JP5950423B2 - 幼若顆粒球（ｅａｒｌｙｇｒａｎｕｌａｔｅｄｃｅｌｌ）（ＥＧＣ）の同定および計数 - Google Patents
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Description
本明細書の実施形態は、概して、粒子分析器により生成された細胞事象データ（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｖｅｎｔ ｄａｔａ）の分析に関連しており、より具体的には、血液サンプル中の幼若顆粒球（ＥＧＣ）の検出および計数に関連する。
（背景）
粒子分析器は、サンプル中に含まれる一つもしくはそれよりも多くのタイプの細胞の数および／もしくは分布を決定するために、生物学的細胞サンプルを分析するために使用される。粒子分析器としては、血液学分析器およびフローサイトメーターが挙げられる。血液分析器およびフローサイトメーターは、一つもしくはそれよりも多くのセンサーによりモニターされる小さな開口部もしくは測定領域を血球が通過する際に生じる信号を収集および分析することにより、様々なタイプの血球を測定および分類する。例えば、血液のサンプルは、測定領域を通って流れ、その測定領域では、一つもしくはそれよりも多くのエネルギー源および関連するセンサーが、通過する細胞の様々な物理的特徴に対応する信号を検出するように構成される。測定領域における単一の細胞の測定値に対応する信号のうちの一つもしくはそれよりも多くが、細胞事象といわれる。次いで、細胞サンプルのうちの複数の細胞に関する細胞事象データが分析されて、細胞の物理的特徴に基づいて分類される集団を決定する。
粒子分析器は、サンプル中に含まれる一つもしくはそれよりも多くのタイプの細胞の数および／もしくは分布を決定するために、生物学的細胞サンプルを分析するために使用される。粒子分析器としては、血液学分析器およびフローサイトメーターが挙げられる。血液分析器およびフローサイトメーターは、一つもしくはそれよりも多くのセンサーによりモニターされる小さな開口部もしくは測定領域を血球が通過する際に生じる信号を収集および分析することにより、様々なタイプの血球を測定および分類する。例えば、血液のサンプルは、測定領域を通って流れ、その測定領域では、一つもしくはそれよりも多くのエネルギー源および関連するセンサーが、通過する細胞の様々な物理的特徴に対応する信号を検出するように構成される。測定領域における単一の細胞の測定値に対応する信号のうちの一つもしくはそれよりも多くが、細胞事象といわれる。次いで、細胞サンプルのうちの複数の細胞に関する細胞事象データが分析されて、細胞の物理的特徴に基づいて分類される集団を決定する。
容積、電導度、および光散乱のような物理的特性の測定値が、細胞を類別するために使用される。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒによる容積、電導度および散乱（ＶＣＳ）技術が、いくつかある用途の中でも特に、白血球をサブグループもしくは集団に類別するために使用される。これらの物理的測定値は、類似の物理的特性を共有する細胞がグループ化してクラスターになる多次元空間を形成する。各クラスターは、特定のタイプの血球の集団に対応する。
白血球（ＷＢＣ（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）ともいわれる））の計数は、様々な種類の感染症のような病理学的状態を検出するための重要なツールである。ＷＢＣ５分類（５−ｐａｒｔ ＷＢＣ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）が、長い間、血液学的状態の検出における極めて重要なテストであった。５分類は、末梢血において通常見出されるＷＢＣの五つの主要なサブタイプ（すなわち、好中球、リンパ球、単球、好酸球および好塩基球）を検出し、計数する。しかしながら、成熟プロセスの中間段階において他のタイプのＷＢＣが存在し得る。成熟プロセスの中間段階にあるこれらのＷＢＣとしては、芽球、異型リンパ球、および幼若顆粒球（ＥＧＣ）が挙げられて、それらはまた、血液学的障害の指標である。ＥＧＣという用語は、主に前骨髄球、骨髄球、および後骨髄球から成る未成熟の骨髄性細胞のサブセットをいう。芽球および桿状核球のような成熟の中間段階にある他の細胞は、一般的に、ＥＧＣ集団には含めない。
末梢血においてＥＧＣの量の増加は、骨髄の活性化の強まりを指し示し得る。例えば、ＥＧＣの数は、重篤な種類の細菌感染症である敗血症の指標となり得る。概して、循環するＥＧＣの増加は、細菌感染症の間に起こる。ＥＧＣの存在は、感染症もしくは重篤な炎症性疾患に起因する脊髄細胞の生産増加を指し示す。ＥＧＣはまた、白血病、骨髄異形成症候群、および骨髄線維症を持つ患者において見られ得る。それゆえ、患者の血液サンプル中のＥＧＣの迅速かつ正確な計数は、急性感染症、敗血症、および他の状態の適時の治療のために大いに所望され得る。ＥＧＣ数を付加することにより慣用のＷＢＣ５分類テストを向上させることは、診断能力の実質的増大を提供し得る。
従来の分析方法において、ＥＧＣの存在は、二次元ヒストグラムもしくは散布図における細胞事象集団の形状の変化と関連付けられている。一つもしくはそれよりも多くの細胞集団の形状に基づいて、従来の粒子分析器は、未成熟もしくは異型の細胞の存在についてエンドユーザーに警告することが可能である。
ＥＧＣを計数することは、従来、手作業の血液塗抹分析によって行われる。このプロセスは、労働集約的であって、（数えられる細胞の数が少ないこと、および人間の主観のような）様々な要因に起因してエラーが生じる傾向が強い。
ＥＧＣ計数の別の従来の方法は、蛍光に基づく。ＷＢＣは、各細胞のＲＮＡおよびＤＮＡを染色するポリメチン染料で染色される。次いで、ＥＧＣは、ＥＧＣ中のＲＮＡおよびＤＮＡのの含有量がより多いことに起因して蛍光がより強いことに基づいて、成熟した顆粒球とは別に同定され得る。しかしながら、蛍光ベースの技術は、高価であり得、そして比較的低コストの分析器には適切でないかもしれない。それゆえに、非蛍光の方法および器具によりＥＧＣを決定することを可能にする必要性が存在する。
またさらに、ＤＣのみに基づいて未成熟の顆粒球を測定する別の方法が、開示されている。しかしながら、この測定の正確度は、好中球のサブ集団の容積、未成熟の顆粒球のサブ集団の容積、および桿状核球集団の容積が重なる場合、損なわれ得る。
ＥＧＣ計数のさらに別の従来の方法は、一つもしくはそれよりも多くの（例えば、ＣＤ１６抗体のような）抗体を使用するフローサイトメトリー分析を含む。この方法を使用すると、ＥＧＣ細胞ではＣＤ１６染色がないことに基づいて、ＥＧＣが同定され得る。しかしながら、この方法は、異なる細胞を順次ゲーティング（ｇａｔｅ）するために複数の抗体を使用することを含む。それゆえに、抗体を使用してＥＧＣを同定するフローサイトメトリー方法は、コストが極めて高く成り得、かつ、一つもしくはそれよりも多くの抗体の使用に起因して細胞の物理的特徴に変化を引き起こし得る。
したがって、血液サンプル中のＥＧＣを同定して計数するための効率的な方法およびシステムの必要性が未だ存在する。
（簡単な説明）
粒子分析器において分析される血液サンプル中の幼若顆粒球（ＥＧＣ）を自動的に同定して計数するための方法およびシステムが、開示される。一つの実施形態において、血液サンプル中のＥＧＣを同定するための方法は、低角度光散乱（ＬＡＬＳ）パラメータを使用して血液サンプルの白血球を分析する工程、ＬＡＬＳパラメータを使用してＥＧＣを他の白血球から分離する工程、および分離されたＥＧＣを計数する工程を含む。
粒子分析器において分析される血液サンプル中の幼若顆粒球（ＥＧＣ）を自動的に同定して計数するための方法およびシステムが、開示される。一つの実施形態において、血液サンプル中のＥＧＣを同定するための方法は、低角度光散乱（ＬＡＬＳ）パラメータを使用して血液サンプルの白血球を分析する工程、ＬＡＬＳパラメータを使用してＥＧＣを他の白血球から分離する工程、および分離されたＥＧＣを計数する工程を含む。
別の実施形態は、血液サンプル中のＥＧＣを同定するための装置である。この装置は、プロセッサ、プロセッサに連結された少なくとも一つのメモリ、およびＥＧＣ決定モジュールを含む。このメモリは、粒子分析器からの細胞事象データを保存するように構成されており、その細胞事象データはＬＡＬＳパラメータを含む。ＥＧＣ決定モジュールは、ＬＡＬＳパラメータを使用して血液サンプルの白血球を分析し、ＬＡＬＳパラメータに基づいてＥＧＣの集団を他の白血球から分類および／もしくは分離するように構成される。
本明細書のさらなる特徴および利点、ならびにその様々な実施形態の構造および作動が、添付の図面を参考として、下記にて詳細に説明される。本明細書が、本明細書において説明される特定の実施形態に限定されないことが、留意される。このような実施形態は、説明的な目的のみのために本明細書において提示される。付加的な実施形態が、本明細書に含まれる教示に基づき、関係のある分野の当業者にとって明白である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
血液サンプル中の幼若顆粒球（ＥＧＣ）を計数するための方法であって、該方法が：
低角度光散乱（ＬＡＬＳ）パラメータを使用して、該血液サンプルの白血球を分析する工程；
該ＬＡＬＳパラメータを使用して他の白血球から該ＥＧＣを分離する工程；および
該分離されたＥＧＣを計数する工程
を含む、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、前記他の白血球からのＥＧＣの前記分離が、さらに、少なくとも一つの付加的なパラメータに基づいており、該少なくとも一つの付加的なパラメータが、軸方向光損失（ＡＬＬ）、中角度光散乱（ＭＡＬＳ）、直流（ＤＣ）量および電導度（ＯＰ）を含む、方法。
（項目３）
項目１もしくは項目２に記載の方法であって、前記分離する工程が：
前記分析のデータをクラスター化し、それによって複数の集団を生成する工程；および
該複数の集団からＥＧＣの集団を同定する工程
を含む、方法。
（項目４）
項目３に記載の方法であって、ＥＧＣの集団が、前記複数の集団のうちの好中球集団から実質的に分離される、方法。
（項目５）
項目１から項目４に記載の方法であって、該方法が：
前記ＥＧＣを、前記分離されたＥＧＣの集団に基づいて計数する工程；および
該計数されたＥＧＣを報告する工程
をさらに含む、方法。
（項目６）
項目５に記載の方法であって、前記計数されたＥＧＣが、白血球の総数に対するパーセンテージとして報告される、方法。
（項目７）
幼若顆粒球（ＥＧＣ）を計数するための方法であって、該方法が：
血液サンプル中の白血球を分析する工程；
ＥＧＣの特異的分葉度および／もしくは表面構造特性を測定するパラメータに基づき、該ＥＧＣを他の白血球から区別する工程；
該区別されたＥＧＣを該他の白血球（ＷＢＣ）から分離する工程；および
該区別されたＥＧＣの集団を計数する工程
を含む、方法。
（項目８）
血液サンプル中の未成熟な顆粒球（ＥＧＣ）を同定するための装置であって、該装置が：
プロセッサ；
該プロセッサへ連結された少なくとも一つのメモリであって、該メモリが、粒子分析器からの細胞事象データを保存するように構成されており、該細胞事象データが低角度光散乱（ＬＡＬＳ）パラメータを含む、メモリ；および
ＥＧＣ決定器モジュールであって：
該ＬＡＬＳパラメータを使用して、該血液サンプルの白血球を分析し；そして
該ＬＡＬＳパラメータに基づく該事象データを使用して、ＥＧＣを他の白血球から分離する
ように構成される、モジュール
を含む、装置。
（項目９）
項目８に記載の装置であって、複数の細胞インタロゲーターを使用して前記血液サンプルの各細胞をインタロゲートすることにより前記細胞事象データを生成するように構成された粒子検出器をさらに含む、装置。
（項目１０）
項目８もしくは項目９に記載の装置であって、前記分離されたＥＧＣ集団を報告するように構成されたディスプレイをさらに含む、装置。
（項目１１）
項目８から項目１０に記載の装置であって、前記他の白血球からのＥＧＣの前記分離が、さらに、少なくとも一つの付加的なパラメータに基づいており、該少なくとも一つの付加的なパラメータが、軸方向光損失（ＡＬＬ）、中角度光散乱（ＭＡＬＳ）、直流（ＤＣ）量、もしくは電導度（ＯＰ）を含む、装置。
（項目１２）
項目８から項目１１に記載の装置であって、前記ＥＧＣ決定モジュールが、さらに：
前記白血球分析データをクラスター化することによりＥＧＣを他の白血球から分離し、それによって複数の白血球集団を生成し；そして
該ＥＧＣの集団を該複数の白血球集団から同定する
ように構成される、装置。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
血液サンプル中の幼若顆粒球（ＥＧＣ）を計数するための方法であって、該方法が：
低角度光散乱（ＬＡＬＳ）パラメータを使用して、該血液サンプルの白血球を分析する工程；
該ＬＡＬＳパラメータを使用して他の白血球から該ＥＧＣを分離する工程；および
該分離されたＥＧＣを計数する工程
を含む、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、前記他の白血球からのＥＧＣの前記分離が、さらに、少なくとも一つの付加的なパラメータに基づいており、該少なくとも一つの付加的なパラメータが、軸方向光損失（ＡＬＬ）、中角度光散乱（ＭＡＬＳ）、直流（ＤＣ）量および電導度（ＯＰ）を含む、方法。
（項目３）
項目１もしくは項目２に記載の方法であって、前記分離する工程が：
前記分析のデータをクラスター化し、それによって複数の集団を生成する工程；および
該複数の集団からＥＧＣの集団を同定する工程
を含む、方法。
（項目４）
項目３に記載の方法であって、ＥＧＣの集団が、前記複数の集団のうちの好中球集団から実質的に分離される、方法。
（項目５）
項目１から項目４に記載の方法であって、該方法が：
前記ＥＧＣを、前記分離されたＥＧＣの集団に基づいて計数する工程；および
該計数されたＥＧＣを報告する工程
をさらに含む、方法。
（項目６）
項目５に記載の方法であって、前記計数されたＥＧＣが、白血球の総数に対するパーセンテージとして報告される、方法。
（項目７）
幼若顆粒球（ＥＧＣ）を計数するための方法であって、該方法が：
血液サンプル中の白血球を分析する工程；
ＥＧＣの特異的分葉度および／もしくは表面構造特性を測定するパラメータに基づき、該ＥＧＣを他の白血球から区別する工程；
該区別されたＥＧＣを該他の白血球（ＷＢＣ）から分離する工程；および
該区別されたＥＧＣの集団を計数する工程
を含む、方法。
（項目８）
血液サンプル中の未成熟な顆粒球（ＥＧＣ）を同定するための装置であって、該装置が：
プロセッサ；
該プロセッサへ連結された少なくとも一つのメモリであって、該メモリが、粒子分析器からの細胞事象データを保存するように構成されており、該細胞事象データが低角度光散乱（ＬＡＬＳ）パラメータを含む、メモリ；および
ＥＧＣ決定器モジュールであって：
該ＬＡＬＳパラメータを使用して、該血液サンプルの白血球を分析し；そして
該ＬＡＬＳパラメータに基づく該事象データを使用して、ＥＧＣを他の白血球から分離する
ように構成される、モジュール
を含む、装置。
（項目９）
項目８に記載の装置であって、複数の細胞インタロゲーターを使用して前記血液サンプルの各細胞をインタロゲートすることにより前記細胞事象データを生成するように構成された粒子検出器をさらに含む、装置。
（項目１０）
項目８もしくは項目９に記載の装置であって、前記分離されたＥＧＣ集団を報告するように構成されたディスプレイをさらに含む、装置。
（項目１１）
項目８から項目１０に記載の装置であって、前記他の白血球からのＥＧＣの前記分離が、さらに、少なくとも一つの付加的なパラメータに基づいており、該少なくとも一つの付加的なパラメータが、軸方向光損失（ＡＬＬ）、中角度光散乱（ＭＡＬＳ）、直流（ＤＣ）量、もしくは電導度（ＯＰ）を含む、装置。
（項目１２）
項目８から項目１１に記載の装置であって、前記ＥＧＣ決定モジュールが、さらに：
前記白血球分析データをクラスター化することによりＥＧＣを他の白血球から分離し、それによって複数の白血球集団を生成し；そして
該ＥＧＣの集団を該複数の白血球集団から同定する
ように構成される、装置。
本明細書のさらなる特徴および利点、ならびにその様々な実施形態の構造および作動が、添付の図面を参考として、下記にて詳細に説明される。本明細書が、本明細書において説明される特定の実施形態に限定されないことが、留意される。このような実施形態は、説明的な目的のみのために本明細書において提示される。付加的な実施形態が、本明細書に含まれる教示に基づき、関係のある分野の当業者にとって明白である。
図１は、本明細書の実施形態に従うシステムである。
図２ａおよび図２ｂは、容積および光散乱に基づいたＷＢＣ分類分析の散布図を図示する。図２ａは、正常サンプルを図示する。図２ｂは、ＥＧＣを有するサンプルを図示する。
図３ａおよび図３ｂは、好中球集団とＥＧＣ集団との重なりを図示する。図３ａは、容積および回転中角度光散乱（ｒｏｔａｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ）に基づいた散布図を図示する。図３ｂは、容積および電導度に基づいた散布図を図示する。
図４ａ、図４ｂ、および図４ｃは、本明細書の実施形態に従い、ＬＡＬＳを使用するＥＧＣ集団の検出を図示する。図４ａは、電導度およびＬＡＬＳによる散布図を図示する。図４ｂは、電導度と、ＬＡＬＳを含む導出測定値とによる散布図を図示する。図４ｃは、ＬＡＬＳを含む第一の導出測定値と、ＬＡＬＳを含む第二の導出測定値とによる散布図を図示する。
図５は、ＤＣ対ＭＡＬＳの散布図における細胞集団を図示する。
図６は、図５と同じ細胞サンプルを、本明細書の実施形態に従う導出測定値による散布図にて図示する。
図７は、本明細書の実施形態に従いＥＧＣを検出および計数する方法を図示する。
図８は、本明細書の実施形態に従いＥＧＣの集団を同定する方法を図示する。
図９は、本明細書の実施形態に従う細胞事象分析器および対応するシステムを示す。
本明細書の特徴および利点は、下記で述べられる詳細な説明が図面と併用される場合、それらからより明白になる。この図面において、同様の参照番号は、概して、同一の、機能的に類似の、および／もしくは構造的に類似の要素を指し示す。概して、ある要素が最初に現れる図面は、対応する参照番号における最も左の桁（単数もしくは複数）により指し示される。
（詳細な説明）
本明細書は、粒子分析器により生成された細胞事象データの処理および分析に関連する。本明細書は、特定の用途についての説明的実施形態を参照にして本明細書において説明されるが、本明細書はそれらに限定されないことが、理解されるべきである。本明細書における教示へアクセス可能な当業者は、その範囲内にある付加的な修正、用途、および実施形態、ならびに本明細書が顕著に有用である付加的な分野を識別する。
本明細書は、粒子分析器により生成された細胞事象データの処理および分析に関連する。本明細書は、特定の用途についての説明的実施形態を参照にして本明細書において説明されるが、本明細書はそれらに限定されないことが、理解されるべきである。本明細書における教示へアクセス可能な当業者は、その範囲内にある付加的な修正、用途、および実施形態、ならびに本明細書が顕著に有用である付加的な分野を識別する。
概要
上記で説明されたように、幼若顆粒球（ＥＧＣ）の検出および計数は、ある範囲の血液学的状態を検出するために大きな診断上の価値がある。本明細書において開示される方法およびシステムは、粒子分析器により生成された細胞事象データを分析することによる細胞サンプル中のＥＧＣの同定および計数を可能にする。本明細書は、本明細書が、概して重なっている好中球集団からＥＧＣを分離するために、何ら特別もしくは高価な染料（ｄｙｅ）も、染色剤（ｓｔａｉｎ）も、抗体も必要としないという点で、既存の技術よりも優れたアプローチを提供する。
上記で説明されたように、幼若顆粒球（ＥＧＣ）の検出および計数は、ある範囲の血液学的状態を検出するために大きな診断上の価値がある。本明細書において開示される方法およびシステムは、粒子分析器により生成された細胞事象データを分析することによる細胞サンプル中のＥＧＣの同定および計数を可能にする。本明細書は、本明細書が、概して重なっている好中球集団からＥＧＣを分離するために、何ら特別もしくは高価な染料（ｄｙｅ）も、染色剤（ｓｔａｉｎ）も、抗体も必要としないという点で、既存の技術よりも優れたアプローチを提供する。
本明細書において使用される場合、「パラメータ」および「測定値」という用語は、概して、互換可能に使用される。本明細書に関して、レーザーは、粒子（すなわち、細胞）により反射もしくは屈折されるエネルギーのビームを放出し、そしてそのエネルギーは、一つもしくはそれよりも多くの検出器によりパラメータとして測定される。それゆえに、概して、このエネルギーは測定パラメータであると考えられる。特定のパラメータは、直接的に測定されるのではなく計算される。具体的な例としては、不透明度（Ｏｐａｃｉｔｙ）（ＯＰ）およびＲＭＡＬＳが計算されたパラメータであり、不透明度パラメータに関しては測定されたＤＣおよびＲＦから計算されたパラメータであり、そしてＲＭＡＬＳパラメータに関してはＭＡＬＳおよびＤＣから計算されたパラメータである。
本明細書の実施形態は、低角度光散乱（ＬＡＬＳ）測定値を利用して、血液サンプル中のＥＧＣ集団を自動的に検出および計数する。さらに、本明細書の実施形態に従うＥＧＣの計数は、粒子検出器の中でサンプルのテストを繰り返すことを必要としない。計数されたＥＧＣ情報は、白血球に関する５分類テストの部分として組み入れられるか、別個に提示されるかのいずれであってもよい。
本明細書が実施され得る例示的環境としては、フローサイトメーターおよび血液学分析器のような粒子分析器が挙げられる。例えば、ＤｘＨ ８００ＴＭ血液学分析器は、Ｃｏｕｌｔｅｒ専有の容積、電導度、および散乱（ＶＣＳ）技術のバリエーションを使用して、粒子分析器の測定領域内の細胞をインタロゲートする。ＶＣＳは、少なくとも３つの相互に協力して働く独立したエネルギー源を使用して、細胞をインタロゲートする：容積を測定するための低周波直流（ＤＣ）電源；電導度（ＯＰ）を測定する高周波電源、および散乱を測定する一つもしくはそれよりも多くのレーザー光源。容積測定は、電気インピーダンスのＣｏｕｌｔｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅを使用して実行されて、細胞全体が等張性希釈剤中で置き換わる体積を物理的に測定する。この方法は、光路での細胞の方向に関わりなく、全ての細胞タイプのサイズを正確に測る。無線周波数（ＲＦ）範囲における交流が、細胞の膜の両極性脂質層を短絡させて、エネルギーが細胞を貫通することを可能にする。このエネルギー源は、細胞のサイズおよび内部構造についての情報を収集するために使用され、その内部構造としては、化学的組成および核体積が挙げられる。一つもしくはそれよりも多くのレーザーエネルギー源および多角度光散乱センサーもしくは多角度光散乱検出器が、細胞の内部構造、粒度、および表面形態（ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）についての情報を提供する。光散乱測定値としては、例えば軸から２０°〜６５°の範囲にて測定される上方中角度光散乱（ｕｐｐｅｒ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ）（ＵＭＡＬＳ）と、例えば軸から１０°〜２０°の範囲にて測定される下方中角度光散乱（ｌｏｗｅｒ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ）（ＬＭＡＬＳ）とが挙げられ得る。ＵＭＡＬＳおよびＬＭＡＬＳの組み合わせは、一般にＭＡＬＳといわれるが、ＵＭＡＬＳおよびＬＭＡＬＳは、隣接する光検出器を使用する別個の光散乱測定値を構成する。
加えて、ＶＣＳ器具は、体積の非常に正確なＤＣ測定を使用して、細胞サイズについて調整された他の測定値を電導度および散乱から得る。その全体が本明細書に参考として援用される（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらへの）米国特許第５，６１６，５０１号は、粒子分析器およびＶＣＳ技術の使用の詳細な記載を含む。
上記の測定に加えて、ＤｘＨ ８００ＴＭ血液学分析器はまた、ＬＡＬＳ測定および軸方向光損失測定（ａｘｉａｌ ｌｉｇｈｔ ｌｏｓｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）（ＡＬＬもしくはＡＬ２）を含む。ＬＡＬＳは、例えば軸から０°〜１０°の範囲にて測定される。ＡＬＬは、例えば軸から０°〜１．０°における軸に沿った光損失として測定される。しかしながら、当業者は、ＵＭＡＬＳ、ＬＭＡＬＳ、ＬＡＬＳ、およびＡＬＬに対応する例示的光散乱角度が相互に相対的であり、粒子検出器、および細胞サンプルと混合される試薬もしくは他の物質の個々の性質のような要因に起因して変化し得ることを理解する。しかしながら、本開示における教示はＶＣＳ技術もしくはその変形を使用するデバイスに限定されないことが、留意されるべきである。
図１は、本明細書の実施形態に従う粒子分析器１００を図示する。図１は、説明の目的のみのためにあり、そして粒子分析器は図１において示されるよりも多いもしくは少ないモジュール、示されるのとは異なったモジュール、および示されるのとは異なるデザインを含み得ることが、理解されるべきである。粒子分析器１００は、粒子検出器１２４および分析器１２２を含む。粒子検出器１２４は、粒子サンプル分注器１０２およびシース流体分注器１０４を含む。サンプル分注器１０２は、所望される分析もしくはテストの必要条件に従い調製された粒子サンプルを含む。例えば、血液のサンプルは、事前に定められた程度の細胞濃度へと希釈剤で希釈され得る。希釈剤のタイプおよび希釈度は、行われるテストに従って異なる（サンプル中の白血球（ＷＢＣ）の数が赤血球（ＲＢＣ）に比べると少ないので、ＷＢＣ分析は、ＲＢＣよりも少ない希釈を必要とする）。シース流体分注器１０４は、例えば食塩水のようなシース流体を収容する。シース流体は、粒子検出器において粒子サンプルの滑らかな流れを可能にする。粒子サンプル分注器１０２からの粒子サンプルと、シース流体分注器１０４からのシース流体とは、事前に定められた一定速度にて注入される。溶液分注器１０６が、粒子サンプルおよびシース流体を漏斗に通すようにフローセル（ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ）１０８内へ進める。フローセル１０８は、概して、単一の粒子が通過するように設計された小さな直径の管である。溶液分注器１０６の中の溶液は、フローセル１０８の中へ一定速度にて流体力学的絞り込み（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）により注入される。流体力学的絞り込みは、溶液を、一定速度かつ、粒子が概してフローセル１０８の内部において一定間隔にて一列で現れるのに十分な圧力下で、注入する。一部の粒子検出器はフローセルを持たない測定領域を有し得ることが、留意されるべきである。
感知デバイス１１０が、一つもしくはそれよりも多くの感知媒体を用いて測定領域１２０を通って流れる粒子を感知し得るように、粒子検出器１２４の内部に配置される。エネルギー源１１２と関連センサー１１４とが、感知デバイス１１０の内部において、フローセル１０８に対して実質的にトランスバースになるように配置される。エネルギー源１１２およびセンサー１１４は、電気的感知媒体もしくは光学的感知媒体のうちの一つもしくはそれよりも多くを用いて、測定領域１２０において粒子を検出する。例えば、一組のエネルギー源１１２および関連センサー１１４が、測定領域１２０を通過する細胞の光散乱性質および光損失性質を測定するために光測定を用い得る。光散乱測定値としては、ＵＭＡＬＳ、ＬＭＡＬＳ、およびＬＡＬＳが挙げられ得る。光損失は、軸方向光損失（ＡＬＬもしくはＡＬ２）（すなわち、例えば軸から０°〜１．０°における、軸に沿った光損失）として測定される。他の組のエネルギー源１１２およびセンサー１１４は、細胞の容積（Ｖ）を測定するためにＤＣ測定を、および細胞の電導性（ＯＰ）の性質を測定するためのＲＦ測定を用い得る。エネルギー源１１２およびセンサー１１４はまた、例えば音響媒体のような他の媒体を含み得、音響媒体では、超音波が使用されて、測定領域１２０における細胞の様々な性質が検出される。
センサー１１４は、信号プロセッサ１１８へ連結される。センサー１１４は、検出された電気的測定値もしくは光学的測定値を、信号プロセッサ１１８において処理される対応する電気信号パルスへ変換する。測定領域１２０を通過する各粒子に関して、一連の測定値に対応する電気信号パルスが、例えば信号プロセッサ１１８において収集される。信号プロセッサ１１８への入力は、アナログ信号であっても、デジタル信号であってもよい。これらの電気信号パルスから信号が形成され、その信号は、一つの粒子が測定領域を通って流れている間に一つの測定パラメータについて取得される測定値の実例である。一つもしくはそれよりも多くのアナログ・デジタル変換器（ＡＤＣ）が、信号プロセッサ１１８における処理の前に、その間に、もしくはその後に使用されて、アナログ信号をデジタル信号へ変換し得る。この信号によりカバーされる継続時間は、測定領域の中への粒子の進入の際に始まり得て、測定領域からのその粒子の退出まで続き得る。本明細書の実施形態において、信号プロセッサ１１８は、各信号の付加的な処理を行って、検出された粒子を説明する一つもしくはそれよりも多くの測定パラメータを導出し得る。
測定領域１２０内での粒子の検出を、事象もしくは細胞事象という。信号プロセッサ１１８は、測定領域１２０を通って流れる検出された各粒子に対応する導出信号を分析して、対応する事象を決定する。次いで、検出された事象は、分析器１２２へ伝達される。分析器１２２は、信号プロセッサ１１８へ連結されており、事象データを受信する。分析器１２２は、粒子検出器へ連結されたコンピュータの中に配置され得る。分析器１２２は、粒子検出器１２４を含む粒子分析器１００に組み込まれて配置されるか、もしくは通信インフラ（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を通して別個に粒子分析器１００へ連結されるかのいずれかであり得ることが、留意されるべきである。
信号生成および事象検出は、別個の各アクティブ電気的測定もしくは各アクティブ光学的測定に関して別個に行われる。分析器１２２は、各アクティブ測定に対応する事象データを受信し得る。次いで、分析器１２２は、受信した事象データを分析して、一つもしくはそれよりも多くの細胞に対応する数、細胞集団、もしくは細胞に対応する他の性質を決定し得る。本明細書の実施形態において、分析器１２２は、受信した事象の散布図、ヒストグラム、または他の図式説明および／もしく文字説明の表示を生じさせ得る。散布図、ヒトストグラム、および／もしくは他の図式表現は、多次元であり得る。
「敏感度」および「特異度」とは、二項分類テストの性能の統計的尺度である。敏感度は、正しく同定される実際の陽性者の割合を測定する。特異度は、正しく同定される陰性者の割合を測定する。１００％の特異度は、そのテストが全ての実際の陰性者を識別することを意味する。１００％の敏感度は、そのテストが全ての実際の陽性者を識別することを意味する。それゆえ、高特異度のテストとは対照的に、高敏感度のテストにおける陰性の結果は、疾患を除外するために使用される。高特異度テストにおける陽性の結果は、疾患の存在を確証し得る。しかしながら、特異度単独では、そのテストが陽性症例を識別するための正確性を十分には指し示さない。敏感度を知ることもまた必要とされる。いかなるテストに関しても、通常、これらの測定値間にトレードオフが存在する。例えば、特定の状態を有する人に関してのテストを行う診断検査において、その検査は、その状態を有していないと正しく同定される特定のパーセンテージの健康な人を見落とすリスクを減らす（高敏感度）ために、その状態を有していると正しく同定される特定のパーセンテージの病気の人を見逃す（低特異度）ように設定され得る。このトレードオフは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して、図式的に表現され得る。
測定システムの「正確度」とは、ある量の測定値がその実際の（真の）値にどれくらい近いかの度合いである。
一つの実施形態において、本明細書は、少なくとも約８０％の正確度で、そしてより特定すると少なくとも約８５％の正確度で、ＥＧＣを計数するための方法を開示する。好ましい実施形態において、本明細書は、少なくとも約９０％の正確度でＥＧＣを計数するための方法を開示する。
別の実施形態において、本明細書は、少なくとも約８５％の敏感度で、より特定すると少なくとも約９０％の敏感度で、そしてさらにより特定すると少なくとも約９５％の敏感度で、ＥＧＣを計数するための方法を開示する。さらに別の実施形態において、本明細書は、少なくとも約８０％の特異度で、そしてより特定すると少なくとも約８５％の特異度で、ＥＧＣを計数するための方法を開示する。好ましい実施形態において、本明細書は、少なくとも約９０％の特異度でＥＧＣを計数するための方法を開示する。
ＥＧＣを同定および計数するためのＬＡＬＳの使用
本発明者らは、粒度、核分葉度（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｂｕｌａｒｉｔｙ）、および／もしくは細胞表面構造に関するＥＧＣの独特の様相に基づいて、ＥＧＣが（具体的には好中球を含む）他の細胞タイプから分類され得ることを観測した。本発明者らが見出したこれらの独特の様相は、ＥＧＣ集団を同定するための基礎として測定および使用され得る。一つの特定の実施形態において、ＬＡＬＳは、細胞の粒度、核分葉度、および／もしくは細胞表面構造の程度を判別するために使用され得る。具体的には、本発明者らは、ＬＡＬＳパラメータが、ＥＧＣの粒度、分葉度、および／もしくは表面特徴の、成熟したＷＢＣと比べられる際の微かな違いに対し非常に敏感であることを見出した。しかしながら、ＬＡＬＳが、ＥＧＣの計数において、特異度および敏感度に関する他のパラメータと組み合され得ることもまた理解される。より具体的には、本明細書の実施形態は、ＬＡＬＳと、前方光散乱、側方散乱、軸方向光損失、ＤＣ、ＲＦおよび不透明度の群のうちの少なくとも一つの測定とを使用して、ＥＧＣを測定する非蛍光の方法および器具を含む。またさらに、前方散乱光が、ＵＭＡＬＳ、ＬＭＡＬＳ、ＭＡＬＳから選択される。
本発明者らは、粒度、核分葉度（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｂｕｌａｒｉｔｙ）、および／もしくは細胞表面構造に関するＥＧＣの独特の様相に基づいて、ＥＧＣが（具体的には好中球を含む）他の細胞タイプから分類され得ることを観測した。本発明者らが見出したこれらの独特の様相は、ＥＧＣ集団を同定するための基礎として測定および使用され得る。一つの特定の実施形態において、ＬＡＬＳは、細胞の粒度、核分葉度、および／もしくは細胞表面構造の程度を判別するために使用され得る。具体的には、本発明者らは、ＬＡＬＳパラメータが、ＥＧＣの粒度、分葉度、および／もしくは表面特徴の、成熟したＷＢＣと比べられる際の微かな違いに対し非常に敏感であることを見出した。しかしながら、ＬＡＬＳが、ＥＧＣの計数において、特異度および敏感度に関する他のパラメータと組み合され得ることもまた理解される。より具体的には、本明細書の実施形態は、ＬＡＬＳと、前方光散乱、側方散乱、軸方向光損失、ＤＣ、ＲＦおよび不透明度の群のうちの少なくとも一つの測定とを使用して、ＥＧＣを測定する非蛍光の方法および器具を含む。またさらに、前方散乱光が、ＵＭＡＬＳ、ＬＭＡＬＳ、ＭＡＬＳから選択される。
図２ａおよび図２ｂは、正常な血液サンプルによるＷＢＣ分類散布図（図２ａ）と、ＥＧＣを含む血液サンプルによるＷＢＣ分類散布図（図２ｂ）とを図示する。集団２０２ａおよび２０２ｂはそれぞれ、正常なサンプルの好中球集団と、ＥＧＣを含むサンプルの好中球集団を代表する。集団２０２ｂの形は、集団２０２ａの形と比較した場合、容積軸に沿って細長い。集団２０１ａおよび２０１ｂは単球を表し、集団２０３ａおよび２０３ｂはリンパ球を表し、集団２０４は好酸球を表し、そして集団２０５は非溶解のＲＢＣを表す。多くの従来の方法は、図２ｂにおいて示されたように好中球集団の形が細長いことに基づいて、ＥＧＣの存在を同定する。例えば、（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらに対する）米国特許第５，１２５，７３７号に記載の図１９および図２０は、ＤＣ対ＯＰと、ＤＣ対ＲＭＡＬＳとをそれぞれマッピングした散布図において、好中球集団の形が容積軸もしくはＤＣ軸に沿って細長いことを図示する。ＲＭＡＬＳは、回転中角度光散乱であり、典型的に、ｌｏｇ（ＵＭＡＬＳ＋ＬＭＡＬＳ）／ＤＣと計算される。
図３ａおよび図３ｂは、別の血液サンプルのＤＣ対ＲＭＡＬＳ散布図とＤＣ対ＯＰ散布図とをそれぞれ図示する。図３ａおよび図３ｂにおいて図示された血液サンプルは、手作業による参照値として分葉核好中球（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）６２．２５％、桿状核球１２．７５％、後骨髄球３％、および骨髄球０．７５％を含む。両方の散布図において、クラスター３０２および３０３において見られるように、ＥＧＣ集団は、好中球集団から分離して同定され得ない。それゆえに、好中球集団の形が細長いことは、血液サンプル中のＥＧＣの存在に関する指標として使用され得るが、ＤＣ、ＲＭＡＬＳ、およびＯＰに基づいた散布図は、従来どおりに使用される場合、ＥＧＣ集団を分離して同定せず、および／もしくはＥＧＣを計数しない。
図４ａは、本明細書の実施形態に従いＯＰ対ＬＡＬＳをマッピングした散布図の図示である。クラスター４０２は、ＯＰ対ＬＡＬＳの散布図により、図３ａおよび３ｂにおいて示されたのと同じ細胞事象を図示する。ＬＡＬＳ軸に沿って集団４０２の形が細長いことは、ＥＧＣの存在についてサンプルに目印を付けることを可能にする。
本発明の実施形態は、ＬＡＬＳを使用してＥＧＣ集団を同定する。下記で説明されるのは、ＬＡＬＳが、ＭＡＬＳ、ＡＬＬ、ＯＰおよび／もしくはＤＣのような他のパラメータと組み合わされて、ＥＧＣ集団を同定および計数する実施形態である。ＬＡＬＳは、他のパラメータおよび／もしくはＬＡＬＳ導出関数を含む導出パラメータと組み合されて、ＥＧＣ集団を同定し得る。ＬＡＬＳは、パラメータもしくは導出パラメータの様々な他の組み合わせに応じて使用されて、本開示における教示に基づいてＥＧＣを同定および計数し得ることが、理解される。しかしながら、以前に言及されたように、ＬＡＬＳパラメータは、ＥＧＣの粒度、分葉度、および／もしくは細胞表面特徴を検出する単なる一つの方法に過ぎないので、本明細書は、ＥＧＣを同定および計数するためのＬＡＬＳの使用だけには限定されない。これらの細胞の特徴は、本発明者らがＥＧＣをＥＧＣと近接して重なる好中球集団から判別することを、可能にしたものである。
ＬＡＬＳをＭＡＬＳと組み合わせてＥＧＣを同定および計数すること
本明細書の別の実施形態に従い、ＬＡＬＳは、ＭＡＬＳおよびＤＣおよびＲＦのうちの一つもしくはそれよりも多くとともに使用されて、ＥＧＣを同定および計数し得る。一つの実施形態に従い、ＬＡＬＳが、ＭＡＬＳおよびＤＣとともに使用される。さらなる実施形態において、ＯＰが使用されて、ＥＧＣ集団を好中球のような他の細胞集団からより明確に分類し得る。またさらなる実施形態は、ＬＡＬＳ、ＭＡＬＳ、ＯＰ、およびＤＣを導出パラメータを構成する際に使用して、ＥＧＣを分類する。
本明細書の別の実施形態に従い、ＬＡＬＳは、ＭＡＬＳおよびＤＣおよびＲＦのうちの一つもしくはそれよりも多くとともに使用されて、ＥＧＣを同定および計数し得る。一つの実施形態に従い、ＬＡＬＳが、ＭＡＬＳおよびＤＣとともに使用される。さらなる実施形態において、ＯＰが使用されて、ＥＧＣ集団を好中球のような他の細胞集団からより明確に分類し得る。またさらなる実施形態は、ＬＡＬＳ、ＭＡＬＳ、ＯＰ、およびＤＣを導出パラメータを構成する際に使用して、ＥＧＣを分類する。
導出関数は、密接に関連した集団における微かな差異を強めるための既知の方法であることが、理解される。導出関数および付随する変数もしくは付加的なパラメータの選択は、当業者にとっての十分に技術水準内である。これらの図において、ＯＰ、ＲＬＳ、Ｆ１、Ｆ２、Ｐ１およびＰ２は、導出関数である。
一つの実施形態において、導出パラメータは、ＬＡＬＳおよびＤＣを組み入れて、ＥＧＣおよび好中球の区別可能な核分葉度および表面構造特性に基づき、ＥＧＣを好中球から分類する。ＥＧＣは、好中球と比較してより低いＬＡＬＳを有する。加えて、ＤＣ測定が、導出測定において利用されて、ＥＧＣが通常は好中球よりもサイズが大きいという性質に基づき、ＥＧＣと好中球との間の分離を増大させる。例えば、米国特許第５，１２５，７３７号に記載の図１９は、ＥＧＣが好中球よりも大きな容積を有することを図示している。
さらなる実施形態において、導出測定は、（ＲＦおよびＤＣの関数である）ＯＰを組み入れて、好中球からのＥＧＣの分離を増大させ得る。ＥＧＣは、好中球と比べるとより低いＯＰを有する。
特定の実施形態において、導出パラメータはまた、ＭＡＬＳを組み入れ得る。ＭＡＬＳは、中角度の光散乱にて微かな構造的差異を感知することにより、ＥＧＣと好中球との間の分離を増大させることに寄与する。しかしながら、図３ａにおいて見られるように、ＭＡＬＳ単独では、ＥＧＣ集団と好中球集団との間の区別可能な分離を達成し得ない。
図４ｂおよび図４ｃは、導出パラメータを組み入れて散布図を作り出す場合の図４ａの細胞サンプルを示す。図４ｂは、Ｐ１軸に沿って好中球集団４０２ｂが細長いことを示す。図４ｃは、導出測定が導入される際、Ｐ２軸に対して好中球集団４０２ｃが広がっていることを示す。例示的実施形態を血液サンプルに適用することの最終的な結果は、図４ｃにおいて見られるように、ＥＧＣが好中球から離れて区別可能に認識され得る散布図を生み出し得る。図４ｃにおいて、ＥＧＣ集団４０６は、好中球集団４０４および未定義の集団４０８から十分に区別可能である。図示される散布図において、ＥＧＣ集団４０６はＷＢＣ集団の８．８％を占め、そして未定義の集団４０８はＷＢＣ集団の７．８％を占める。ＥＧＣ集団は、ほぼ全体が後骨髄球、骨髄球、および前骨髄球から成るようである。いくつかの例において、前骨髄芽球段階へ移行中の骨髄芽球のうちのわずかなパーセンテージが、ＥＧＣ集団の中に含まれ得る。未定義の集団は、非幼若好中球、老化好中球、および桿状核球から成るようである。
開示される実施形態の導出パラメータへの到達に関して、適切な係数値は、細胞サンプルの集団間で実質的に最適な分離を生み出す係数の組み合わせであり得ることが、理解される。係数値の選択は、動的に計算され得る。例えば、一つの実施形態に従い、散布図上にマッピングされた細胞集団間の分離に関して予め定められたセットの閾値が満たされるまで、係数値は、繰り返し再較正され得る。
ＬＡＬＳをＡＬＬと組み合わせてＥＧＣを同定すること
本明細書の別の実施形態において、ＬＡＬＳが、ＡＬＬ測定と一緒に考慮され得る。細胞のＡＬＬの大きさは、細胞の表面特性および吸収性質を代表する。その全体が本明細書に参考として援用される米国特許第７，００８，７９２号は、ＮＲＢＣを計数するための方法の一部としてＡＬＬ測定の記載を提供する。
本明細書の別の実施形態において、ＬＡＬＳが、ＡＬＬ測定と一緒に考慮され得る。細胞のＡＬＬの大きさは、細胞の表面特性および吸収性質を代表する。その全体が本明細書に参考として援用される米国特許第７，００８，７９２号は、ＮＲＢＣを計数するための方法の一部としてＡＬＬ測定の記載を提供する。
本発明者らは、ＥＧＣおよび好中球に関して、ＬＡＬＳパラメータおよびＡＬＬパラメータが反対方向に動くことを観測した。それゆえ、本明細書の一つの実施形態に従い、ＬＡＬＳおよびＡＬＬを基にした導出測定（特にＬＡＬＳとＡＬＬとの間の差異）が、作り出される。ＬＡＬＳとＡＬＬとの間の差異を考慮することは、ＥＧＣ集団と好中球集団との間の分離の増大に寄与する。
本発明者らはまた、概して、ＥＧＣが好中球に比べてより高いＤＣパラメータとより低いＯＰパラメータとを呈することを観測した。それゆえ、本明細書の実施形態に従い、ＯＰとＤＣとの間の差異を基にした導出測定が、好中球集団からのＥＧＣ集団の分離を増大させるために考慮される。
付加的な並進、回転および倍率変更が、ＥＧＣ集団および好中球集団の最適なポジショニングへ達するために、最初の導出パラメータに関して行われ得る。
中間の導出パラメータは、所望される表示領域を占めるために、さらに伸縮および倍率変更され得る。伸縮および倍率変更は、自動ゲーティングおよび自動計数がより正確に達成され得るように、集団間での分離を増大することに寄与する。
導出パラメータは、各集団の自動化計数が達成され得るほど十分に、ＥＧＣ集団と好中球集団とが分離されるヒストグラム、散布図、および／もしくは他の図式表示を生成するために使用され得る。
図５は、ＥＧＣを含む好中球集団５０２を、従来のＤＣ対ＭＡＬＳの散布図にて図示する。図示されるように、従来のＤＣ対ＭＡＬＳの散布図は、ＥＧＣ集団を好中球集団から十分に分離しない。
図６は、図５において示されたのと同じ細胞サンプルを、本明細書の一つの実施形態に従う、導出パラメータをプロットする散布図にて図示する。図６において、ＥＧＣ集団６０４は、好中球集団６０２から明確に分離されている。
ＬＡＬＳを使用してＥＧＣを同定および計数するための方法
図７は、本明細書の一つの実施形態に従い血液サンプル中のＥＧＣを同定および計数するための方法７００を図示する。方法７００は、図１にて図示されるような粒子検出器および分析器において実施され得る。
図７は、本明細書の一つの実施形態に従い血液サンプル中のＥＧＣを同定および計数するための方法７００を図示する。方法７００は、図１にて図示されるような粒子検出器および分析器において実施され得る。
ステップ７０２において、血液サンプルが、分析のために調製される。例えば、そして一般性を損なうことなしに、血液学分析において、全血サンプルは、白血球に関する５分類テストの前に、溶解されて赤血球が取り除かれ得る。調製ステップはまた、希釈剤をサンプルおよび必要に応じてシース流体へ加えて、サンプルが測定領域を通って流れるのを容易にすることを含み得る。次いで、調製された粒子サンプルは、粒子が一列で流路を通って動くのに十分な圧力を確保する流体力学的絞り込みのようなプロセスを使用して、測定領域を含む流路の中へ実質的に一定の速度で注入される。
ステップ７０４において、血液サンプルの細胞は、粒子分析器の測定領域において測定に供される。希釈剤中の、および必要に応じてシース流体中の、細胞は、一つ一つ測定領域を通過する。細胞が測定領域中にある時間間隔の間、複数のエネルギー源およびセンサーが作動して、細胞をインタロゲーションに供し、それぞれのインタロゲーションにより生成される信号を収集する。上記で説明されたように、本明細書の一つの実施形態に従い、複数のエネルギー源および対応するセンサーが作動して、ＬＡＬＳ測定、ならびにＤＣ、ＯＰ、ＭＡＬＳ、およびＡＬＬパラメータのうちの一つもしくはそれよりも多くに関する測定信号を収集する。
ステップ７０６において、収集された測定信号に対応する細胞事象データが、生成される。例えば、ある細胞に関する細胞事象データは、その細胞が測定領域を通過した時間間隔のその細胞の全てのパラメータを代表するデータを含み得る。細胞事象データの生成は、様々なセンサーにて検出された光学信号、ＲＦ信号および他の信号に関する電気信号の生成を含み得る。
ステップ７０８において、細胞事象データは、例えば、分析器の構成要素によりアクセスされる。一つの実施形態に従い、ステップ７０８〜７１６の処理のうちのいくつかもしくは全てが、細胞が粒子検出器において測定される際に、リアルタイムもしくはほぼリアルタイムの態様にて行われ得る。別の実施形態に従い、ステップ７０８〜７１６の処理は、以前に粒子検出器により生成されてストレージされている測定データについて行われ得る。
ステップ７１０において、ＥＧＣの集団は、本明細書の実施形態に従う細胞事象データから分類される。ＥＧＣ集団の分類は、図８に関連して下記でさらに説明される。
ステップ７１２において、分類されたＥＧＣの集団が報告され得る。一つの実施形態に従い、報告することには、一つまたはそれよりも多くのヒストグラム、散布図、または他の図式形式および／もしくは文字形式の表示にて、一つまたはそれよりも多くの細胞集団の表示および／または印刷出力が含まれる。別の実施形態に従い、報告することには、ストレージされた情報がより後の検索および分析のために利用可能であるために、様々な細胞集団のデータをコンピュータ読み取り可能なストレージ媒体へ書き込むことが含まれる。
ステップ７１４において、ＥＧＣが計数される。ＥＧＣ集団が好中球集団を含む細胞集団の残りから分離された後、ＥＧＣは数えられ得る。ＥＧＣを数えることは、一つのエリア内に入っている個別の細胞事象を数えること、一つのエリアの中の細胞事象をゲーティングすること、および／もしくは一つのエリアの中の細胞事象を見積もることに基づき得る。
ステップ７１６において、計数されたＥＧＣが報告される。計数されたＥＧＣは、絶対数として、および／もしくは総白血球数に対するパーセンテージとして報告され得る。計数されたＥＧＣはまた、例えば好中球のような任意の他の細胞集団に対するパーセンテージおよび／もしくは分数として報告され得る。分類されたＥＧＣ集団を報告する場合のように、報告することには、表示、印刷出力、および／もしくはコンピュータ読み取り可能媒体へのストレージが含まれ得る。
図８は、ＥＧＣ集団を細胞サンプルのうちの他の細胞集団から分類するための方法８００を図示する。
ステップ８０２において、ＬＡＬＳを含む最初の導出測定が作り出される。一つの実施形態に従い、第一の導出パラメータには、ＬＡＬＳ測定およびＤＣ測定が含まれる。
ステップ８０４において、ＯＰを含む第二の導出測定が作り出される。一つの実施形態に従い、第二の導出パラメータには、ＯＰ測定およびＭＡＬＳ測定が含まれる。
ステップ８０６において、細胞事象のクラスター化が行われる。一つの実施形態に従い、一方の軸として第一の測定を、そしてもう一方の軸として第二の測定を有する散布図が、作り出される。細胞集団のクラスター化は、手作業によりおよび／もしくは自動的に行われ得る。クラスター化には、選択された細胞集団が少なくとも事前に定められた閾値距離によって分離されるまで、係数および／もしくは測定条件を相互作用的に較正することが含まれ得る。クラスター化ステップにはまた、一つもしくはそれよりも多くの細胞集団をゲーティングすることが含まれ得る。
ステップ８０８において、ＥＧＣの集団は、前のステップにおいて行われたクラスター化に基づいて同定される。ＥＧＣのクラスターは、第一の導出パラメータおよび第二の導出パラメータに基づいて、図４ｃにおいて示されるように、好中球のクラスターから分類され得る。
別の実施形態に従い、第一の導出パラメータおよび第二の導出パラメータは、ステップ８０２およびステップ８０４において作り出され得る。したがって、第一の導出測定は、ＬＡＬＳパラメータおよびＭＡＬＳパラメータを含み得る。第二の導出パラメータは、ＤＣパラメータおよびＯＰパラメータを含み得る。この実施形態に従い、ステップ８０６におけるクラスター化は、第一の導出パラメータおよび第二の導出パラメータに基づいた軸を備える散布図を作り出すことを含み得る。
他の例示的実施形態
本明細書の他の例示的実施形態には、ＬＡＬＳおよび二つもしくはそれよりも多くのパラメータに基づいた非成熟の顆粒球の同定および／もしくは計数が含まれ得る。散布図、ヒストグラム、および／もしくは二次元以上の次元における他のグラフタイプが、ＥＧＣ集団の分類および計数において使用され得る。例えば、一つの実施形態には、導出パラメータおよび別の物理的測定もしくは導出測定に基づいた三次元曲面画像の生成が含まれ得、そしてＥＧＣ集団は、三次元曲面における対応する細胞事象の位置に基づいて、同定および計数され得る。
本明細書の他の例示的実施形態には、ＬＡＬＳおよび二つもしくはそれよりも多くのパラメータに基づいた非成熟の顆粒球の同定および／もしくは計数が含まれ得る。散布図、ヒストグラム、および／もしくは二次元以上の次元における他のグラフタイプが、ＥＧＣ集団の分類および計数において使用され得る。例えば、一つの実施形態には、導出パラメータおよび別の物理的測定もしくは導出測定に基づいた三次元曲面画像の生成が含まれ得、そしてＥＧＣ集団は、三次元曲面における対応する細胞事象の位置に基づいて、同定および計数され得る。
図９は、本明細書の別の実施形態を図示する。本明細書の一つの実施形態に従うシステム９００には、分析器１２２へ連結された粒子検出器１２４が含まれる。分析器１２２はまた、ディスプレイ９２０およびストレージ装置９２１へ連結され得る。粒子検出器１２４は、一つもしくはそれよりも多くの測定パラメータを使用して粒子事象を検出し、そしてその粒子検出器には、検出された測定パラメータを処理して、各粒子が測定領域にある持続時間を代表する粒子事象に関する信号を構成する信号プロセッサ１１８が含まれる。上記で示されたように、信号プロセッサ１１８は、測定領域内での各細胞の測定に対応する細胞事象を生成する。信号プロセッサ１１８は、受信された信号の処理を行って、例えば受信された信号の中のノイズを減らすことにより、細胞事象の生成を最適化し得る。粒子が測定領域にある持続時間に対応する信号をアセンブルするための命令と、その信号に対応するパラメータの決定とが、ハードウェア記述言語（ＨＤＬ）、アセンブリ、ＣおよびＣ＋＋を含む任意の適切なプログラミング言語にて実施され得、そしてハードウェア、ファームウェア、もしくはソフトウェアの構成要素のうちの一つもしくはそれよりも多くを含み得る。
上記で図１に関して説明されたように、分析器１２２は、粒子分析器１００の内部に配置されてもよいし、もしくは別個に配置されて通信媒体を通じて粒子検出器１２４へ連結されてもよい。分析器１２２は、粒子検出器１２４により検出された各粒子に対応する細胞事象データを受信する。事象データは、数ある中でもとりわけ、ＬＡＬＳ、ＯＰ、ＤＣ、およびＭＡＬＳに関するパラメータが含み得る。
分析器１２２は、プロセッサ９０２、メモリデバイス９０３、ストレージデバイス９０４、入力デバイス９０５、出力デバイス９０６、ＥＧＣ決定モジュール９０７および通信インフラ９０８が含まれる構成要素を含む。プロセッサ９０２は、任意のマイクロプロセッサ、もしくは処理命令を実行可能な他のプロセッサであり得る。メモリデバイス９０３は、ランダムアクセスメモリを含み得る。ストレージデバイス９０４は、フラッシュメモリもしくはハードディスクのようなコンピュータで読み取り可能な永続的ストレージ媒体を含む。プロセッサ９０２は、粒子分析器から事象データを受信すること、受信したデータを処理すること、および処理された結果データを出力することに関する命令を実行する。メモリデバイス９０３およびストレージデバイス９０４は、プロセッサ９０２の任意の一時的もしくは永続的なメモリーおよびストレージの必要条件を提供する。通信インフラ９０８は、分析器１２２の構成要素をお互いに相互接続し、そして通信媒体を含み得、その通信媒体としては、ｐｅｒｉｆｅｒａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔ（ＰＣＩ）バス、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ（ＥＩＳＡ）バス、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）および／もしくはＷＩＦＩが挙げられるが、それらに限定されない。入力デバイス９０５は、粒子分析器１００への通信インフラ９０８を通じての接続性と、粒子分析器１００からの事象データを含むデータを受信する能力とを含み得る。
ＥＧＣ決定器モジュール９０７は、粒子検出器１２４からの細胞事象データを処理して血液サンプル中のＥＧＣ集団を同定および計数する機能を含む。例えば、ＥＧＣ決定モジュール９０７は、方法７００のステップ７０８〜７１６を実施するための命令もしくはコンピュータプログラムを含み得る。ＥＧＣ決定器モジュール９０７は、データアクセスモジュール９４２、ＥＧＣ分類器モジュール９４４、およびＥＧＣ報告器モジュール９４６から構成され得る。データアクセスモジュール９４２は、粒子検出器から受信した細胞事象データにアクセスし得る。データにアクセルすることには、ストレージデバイスにアクセスして以前に保存された細胞事象データを検索すること、もしくは粒子検出器から細胞事象データをリアルタイムで受信することが含まれ得る。ＥＧＣ分類器モジュール９４４は、例えば、方法７００のステップ７１０およびステップ７１４に関連して上記で説明されたＥＧＣ集団を同定および計数する機能を含み得る。ＥＢＣ報告器モジュールは、例えば、方法７００のステップ７１２およびステップ７１６に関連して上記で説明されたＥＧＣ情報を報告する機能を含み得る。
ＥＧＣ決定器モジュール９０７は、ハードウェア記述言語（ＨＤＬ）、アセンブリ、ＣおよびＣ＋＋を含む任意の適切なプログラミング言語にて実施され得、そしてハードウェア、ファームウェア、もしくはソフトウェアの構成要素のうちの一つもしくはそれよりも多くを含み得る。ＥＧＣ決定器モジュール９０７を実施する命令および／もしくはコンピュータプログラムは、例えば、コンピュータ読み取り可能なストレージ媒体９０４の中に保存され得る。
出力モジュール９０６は、ＥＧＣ決定器モジュール９０７において決定されたＥＧＣ集団情報が含まれる細胞集団情報を、用途のために適切な方法で扱う機能を含む。一つの実施形態において、出力モジュール９０６は、事前に構成されたグラフ設定に従う一つもしくはそれよりも多くのグラフを生成して、ＥＧＣ決定器モジュール９０７を含む処理モジュールにて決定される分類された細胞集団を表示し得る。
出力モジュール９０６は、通信インフラ９０８を使用して、ディスプレイ９２０および／もしくはストレージデバイス９２１へ連結される。出力モジュール９０６からの結果データは、ディスプレイ９２０へ伝えられて、操作者により表示および分析される。例えば、ディスプレイ９２０は、ヒストグラムの形式、散布図の形式、または図式表示および／もしくは文字表示の他の形式にて、結果データを図示し得る。別の実施形態において、結果データは、後に続く処理および分析のために、外部ストレージデバイス９２１の中に保存され得る。
本開示において、自動化された血球計数の診断値を改善し得る方法およびシステムが、開示された。特に、本明細書の実施形態は、血球サンプル中のＥＧＣの自動化された同定および計数を可能にし、そのことは、感染症の様々な状態を検出および治療するために重要であり得る。開示された方法およびシステムは、現在の方法およびシステムに対する費用対効果および効率の実質的な改善を生み出し、粒子分析器データの分析における有意な改善につながり得る。
本明細書の前述の説明は、例証および説明の目的のために提示された。網羅的であることも、本明細書を開示された正確な形態に限定することも、意図されず、そして他の改変およびバリエーションが、上記の教示に照らして可能であり得る。実施形態は、本明細書の原理およびその実践的用途を最もよく説明し、それによって他の当業者が、意図する特定の使用に適うような様々な実施形態および様々な改変にて、本明細書を最もよく利用できるようにするために選択および説明された。添付の特許請求の範囲は、先行技術により限定される範囲を除き、本明細書の他の代替的な実施形態を含むと解釈されることが、意図される。
以下の非限定の実施例を、ここで意図する代表的な実施形態のより完全な理解を容易にするため、例証とする目的のみのために提供する。これらの実施例は、幼若顆粒球の同定および／もしくは計数のための方法、システム、および／もしくは装置と関係がある実施形態を含め、本明細書において説明される実施形態のいずれをも限定するとは解釈されるべきではない。
実施例１
７つの異なる場所にて収集された１５３６個の固有サンプル１セットを対象にして、参照となる４００個の細胞の手作業による分類と比較しての、ＥＧＣの計数の評価を、下記の表１にて示す。相関係数ｒを、ＥＧＣ％を前骨髄球％、骨髄球％および後骨髄球％の合計に対して比較することにより決定した。ＲＯＣ曲線下面積の計算のために使用した陽性の基準は、前骨髄球％、骨髄球％および後骨髄球％の合計が１％以上であることであった。
７つの異なる場所にて収集された１５３６個の固有サンプル１セットを対象にして、参照となる４００個の細胞の手作業による分類と比較しての、ＥＧＣの計数の評価を、下記の表１にて示す。相関係数ｒを、ＥＧＣ％を前骨髄球％、骨髄球％および後骨髄球％の合計に対して比較することにより決定した。ＲＯＣ曲線下面積の計算のために使用した陽性の基準は、前骨髄球％、骨髄球％および後骨髄球％の合計が１％以上であることであった。
敏感度は、真陽性ＥＧＣ／（真陽性ＥＧＣ＋偽陰性数）の比率である。もう一方で、特異度は、真陰性ＥＧＣ／（真陰性ＥＧＣ＋偽陽性数）の比率である。ＲＯＣ曲線（受信者操作特性曲線）下面積は、ＥＧＣ計数方法の敏感度と特異度とを組み合わせた分析的アプローチの正確性の尺度である。記載されている敏感度および特異度の基準は、敏感度と引き換えに特異度を得る値のスライディングスケール（ｓｌｉｄｉｎｇ ｓｃａｌｅ）を反映し、特異度と引き換えに敏感度を得る場合も同じである。それゆえ、例えば、基準が１．０とは、特異度が、敏感度の減少を代償にして増加した場合である。最適な値は当業者により到達され得ることが、理解される。
二つの異なった場所で、参照として、フローサイトメトリーＣＤ１６マーカーを使用して収集された３１５個のサンプル１セットを対象にした同様の評価が、表２において示される結果を提供した。ＣＤ１６は、ＥＧＣではなく好中球と関連性のあるマーカーである。それゆえ、ＥＧＣ集団は、概して、散布図の好中球集団と密接に重なる領域において現れるが、標識付きのＣＤ１６抗体を使用することにより、好中球をゲーティングし得、それらをＥＧＣ集団から分離し得る。成熟度が低い細胞は、成熟細胞よりも低い光散乱を有する。それゆえ、ＣＤ１６抗体と光散乱との組み合わせを使用して、ＥＧＣ集団をゲーティングし得る。この方法を使用して、３１５サンプルを選別し、そのサンプルのうちの１６４がＥＧＣを含んでいると同定した。ＣＤ１６ゲーティング分析アプローチを本明細書の分析方法と比較すると、本明細書は、表２において表記される結果を提供した。
収集されたサンプルの上記のデータ分析により、本明細書で開示される発明は、サンプルの手作業による分類検査と比較して、高レベルの相関、敏感度および特異性を有することが、実証されている。
Claims (12)
- 血液サンプル中の幼若顆粒球（ＥＧＣ）を計数するための方法であって、該方法が：
低角度光散乱（ＬＡＬＳ）パラメータを使用して、該血液サンプルの白血球を分析する工程；
該ＬＡＬＳパラメータを使用して他の白血球から該ＥＧＣを分離する工程；および
該分離されたＥＧＣを計数する工程
を含み、該方法が非蛍光の方法である、方法。 - 請求項１に記載の方法であって、前記他の白血球からのＥＧＣの前記分離が、さらに、少なくとも一つの付加的なパラメータに基づいており、該少なくとも一つの付加的なパラメータが、軸方向光損失（ＡＬＬ）、中角度光散乱（ＭＡＬＳ）、直流（ＤＣ）量および電導度（ＯＰ）を含む、方法。
- 請求項１もしくは請求項２に記載の方法であって、前記分離する工程が：
前記分析のデータをクラスター化し、それによって複数の集団を生成する工程；および
該複数の集団からＥＧＣの集団を同定する工程
を含む、方法。 - 請求項３に記載の方法であって、ＥＧＣの集団が、前記複数の集団のうちの好中球集団から実質的に分離される、方法。
- 請求項１から請求項４に記載の方法であって、該方法が：
前記ＥＧＣを、前記分離されたＥＧＣの集団に基づいて計数する工程；および
該計数されたＥＧＣを報告する工程
をさらに含む、方法。 - 請求項５に記載の方法であって、前記計数されたＥＧＣが、白血球の総数に対するパーセンテージとして報告される、方法。
- 幼若顆粒球（ＥＧＣ）を計数するための方法であって、該方法が：
血液サンプル中の白血球を分析する工程；
ＥＧＣの特異的分葉度および／もしくは表面構造特性を測定する低角度光散乱（ＬＡＬＳ）パラメータに基づき、該ＥＧＣを他の白血球から区別する工程；
該区別されたＥＧＣを該他の白血球（ＷＢＣ）から分離する工程；および
該区別されたＥＧＣの集団を計数する工程
を含み、該方法が非蛍光の方法である、方法。 - 血液サンプル中の未成熟な顆粒球（ＥＧＣ）を同定するための装置であって、該装置が：
プロセッサ；
光散乱を検出するための非蛍光センサーであって、該光散乱が低角度光散乱（ＬＡＬＳ）パラメータを含むセンサー；
該プロセッサへ連結された少なくとも一つのメモリであって、該メモリが、粒子分析器からの細胞事象データを保存するように構成されており、該細胞事象データが前記低角度光散乱（ＬＡＬＳ）パラメータを含む、メモリ；および
ＥＧＣ決定器モジュールであって：
該ＬＡＬＳパラメータを使用して、該血液サンプルの白血球を分析し；
該ＬＡＬＳパラメータに基づく該細胞事象データを使用して、ＥＧＣを他の白血球から分離し；そして
該分離したＥＧＣを計数する
ように構成される、モジュール
を含む、装置。 - 請求項８に記載の装置であって、複数の細胞インタロゲーターを使用して前記血液サンプルの各細胞をインタロゲートすることにより前記細胞事象データを生成するように構成された粒子検出器をさらに含む、装置。
- 請求項８もしくは請求項９に記載の装置であって、前記分離されたＥＧＣ集団を報告するように構成されたディスプレイをさらに含む、装置。
- 請求項８から請求項１０に記載の装置であって、前記他の白血球からのＥＧＣの前記分離が、さらに、少なくとも一つの付加的なパラメータに基づいており、該少なくとも一つの付加的なパラメータが、軸方向光損失（ＡＬＬ）、中角度光散乱（ＭＡＬＳ）、直流（ＤＣ）量、もしくは電導度（ＯＰ）を含む、装置。
- 請求項８から請求項１１に記載の装置であって、前記ＥＧＣ決定器モジュールが、さらに：
前記白血球分析データをクラスター化することによりＥＧＣを他の白血球から分離し、それによって複数の白血球集団を生成し；そして
該ＥＧＣの集団を該複数の白血球集団から同定する
ように構成される、装置。
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