RNA)的最佳标记之一。该分子有优势是因为它强烈吸收入射光并且在与核酸混合之后荧光产出非常高。在用于自动统计网织红细胞的所有Horiba医疗分析器中都提出了这种方法(“Automatedreticulocytecountingandimmaturereticulocytefractionmeasurement”，Lacombe等人，AmericanJournalofClinicalPathology，Vol.112，No.5，1999年11月)。

例如，MilesInc.名下的美国专利No.5350695描述了一种利用恶嗪750或新亚甲基蓝对核酸着色的方法。恶嗪750导致核酸沉淀，由此能够通过消光测量来检测它们。作者发现，他们的发明依赖于针对常规上述Tycko装置调整消光测量。排他地使用吸收测量来区分未成熟细胞，尤其是网织红细胞，而使用衍射信号计算包括体积和血细胞血红蛋白含量的球状指数。在该专利中，人们公认分辨未成熟细胞所需的吸收测量与衍射测量是相互依赖的。为了减少这样的干扰，如范例3第15和16栏中所述，作者提出细胞间校正方法。令人遗憾的是，那些计算是复杂的，并且可能不精确，因为它们需要对两种小幅度光学现象解耦合：第一是折射效果，而第二是吸收效应，在信号测量光学消光中将那两种效果混合在一起。对那种校正方法的第一个限制是，假设血细胞是完美均匀的球体。使用米氏理论计算要从光学消光信号减去的信号比例。该计算给出新的吸收值，该吸收值可以唯一地归因于染料的贡献，并用于测量核酸的量，从而确定红细胞的成熟度。

文献US5350695的图18比较了所述方法和手工计数方法之间统计网织红细胞的结果。尽管未给出相关系数，但能够看出，测量是高度分散的，并且网织红细胞计数的不精确度低于2％。然而，已知红细胞的平均寿命为120天：因此能够估计出红细胞的更新率平均等于每天0.8％，从纯粹生物学的角度来讲这解释了需要有一种能够测量低于2％细胞的敏感方法。

仍然在MilesInc.名下的美国专利No.5360739描述了一种确定血细胞血红蛋白含量的方法，其基于Tycko的原理，即在分别称为“红散射低”和“红散射高”的两个衍射角下测量光衍射，而网织红细胞测量基于测量光学吸收，如在美国专利5350695中那样，但基于荧光作用的原理。作者考虑使用两种能光激励的化合物，一种为红色(恶嗪750)，另一种为蓝色(吖啶橙及其衍生物)。在这种环境下，作者提出耦合血管上游的两束激光，使得光束在测量点处重合。所提出的光学装置使用重合的照明和检测轴，由此引入相当大程度的复杂性，因为在使用在蓝色中能光激励的化合物时，该装置需要使用四个测量通道。在该方法中，优选全光学方法，用于确定血样中包含的每个红细胞和每个网织红细胞的感兴趣参数(体积和红细胞血红蛋白浓度)。

Abbott名下的美国专利No.6630990以基本等效于上述方法的方式解决了测量红细胞血红蛋白浓度的问题。该专利提出了一种光学装置，能够分辨多种细胞系，尤其是白系血细胞和红系血细胞。该系统具有单个光源和单个接收器，提供三个测量区域，定义独特的配置，以利用米氏理论计算血细胞血红蛋白和细胞体积。主要特性依赖于使用三个衍射角计算体积参数V和血细胞血红蛋白HC，由此从技术角度导致显著的复杂性，因为如果增加荧光作用作为测量红细胞成熟度的参数，必需有特定的探测器并且由工作于三维或四维空间中的方法处理数据。校准装置的方法复杂也是那篇文献中未解决的重要问题。

Sysmex针对XE2100分析器提出了参数RET-y。几个团队已经进行了各种试验研究，以便评估这种RET-y参数的临床优点。例如，文章“NewredcellparametersontheSysmexXE-2100aspotentialmarkersoffunctionalirondeficiency”(Briggs等人，2001，SysmexJournalInternational，Vol.11，No.2)指出，参数RET-y与网织红细胞的血红蛋白含量相关。该参数是仅限于网织红细胞群体的前向散射(FSC)的平均值，是从流式细胞术分析的细胞样本的两参数FSC×FLUO表达计算的，其中，常规上，参数FSC对应于小角度的衍射，参数FLUO对应于聚甲炔的荧光作用，其在红色中能光激励，并用于标记和量化核酸(DNA/RNA)。新近以来，在文章“PotentialutilityofRet-Yinthediagnosisofiron-restrictederythropoiesis”(Franck等人，ClinicalChemistry50：第1240-1242页，2004)中，C.Briggs等人描述了类似结果。作者发现，参数MCH和CHr与参数RET-y相关。还提供了一种非线性回归方法，能够利用商标为Bayer的参考Advia120分析器校准SysmexXE2100分析器。在Sysmex于2007年3月提交的专利EP1967840A2中描述并阐明了那些结果。令人遗憾的是，FSC的响应非线性可能导致显著的不精确，尤其是对于参数CHr的大值。具体而言，对于接近40pg的值，可以看出该方法不灵敏，因为在该值附近RET-y几乎不变。此外，该专利仅参考了网织红细胞群体，未调整FSX×FLUO两参数表达以测量循环的血液中其他颗粒，尤其是白细胞。

如现有技术专利中所述，例如Tycko装置和从其推导出的装置，通过视直径位于5°到15°范围中的环形光瞳来测量小角度的衍射。为了以良好的信噪比在小角度测量衍射，那些装置利用了激光。在这种工作条件下，照射光束的数值孔径基本为零。从实际的角度来讲，使用激光是在数值孔径基本为零的情况下能够在有效测量小角度衍射所需的高功率(几毫瓦)下产生辐射的唯一方案。

因此基于现有技术中描述的测量原理的装置很昂贵，因为它们包括激光器。

此外，它们需要使用停止器以有效地停止激光束。由于停止器需要以大精度对准，以避免使探测器饱和，所以特别难以制造和调节基于该原理工作的装置。

此外，现有技术装置对试剂使血细胞成球形的质量非常敏感。在利用小角度衍射工作的装置中，衍射现象基本对应于平面波的衍射，根据定义，平面波呈现出零发散。与微颗粒的那种交互的性质对微颗粒性质的效应非常敏感。此外，在微颗粒不是理想球形时，测量结果包括显著的误差。已经通过试验发现了这种情况，如图1A和1B所示。这些是在1°到30°范围中的角度上测量的关于红细胞体积(RES)和激光衍射(FSC)参数的两参数曲线。图1A是利用ABX供应商的稀释剂(专利FR2759166-)获得的，其拥有弱球形化指数，而图1B是利用同一系统，但利用球形化指数高的试剂获得的(对Advia2120使用的Bayer稀释剂)。可以看出，图1A包括显著的误差，因为该组群体是高度分散的。相反，在图1B中，颗粒群体位于平面中界定一集合的区域中，该集合更加紧凑，具有高度的FSC×RES相关性，如该集合的椭圆形所示。

因此，显然，与测量系统无关，试剂的性质对现有技术装置的结果有很大影响。

发明内容

于是，本发明的主要目的是通过提出如下方法来减轻这样的缺点：一种利用光源对流体中存在的至少两个颗粒群体的折射IDX进行分类和流量测量的方法，所述光源的相干时间短、相干长度Lc<100μm，在根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的中心波长处并在消光条件下使用，所述方法包括如下步骤：

·使用所述光源形成会聚的照射光束，其孔径角处于1°到60°范围中，根据在选定的中心波长处针对所考虑颗粒预期的所述体积范围和所述折射率范围选择，并且提供的光照均匀度在尺度为a×b×c的矩形体积中好于10％，其中，a×b是高宽比a/b小于4的光束的矩形截面，并且其中，c是景深，被定义为功率改变不超过10％的相对于测量点的距离范围，其值位于500μm±250μm处；

·令具有颗粒的所述流体流经测量孔口；

·在所述颗粒经过所述测量孔口时测量阻抗变化RES；

·令具有颗粒的所述流体在测量窗中流动，所述测量窗被置于出口处的光束从所述测量孔口照射；

·在所述颗粒通过所述测量窗时，测量所述光束的轴上的消光EXT，利用具有会聚接收光束的装置或探测器进行所述测量，所述会聚接收光束的孔径角处于1°到60°范围中，根据针对所考虑颗粒预期的所述体积范围和所述折射率范围选择；

·合并RES和EXT数据以从其形成事件；

·根据RES和EXT，针对每个事件计算折射IDX；以及

·使用从RES、EXT和IDX中选择的至少一个参数对所有事件分类。。

可以通过增加荧光作用测量以便在细胞成熟各级间进行区分来扩展本发明。

如图2所示，本发明这样提出了一种使用电光手段的方法，该手段简单并且能够测量若干细胞系的折射率(或折射)。在制备要利用本发明的方法进行测量的样本时，选择适当的试剂。

本发明的创意在于，同时利用通过电气方法执行的体积测量和光学消光测量，来获得颗粒折射信息。

应当看出，颗粒折射是与颗粒浸于其中的液体介质折射相关的测量，最后，颗粒的折射测量取决于表征测量装置的参数。

于是，可以由两个物理大小的比值表示颗粒的折射或其折射率，记为m：

m＝Ne/NL，

其中，在给定的试验条件下，Ne是颗粒的折射率，N_L是颗粒浸于其中的液体介质的折射率，本文也将这一相对折射率记为IDX。

在细胞学分析中，尤其是在血液病学领域中，这种折射信息使得能够例如获得所考虑细胞群体的改进分类，或者可以提供关于细胞代谢的信息，因为它提供了关于细胞含量或关于其膜性质的额外信息。

在本发明的方法中，不执行这种衍射测量以评估折射。本发明基于使用光学消光的测量。于是，相对于光亮背景，而非如现有技术装置那样相对于黑暗背景，来测量光信号。一个直接效果是，不必使用激光器，其中，激光器一直是较为昂贵的部件并且比非激光源使用起来更为复杂。

本发明的方法于是利用了非激光源，例如可以是半导体灯，如发光二极管(LED)、超级发光LED，甚至白炽灯。

在本发明中，光学装置比现有技术装置简单。此外，实施更加容易，尤其是因为相对于光亮背景进行测量，所以不必在光电检测步骤之前停止照射光束。

在本发明中使用的照射光束以大于10度的较大孔径角会聚，用于使红细胞的形状具有更低灵敏度。

已知可以将不相干会聚光束分解成相对于红细胞具有各种入射角的平面波频谱。照射光束的孔径角由这两个值之间的差异界定。

根据优选特性，这个孔径角处于10°到60°的范围中。

于是，与现有技术装置不同的是，由连续谱(spectrum)的平面波照射颗粒。每个波然后产生衍射图案，使得实测信号是所有平面波与被分析颗粒的集成响应。

由于平面波中的每个从不同的角度看到颗粒，所以形状各向异性通过平均而“消除”。

这解释了在面对颗粒形状条件，尤其是颗粒球形化时，本发明方法优于现有技术装置的原因。尤其是红细胞，通过对微颗粒进行化学处理获得这一在先步骤，例如，化学处理的种类如Y.R.Kima和L.Ornstein在文章“Isovolumetricspheringoferythrocytesformoreaccurateandprecisecellvolumemeasurementbyflowcytometry”(Cytometry，1983，Vol.3，Issue6，pp.419-427)中所述。

对于生物颗粒，例如红细胞的球形质量，本发明的光学装置更能够容忍。于是，降低了在球形化能力方面对试剂的要求。由于颗粒的球形化不再对实施测量方法是总体决定性的因素，本发明能够增强或生成其他化学功能，例如使膜可渗透，这是对颗粒内部的特定结构着色或标记所需的。

于是，本发明能够基于测量颗粒的实际折射和其体积，通过测量阻抗和消光对被分析的颗粒分类。

这样不仅能够确定根据折射区分的若干类别，而且能够确定颗粒在每一类中的百分比作为其比例，使得比例之和总计为100％。

在本发明的具体实施方式中，如图27中所示，仅仅通过在接收系统中增加二向色反射镜F1连同与光源S1轴成90°的激光器，本发明的光学装置还能够测量荧光作用，从而在红细胞和网织红细胞之间进行区分。

通过同样的方式，该装置能够测量白细胞的荧光作用，从而能够根据荧光作用响应分离它们。

具体而言，本发明提供了比先前发表的方案性能更好并且更简单的方案。

该方法的应用在于测量红细胞和血小板的折射。知道了红细胞的折射能力就能够确定其血红蛋白浓度。

更一般地，本发明能够确定红细胞和网织红细胞的血红蛋白含量，与全血样本中包含的其他细胞或微颗粒(尤其是用于稀释初始样本的各种流体传输的红细胞和本底噪声)相比改进血小板的分类，并确定血小板的活化水平。然后可以将本发明的方法扩展到循环血液中的所有细胞，以便对白细胞(尤其是淋巴细胞、单核白细胞、中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱性细胞和其他有核细胞)进行分类和/或量化。

根据有利特性，利用如下类型的表达式计算相对折射率：

$\mathrm{IDX}=\frac{\mathrm{EXT}-B.\ln (\mathrm{RES}+T)-D}{A.\ln (\mathrm{RES}+T)+C},$

其中，A、B、C、D和T是取决于测量周期的系数。

这一特性使得能够快速简单地计算折射率，因为它是从两个变量和简单的对数函数对折射率建模的表达式。

有利地，被分析的颗粒是生物学液体中的细胞。

而且，根据本发明的优选特性，用于测量颗粒折射的波长位于红色和超过0.6μm的近红外区中。

测量微颗粒体积的范围主要从0到500飞升(fL)。这尤其适用于红细胞和白细胞，还适用于血小板。

对于红细胞，选定的波长范围确保了解的唯一性，给出了与每个细胞折射成正比的血红蛋白浓度，其自身由光学消光和阻抗测量确定。

根据本发明的有利特性，对事件分类的步骤利用处于600纳米(nm)到800nm并且数值孔径NA1＝NA2处于0.2到0.6范围中的波长分开红细胞和血小板。根据界定血小板所属区域的阈值执行这一分离步骤，该阈值具有默认值并且能够自动加以调节。

这一特性使得能够具有适于被观测样本的分离阈值。在本发明中，测量光学消光信号并与电阻信号相关联，以便构成事件。当在消光中未看到特定颗粒时，本发明的方法将它们与零消光相关联。这个子步骤仅基于其阻抗值处理这些事件。

有利地，对事件分类的步骤包括如下子步骤：通过在从所有遇到的颗粒准备的直方图中确定谷，调节不能测量消光的颗粒之间的电阻分离阈值。

根据本发明的特定特征，对事件分类的步骤包括如下子步骤：调节根据分离阈值之下遇到的颗粒的统计参数，即均值和标准偏差，计算的电阻分离阈值，所述分离阈值是由作为体积和光学消光函数的仿射直线定义的。

还是在这种情况下，根据样本确定分离阈值的位置。这构成了原创性方法，因为大部分对红细胞(RBC)和血小板(PLT)分类的当前设备仅基于其体积这样做。这一阈值这样能够对小红细胞尺寸的血小板分类，在观测小红细胞干涉的其他设备中不能这样做。虽然如此，现存一些设备利用激光进行衍射测量，但实施的方法比本发明的方法更复杂。

根据本发明的另一特定特征，对事件分类的步骤包括如下子步骤：在旋转整个阻抗(体积)/消光平面之后调节由仿射直线定义的阈值，所述仿射直线是体积和(光学)消光测量值的函数，从而通过在从位于分离线任一侧的事件的横轴点形成的直方图中确定谷来垂直地放置所述分离线。

再次，根据样本确定分离阈值的位置。于是，本发明能够在血小板以及小尺寸红细胞之间进行区分，因此对其进行分类。

根据本发明的有利特性，该方法包括如下步骤：借助于作为其折射率IDX的函数的仿射表达式，计算被分类为红细胞群体中的颗粒的红细胞血红蛋白浓度。

于是，本发明使得容易利用血细胞血红蛋白和折射率IDX之间的已知联系计算血细胞血红蛋白。

有利地，该方法包括如下子分类步骤：对低色素性、高色素性和正常色素的红细胞群体以及小红细胞、大红细胞和正常色素的红细胞群体进行分类。

在这些群体在体积和折射方面有差异的范围之内，利用本发明进行的测量用以根据体积和血红蛋白含量在分类之前定义和配置的小红细胞、大红细胞、低色素性或高色素性群体之间进行区分。定义这些群体之间差异的方式常常是对每个实验室特有的。虽然如此，可以提供默认设置。

根据本发明的有利特性，该方法包括如下步骤：利用作为其折射率的函数的仿射表达式，计算被分类为血小板群体中的颗粒的密度。

本发明使得容易通过从别处获知的密度和折射率关系评估血小板的密度。

有利地，该方法还包括如下步骤：从通过阻抗测量获知的其密度和其体积计算血小板的干重。

这一步骤使得能够使用从生物学角度而言有意义并且重要的量值：血小板小粒的量。在血小板变得活化时，排除这些小粒。于是，血小板密度揭示了血小板活化情况。已经活化的一组血小板几乎不包含或不包含小粒。于是，测量折射率间接地测量了其活化程度。这里强调的是，颗粒折射率的测量是相对于颗粒浸于其中的介质而言的，还相对于对颗粒而言特有的结构而言。于是，血小板折射测量的解释还涉及其内部复杂性：包含高折射小粒的血小板将具有明显的折射率，大于在被活化时丢失其小粒的同样血小板。最后，计算的折射率是体积等于已经产生与被分析颗粒(血小板、粒性白细胞等)相同的光学消光的微颗粒体积的均匀球体的折射率。

根据特定特征，本发明的方法包括如下子分类步骤：对正常血小板、活化的血小板、小的血小板和大的血小板进行分类。由于“大的血小板”概念涉及到体积，所以子分类可以适于每个实验室，如同红细胞那样。

根据有利特性，对事件分类的步骤将白细胞群体分离为尤其包括淋巴细胞、单核白细胞、粒性白细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞，并且包括如下步骤：

a)使用第一二维(2D)阈值化子步骤(REX×EXT或VOL×IDX)分离与碎片、血小板聚集、成红细胞、人为噪声等对应的本底噪声；以及

b)使用相继的2D阈值化子步骤分离各种群体和它们的非典型或不成熟子群体，并包括：

i)自动调节淋巴细胞和中性粒细胞之间的阈值的子步骤；

ii)自动调节嗜中性和嗜酸粒细胞之间的阈值的子步骤；以及

iii)自动调节单核白细胞和中性粒细胞之间的阈值的子步骤。

本发明实现的折射率(IDX)变换使得能够使用更精确并且更加互不相关的信息。这样能够消除在光学消光中与体积相关的分量。于是，对从体积(VOL)和从折射率(IDX)计算的量值，而非对阻抗参数(RES)和消光参数(EXT)有利地执行2D阈值化处理。如上所述，统计学折射性质提供了比光学消光更精确的信息。

之后，针对每个群体以不同方式解释信息，因此需要对群体分类。例如，可以针对淋巴细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒性白细胞等评估活化情况。

有利地，该方法包括如下步骤：借助于作为所计算的相对折射率的函数的仿射表达式，计算被分类为淋巴细胞的颗粒的活化指数。

例如，在题为“Thecytoplasmicrefractiveindexoflymphocytes,itssignificanceanditschangesduringactiveimmunization”(Metcalf等人，ExperimentalPhysiology，44，pp.343-350，1959)的文献以及文献“Changesinbloodlymphocytecytoplasmicrefractiveindexfollowingskingraftinginrabbits”(Metcalf等人，Blood1972-39：pp.113-116)中描述了淋巴细胞的折射率变化。

本发明使得能够利用从别处获知的所述活化与计算的相对折射率之间的关系来评估淋巴细胞活化。

根据本发明的有利特性，该方法包括如下步骤：通过分析所述体积和光学消光的2D分布，并通过确定围绕所述淋巴细胞群体的统计学椭圆，为分类为淋巴细胞的颗粒计算活化指数，所述椭圆由其中心的位置、其长轴、其短轴和其角度定义。

利用本发明类似地能够利用体积和折射率信息确定围绕淋巴细胞的椭圆。此外，在VOL×IDX平面中，2D统计性质能够访问更精确的附加信息，因为它不与体积相关。

根据特定特征，本发明的方法包括借助于作为所计算的相对折射率IDX的函数的仿射表达式为分类为中性粒细胞的颗粒计算小叶度/颗粒度指数。

因为这种小叶/颗粒度和所计算相对折射之间的关系，本发明使得容易评估中性粒细胞的小叶/颗粒度。

根据本发明的有利特性，该方法包括如下步骤：通过分析2D分布(阻抗和消光)或(体积和折射率)测量，并通过确定围绕中性粒细胞群体的统计学椭圆，为分类为中性粒细胞的颗粒计算小叶度/颗粒度指数，所述椭圆由其中心的位置、其长轴、其短轴和其角度定义。

这一步骤使得能够获得平均指数。

根据特定特征，对事件分类的步骤将嗜碱性粒细胞与其他白细胞群体分开，并且包括如下步骤：

a)使用2D阈值化来分离与红细胞碎片、血小板聚集体、成红细胞、人为噪声等对应的本底噪声；以及

b)通过2D阈值化将嗜碱性粒细胞与其他白细胞分开，包括自动调节所述嗜碱性粒细胞与其他白细胞之间的阈值。

使用“2D阈值化”一词表示在RES×EXT、VOL×IDX平面中或在可用量值的任何组合的平面中进行阈值化处理。在保持次序关系的任何变换之后可能进行分类。

在继续测量和分类之前，利用特定的试剂(例如来自供应商HoribaMedical的ABXBasolyse试剂)处理相关样本，该试剂维持嗜碱性细胞的细胞核-细胞质比例。可以通过在RES×EXT平面中执行阈值化处理来执行自动定位方法，并且包括分析在其细胞核周围“收缩”的其他白细胞的分布。从中心和标准偏差开始，然后在“收缩”的白细胞上设置阈值。其他阈值是固定的。利用其他形式的开窗和其他调节方法，本发明的方法能够在VOL×IDX平面中做同样的事情。

有利地，本发明的方法包括如下步骤：检测呈现出异常相对折射率并实际上对应于由于存在脂血、晶体、气泡等而导致的干扰的事件。

这样的步骤用于检测样本质量，并从而检测已经对其执行的测量。

根据有利特性，该方法包括检测具有异常相对折射率和典型为乳液的体积分布的事件的步骤。然后检测到的事件包括干涉。于是本发明能够检测它们。

根据有利特性，所述方法包括利用所选波长用于生成荧光现象的光来照射测量体积的步骤、在测量体积中测量所生成的荧光的步骤，而对事件分类的步骤包括调节荧光分离阈值的子步骤，所述阈值是从所遇到的颗粒的统计参数，即极大值和标准偏差计算的。

通过向RES×EXT或VOL×IDX测量增加荧光作用测量，能够基于三种测量进行分类，给出关于事件的清楚信息条目。

根据特定特征，对识别为红细胞的事件分类的步骤根据基于测量荧光作用并对应于红细胞的成熟的极限的阈值将红细胞与网织红细胞分开，所述阈值具有适于以自动方式调节的默认值。

有利地，该方法包括如下步骤：利用作为其折射率IDX的函数的仿射表达式，计算被分类为网织红细胞群体中的颗粒的红细胞血红蛋白浓度。

本发明使得更容易利用血细胞血红蛋白和IDX之间的已知联系，计算血细胞血红蛋白，包括对于网织红细胞的群体。

根据特定特征，对识别为淋巴细胞或单核白细胞的事件分类的步骤根据针对荧光测量的阈值与具有高含量核酸(尤其是RNA)的其他颗粒分开，所述阈值对应于单核白细胞的成熟极限，所述阈值具有默认值并适于以自动方式调节。

根据特定特征，对识别为嗜中性或嗜酸性白细胞的事件进行分类的步骤根据荧光测量阈值分开粒性白细胞和不成熟的粒性白细胞，所述阈值对应于粒性成熟极限，所述阈值具有默认值并适于以自动方式调节。

本发明由此提供了一种对流体中存在的至少两个颗粒群体的折射进行分类和流量测量的方法。该方法使用的光源相干时间短、相干长度Lc<100μm，在根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选定的中心波长处并在消光条件下使用。该方法使用一种装置，该装置与光源协作以形成会聚照射光束，其孔径角是根据在选定中心波长针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的。然后让具有颗粒的流体流经测量孔口，以便在颗粒通过时测量阻抗变化(RES)。所述具有颗粒的流体流经光束照射的测量窗，并且在颗粒通过测量窗时在光束轴上测量消光EXT，利用具有会聚接收光束的装置或探测器这样做，所述会聚接收光束的孔径角是根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的。该方法合并RES和EXT数据，以便从其提取事件，使得能够针对每个事件评估相对折射率并利用从RES、EXT和IDX中选择的至少一个参数对所有事件分类。

附图说明

从参考附图做出的以下描述将明了本发明的其他特性和优点，附图示出了没有任何限制特性的实施方式。在附图中：

图1A和1B示出了利用现有技术装置在阻抗/激光衍射平面中获得的结果，分别利用了球形化能力低的试剂和球形化能力强的试剂；

图2是本发明的装置的图示；

图3A和3B示出了利用本发明的装置在阻抗/消光平面中获得的结果，分别利用了球形化指数弱的试剂和球形化指数强的试剂；

图4示出了作为红细胞血红蛋白浓度函数的水溶液折射率；

图5针对λ＝650nm和NA＝0.3示出了作为其体积和红细胞血红蛋白浓度(g/dL)函数的红细胞视消光值；

图6针对λ＝405nm和NA＝0.3示出了作为其体积和红细胞血红蛋白浓度(g/dL)函数的红细胞视区分值；

图7针对λ＝800nm和NA＝0.3示出了作为其体积和红细胞血红蛋白浓度(g/dL)函数的红细胞视区分值；

图8比较了针对两个不同分析器覆盖本参数高值和低值的28份血样测量平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)的结果；

图9A到9F示出了分别利用己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷和十二烷，利用本发明的装置进行的乳剂测量；

图10示出了作为折射率的函数的参数k和o的建模；

图11示出了以RES作为其横轴，以计算的折射率作为其纵轴的平面中各种乳剂的图示；

图12示出了VOL×EXT平面中的RBC/PLT矩阵；

图13是针对RBC和PLT分类的流程图；

图14示出了利用RES×EXT矩阵的RBC/PLT分类；

图15示出了图14的第一种选通期间使用的RBC/PLT矩阵的阈值；

图16A和16B示出了调节电阻分离的子步骤实施；

图17A到17C示出了调节消光分离的子步骤实施；

图18示出了如何从折射率计算血红蛋白浓度；

图19示出了按照体积和血红蛋白浓度进行的红细胞子分类；

图20示出了按照体积和密度进行的血小板子分类；

图21A和21B示出了微细胞摄入情况下的分类比较；

图22A和22B示出了针对大血小板的分类比较；

图23示出了RES×EXT矩阵上的白细胞分类；

图24示出了分析颗粒的2D椭圆分布针对白细胞群体的RES×EXT矩阵；

图25A、25B和25C示出了分别用于正常血液和两种病理血液的VOL×IDX矩阵；

图26A示出了用于鉴别嗜碱性细胞的通道上的RES×EXT分类，图26B和26C分别示出了利用VOL×IDX平面中的同样通道的正常血液和脂类干涉；

图27示出了测量颗粒折射与测量荧光作用耦合；

图28示出了RES×FLUO矩阵，用淡灰色示出了红细胞，用黑色示出了网织红细胞；

图29A和29B用淡灰色示出了红细胞的VOL×CHC矩阵，用黑色示出了网织红细胞，单独示出了网织红细胞的VOL×CHC矩阵；以及

图30示出了针对白细胞如何在EXT×FLUO矩阵上在荧光作用中区分未成熟细胞。

具体实施方式

在其最简单的版本中，该方法依赖于测量细胞悬浮液的两个参数，悬浮液取自在特定试剂中稀释的总血样。试剂可以是与血液同浓度的稀释剂，例如由供应商HoribaMedical销售的“ABX稀释剂”，或者可以是微分溶胞试剂，例如使用也是由供应商HoribaMedical销售的“Leukodiff”试剂进行红细胞的总体溶胞，同时保留来自循环血液的所有有核细胞。细胞悬浮液的特征在于每微升的细胞数，其自身取决于分析系统。例如，在借助于通量细胞计数装置，利用水聚焦原理，分析细胞悬浮液时，由血液同浓度稀释剂对总体血液的稀释约为1：1000。在试剂是用于差分溶胞时，稀释约为1：100。于是，对于可能正常或患病的血液，针对总血样的这些稀释水平能够制备每微升10到10000个细胞的细胞悬浮液。然后利用图2中示意性示出的装置获得测量的两个细胞特性，即1)通过电气方法测量的细胞体积V，以及2)光学消光信号。

图2中所示的装置包括光源S、聚光透镜L1、光阑D1、投影透镜L2、用于收集十字线D'1的图像的收集透镜L3、光电探测器D2和聚焦喷嘴BFC。

从图2中所示的工作于光学消光条件而非现有技术装置的激光衍射条件下的装置，获得图3A和3B。

图3A是利用本发明的装置，使用供应商HoribaABX销售的“Fluored”试剂(专利FR2759166)获得的。图3B是利用本发明的装置，使用供应商Bayer销售的具有强球形化能力的试剂获得的。在此应当观察出，在事件组的位置和组的形状两个方面，这些图都是可比拟的。

将这些图与图1A和1B比较，可以看出，本发明的装置在实测颗粒的形状方面提供了更好的容限。

在图2中所示的实施例中，直径为125μm的毛细管将细胞悬浮液引导到聚焦喷嘴BFC，聚焦喷嘴由直径为50μm的小孔构成。箭头表示的辅助流体用于使细胞悬浮液处于中心，直到其通过测量孔口。这一孔口用于由电方法进行体积测量。恒定的电流通过孔口。在颗粒通过孔口时，通道的阻抗被修改，并产生计数孔末端间电压的变化。这一电压与颗粒体积成正比。这种测量方法是已知的，在本说明书中未描述用于实施该方法所需的任何电子装置。

之后，将颗粒传输到光学分析窗口，通过投射强度尽可能均匀的光的十字线获得光学分析窗口。在每个颗粒上测量光学消光。应当观察到，根据本发明，照射光束为汇聚光束，其特征在于其数值孔径NA＝sinu，其中，u是光阑D1处的半孔径角。

在测量血管中，照射光束的数值孔径为NA1＝n*sinu。

常规上通过型装置获得均匀照明。照明的原理包括在透镜L2的光瞳中对光源S成像。这样能够，第一，具有位于透镜L2光瞳中的源S的单个图像，第二，使得光在十字线D'1的图像中分布均匀。

照明系统还可以基于使用成形的光学纤维，如申请人名下的专利WO2006/053960中所述。

光工作台的尺寸取决于光学窗口的尺寸，并且还取决于计数单元中射束的孔径。可以在平面P1中定义拉格朗日不变量I＝hu，其中，h是测量窗的半高，u是光束的半孔径角。在光学系统中的所有点保持这一不变量的值。为光阑D1的特征尺寸使用符号d，为光阑D1处的半孔径角使用符号θ，以下关系成立：

I＝hu＝dθ。

之后，光通量，写为φ，由光阑截取并由透镜L2收集，等于光束的几何范围，写为G，乘以源S的亮度L之积，即φ＝LG。由于在无损耗光学系统亮度L是守恒的，这一通量由几何范围G＝πSsin²θ固定，其中，S是光阑的面积，θ是半孔径角。

不失一般性地，假设光阑是方形的并且边长为d。然后由以下表达式给出通量：

φ＝LG＝Lπd²sin²θ≈Lπd²θ²，即φ≈πLI²。

这就表明，通量与如下量成比例：

·源的亮度L，这一参数是源的特性，被定义为每单位面积单位立体角发射的通量(瓦每平方米每球面度(w/m²/sr))；以及

·拉格朗日不变量I的平方，这一参数由计数单元内部光束的几何数据完全决定。

重要的是观察到，一旦将I设置在测量室旁边，就能够仅改变源的亮度来增大光学系统的功率。

在实践中，光阑为矩形形状，并且其尺度由两个考虑因素决定。更大的尺度由外壳流体的尺寸决定，这一直径基本是用于体积测量的孔口直径，直径大约为60μm。于是将这一尺度设置在100μm左右。

较小的尺度确定了测量的空间分辨率，即在彼此非常接近的两个细胞之间进行区分的能力。理想地，这一尺度应当尽可能地小。对于以速度v通过光窗口的生物颗粒，窗口的最小尺度界定了细胞暴露于光通量的持续时间，以及由此界定了对应于吸收和衍射物理现象的电脉冲持续时间。在实践中，这一尺度大约为30μm。应当发现，在通过时，分析窗口的这一高宽比大约为3。

理想地，应当从聚焦喷嘴距出口尽可能近地进行光学测量。在这一位置，因为液流的相干性，颗粒处于明确的位置。于是，从聚焦喷嘴BFC将光聚焦到出口紧后方相当自然。如果将从焦点到喷嘴出口的距离写为x，如果将喷嘴的半径写为y，那么umax＝x/y。于是，喷嘴的尺寸越小，形成光束孔径的可能性越大，并使得测光平衡越好。

为了结束对本发明的装置的光学特性的这种描述，应当观察到，设置参数G，即成像光学系统的放大率，使得系统被完全定义。这一参数是由空间考虑决定的。

需要距透镜L2非常远地放置大尺寸的光阑，而小尺寸光阑能够使用更为紧凑的设置，因为它距透镜L2更近。从拉格朗日不变量，能够以任意方式设置参数θ。于是，由关系d＝I/θ给出光阑D1的尺寸。一旦已经设置了这一参数，就充分确定了放大率G＝h/d。

如果设置了工作距离，如图2的装置上标记的β，那么对应值α＝β/G是所确定的值。应当观察到，参数β自身是由通常由玻璃或石英制成的测量室的壁厚以及需要通过的流体厚度设置的，流体通过以便到达沿聚焦喷嘴BFC对称轴的点表示的颗粒上游。在设置工作距离β时，出于可用空间的原因，应当考虑到一个光学厚度。最后，还确定了透镜的焦距，因为f＝αβ/(α+β)。这样在第一级设置了图2装置的光学和几何数据。

被颗粒衍射、反射或吸收的光在光的传播中造成扰动，由包括透镜L3和探测器D2的接收器探测该扰动。所有信号都对测量光学消光有贡献，下文称为消光并写作EXT。

透镜L3与探测器D2相关联构成装置的接收器部分。在装置的最简单版本中，接收光束的数值孔径等于照射光束的数值孔径。

数值孔径NA2＝n*sin(v)是接收器光学系统的数值孔径。

在装置的最简单版本中，接收光束的数值孔径等于照射光束的数值孔径。于是NA2＝NA1。由于微颗粒是在折射率为n的同一流体中被照明和测量的，因此能够推论，角度u和v是相等的。

更一般地，照射光束不必与用于观察微颗粒的光束具有相同数值孔径。这是光学显微术中公知的，其中，数值孔径定义照射光束的相干水平。此外，由于衍射现象一般是被照明对象处的场相干性的函数，所以预期光学系统的响应取决于照明系统的数值孔径NA1。

已知微颗粒通过的平面中光场的相干半径大约为rc＝λ/w，其中，λ是中心波长，w是照明光瞳的视直径。这是VanCittert-Zernike定理的结果。例如，在这一专题上可以参考L.Mandel和E.Wolf的著作，“Opticalcoherenceandquantumoptics”，CambridgeUniversityPress，1995，第188页。

于是，在本发明中，可能需要根据光学消光需要在更多或更少敏感程度上结合形态信息来改变测量点处照明的空间相干性，对于更多或更少的敏感程度，空间频率的范围可以更大或更小。例如，如果颗粒的空间频率高，由于表面颗粒度甚至颗粒内部的小粒(特定白细胞或血小板可能发生这种情况)，可以通过减小聚光透镜的数值孔径来降低照明的相干性。在这样的环境中，照射光束没有充分高的空间分辨率来揭示这些高空间频率的存在，测量光学消光对这种颗粒度将是敏感的。否则，与小粒的交互作用会得到增强，并且光学消光测量将相应地更多被标记。换言之，在对成像应用Abbe理论时，被分析颗粒的空间频率使入射光衍射。

这种交互作用产生一种谱，其特征在于在光与被分析对象交互作用之后具有角色散。用于观测的物镜由空间滤波器构成，其仅通过一些空间频率。滤波器的通带由数值孔径NA2界定。要获得角频谱和相干效应的更详细描述，可以参考JosephW.Goodman题为“IntroductiontoFourieroptics”的著作(第3版，RobertsCompany，Anglewood，Colorado，2005，第127页，第6章)。巴黎“Institutd'Optique”的S.Slansky的工作提供了关于NA1和NA2对于非常简单的对象，例如白色背景上的黑点的同时作用的信息，并表明通过适当选择比值NA1/NA2来优选对比度。

还可以参考例如S.Slansky的文章“Influencedelacohérencedel'éclairagesurlecontrastedel'imaged'unpointnoirenprésenced'unpetitdéfautdemiseaupoint”[theInfluenceofthecoherenceofilluminationonthecontrastintheimageofablackdotinthepresenceofasmallfocusingerror](JournalofModernOptics，Vol.2，No.3，1955年10月)。

尽管本发明未使用对比度的概念，但可以将这样的概念类比为本发明的有效折射测量，其包括可能更大或更小空间频率下的结构信息。最后，被分析颗粒的有效折射对应于体积V与被分析颗粒体积相同的均匀球体的折射，该球体在特征为(NA1、NA2、Lc、λ、a、b)的同一装置上产生与颗粒自身相同的光学消光现象，其中，NA1是照明的数值孔径，NA2是接收的数值孔径，Lc是源的相干长度，λ是中心波长，a是分析光学窗口的短尺度，处在颗粒的行进方向上，b是分析光学窗口的长尺度，垂直于颗粒的行进方向。例如，A.Doicu和T.Wriedt在其题为“EquivalentrefractiveindexofAspherewithmultiplesphericalinclusions”的文章中阐述了有效折射率概念的数值分析(J.Opt.A：PureAppl.Opt.3(2001)，第204-209页)。

最后，应当观察到，可以使用其他类型的光瞳，例如环形光瞳。这样的方案对应于未详细描述的本发明的特例。最后，应当发现，系统参数NA1、NA2、Lc、λ、a和b的选择在很大程度上取决于待分析颗粒的特性。

下文例示了为这些参数选择的值，用于测量循环血细胞的折射率。使用以下特性：

NA1＝NA2＝0.3，Lc＝15μm，λ＝0.650μm，

a＝30μm，b＝90μm。

通过光窗口的颗粒吸收并散射照射光束的光。这两个现象有助于减小光电信号的直流分量，这里称为“消光”。

本发明与解释波/颗粒交互作用的机制相关。如下所述，这种交互作用是入射波干扰和被分析颗粒散射的波的微妙结果。

使用了VandeHulst的理论方法，这是一种衍射现象的近似理论，并且还称为异常衍射理论。

根据本发明，研究平面波与均匀球体的交互作用在生物颗粒与焦平面附近的光束交互作用的领域内是有用的。在这一平面中，波结构基本是平面。如复电场表达的那样，可以将这一波如下书写：

E_o＝e^-ikz+ωt。

假设这个波的幅度是一，然后由如下形式的球面波对扩散波建模：

$E_{\mathrm{sca}}=S{\left(\mathrm{\&theta;}\right)}^{\frac{e^{-\mathrm{ikr}+\mathrm{\&omega;t}}}{\mathrm{ikr}}}.$

这一表达式涉及到函数S(θ)，其表示生物颗粒扩散的波幅度。具体而言，该函数揭示了扩散波作为参数θ的函数的空间分布的信息。

根据定义，针对θ＝0定义消光参数，将其写为Cext。

下文表明，可以将这一消光参数Cext表达为函数S(θ)的函数。

接近装置的光轴，可以观察到以下近似：

$r={(x^2+y^2+z^2)}^{1/2}={z(1+\frac{x^2+y^2}{z^2})}^{1/2}\&ap;z(1+\frac{x^2+y^2}{2z^2}).$

假设x，y<<z，可以将轴z附近的波写为：

$\begin{array}{c}{E}_{\mathrm{sac}}+E_0=s(\mathrm{\&theta;}=0)\frac{e^{-\mathrm{ikz}(1+\frac{x^2+y^2}{{2z}^2})+\mathrm{\&omega;t}}}{\mathrm{ikz}}+E_0\\ =s(\mathrm{\&theta;}=0)\frac{e^{-\mathrm{ikz}+\mathrm{\&omega;t}}{e}^{-\mathrm{ikz}\left(\frac{x^2+y^2}{{2x}^2}\right)}}{\mathrm{ikz}}+E_0\\ =s(\mathrm{\&theta;}=0)\frac{E_0{e}^{-\mathrm{ikz}\left(\frac{x^2+y^2}{2z^2}\right)}}{\mathrm{ikz}}+E_0\\ =E_0\{s(\mathrm{\&theta;}=0)\frac{e^{-\mathrm{ikz}\left(\frac{x^2+y^2}{2z^2}\right)}}{\mathrm{ikz}}+1\}.\end{array}$

通过取这一复数的模的平方获得强度：

$I(x,y)={|E_{\mathrm{sca}}+E_o|}^2={\left|E_0\right|}^2\{1+\frac{2}{\mathrm{kz}}\mathrm{Re}\{\frac{s(\mathrm{\&theta;}=0)}{i}{e}^{-\mathrm{ikz}\left(\frac{x^2+y^2}{2z^2}\right)}\left\}\right\}.$

那么，括号中的项就是复数1+w的模。此外，与1相比二阶项可以忽略，因为假设z充分大。

可以在居于轴z中心的小光瞳(pupil)的面积中对这一强度积分。这一积分写为下式：

$\underset{\mathrm{pupil}}{\&Integral;\&Integral;}I(x,y)\mathrm{dxdy}=\mathrm{Io}\underset{\mathrm{pupil}}{\&Integral;\&Integral;}\mathrm{dxdy}+\frac{2\mathrm{Io}}{\mathrm{kz}}\underset{\mathrm{pupil}}{\&Integral;\&Integral;}\mathrm{Re}\left\{\frac{s(\mathrm{\&theta;}=0)}{i}{e}^{-\mathrm{ikz}\left(\frac{x^2+y^2}{2z^2}\right)}\right\}\mathrm{dxdy}.$

这一积分表明，通过光瞳的光子通量是两项的结果：第一项表示没有生物颗粒时的光子通量，第二项表示有颗粒时的光子通量，颗粒通过衍射挤出光瞳的一部分。光通量守恒要求这一项为负。

利用H.C.VandeHulst的符号，可以写出下式：

$\underset{\mathrm{pupil}}{\&Integral;\&Integral;}I(x,y)\mathrm{dxdy}=O-C.$

仍然使用VandeHulst的表示法，第二项由均涉及项(2πz/ik)1/2的两个菲涅耳积分构成。在将积分扩展到(x，y)平面中的∞的极限时，可以推导出以下基本公式：

$C_{\mathrm{ext}}=\frac{4\mathrm{\&pi;}}{k^2}\mathrm{Re}\left\{S(\mathrm{\&theta;}=0)\right\},$

其中，k＝2π/λ，

并且，

$Q_{\mathrm{ext}}=\frac{4}{x^2}\mathrm{Re}\left\{S(\mathrm{\&theta;}=0)\right\},$

其中，x＝ka，a是颗粒的半径。

于是能够通过简单的几何考虑确定函数S(θ＝0)。

VandeHulst的推理使得能够通过计算以下积分确定这一函数：

其中，在生物颗粒投射的阴影中取积分。

可以精确计算这一积分，以便给出如下表达式：

S(θ＝0°)＝x²K(iρ)，

其中：

$K\left(w\right)=\frac{1}{2}+\frac{e^{-w}}{w}+\frac{e^{-w}-1}{w^2}.$

于是，通过对这些结果求平均值，能够将消光系数写成如下形式：

Qext＝2-(4/ρ)sinρ+(4/ρ²)(1-cosρ)

ρ＝2(2π/λ)a|m-1|

m＝IDX对应于本说明书序言中定义的微颗粒折射。对于红细胞，可以由以下公式给出m：

m-1＝(α/no)*Hc–i(Ln10/πΜ)*(λε_μm/no)Hc。

应当看出，红细胞，通常任何颗粒的折射是由复数表示的。实数部分对入射波的相位有影响。例如，它可以是R.Barer和S.Joseph在题为“Refractometryoflivingcells”的文章(QuarterlyJournalofMicroscopicalScience，Vol.95，第4部分，第399-423页，1954年12月)中执行的分析和观测结果。虚数部分导致吸收，其发展导致不超过Beer-Lambert定律的应用。

可以利用以下公式计算来自探测器D2的信号Si：

Si＝Po–Qext*Po*(πr²/axb)。

在光电信号已经由高通型电子电路滤波之后，利用如下公式确定因存在颗粒而产生的消光：

EXT＝Po*Qext*(πr²/axb)。

利用以下数值数据：

no＝1.34，没有血红蛋白时的细胞质折射率，认为等于红细胞沉浸其中的流体的折射率；

NL＝1.335，颗粒沉浸其中的流体的折射率；

α＝0.0019分升每克(dL/g)，取决于溶质，这里为血红蛋白的常数；

Hc＝22g/dL到46g/dL，血细胞血红蛋白变化的范围；

M：66650道尔顿(D)，血红蛋白的分子质量；

λ＝0.650μm，照明波长；

εμm:0.2520平方厘米每微摩(cm²/μmol)，摩尔消光系数；

Po＝1.00微瓦(μW)，光束的功率；

a＝33μm，分析窗口的短尺度；以及

b＝100μm，分析窗口的长尺度。

结合在一起考虑，这种理论和数值数据能够预测图4的曲线，其示出了红细胞作为血红蛋白浓度函数的折射率IDX。

图5针对血红蛋白浓度的各种等效值更精确地示出了作为球状颗粒体积V的函数的消光信号EXT。图5示出了对于给定体积，红细胞中血红蛋白越多，其消光就越大。

这组曲线是上述计算的结果，上述计算是为了表明红细胞的消光信号不仅是其体积的函数，而且是其折射率的函数，折射率自身线性依赖于其血红蛋白浓度。

这种解决方案并非无足轻重，因为在405nm波长处，计算的该组曲线如图6所示，表明确定(CHC，V)没有唯一解，这表示不能在该波长处测量这些参数。

相反，在红外区中测量更加有利，如图7所示，其中，照明波长为800nm。

图8比较了针对覆盖本参数高值和低值的28份血样测量平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)的结果。横轴对应于HoribaABX范围的分析器(Pentra120)获得的MCHC值，而纵轴给出了本发明的方法确定的，并对应于在测量CHC参数的所有红细胞上计算的平均值的本参数的值。应当看出，给出的结果(R²≈0.9)令人满意，首先，本参数的小幅度为Wintrobe常数，第二，确定本参数所应用的方法有差异。在血液病学分析器上，利用以下公式组合多个独立测量结果以确定MCHC的值，例如：记做#RBC的红细胞总数，记做MCV的平均细胞体积，以及记做Hb的样本中血红蛋白重量：

计算的MCHC＝Hb/(HT＝MCV×#RBC)。

在本发明中，直接从阻抗和消光测量结果导出MCHC，使得计算仅涉及两个独立测量结果而非三个。

在实践中，用于采集试验数据的装置是图2中所示的装置。在进行本发明方法的测量之前，利用选择的使红细胞呈球形的试剂稀释血样。球形化能力通常是通过表面活性剂实现的。试剂还可以包括染料或荧光染料。存在这些化学元素(element)能够测量细胞的其他性质，例如申请人名下的专利FR2759166中所述的那些性质。

假设这种测量原理已知，以下描述涉及用于反演的模型，即，通过阻抗法根据消光测量结果和体积测量结果确定球状颗粒的参数。目的是能够对进行的测量进行反演。

有利地基于试验数据确定反演模型，以避免受到求解正演问题中包括的近似和假设影响。

为了求解反演问题，从有机溶剂制备一组乳剂，选择有机溶剂使其具有已知的折射率并接近要分析的生物颗粒折射率。

对于红细胞，选择的溶剂是烷烃系列，其折射率处于650nm照明波长处感兴趣的范围中。

于是下表给出了所用溶剂折射率IDX的值：

观测乳剂使得能够针对每个系列(己烷、庚烷……)，以及由此针对每个折射率，根据由阻抗测量的体积对光学消光响应建模。

可以使用各种模型。在下文中，为了求解问题而选择的模型是对数模型。然后通过下式对系列i的消光响应EXT建模：

EXT＝k_i.ln(RES+t)+o_i，

其中，k_i和o_i是系列的参数，t是常数，在本范例中，对于RBC/PLT通道而言为3000，用于改善模型k_i和o_i的拟合。这里应当看出，常数t作为所用机器的函数并作为被分析颗粒的函数而变化。具体而言，在分析白细胞时可能不同。

试验表明，能够使用这样的对数模型建立乳液的(体积×消光)响应之间的对应关系。每种溶剂的乳液产生一组小滴，其体积在本发明装置的测量范围内连续分布。每个小滴都具有由容积性质明确界定的折射率。

这由图9A到9F示出，其中，每个小滴由平面上的点表示，点由横轴值和纵轴值定义，横轴值对应于小滴的体积V(这里按照通道数示出了刻度)，纵轴值对应于小滴的消光，也按照通道数表示。

在曲线图上以如下形式标记针对每次测量的计算内插函数：

y＝k_i.ln(x+t)+o_i，

其中，i是溶剂的指数。

于是，对于未知折射率而言，反演问题包括确定对数模型的参数，即参数k_i和o_i。

获得的试验数据针对考虑的指数范围产生以下目标：

于是能够用图10中所示的仿射近似根据指数对这些系数粗略建模。

于是获得了以下方程，其中，i是指数：

k_i＝a.i+b，

o_i＝c.i+d，

其中，a、b、c和d是通过所述仿射近似获得的。在图10中，参数为：

a＝78519，b＝-106853，c＝-624927并且d＝850440。

将系数的这种线性近似与对数模型联合能够基于试验系数求解反演问题。

EXT＝k_i.ln(RES+t)+o_i

＝(a.i+b).ln(RES+t)+c.i+d

＝(a.ln(RES+t)+c).i+b.ln(RES+t)+d，

其中：

i＝(EXT-b.ln(RES+t)-d)/(a.ln(RES+t)+c)。

于是，对于阻抗测量的给定体积的消光水平使得能够确定折射率。

通过确定试验中使用的乳剂的指数展示确定指数的这种能力。在图11中示出了这个结果。

下文中，接着描述利用本发明的方法分离红细胞和血小板的方法。

红细胞，记为RBC，和血小板，记为PLT的这种分离原理依赖于两种区分标准。第一种由自动血液病学分析器的大部分制造商使用。它就是体积。

对于正常的血液，血小板PLT的平均体积处于6fL到10fL的范围中，而红细胞的平均值处于80fL到100fL的范围中。电阻脉冲的实测大小表示体积，从而能够对这两种群体分类。

可以使用第二种标准来改进RBC/PLT的区分。这就是血红蛋白浓度。血小板PLT没有任何血红蛋白，而红细胞的平均血红蛋白浓度处于31g/dL到35g/dL范围中。作为光学掩模特征的消光脉冲的实测大小表示这种血红蛋白含量。

因此，似乎适于基于RBC/PLT矩阵中的事件位置，利用2D阈值化方式进行分离，从而将矩阵细分成相邻的多边形。

然后，利用图12中用虚线绘制的阈值，根据每个细胞的血细胞血红蛋白在RBC类别之间增加区别。

图12中示出了RES×EXT平面中给出RBC/PLT基质形状的群体布置。

分类算法分两步进行：

·对红细胞和血小板分类；以及

·根据其血红蛋白对红细胞子分类，根据其密度对血小板子分类。

这些分类依赖于同样的原理，包括如下操作：执行选通或开窗口操作，或利用RES×EXT、VOL×CHC(红细胞血红蛋白浓度)或VOL×DENS(血小板密度)矩阵通过选择阈值执行人工选择。

下文解释选通操作。

首先，在参考系中以有限数量的线段形式生成多边形，其第一个附着于最后一个，以便形成多边形。

然后在参照系外部选择参考点。

执行测试，以通过统计多边形的多少线段与将参考点连接到被测试点的线段相交，来确定给定点是否位于多边形之内。

当且仅当该数量为奇数时，该点才位于多边形中。

如果从参考点到被测点的线段通过顶点到达多边形，那么移动参考点。

之后，如下测试两条线段[P1-P2]和[P3-P4]是否相交。

一开始计算以下大小：

Xa＝X2-X1

Ya＝Y2-Y1

Xb＝X3-X1

Yb＝Y3-Y1

Xc＝X3-X4

Yc＝Y3-Y4

d＝Xa.Yc-Ya.Xc；

如果d＝0，那么这些线段对准。

在这种情况下，如果它们属于同一直线(斜率、偏移)，并且如果在该条线上，线段的一端位于另一线段的两端之间，那么仅在这时线段才相交。

否则进行如下计算：

在图12中所示的合成矩阵上，通过绘制不同类型的线表示若干种阈值。细线的阈值是固定阈值。通过执行计算算法默认设置的参数确定它们。粗线阈值对应于自动阈值，可以通过分类算法找到那些阈值。

下表给出了RBC/PLT分类算法的类别。

图13是用于分类算法的流程图。

第一分类步骤E0包括将每个事件初始化为类别NI。

这一步骤E1利用图14中所示的RES×EXT矩阵对所有事件分类。然后适当地开始RBC/PLT分类的步骤E10。

于是在RBC/PLT分类步骤的初步子步骤E10中识别了以下群体：RBC(红细胞)、PLT(血小板)、PEC(小细胞分子元素)和SAT(饱和元素)。

对于包括第一选通操作的这个第一子步骤E10，使用阈值rPLTh和aPLTh，以便在原点具有斜率和偏移，用于消光分离。血小板的分离不限于rPLTh。于是这种选通操作依赖于图15的矩阵。

之后，在子步骤E11中，对无消光单元的电阻分离进行调节。这是为了获得无消光红细胞和血小板之间的良好分离。未通过光学方式看到的血小板是小尺寸的。因此，这证明不利用体积信息来将它们与红细胞分开。这种选择似乎比由利用消光非零的血小板找到的阈值进行外插构成的选择更好。

对于这一子步骤E11，仅考虑分类为血小板和红细胞的事件。评估它们的横坐标值H_RES以便生成直方图。搜索直方图中的谷。如果谷展示出红细胞的双群体，由于谷中发生事件的数目大，所以对另一谷进行搜索。一旦发现了血小板和红细胞之间的谷，如果其得到充分标记，那么在谷上再次调节阈值rPLTl。

之后，在子步骤E12中，进行电阻分离的调节。为此目的，利用以下表达式事先计算消光中分离原点处的斜率(slope)和偏移(offset)：

$\mathrm{slope}=\frac{\mathrm{aPLTh}-\mathrm{aPEC}}{\mathrm{rPLTh}-\mathrm{rPEC}}$

offset＝aPEC-slope·rPEC。

在子步骤E11中调节阈值rPLTh之后重新计算阈值aPLTh时，这是必要的。

仅将分类为血小板的事件视为这个点。使用它们的横坐标值H_RES生成直方图。在其中搜索谷。如果该谷得到很好标记，在其上重新调节阈值rPLTl。这一子步骤允许这样的情况：消光分离通过红细胞云切割。

如果未发现谷或者如果谷不够清楚，那么通过统计方式计算rPLTh的值。这先验地表示消光分离仅隔离血小板。从这个云推论出平均μ和标准偏差σ。在图16A和16B中示出了这种情况。

那么能够写出：

rPLTh＝μ+rFACTOR·σ，

从其能够推论出：

aPLTh＝slope·rPLTh+offset。

在调节消光分离的子步骤E13中，仅考虑消光不是零的分类为血小板和红细胞的事件。

于是，如图17A到17C中所示，绕中心(2048，2048)旋转角度

$\mathrm{\&theta;}=270-a\tan \left(\mathrm{slope}\right)\&times;\frac{360}{2\mathrm{\&pi;}},$ 其中， $\mathrm{slope}=\frac{\mathrm{aPLTh}-\mathrm{aPEC}}{\mathrm{rPLTh}-\mathrm{rPEC}},$

给出新的轴：

X₁＝cosθ(X-2048)+sinθ(Y-2048)+2048

Y₁＝-sinθ(X-2048)+cosθ(Y-2048)+2048。

评估事件的横坐标值X₁以生成直方图。在直方图中搜索谷。如果谷得到充分标记，然后作为其函数重新计算阈值aPEC和aPLTl，否则将它们保持不变。

然后，子步骤E14利用重新调节的阈值对RES×EXT矩阵进行RBC/PLT分类。

然后进行对RBC和PLT子分类的步骤E2。

这一步骤E2包括对红细胞和血小板子群体分类。

在第一步骤E20中，如下计算每个颗粒的折射率：

$\mathrm{IDX}=\frac{H\_\mathrm{ABS}-b.\ln (H\_\mathrm{RES}+3000)-d}{a.\ln (H\_\mathrm{RES}+3000)+c}.$

其中，A、B、C、D和T为取决于试验条件和测量周期的系数。

之后，为了能够分离低色素性、高色素性和正常色素的红细胞群体，必须要在子步骤E21中计算它们的红细胞血红蛋白浓度(CHC)。于是，基于事件分类并利用以下表达式向红细胞应用折射率到红细胞血红蛋白浓度的变换：

HGBc＝hgbcSlope*IDX+hgbcOffset。

于是图18示出了如何从折射率计算红细胞血红蛋白浓度。

在子步骤E22中，基于VOL×CHC矩阵通过体积和红细胞血红蛋白浓度对红细胞进行子分类。这样能够在低色素性、高色素性和正常色素的群体之间以及小红细胞和大红细胞群体之间进行区分。于是获得九种红细胞子群体，并可以在图19中示出。

如果它们的体积在阈值volMic之下，它们是小红细胞，如果大于volMac，它们是大红细胞，否则认为它们正常。

之后，如果它们的血红蛋白浓度小于阈值CHCL，它们是低色素性的，如果它们的血红蛋白浓度大于阈值CHCH，它们是高色素性的，否则认为它们是正常的。

此外，由于血小板密度提供了关于血小板活化的信息，所以还在子步骤E23中并行计算血小板的密度。通过同样方式，从而能够通过针对分类为这种的事件的另一种仿射变换评估血小板密度，因为从阻抗测量知道了它们的体积，所以能够确定干燥重量：

PLT_COMPO＝DENS＝compoSlope*IDX+compoOffset。

之后，在子步骤E24中，按照它们的体积和它们的密度对血小板子分类。

从图20中所示的VOL×DENS矩阵，对血小板进行子分类，以便在活化的血小板、小的血小板和大的血小板之间进行区分。从图20中可以看出，这产生了四个血小板子群体。

如果它们的体积小于20fL，那么它们是小的血小板，如果大于20fL，它们是大的血小板。

之后，如果它们的密度小于阈值PLTa，它们是活化的血小板。

发现本发明在RES×EXT矩阵中实现的分离对微细胞摄入非常有效。由于红细胞的体积更小，其容易接近最大的血小板体积。因此难以通过特定方式在仅执行电阻测量的同时在最大的血小板和最小的小红细胞之间进行分离。于是可以看出，本发明的分离与纯粹电阻的分离相比具有优点。

此外，还难以仅仅基于区分将血小板与小红细胞分开，因为小红细胞的血红蛋白含量因其尺寸天然很小。然而，通过组合这两个测量值，完全有可能实现适当的分离。

图21A和21B示出了微细胞摄入情况下的分类比较。

对于大的血小板而言，发现这种分离同样引人关注。在这种情况下，在使用电阻通道分离时，26％的血小板是被识别为红细胞的大血小板。

图22A和22B针对大血小板的情况比较了分类。

利用本发明实施分类的质量对临床有意义，从而能够诊断β-地中海贫血。

已知β-地中海贫血的特征是低色素性的小红细胞贫血。已经表明，小红细胞的百分比与低色素性细胞百分比的比值是在缺铁性贫血和β-地中海贫血之间区分的可靠手段。

本发明还能够访问血小板活化，因为平均血小板密度(MPD)用于确定被活化的血小板比例，从而可能确定血栓形成的风险。

最后，本发明使得能够检测到血小板的定性异常，尤其是大的血小板的存在。

接下来简要描述如何利用本发明对白细胞进行分类。

图23示出了RES×EXT矩阵，用于利用选通来分析白细胞以分离群体。

利用本发明，在针对所考虑点的RES×EXT平面中或者在VOL×IDX平面中计算2D统计，以便找到线性回归。

提取趋势线的斜率，旋转平面以便使得这条线水平。

然后进行一维(1D)统计，Xs和Ys的标准偏差分别通过给出标准偏差轴的两个参数Xc和Yc给出椭圆的长轴和短轴。

获得椭圆(例如Xc，Yc)，其中，长轴等于旋转后的Xs标准偏差的Xc倍，短轴等于旋转后Ys标准偏差的Yc倍。实际上，根据被考虑群体中事件数量并根据群体的性质自动调节这些因素。以图24所示的方式在RES×EXT矩阵上，或者在VOL×IDX矩阵上有利地显示这种椭圆。

在这幅图中，中性粒细胞(NEU)被长轴和短轴比为2.5的椭圆围绕。淋巴细胞被长轴和短轴对于多达30个事件，比例为2.0，对于30到100个事件比例为2.25，对于超过100个事件比例为2.5的椭圆围绕。

图25A、25B和25C示出了VOL×IDX矩阵，在其上可以分别针对正常血液和两种病理学血液绘制椭圆。

于是，在图25B上，能够观察到存在不成熟的粒状中性粒细胞，且形式为亚分割的或脱粒的。还可以看出，中性粒细胞的平均高度小于针对正常血液观察到的：1384而非1391。

在图25C中，可以看出，淋巴细胞的位置低于正常血液：1378而非1383。

图26A、26B和26C示出了利用另一种制备方法和试剂，如专利FR2791138中所述，获得嗜碱性细胞的分类。

图26A示出了RES×EXT平面中的分类，其中，嗜碱性细胞被椭圆围绕。

图26B示出了同样的血液，但是在VOL×IDX平面中。与嗜碱性细胞对应的点云被椭圆围绕。

图26C示出了由于存在内脂质导致的干扰结果。观察到指数分布在大约1.47的值处具有峰，对于在本发明试验条件下的白细胞而言这是一个大值。

于是，本发明能够在高于1.46的折射率的干涉间进行区分。在这个高折射率部分中，存在体积的连续流(continuum)，通常为乳液。这样使得能够指出在分析样本时有问题。

最后，应当看出，可以基于本发明的原理进行各种实施。

例如，可以将本发明用于测量颗粒折射的方法与荧光作用的测量耦合，如图27中所示。在这样的装置中，根据本发明，基于用电方法测量体积以及测量光学消光来测量颗粒折射的方法与测量荧光作用相关联。利用核酸染料，例如“Fluowhite”或“Fluored”试剂中包含的核酸染料(专利FR2821428和FR2759166中描述的)，能够逐个颗粒地进行这种测量。

在那些专利中，提到噻唑橙作为标记核酸的手段。于是，在图27的装置中，布置第一光源S1，诸如LED，以便照明在测量室M之内的点I处从图27的平面离开的一束颗粒。第二测量光束也聚焦于点I上，该光束来自第二光源S2，使得来自S1和S2的光束在点I交汇，每个光束都经由测量室M的相应表面出现。

例如，在专利申请FR08/54229中由申请人描述了这种照明布置。应当看出，由L1型的第一光学组合对第一光束成形以形成呈现出本专利申请中所述照明特性的光束，即该光束具有尺度为a×b的矩形截面，其尺度等于a＝30μm，b＝90μm，使得高宽比，即a/b等于1：3。假设系统的相干长度Lc大约为λ/δλ≈15μm，对于δλ＝30nm的谱宽度，照射波长中心处于λ＝650nm。数值孔径为NA1＝NA2＝0.3。在本范例中，注意第二光源S2，其由发射以488nm波长为中心的基本单色光的半导体激光二极管构成。接下来描述耦合到测量室并在这样的照明条件下工作的检测系统的配置。

将检测系统沿着相干性更低的光源，即S1的方向耦合到测量室。因此其以九十度耦合到相干性更大的光源，即S2。微颗粒和照射光束之间交互作用产生的光被单个接收器光学系统(表示为L2)收集，聚焦在I，即，通过光学系统F2使来自点I的光束平行。

光束具有各种谱成分，由一组滤波器F1、F2和F3对谱成分分析，以便在这种特定配置中，在执行消光测量的光和荧光作用导致的光之间进行区分。

在特定的情况下，如专利FR2759166中所述，由噻唑橙分子先前标记过核酸，滤波器F1是二色性型滤波器，其相对于入射光束以九十度反射所有小于580nm的谱成分，并透射大于580nm的谱成分。

滤波器F2和F3是带通型滤波器，用于优化探测器D1和D2处不希望有的谱成分的排除。具体而言，探测器D1必须仅对噻唑橙的荧光作用的谱成分敏感，限于宽度为50nm且以530nm为中心的谱。

在D1处，必须要将其他波长排除超过10⁵，尤其是对于来自光源S1，完全照射接收器光学系统L2光瞳的光源S1。

F1、F2和F3优选是多介质滤波器。给定光源S1的定义，滤波器F2自然以波长650nm为中心，通带大约为50nm。于是，在这种特定的装置中，能够对每个颗粒进行三种物理测量：表示颗粒体积的电测量；与颗粒折射相关联的消光测量；还有与被分析颗粒的核酸含量相关联的荧光作用测量。例如，这种装置对于测量称为网织红细胞的不成熟红细胞折射特别有利。

荧光作用值使得能够仅仅利用阈值化操作将先前由红细胞/血小板分离识别的红细胞与网织红细胞分开。如果荧光作用值超过阈值，那么将颗粒重新分类为网织红细胞，如图28所示。

可以通过对先前识别为红细胞的群体进行统计分析来自动调节红细胞和网织红细胞之间的分离阈值。为了这样做，画出荧光作用直方图，从其提取出写为fSigma的标准偏差和写为fMode的最大密度。

然后确定下值：

SeparationThreshold＝fMode+fF1SigmaCoef*fSigma＝fF1Offset。

其中，fF1SigmaCoef和fF1Offset是可调参数。

然后像对红细胞群体那样进行分类，以便确定它们的折射率，然后确定它们的血细胞血红蛋白。

然后能够获得网织红细胞在VOL×CHCr矩阵中的表达，从而访问临床参数CHr＝MRV×E(CHCr)，图29B。MRV是平均网织红细胞体积，E(CHCr)是CHCr分布的期望值。最后，由于需要在红色或近红外区中执行消光测量，所以可能为荧光拓宽测量带。适当选择荧光染料之后，本领域的技术人员知道如何标记各种特别的隔室，例如膜、线粒体和细胞质。

图30在EXT×FLUO平面中示出了有可能利用荧光作用分开具有不同成熟水平的群体。

荧光作用值使得能够仅仅利用阈值化操作区分先前由图23的矩阵识别的粒性白细胞和不成熟的粒性白细胞。如果荧光作用值超过阈值，那么将颗粒重新分类为不成熟的粒性白细胞，如图30所示。对于骨髓细胞系的病变(急性粒细胞性白血病(AML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、骨髓增生性综合症(MPS)、骨髓发育异常综合症(MDS))，存在不成熟的粒性白细胞可能会歪曲中性粒细胞指数的测量值，荧光作用测量使得能够更好地仅靠自身识别中性粒细胞群体，从而确保仅在该群体上执行折射率测量。

荧光作用值用于仅利用阈值化操作将先前在图23的矩阵中识别的淋巴细胞和单核白细胞与高RNA含量(HRC)或未成熟细胞区分开。如果荧光作用值超过阈值，那么将细胞重新分类为HRC细胞，如图30所示。对于与淋巴相关的病变(急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴母细胞性白血病(CLL))，测量荧光作用使得能够更好地依靠自身识别正常淋巴细胞群体，从而确保仅在该群体上执行折射率测量。

另一种标记可以由利用耦合到荧光性化合物的单克隆抗体构成。可以由多通道探测器分析来自荧光化合物的多种荧光，其中，每个通道提供关于每种荧光化合物荧光作用强度的信息。本领域的技术人员知道，处理这样的荧光能够更好地识别特定的细胞群体。可以发现这种多荧光作用测量对于白细胞尤其有利，对于白细胞，可以与其表现型一起，例如利用专利FR2895087由CD45、CD38和CD138表现型检测到的浆细胞，一起测量有效折射率。

Claims (29)

1.一种利用光源对流体中存在的至少两个颗粒群体的折射IDX进行分类和流量测量的方法，所述光源的相干时间短、相干长度Lc<100μm，在根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的中心波长处并在消光条件下使用，所述方法包括如下步骤：

·使用所述光源形成会聚的照射光束，其孔径角处于1°到60°范围中，根据在选定的中心波长处针对所考虑颗粒预期的所述体积范围和所述折射率范围选择，并且提供的光照均匀度在尺度为a×b×c的矩形体积中好于10％，其中，a×b是高宽比a/b小于4的光束的矩形截面，并且其中，c是景深，被定义为功率改变不超过10％的相对于测量点的距离范围，其值位于500μm±250μm处；

·令具有颗粒的所述流体流经测量孔口；

·在所述颗粒经过所述测量孔口时测量阻抗变化RES；

·令具有颗粒的所述流体在测量窗中流动，所述测量窗被置于出口处的光束从所述测量孔口照射；

·在所述颗粒通过所述测量窗时，测量所述光束的轴上的消光EXT，利用具有会聚接收光束的装置或探测器进行所述测量，所述会聚接收光束的孔径角处于1°到60°范围中，根据针对所考虑颗粒预期的所述体积范围和所述折射率范围选择；

·合并RES和EXT数据以从其形成事件；

·根据RES和EXT，针对每个事件计算折射IDX；以及

·使用从RES、EXT和IDX中选择的至少一个参数对所有事件分类。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述会聚照射光束的孔径角处于10°到60°范围中。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于利用如下类型的表达式计算所述折射：

$\text{ID}X=\frac{EXT-B.ln(RES+T)-D}{A.ln(RES+T)+C},$

其中，A、B、C、D和T是取决于测量周期的系数。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于被分析的颗粒是生物学液体中的细胞。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于用于测量颗粒折射的所述中心波长位于红色和超过0.6μm的近红外区中。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤利用处于600nm到800nm并且数值孔径NA1＝NA2处于0.2到0.6范围中的波长来分开红细胞和血小板，包括如下步骤：根据界定血小板所属区的默认阈值来分开红细胞和血小板，所属阈值具有默认值并且能够被自动调节，其中NA1是照射光束的数值孔径，NA2是接收光束的数值孔径。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤包括如下子步骤：通过在从遇到的所有颗粒准备的直方图中确定谷，来调节不能测量消光的颗粒之间的电阻分离阈值。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤包括如下子步骤：调节根据分离阈值之下遇到的颗粒的统计参数，即均值和标准偏差而计算的电阻分离阈值，所述分离阈值是由分离线定义的，所述分离线是作为阻抗变化和消光测量值的函数的仿射直线。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤包括如下子步骤：在旋转阻抗/消光的点的平面之后调节由仿射直线定义的阈值，所述仿射直线是阻抗变化和消光测量值的函数，从而通过在从位于分离线的任一侧的事件的横轴点形成的直方图中确定谷来垂直地放置所述分离线。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于包括如下步骤：借助于作为其折射IDX的函数的仿射表达式，来计算被分类为红细胞群体中的颗粒的红细胞血红蛋白浓度。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于包括如下子分类步骤：对低色素性、高色素性和正常色素的红细胞群体以及小红细胞、大红细胞和正常红细胞的红细胞群体进行分类。

12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于包括如下步骤：利用作为其折射的函数的仿射表达式，来计算分类在血小板群体中的颗粒密度。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于包括如下步骤：从通过阻抗测量获知的血小板密度和血小板体积来计算血小板的干重。

14.根据权利要求6所述的方法，其特征在于包括如下子分类步骤：对正常血小板、活化的血小板、小的血小板和大的血小板进行分类。

15.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤将白细胞群体分离为包括淋巴细胞、单核白细胞、粒性白细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞，并且包括如下步骤：

a)使用第一2D阈值化子步骤来分离与碎片、血小板聚集体、成红细胞、人为噪声对应的本底噪声；以及

b)使用相继的2D阈值化子步骤来分离各种群体和它们的非典型或不成熟子群体，并包括：

i)自动调节淋巴细胞与中性粒细胞之间的阈值的子步骤；

ii)自动调节嗜中性与嗜酸粒细胞之间的阈值的子步骤；以及

iii)自动调节单核白细胞与中性粒细胞之间的阈值的子步骤。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于包括如下步骤：借助于作为所计算的折射的函数的仿射表达式，为被分类为淋巴细胞的颗粒计算活化指数。

17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于包括如下步骤：通过分析体积和光学消光的2D分布，并通过确定围绕淋巴细胞群体的统计学椭圆，为被分类为淋巴细胞的颗粒计算活化指数，所述椭圆由其中心的位置、其长轴、其短轴和其角度定义。

18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于包括如下步骤：借助于作为所计算的折射IDX的函数的仿射表达式，为被分类为中性粒细胞的颗粒计算小叶度/颗粒度指数。

19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于包括如下步骤：通过分析在阻抗变化和消光测量中或者在体积和折射测量中的2D分布(REX×EXT或VOL×IDX)，并通过确定围绕中性粒细胞群体的统计学椭圆，为被分类为中性粒细胞的颗粒计算小叶度/颗粒度指数，所述椭圆由其中心的位置、其长轴、其短轴和其角度定义。

20.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤将嗜碱性粒细胞与其他白细胞群体分开，并且包括如下步骤：

a)使用2D阈值化分离与红细胞碎片、血小板聚集体、成红细胞、人为噪声对应的本底噪声；以及

b)通过2D阈值化将嗜碱性粒细胞与其他白细胞分开，包括自动调节所述嗜碱性粒细胞与其他白细胞之间的阈值。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于包括检测呈现出异常折射并实际上对应于由于存在脂质、晶体、气泡而导致的干扰的事件的步骤。

22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于包括检测具有异常折射和典型为乳液的体积分布的事件的步骤。

23.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法包括利用所选波长用于产生荧光现象的光来照射测量体积的步骤、测量所产生的荧光的步骤以及在调节荧光作用分离阈值之后对事件分类的步骤。

24.根据权利要求6所述的方法，其特征在于对识别为红细胞的事件分类的步骤根据基于测量荧光作用并对应于红细胞的成熟的极限的阈值将红细胞与网织红细胞分开，所述阈值具有适于以自动方式调节的默认值。

25.根据权利要求6所述的方法，其特征在于包括如下步骤：利用作为折射的函数的仿射表达式，来计算被分类在网织红细胞群体中的颗粒的红细胞血红蛋白浓度。

26.根据权利要求15所述的方法，其特征在于对识别为淋巴细胞或单核白细胞的事件分类的步骤根据针对荧光测量的阈值将淋巴细胞或单核白细胞与具有高含量核酸HRC的其他颗粒分开，所述阈值对应于单核白细胞的成熟极限，所述阈值具有默认值并适于以自动方式调节。

27.根据权利要求23所述的方法，其特征在于对识别为淋巴细胞或单核白细胞的事件分类的步骤根据针对荧光测量的阈值将淋巴细胞或单核白细胞与具有高含量核酸HRC的其他颗粒分开，所述阈值对应于单核白细胞的成熟极限，所述阈值具有默认值并适于以自动方式调节。

28.根据权利要求18所述的方法，其特征在于对识别为嗜中性或嗜酸性白细胞的事件分类的步骤根据荧光测量阈值分开粒性白细胞和不成熟的粒性白细胞，所述阈值对应于粒性白细胞的成熟极限，所述阈值具有默认值并适于以自动方式调节。

29.根据权利要求23所述的方法，其特征在于对识别为嗜中性或嗜酸性白细胞的事件分类的步骤根据荧光测量阈值分开粒性白细胞和不成熟的粒性白细胞，所述阈值对应于粒性白细胞的成熟极限，所述阈值具有默认值并适于以自动方式调节。