JP2022534866A - 粒子特性評価のための方法及びシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の実施形態の目的は、例えば細胞などの粒子を特性評価するための良好な方法及びシステムを提供することである。
液体環境における少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動を、少なくとも1つの瞬間にイメージングすることと、
イメージングされた液体環境における自由浮遊粒子の移動に基づいて、少なくとも1つの移動パラメータを、少なくとも1つの瞬間に決定することと、
少なくとも1つの移動パラメータから、少なくとも1つの粒子の特性を導出することと
を含む。
液体環境における少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動を、少なくとも複数の瞬間にイメージングすることと、
前記複数の瞬間のそれぞれについて、イメージングされた自由浮遊粒子の移動に基づいて移動パラメータを決定することと、
前記異なる移動パラメータから、少なくとも1つの粒子の特性を導出することと
を含んでいてもよい。
液体環境における少なくとも1つの自由浮遊粒子の、少なくとも1つの瞬間にイメージングされた移動を得るための入力手段と、
液体環境における自由浮遊粒子のイメージングされた移動に基づいて、少なくとも1つの瞬間に少なくとも1つの移動パラメータを決定し、少なくとも1つの移動パラメータから、少なくとも1つの粒子の少なくとも1つの特性を導出するためのプロセッサと
を含む。
液体環境における少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動を少なくとも1つの瞬間にイメージングするための、少なくとも1つの光学センサ、好ましくはカメラを含む光学系と、
上述のようなプロセッサと
を含む。
顕微鏡の倍率400倍で撮影した12秒間の動画(1000フレーム)を記録することで、細胞のX,Y方向の変位をモニタリングする。これらの動画を定期的に記録することで、細胞の時間的な挙動が、異なる濃度の抗真菌薬の関数として特徴付けられる。単一細胞の細胞変位を追跡するために、相互相関画像登録アルゴリズムが使用される。各フレームにおける細胞変位、追跡された細胞の軌跡とともに、総変位の二乗平均平方根も計算される。単一細胞の変位、すなわちナノモーションが、フレームごとの変位の分布をバイオリン図としてプロットすることで特徴付けられる。20個の細胞のセットの動作は、フレームごとのグループ化された細胞変位をバイオリン図としてプロットし、1000フレームにわたる20個の細胞の総変位を箱ひげ図としてプロットすることによって特徴付けられる。
以下、本発明の好ましい実施形態を、図面を参照して説明するが、当該図面は、本発明の好ましい実施形態を説明するためのものであり、これを限定するためのものではない。
すべての酵母株(表1)は、YPD寒天(20g/l)プレートからのコロニーをYPD(10g/l酵母エキス、20g/lペプトン、20g/lデキストロース)培地10mlに接種することによって培養した。培養液をエルレンマイヤーフラスコ(30℃及び200rpm)で一晩培養した。一晩培養したものを5mlのYPD培地中で10倍~20倍に希釈してOD600nmを0.5にした後、エルレンマイヤーフラスコ内で30℃及び200rpmで1時間増殖させた。その後、細胞濃度(OD600nm値)に応じて培養液をさらに希釈し、可視化に最適な細胞数を得た。
4ウェルのFulTracマイクロインサート(Ibidi社製、ドイツ)を用いて、イメージングマイクロディッシュ(Ibidi社製、ドイツ)のマイクロウェルの1つに、各酵母細胞培養液を10μlずつ分注した。測定を開始する前に、酵母細胞を10分間沈降させた。細胞の移動は、40倍の対物レンズを備えたNikon TE-2000顕微鏡を用いて、EMCCDカメラ(Andor iXon, Oxford Instruments社製)により、84fpsのフレームレートで1000フレームの動画を撮影して観察した。ペトリ皿は、顕微鏡ステージトップインキュベーター(Ibidi社製、ドイツ)を用いて30℃に保った。
光学ナノモーション検出アルゴリズムは、各フレームのセルの変位を計算し、追跡したセルの軌跡とともに、変位の二乗平均値もMS Excelファイルに保存する。このプログラムの主要部分は、Guizar-Sicairosら[14]のアルゴリズムに基づいており、オープンソースの画像処理ライブラリsci-kit image[38]でMatlabからPythonに移植されている。ND2 Nikonフォーマットの動画を取り込むために、Pythonパッケージnd2 reader(Verweij R, Online: http://www.lighthacking.nl/nd2reader/)を用いた。
先に説明したナノモーション解析は、個々の細胞の位置から始まるが、これは現在、最初のビデオフレーム内の細胞のバウンディングボックスを手動で選択することで提供されている。しかしながら、特にMICや異なる温度条件の影響を決定する場合、ビデオの数やビデオ内に存在する細胞の数がかなり多くなる可能性がある。さらに重要なことは、最初のビデオフレームのみではなく、数フレームごとに細胞の検出を行うことで、初期位置から離れてしまった細胞の位置を修正することができることである。このような場合、手動での検出作業はマルチフレームのアノテーションに数時間を要するため、細胞の自動検出プロセスに置き換える必要がある。そのため、ディープラーニングアルゴリズム、すなわち中規模のYOLOアーキテクチャを用いて、セルの検出を自動化することにした。学習プロセスは、ランダムに生成された50,000枚の合成細胞画像セットを用いて行われる。これらの合成画像は、我々が以前に提案した位相差イメージングモデル[39]を用いて得られたもので、細胞の分布、照明及びイメージングアーチファクトなどの点で、顕微鏡で得られた細胞画像と非常によく似ている。YOLOモデルを学習させた後、このモデルを使って実際の顕微鏡画像内の細胞を自動的に検出し、各検出結果を初期位置として、前述の相互相関アルゴリズムを使って光学ナノモーションを計算する。全体的な処理パイプラインは、大量のビデオシーケンスから始まり、フレームごとに自動化された単一細胞の検出を行う。次に、連続したフレーム間の急激な変化を補正するために、フレーム間の細胞の位置と検出信頼度とを平均化することで、結果を精緻化する。最後に、高い信頼度(すなわち0.6超)で検出された細胞の位置が、ナノモーション解析アルゴリズムの入力として提供される(図3d)。
全体的なプロセスは、一連のフレームを、細胞を含む画像として読み込み、10フレームごとに上述の細胞検出プロセスを適用して、自動的に検出された個々の細胞の位置を示すバウンディングボックスのセットを得ることである。それらの位置に基づいて、ビデオ解析処理の展開に合わせて時間的に細胞を追跡する。最後に、サブシーケンスリファインメントの段階で、バウンディングボックスで示された細胞の輪郭を見つけて、その中心がバウンディングボックスのそれとほぼ一致することを確認し、次いで、不一致があれば、細胞の検出信頼度に比例してペナルティを課す。さらに、バウンディングボックスの位置と検出信頼度とをフレーム間で平均化することで、セルの検出位置の急激な変化を防ぐ。
光学的に記録された酵母の細胞移動の周波数領域と臨界周波数とを計算するために、水平方向(x)と垂直方向(y)との2つの細胞移動の信号に対して算出されたFFT振幅スペクトルの計算に基づく手法を開発した。この方法をDouble Region Interpolation Method(DRIM)と名付けた。考え方としては、平均化された振幅に対して、2つの異なる周波数領域で2つの線形補間を行う。1つは、細胞の活動領域から十分に離れた、スペクトルの広帯域ノイズ部分で行う(例:5~10Hz)。もう1つは、細胞が活動している低周波領域で行う。この2本の直線の交点が、細胞活性領域の上限臨界周波数を決定する。
本論文内のプロットや本研究の他の知見を裏付けるデータは、要請に応じて対応する著者から入手可能である。
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Claims (45)
- 粒子特性を導出する方法であって、前記方法が、
- 液体環境における少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動を、少なくとも1つの瞬間にイメージングすることと、
- 前記イメージングされた液体環境における前記自由浮遊粒子の移動に基づいて、少なくとも1つの移動パラメータを、少なくとも1つの瞬間に決定することと、
- 前記少なくとも1つの移動パラメータから、前記少なくとも1つの粒子の少なくとも1つの特性を導出することと
を含む、方法。 - 前記少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動を時間の関数としてイメージングし、前記移動パラメータを時間の関数として決定する、請求項1記載の方法。
- 前記方法が、
- 少なくとも2つの瞬間に、前記少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動をイメージングし、それによって少なくとも第1のイメージングされた移動と第2のイメージングされた移動とを得ることと、
- 前記第1のイメージングされた移動と前記第2のイメージングされた移動との間の変化を決定することであって、前記変化が前記移動パラメータを示している、ことと
を含む、請求項1又は2記載の方法。 - 前記変化が、前記自由浮遊粒子の空間変位、及び/又は、前記自由浮遊粒子の前記空間変位に関連する速度、及び/又は、前記自由浮遊粒子の前記空間変位に関連する加速度、及び/又は、前記自由浮遊粒子の前記空間変位の分布、及び/又は、前記自由浮遊粒子の前記空間変位に関連する前記速度の分布、及び/又は、前記自由浮遊粒子の前記空間変位に関連する前記加速度の分布に対応する、請求項3記載の方法。
- 前記空間変位、及び/又は、前記空間変位に関連する前記速度、及び/又は、前記空間変位に関連する前記加速度、及び/又は、前記空間変位の前記分布、及び/又は、前記空間変位に関連する前記速度の前記分布、及び/又は、前記空間変位に関連する前記加速度の前記分布を、時間の関数として決定する、請求項4記載の方法。
- 前記空間変位を、少なくとも1つの空間方向に関して決定し、前記空間変位を、好ましくは2つ以上の空間方向に関して決定し、前記2つ以上の空間方向は、好ましくは互いに垂直に延びている、請求項4又は5記載の方法。
- 前記空間変位の量を測定し、
前記量から前記粒子の特性を導出し、及び/又は、前記空間変位の量を一定期間内に決定する、請求項4~6のいずれか1項記載の方法。 - 前記空間変位を、前記空間変位に関連する1つ以上の周波数を得るために、空間周波数変換し、前記1つ以上の周波数から前記粒子の特性を導出する、請求項4~7のいずれか1項記載の方法。
- 前記空間変位が、前記自由浮遊粒子の並進、及び/又は、前記自由浮遊粒子の回転、及び/又は、前記自由浮遊粒子の変形に対応する、請求項4~8のいずれか1項記載の方法。
- 前記自由浮遊粒子全体の空間変位、又は、前記自由浮遊粒子の少なくとも1つの部分の空間変位を決定し、
前記自由浮遊粒子全体の前記空間変位を、好ましくは、前記粒子の質量中心の前記空間変位から決定し、及び/又は、
前記自由浮遊粒子の少なくとも1つの部分の前記空間変位を、好ましくは、前記粒子の形状の変更から決定する、請求項4~9のいずれか1項記載の方法。 - 前記空間変位を、相互相関アルゴリズムを用いて決定する、請求項4~10のいずれか1項記載の方法。
- 前記移動パラメータを、単一粒子のイメージングされた移動から決定するか、又は
前記移動パラメータを、2つ以上の、好ましくは複数の粒子のイメージングされた移動から決定する、請求項1~11のいずれか1項記載の方法。 - 前記移動パラメータの決定のために1つ以上の粒子を選択することをさらに含み、前記選択は、手動選択及び/又は自動選択に対応し、前記自動選択は、好ましくは、1つ以上のモルフォロジー演算子及び/又はハフ変換及び/又はニューロンネットワーク及び/又はディープラーニング技術を適用して行う、請求項1~12のいずれか1項記載の方法。
- 前記少なくとも1つの自由浮遊粒子を、静止した液体環境及び/又は流動する液体環境に提供し、及び/又は、
前記液体環境を強制対流に供し、及び/又は、
前記液体環境を、チャンバ又はリザーバ又はチャネルなどの制限要素、好ましくはマイクロ流体デバイスのチャネルに提供するか、又は、液体環境を無制限に提供する、請求項1~13のいずれか1項記載の方法。 - 前記少なくとも1つの自由浮遊粒子を、1つ以上の化学的刺激及び/又は1つ以上の物理的刺激に供し、前記1つ以上の化学的刺激及び/又は物理的刺激の作用前及び/又は作用中及び/又は作用後に、前記少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動をイメージングする、請求項1~14のいずれか1項記載の方法。
- 1つ以上の化合物を前記液体環境に添加し、前記1つ以上の化合物が前記少なくとも1つの自由浮遊粒子に与える影響を、前記移動パラメータから導出する、請求項1~15のいずれか1項記載の方法。
- 前記1つ以上の化合物が前記液体環境と本質的に非混和性であり、及び/又は、
前記1つ以上の化合物を1つ以上の更なる化合物に提供し、前記1つ以上の更なる化合物は、好ましくは、前記液体環境と本質的に非混和性であり、及び/又は、
前記1つ以上の化合物が抗生物質又は抗真菌薬などの1つ以上の薬剤に対応する、請求項16記載の方法。 - 前記少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動を少なくとも1つの光学センサでイメージングし、前記光学センサは、好ましくはCCD又はCMOSカメラである、請求項1~17のいずれか1項記載の方法。
- 前記少なくとも1つの光学センサが、1マイクロ秒以上、好ましくは1秒以上、より好ましくは10秒以上、特に好ましくは50秒以上のフレームレートで、前記少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動をイメージングし、及び/又は、
前記少なくとも1つの光学センサが、前記少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動をサブピクセルの解像度でイメージングする、請求項18記載の方法。 - 前記少なくとも1つの光学センサが、前記少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動のイメージング中に静止しているか、又は、前記少なくとも1つの光学センサが、前記少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動のイメージング中に移動している、請求項18又は19記載の方法。
- 前記少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動を、顕微鏡などの少なくとも1つの拡大装置によって拡大しながらイメージングする、請求項1~20のいずれか1項記載の方法。
- 前記液体環境を前記少なくとも1つの光学センサ上に直接配置する、請求項18~21のいずれか1項記載の方法。
- 前記移動パラメータを、前記粒子の移動がイメージングされている間、及び/又は、前記粒子の移動がイメージングされた後に決定し、及び/又は、
前記粒子の特性を、前記粒子の移動がイメージングされている間、及び/又は、前記粒子の移動がイメージングされた後に、前記移動パラメータから導出する、請求項1~22のいずれか1項記載の方法。 - 前記方法が、
- 液体環境における少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動を、少なくとも複数の瞬間にイメージングすることと、
- 前記複数の瞬間のそれぞれについて、前記イメージングされた自由浮遊粒子の移動に基づいて移動パラメータを決定することと、
- 前記異なる移動パラメータから、少なくとも1つの粒子の特性を導出することと
を含む、請求項1~23のいずれか1項記載の方法。 - 前記方法が、複数の瞬間において、所定の期間にわたって映像を記録することにより、少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動をイメージングすることを含む、請求項24記載の方法。
- 前記少なくとも1つの自由浮遊粒子が、物体の表面又はより大きな粒子の表面に結合していない粒子である、請求項1~25のいずれか1項記載の方法。
- 前記移動が振動であり、前記移動パラメータが振動による移動パラメータであり、及び/又は、
前記方法が、異なる画像を登録することを含む、請求項1~26のいずれか1項記載の方法。 - 前記イメージングが、前記少なくとも1つの粒子の移動を光学的に記録することを含み、及び/又は、
前記イメージングが、光学系及びカメラを用いて光学的に記録することを含み、及び/又は、
前記イメージングが、所定の期間にわたって前記粒子の動画を記録することを含む、請求項1~27のいずれか1項記載の方法。 - 前記方法が、ニューラルネットワークを使用すること、及び/又は、ディープラーニング技術を使用することを含み、及び/又は、
前記方法が、トレーニングされたモデルを用いて少なくとも1つの粒子を検出することを含み、好ましくは、前記方法は、トレーニングされたモデルを用いて前記少なくとも1つの粒子の検出を精密化することを含む、請求項1~28のいずれか1項記載の方法。 - 前記少なくとも1つの粒子が複数の粒子を含む、請求項1~29のいずれか1項記載の方法。
- 前記液体環境が、前記粒子の移動が対流によって妨げられない拡散環境であり、及び/又は、
前記液体環境が、自然流体、例えば生物学的流体、好ましくは尿、脳脊髄液、痰、又は血液であり、及び/又は、
前記液体環境が人工流体である、請求項1~30のいずれか1項記載の方法。 - 前記少なくとも1つの粒子の特性が、前記少なくとも1つの粒子の生存率又は代謝活性又は代謝活性のレベル又は代謝状態又は活力又は感度又は耐性である、請求項1~31のいずれか1項記載の方法。
- 前記移動パラメータから前記少なくとも1つの粒子の特性を導出することが、前記粒子の移動量、特に並進量及び/又は回転量及び/又は変形量が、前記少なくとも1つの粒子の生存率及び/又は代謝活性及び/又は代謝活性のレベル及び/又は活力及び/又は感度及び/又は耐性に比例することを考慮に入れることを含む、請求項1~32のいずれか1項記載の方法。
- 前記少なくとも1つの粒子の全体の移動を決定し、及び/又は、
前記方法が、前記少なくとも1つの粒子のX方向の移動及び/又はY方向の移動及び/又はZ方向の移動及び/又はX,Y方向の移動及び/又はX,Y,Z方向の移動を導出することを含み、及び/又は、
前記方法が、前記少なくとも1つの粒子の粒子活性及び/又は生存率及び/又は代謝活性及び/又は代謝活性のレベル及び/又は代謝状態及び/又は活力及び/又は感受性及び/又は耐性を導出することを含む、請求項1~33のいずれか1項記載の方法。 - 前記少なくとも1つの粒子が、少なくとも1つの細胞、特に原核細胞及び/又は真核細胞及び/又は運動性細胞及び/又は非運動性細胞及び/又は少なくとも1つのオルガネラであり、好ましくは、前記少なくとも1つの粒子が、細菌細胞、真菌細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、ミトコンドリア及び核のうちの少なくとも1つである、請求項1~34のいずれか1項記載の方法。
- 前記方法が、ナノモーションの解析に基づいて相互相関を行うことを含み、及び/又は、
前記解析が、前記粒子全体の移動を決定すること、粒子壁の変位を決定すること、及びオルガネラの変位を決定することのいずれか又はそれらの組み合わせを含む、請求項1~35のいずれか1項記載の方法。 - コンピュータプログラム製品であって、前記プログラムがコンピュータシステムによって実行されると、前記コンピュータシステムに請求項1~36のいずれか1項記載の方法を実行させる命令を含む、前記コンピュータプログラム製品。
- コンピュータ可読媒体であって、コンピュータシステムによって実行されると、前記コンピュータシステムに請求項1~36のいずれか1項記載の方法を実行させる命令を含む、前記コンピュータ可読媒体。
- 粒子特性を導出するためのプロセッサであって、前記プロセッサは、
- 液体環境における少なくとも1つの自由浮遊粒子の、少なくとも1つの瞬間にイメージングされた移動を得るための入力手段と、
- 前記液体環境における前記自由浮遊粒子のイメージングされた移動に基づいて、少なくとも1つの瞬間に少なくとも1つの移動パラメータを決定し、前記少なくとも1つの移動パラメータから、前記少なくとも1つの粒子の少なくとも1つの特性を導出するためのプロセッサと
を含む、前記プロセッサ。 - 前記プロセッサが、請求項1~36のいずれか1項記載の方法を実行するように構成されている、請求項39記載のプロセッサ。
- 粒子特性を導出するためのシステムであって、前記システムは、
- 液体環境における少なくとも1つの自由浮遊粒子の移動を少なくとも1つの瞬間にイメージングするための、少なくとも1つの光学センサ、好ましくはカメラを含む光学系と、
- 請求項39又は40記載のプロセッサと
を含む、前記システム。 - 抗生物質感受性試験のための、請求項41記載のシステムの使用。
- 抗真菌薬感受性試験のための、請求項41記載のシステムの使用。
- 細胞の生存率の特性評価及び/又は代謝のモニタリングのための、請求項41記載のシステムの使用。
- 診断及び/又は薬物スクリーニング及び/又は抗有糸分裂性薬剤感受性試験のための、請求項41記載のシステムの使用。
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