BR112013025329B1 - método não-fluorescente para enumerar células de granulócitos prematuras (ecgs) compreendendo promielócitos, mielócitos e metamielócitos em uma amostra de sangue - Google Patents

Abstract

IDENTIFICAR E ENUMERAR CÉLULAS PREMATURAMENTE GRANULADAS (ECGS). A presente invenção refere-se a métodos e sistemas para automaticamente identificar e enumerar células prematuramente granuladas (ECG) em amostras de sangue. Em uma modalidade, um método para identificar ECG em uma amostra de sangue inclui analisar células de sangue brancas da amostra de sangue usando um parâmetro de dispersão de luz de ângulo baixo (LALS), separar as ECGs das outras células de sangue brancas usando o parâmetro de LALS, e enumerar as ECGs separadas.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se, em geral, a análise de da dos de evento celular gerados por um analisador de partícula, e, mais particularmente, a detecção e enumeração de células granuladas prematuras (EGCs) em amostras de sangue.

Antecedentes

[0002] Analisadores de partículas são usados para analisar amostras biológicas de célula, de modo a determinar a contagem e/ou distribuição de um ou mais tipos de células contidos nas amostras. Analisadores de partículas incluem analisadores de partículas hematológicos e citômetros de fluxo. Analisadores de partículas hematológicos e citômetros de fluxo medem e diferenciam células de sangue de vários tipos, coletando e analisando sinais produzidos, quando as células passam através de uma pequena abertura ou região de medição, que é monitorada por um ou mais sensores. Por exemplo, uma amostra de sangue flui através de uma região de medição, na qual uma ou mais fontes de energia e sensores associados são configurados para detectar sinais que correspondem às várias características físicas das células que passam pela mesma. Um ou mais dos sinais que correspondem às medições de uma única célula na região de medição são chamados eventos celulares. Dados de evento celular para uma pluralidade de células de amostra de célula, então, são analisados para determinar populações, diferenciadas com base nas características físicas das células.

[0003] Medições de propriedades físicas, tal como volume, condu- tividade, e dispersão da luz são usadas para classificar células. Por exemplo, a tecnologia de Volume, Condutividade, Dispersão VCS (de Volume, Condutivity, Scatter) de Beckman Coulter é usada dentre outras aplicações para classificar células de sangue brancas em subgrupos ou populações. Estas medições físicas formam um espaço multidimensional, onde as células compartilham grupos de propriedades físicas similares em agrupamentos. Cada agrupamento corresponde a uma população de um tipo específico de células de sangue.

[0004] A enumeração de células de sangue brancas (WBCs (de White Blood Cells), também chamadas de Leucócitos) é uma ferramenta importante para detectar condições patológicas, tais como, várias formas de infecção. Um diferencial WBC de 5 partes vem se constituindo a muito tempo um teste valioso para detecção de condições hematológicas. O diferencial de 5-partes detecta e enumera os cinco mais importantes subtipos de WBC, normalmente encontrados no sangue periférico, isto é, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosionófilos, e basófilos. No entanto, pode haver outros tipos de WBC em estágios intermediários do processo de maturação. Estes WBCs em estágios intermediários de processo de maturação incluem células blásticas, variantes de células linfáticas, e células prematuramente granuladas (ECGs de Early Granulated Cells) que também são indicadores de doenças hematológicas. O termo ECG se refere a um subconjunto de células mieloides imaturas, principalmente compostas de promielóci- tos, mielócitos, e metamielócitos. Outras células em estágios intermediários de maturação, tais como células blásticas e células de banda geralmente não estão incluídas na população de ECG.

[0005] A presença em um número elevado de ECGs no sangue periférico poderia indicar uma ativação da medula do osso. A contagem de ECGs, por exemplo, pode indicar sepsis que é uma forma severa de infecção bacteriana. Em geral, um aumento nas ECGs em cir- culação ocorre durante uma infecção bacteriana. A presença de ECGs indica uma produção de célula mieloide crescente devido à infecção ou doença inflamatória severa. As ECGs também podem ser encontradas em pacientes com leucemia, síndrome mielodisplástica, e mi- elofibrose. Assim, uma enumeração rápida e precisa de ECGs em uma amostra de sangue de paciente pode ser altamente desejável para um tratamento oportuno de infecção aguda, sepsis, e outras condições. Melhorar o teste diferencial WBC de 5 partes de rotina adicionando uma contagem ECG pode prover uma capacidade de diagnóstico substancialmente melhorada.

[0006] Nos métodos convencionais de análise, a presença de ECGs é associada a mudanças na forma de uma população de evento de célula em um histograma ou diagrama de dispersão bidimensional. Com base na forma de uma ou mais populações de controles, analisadores de partículas convencionais são capazes de alertar ao usuário final a presença de células imaturas ou atípicas.

[0007] A enumeração ECG é convencionalmente feita por meio de análise por tingimento manual de sangue. Este processo requer muito trabalho e é altamente propenso a erro, por vários fatores, tal como o número baixo de células contadas e subjetividade humana.

[0008] Outro método convencional de enumeração de ECG é ba seado na fluorescência. As WBCs são tingidas com polimetina, que tinge RNA e DNA de cada célula. As ECGs, então, podem ser identificadas separadas de granulócitos maduros com base na maior fluorescência, por causa do maior conteúdo de RNA e DNA nos ECGs. No entanto, a tecnologia baseada na fluorescência pode ser dispendiosa e não adequada para analisadores de partículas de baixo custo. Por conseguinte, há uma necessidade de ser capaz de determinar ECG com um método e instrumento não fluorescente.

[0009] Adicionalmente, outro método foi descrito que mede os granulócitos imaturos somente com base em CC. No entanto, a precisão desta medição pode ser comprometida para os casos nos quais os volumes da subpopulação de neutrófilos, e bandas e subpopulação de granulócitos imaturos se sobrepõem.

[00010] Ainda outro método convencional de enumeração ECG compreende uma análise citométrica de fluxo, usando um ou mais anticorpos, tal como, por exemplo, o anticorpo CD16. Usando este método, as ECGs podem ser identificadas com base na falta de tingimento CD16 nas células ECG. No entanto, o método compreende uso de múltiplos anticorpos para reter sequencialmente diferentes tipos de célula. Por conseguinte, os métodos citométricos de fluxo usando anticorpos para identificar ECGs podem ter um custo proibitivo e causar mudanças nas características físicas das células por causo do uso de um ou mais anticorpos.

[00011] Por conseguinte, há necessidade de métodos e sistemas eficientes para identificar e enumerar ECGs em amostras de sangue. Breve Sumário

[00012] Método e sistemas para automaticamente identificar e enumerar Células Granuladas Prematuras (CCGs) em amostras de sangue analisadas em um analisador de partícula são descritos. Em uma modalidade, um método para identificar ECGs em uma amostra de sangue inclui analisar células de sangue brancas da amostra de sangue, usando um parâmetro de dispersão de luz de ângulo baixo (LALS de Low Angle Light Scatter), separar as ECGs das outras células de sangue brancas usando o parâmetro de LALS e enumerar as ECGs separadas.

[00013] Outra modalidade é um aparelho para identificar ECGs em uma amostra de sangue. O aparelho inclui um processador, pelo menos uma memória acoplada ao processador, e um módulo determinador de ECGs. A memória é configurada para armazenar dados de evento celular a partir de um analisador de partícula, os dados de evento célula incluindo o parâmetro de LALS. O módulo determinador ECG é configurado para analisar células de sangue brancas usando o parâmetro de LALS, e para diferenciar e/ou separar a população de ECGs de outras células de sangue brancas com base no parâmetro de LALS.

[00014] Aspectos e vantagens da presente invenção, assim como a estrutura e operação de várias de suas modalidades serão descritas em detalhes abaixo fazendo referência aos desenhos anexos. Deve ser notado que a especificação não se limita às modalidades específicas descritas aqui. Tais modalidades serão apresentadas aqui somente com propósito ilustrativo. Modalidades adicionais serão aparentes àqueles versados na técnica com base nos ensinamentos contidos nesta.

Breve Descrição dos Desenhos

[00015] Aspectos e vantagens da presente invenção, assim como a estrutura e operação de várias de suas modalidades serão descritas em detalhes abaixo, fazendo referência aos desenhos anexos. Deve ser notado que a especificação não se limita às modalidades específicas descritas aqui. Tais modalidades serão apresentadas aqui somente com propósito ilustrativo. Modalidades adicionais serão aparentes àqueles versados na técnica, com base nos ensinamentos contidos nesta.

[00016] A Figura 1 é um sistema de acordo com uma modalidade da presente especificação.

[00017] As Figuras 2a e 2b ilustram diagramas de dispersão de análise diferencial WBC com base em volume e dispersão de luz. A Figura 2a ilustra uma amostra normal. A Figura 2b Ilustra uma amostra com ECGs.

[00018] As Figuras 3a e 3b ilustram a sobreposição de população de neutrófilo e população ECG. A Figura 3a ilustra um diagrama de dispersão baseado em volume e dispersão de luz de ângulo médio ro- tacionado. A Figura 3b ilustra um diagrama de dispersão baseado em volume e condutividade.

[00019] As Figuras 4a, 4b e 4c ilustram o uso da LALS para detectar a população de ECG de acordo com modalidades da presente especificação. A Figura 4a ilustra um diagrama de dispersão com condu- tividade e LALS. A Figura 4b ilustra um diagrama de dispersão com condutividade e medições derivadas incluindo LALS. A Figura 4c ilustra um diagrama de dispersão com uma primeira medição derivada incluindo LALS e uma segunda medição derivada incluindo LALS.

[00020] A Figura 5 ilustra uma população de célula em um diagrama de dispersão CC v MALS (MALS de Medium Angle Light Scatter).

[00021] A Figura 6 ilustra a mesma amostra de célula da Figura 5 em um diagrama de dispersão, com medições derivadas, de acordo com uma modalidade da presente especificação.

[00022] A Figura 7 ilustra um método para detectar e enumerar ECGs, de acordo com uma modalidade da presente especificação.

[00023] A Figura 8 ilustra um método para identificar uma população de ECGs, de acordo com uma modalidade da presente especificação.

[00024] A Figura 9 mostra um analisador de evento celular e sistema correspondente, de acordo com uma modalidade da presente especificação.

[00025] Os aspectos e vantagens da presente especificação serão mais aparentes a partir da descrição detalhada a ser descrita em seguida em conexão com os desenhos. Nos desenhos, os mesmos números de referência indicam geralmente elementos idênticos funcionalmente similares e/ou estruturalmente similares. Geralmente, o desenho no qual o elemento que primeiro aparece é indicado pelos dígi- tos dispostos a esquerda no correspondente número de referência. Descrição Detalhada

[00026] A presente invenção relaciona-se ao processamento e análise de dados de evento celular gerados por um analisador de partículas. Embora a presente invenção venha a ser descrita aqui fazendo referência às modalidades ilustrativas para aplicações particulares, deve ser entendido que a especificação não se limita a isto. Aqueles habilitados na técnica com acesso aos ensinamentos aqui contidos deverão reconhecer que modificações, aplicações, e modalidades adicionais dentro do escopo da invenção e campos adicionais nos quais a especificação seria de utilidade significativa. Visão Global

[00027] Como descrito acima, a detecção e enumeração de células prematuramente granuladas ECGs tem grande valor diagnóstico para detectar uma faixa de condições hematológicas. Os métodos e sistemas descritos aqui permitem a identificação e enumeração de ECGs em amostras de sangue analisando dados de evento celular gerados por um analisador de partículas. A presente invenção provê uma solução superior com respeito às técnicas existentes, sendo que a presente invenção não requer quaisquer corantes, tingidores, ou anticorpos especiais e dispendiosos para separar ECGs da população de neutró- filos, geralmente sobreposta.

[00028] Como usado nesta, os termos "parâmetro" e "medição" são usados geralmente de modo intercambiável. Com respeito à presente especificação, um laser emite um feixe de energia, que é refletido ou defletido a partir de uma partícula, isto é, uma célula, e esta energia é medida como parâmetro por um ou mais detectores. Por conseguinte, é considerado geralmente que a energia seja um parâmetro medido. Certos parâmetros não são medidos diretamente, mas, ao invés, calculados. Para efeito de exemplo específico, Opacidade (OP) e RMALS são parâmetros calculados a partir de CC e RF medidos para parâmetro de Opacidade, e MALS e CC para parâmetro RMALS.

[00029] Modalidades da presente especificação usam medições de dispersão de luz de ângulo baixo (LALS) para detectar e enumerar automaticamente populações de ECG nas amostras de sangue. Ademais, a enumeração de ECGs, de acordo com modalidades da presente especificação, não requer a repetição de teste das amostras no detector de partícula. A informação de ECGs enumeradas pode ser quer incorporada como parte do teste diferencial de 5 partes para células de sangue brancas ou apresentada separadamente.

[00030] Ambientes exemplares onde esta especificação pode ser praticada inclui analisadores de partículas, tais como citômetros de fluxo e analisadores hematológicos. O analisador hematológico DX800®, por exemplo, usa uma variação de tecnologia de Volume, Condutividade, e Dispersão (VCS) proprietária Coulter para interrogar células na região de medição de um analisador de partículas. O VCS usa pelo menos três fontes de energia independentes que trabalham em conjunto para interrogar células: uma fonte de energia de corrente contínua (CC) de baixa frequência para medir volume, uma fonte de energia de alta frequência para medir condutividade (OP), e uma ou mais fontes de luz laser para medir dispersão. A medição de volume é realizada usando Princípio Coulter de impedância elétrica para medir fisicamente o volume que a célula inteira desloca em um diluente iso- tônico. Este método dimensiona com precisão todos os tipos de célula a despeito da orientação na trajetória de luz. Corrente alternada na faixa de radiofrequência (RF) curto-circuita a camada lipídica bipolar de uma membrana de célula, permitindo que energia penetre na célula. Esta fonte de energia é usada para coletar informação com respeito a tamanho e estrutura interna da célula, incluindo composição química e volume nuclear. Uma ou mais fontes de energia laser e sensores ou detectores de dispersão de luz de múltiplos ângulos de luz proveem informações com respeito à estrutura interna, granularidade, e morfologia superficial da célula. Medições de dispersão de luz incluem medida de dispersão de luz de ângulo médio superior (UMALS de Upper Medium Angle Light Scatter), por exemplo, em uma faixa entre 20-65 graus do eixo, medida de dispersão de luz de ângulo médio inferior (LMALS de Lower Medium Angle Light Scatter), por exemplo, em uma faixa entre 10-20 graus do eixo. A combinação UMALS e LMALS é chamada MALS, no entanto, UMALS e LMALS constituem medições de dispersão de luz distintas, usando detectores de luz ligados.

[00031] Em adição, instrumentos VCS usam uma medição CC de alta precisão de volume para obter outras medições que são ajustadas com respeito ao tamanho da célula a partir de condutividade e dispersão. A Patente U.S. No 5.616.501 (de Rodriguez et al), incorporada nesta por referência em sua integralidade, contém a descrição detalhada de um analisador de partículas e uso de tecnologia VCS.

[00032] Em adição às medições acima, o analisador hematológico DxH 800® também inclui medição de LALS e medição de perda de luz axial (ALL ou AL2). O LALS é medido, por exemplo, em um exemplo entre 0-10 graus a partir do eixo. ALL é medido como perda de luz ao longo do eixo, por exemplo, 0-1,0 grau do eixo. Aqueles habilitados na técnica deverão entender, no entanto, que ângulos de dispersão de luz exemplares que correspondem a UMALS, LAMALS, LALS, e ALL são relativos entre si, e podem mudar devido a uma variedade de fatores, tais como características individuais do detector de partícula e reagentes e outros materiais misturados com as amostras de célula. Deve ser notado, no entanto, que os ensinamentos da presente invenção não se limitam a dispositivos usando tecnologia VCS ou suas variantes.

[00033] A Figura 1 ilustra um analisador de partículas 100 de acordo com uma modalidade da presente especificação. A Figura 1 se des tina a propósitos ilustrativos e deve ser entendido que analisadores de partículas podem incluir mais ou menos módulos, diferentes módulos, e diferentes desenhos, que aqueles mostrados na Figura 1. O analisador de partículas 100 inclui detector de partícula 124 e analisador 122. O detector de partícula 124 inclui um dispensador de amostras de partículas 102 e dispensador de fluído de cobertura (sheath fluid) 104. O dispensador de partículas 102 inclui uma amostra de partícula preparada de acordo com os requisitos de uma análise ou teste desejado. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser diluída em um diluente em um predeterminado grau de concentração de célula. O tipo de diluente e o grau de diluição diferem de acordo com o teste executado - a análise de células de sangue brancas WBC requer menos diluição que células de sangue vermelhas RBC em razão de o número de WBC na amostra ser baixo em relação ao RBC. Um dis- pensador de fluído de cobertura 104 contém um fluído de cobertura, tal como, por exemplo, uma solução salina. O fluído de cobertura permite um fluxo suave da amostra de partícula no detector de partícula. A amostra de partícula a partir do dispensador de amostra de partícula 102 e o fluído de cobertura a partir do dispensador de fluído de cobertura 104 são injetados em uma taxa constante predeterminada. O dis- pensador de solução 106 canaliza a amostra de partícula e fluído de cobertura para dentro de uma célula de fluxo 108. O fluxo de célula 108, em geral, é um tubo de diâmetro pequeno, desenhado de modo a permitir a passagem de uma única partícula. A solução no dispensador de solução é injetada na célula de fluxo 108 a uma taxa constante por focalização hidrodinâmica. A focalização hidrodinâmica injeta a solução a uma taxa constante e a uma pressão suficiente, de modo que, em geral, as partículas pareçam estar em uma única fila em intervalos constantes na célula de fluxo 108. Deve ser notado que alguns detectores de partículas podem ter uma área de medição sem uma célula de fluxo.

[00034] Um dispositivo sensor 110 é posicionado dentro do detector de partícula 124, de modo que um ou mais meios sensores possam ser empregados para detectar as partículas que fluem através da região de medição 120. Fontes de energia 112 e sensores associados 114 são posicionadas dentro do dispositivo sensor 110 substancialmente transversalmente à célula de fluxo 108. Fontes de energia 112 e sensores 114 empregam um ou mais meios elétricos ou óticos para detectar partículas na região de medição 120. Por exemplo, um conjunto de fontes de energia 112 e sensores associados 114 pode empregar uma medição de luz para medir as características de dispersão de luz e perda de luz de uma célula que passa através da região de medição 120. Medições de dispersão de luz incluem UMALS, LMALS, e LALS. A perda de luz é medida como perda de luz axial (ALL ou AL2) isto é a perda de luz ao longo do eixo, por exemplo, em 0-1,0 graus de eixo. Outros conjuntos de fontes de energia 112 e sensores 114 podem empregar uma medição CC para medir o volume V de uma célula e medição RF para medir as características de condutividade OP de uma célula. As fontes de energia 112 e sensores 114 também podem incluir outros meios, tais como, por exemplo, um meio acústico, que usa ultrassom para detectar várias características de uma célula em uma região de medição 120.

[00035] Sensores 114 são acoplados a um processador de sinal 118. Os sensores 114 convertem medições elétricas ou óticas em correspondentes pulsos de sinal elétrico, que são processados no processador de sinal 118. Para cada partícula que passa pela região de medição 120, os pulsos de sinal elétrico, que correspondem a uma sequência de medições, são coletados, por exemplo, no processador de sinal 118. A partir destes pulsos de sinal elétrico, um sinal é formado para ilustrar as medições capturadas para um parâmetro de medição, enquanto outra partícula está fluindo através da região de medição 120. A entrada para o processador de sinal 118 pode ser sinal analógico ou digital. Um ou mais conversores analógico-para-digital (ADC) podem ser usados para converter sinais analógicos em sinais digitais, antes, durante, ou depois do processamento no processador de sinal 118. A duração coberta pelo sinal compreende da entrada à saída da partícula na região de medição. Em modalidades da presente especificação, o processador de sinal 118 pode realizar um processamento adicional de cada sinal, para obter um ou mais parâmetros de medição que descrevem a partícula detectada.

[00036] A detecção de uma partícula na região de medição 120 é chamada evento ou evento celular. O processador de sinal 118 analisa o sinal obtido que corresponde a cada partícula detectada que flui pela região de medição 120 para determinar o evento correspondente. Os eventos detectados, então, são transmitidos para o analisador 122. O analisador 122 é acoplado ao processador de sinal 118 para receber os dados de evento. O analisador 122 pode ser localizado em um computador acoplado ao detector de partícula. Deve ser notado que o analisador 122 pode ser quer localizado no analisador de partículas 100 compreendendo um detector de partícula 124 ou separado, acoplado ao analisador de partículas 100 de uma infraestrutura de comu-nicação.

[00037] A geração de sinal e a detecção de evento são realizadas separadamente para cada medição elétrica ou ótica ativa. O analisador 122 pode receber dados de evento que correspondem a cada medição ativa. O analisador 122, então, pode analisar os dados de evento recebidos, para determinar uma ou mais contagens, populações de célula, e outras características correspondentes da célula. Na modalidade da presente especificação, o analisador 122 pode representar histogramas, gráficos, e outras ilustrações gráficas ou textuais dos eventos recebidos. Os pontos de dispersão histogramas e/ou outras representações gráficas podem ser multidimensionais.

[00038] "Sensibilidade" e "Especificidade" são medidas estatísticas do desempenho de um teste de classificação binária. Sensibilidade mede a proporção de positivos reais que são corretamente identificados. Especificidade mede a proporção de negativos que são corretamente identificados. Uma especificidade de 100% significa que o teste reconhece todos negativos reais. Uma sensibilidade de 100% significa que o teste reconhece todos positivos reais. Assim, em contraste com teste de alta especificidade, resultados negativos em um teste de alta especificidade são usados para descartar a doença. Um resultado positivo em um teste de alta especificidade pode confirmar a presença da doença. No entanto, a especificidade sozinha não indica precisão suficiente do teste para reconhecer um caso positivo. O conhecimento da sensibilidade também é requerido. Para qualquer teste, usualmente há um compromisso entre estas medições. Por exemplo, em um teste diagnóstico no qual se testa alguém com respeito a uma certa condição, o teste pode ser ajustado para desconsiderar uma certa porcentagem de pessoas doentes, que são corretamente identificadas como tendo a condição (baixa especificidade), para reduzir o risco de perder a por-centagem de pessoas saudáveis, que foram corretamente identificadas como não tendo a condição (alta sensibilidade). Este compromisso pode ser representado graficamente, com curva característica de operação de receptor (ROC).

[00039] A "precisão" de um sistema de medição é o grau de aproximação da medição de uma quantidade com respeito a seu valor real.

[00040] Em uma modalidade, a especificação descreve um método para enumerar ECGs com pelo menos cerca de 80% de precisão, e, mais particularmente, com pelo menos cerca de 85% de precisão. Em modalidades preferidas, a especificação descreve um método para enumerar ECGs com pelo menos cerca de 90% de precisão.

[00041] Em outra modalidade, a especificação descreve um método para numerar ECGs com pelo menos cerca de 85% de sensibilidade, mais particularmente com pelo menos cerca de 90% de sensibilidade, e ainda mais particularmente com pelo menos cerca de 95% de sensibilidade. Em ainda outra modalidade, a especificação descreve um método para enumerar ECGs com pelo menos cerca de 80% de especificidade, e, mais particularmente, com pelo menos cerca de 85% de especificidade. Em modalidades preferidas, a especificação descreve um método para enumerar ECGs com pelo menos cerca de 90% de especificidade. Uso de LALS para Identificar e Enumerar ECGs

[00042] Os inventores observaram que as ECGs podem ser diferenciadas de outros tipos de células, especificamente neutrófilos, com base em aspectos únicos de granularidade, lobularidade nuclear, e/ou estrutura superficial da célula. Os inventores descobriram que estes aspectos únicos podem ser medidos e usados como base para identificar a população de ECGs. Em uma modalidade específica, a LALS pode ser usada para discernir o grau de granularidade, lobularidade nuclear, e/ou estrutura superficial da célula. Especificamente, os inventores descobriram que o parâmetro de LALS é um parâmetro altamente sensível a mudanças sutis em granularidade, lobularidade, características superficiais de ECGs em relação à s WBC maduras. No entanto, também deve ser entendido que a LALS pode ser combinada com outros parâmetros com respeito à especificidade e sensibilidade na enumeração de ECGs. Mais particularmente, uma modalidade da presente especificação inclui método e instrumento fluorescente, que mede ECGs usando LALS e pelo menos uma medição do grupo de dis- persor de luz para frente, dispersor lateral, perda de luz axial, CC, RF e Opacidade. Ainda adicionalmente, a luz de dispersador direcionada para frente é selecionada de UMALS, LMALS, MALS.

[00043] As Figuras 2a e 2b ilustram um diagrama de dispersão diferencial WBC de uma amostra de sangue normal (FIG. 2a) e amostra de sangue contendo ECGs (FIG. 2b). As populações 202a e 202b representam populações de neutrófilos da amostra normal e amostra contendo ECGs, respectivamente. A forma das populações 202b é alongada ao longo do eixo geométrico de volume em comparação com a forma da população 202a. As populações 201a e 210b representam populações de monócitos, as populações 203a e 203b representam populações de limfócitos, a população 204 representa eosinófilos, e a população 205 representa RCBs não lisada. Muitos métodos convencionais identificam a presença de ECG com base no alongamento da forma da população de neutrófilos como mostrado na Figura 2b. As Figuras 19 e 210 da Patente U.S. No 5.210.737 (de Rodriguez et al), por exemplo, ilustra o alongamento da forma de população de neutrófi- los ao longo do volume ou eixo geométrico CC no diagrama de dispersão, respectivamente mapeando CC versus OP e CC versus RMALS. RMALS é uma dispersão de luz de ângulo médio rotacionado, tipicamente calculado por log(UMALS +LMALS)/CC.

[00044] As Figuras 3a e 3b ilustram respectivamente diagramas de dispersão CC versus RMALS e CC versus OP de outra amostra de sangue. A amostra de sangue ilustrada nas Figuras 3a e 3b inclui uma referência manual de 62,25% de neutrófilos segmentados e bandas de 12,75% de metamielócitos e 0,75% de mielócitos. Em ambos os diagramas de dispersão, como nos agrupamentos de 302 e 303, a população de ECG não pode ser identificada separada da população de neutrófilos. Portanto, embora o alongamento da forma de população de neutrófilos possa ser usado indicando a presença de ECG na amostra de sangue, os diagramas de dispersão baseados em CC, RMALS, e OP como usados convencionalmente, não identificam sepa- radamente população de ECG e/ou enumeram o ECG.

[00045] A Figura 4a é uma ilustração de diagrama de dispersão mapeando OP versus LALS, de acordo com uma modalidade da presente especificação. O agrupamento 402 ilustra em um diagrama de dispersão de OP versus LALS, os mesmos eventos celulares mostrados nas Figuras 3a e 3b. O alongamento da forma da população 402 ao longo do eixo geométrico de LALS permite a marcação das amostras com respeito à presença de ECG.

[00046] Modalidades da presente especificação usam LALS para identificar populações de ECG. Modalidades, nas quais a LALS é combinada com outros parâmetros, tais como MALS, ALL, OP e/ou CC para identificar e enumerar populações ECG, são descritas abaixo. A LALS pode ser combinada com outros parâmetros e/ou parâmetros derivados incluindo derivados de LALS para identificar uma população de ECG. Deve ser entendido que LALS pode ser usada de acordo com várias outras combinações de parâmetros ou parâmetros derivados para identificar e enumerar ECG com base nos ensinamentos da presente especificação. A presente especificação, contudo, como mencionado, não se limita ao uso de LALS para identificar e enumerar ECGs, porque o parâmetro de LALS é apenas um meio para detectar granularidade, lobularidade, e características superficiais de célula de ECGs. Estas características de célula permitiram que os inventores distinguissem as ECGs de suas populações de neutrófilos, proximamente sobrepostas. Combinando LALS com MALS para identificar e enumerar ECG

[00047] De acordo com outra modalidade da presente especificação, a LALS pode ser usada com um ou mais de MALS e CC e RF para identificar e enumerar ECGs. De acordo com uma modalidade, a LALS é usada com MALS e CC. Em uma modalidade adicional, OP pode ser usado para diferenciar mais claramente uma população ECG de outras populações de célula, tais como de populações de neutrófi- los. Ainda outra modalidade adicional usa LALS, MALS, OP e CC para construir parâmetros derivados para diferenciar ECGs.

[00048] Deve ser entendido que funções derivadas são meios conhecidos para aumentar a sutil diferença em populações proximamente relacionadas. A seleção da função derivada e suas respectivas variáveis ou parâmetros adicionais é conhecida por aqueles habilitados na técnica. Nas Figuras, OP, RLS, F1, F2, P1 e P2 são funções derivadas.

[00049] Em uma modalidade, um parâmetro derivado incorpora LALS e CC para diferenciar ECGs de neutrófilos, com base na lobula- ridade nuclear e características de estrutura superficial de ECGs e neutrófilos. ECGs tem uma LALS mais baixa em comparação com neutrófilos. Em adição, a medição CC é usada na medição derivada para aumentar a separação entre ECGs e neutrófilos, com base na característica na qual as ECGs são usualmente maiores que neutrófi- los. Por exemplo, a Figura 19 da Patente U.S. No 5.123.737 ilustra ECGs com volume maior que neutrófilos.

[00050] Em uma modalidade adicional, uma medição derivada pode incorporar OP (função de RF e CC) para aumentar a separação entre ECGs e neutrófilos. As ECGs têm OP mais baixo em comparação com neutrófilos.

[00051] Em certas modalidades, o parâmetro derivado também pode incorporar MALS. Os MALS contribuem para aumentar a separação entre ECGs e neutrófilos, detectando diferenças estruturais sutis em um ângulo médio de dispersão de luz. No entanto, como na Figura 3a, os MALS não conseguem sozinhos prover uma separação distinta entre ECG e populações de neutrófilos.

[00052] As Figuras 4b e 4c mostram exemplo de célula da Figura 4a quando parâmetros derivados estão incorporados para criar um di- agrama de dispersão. A Figura 4b mostra o alongamento da população de neutrófilos 402 ao longo do eixo geométrico P1. A Figura 4c mostra a dispersão da população de neutrófilos 402c em relação ao eixo geométrico P2, quando da introdução desta medição derivada. O resultado final de aplicação das modalidades exemplares a uma amostra de sangue, como na Figura 4c, produz um diagrama de dispersão, no qual as ECGs podem ser distintamente reconhecidas separadas dos neutrófilos. Na Figura 4c, a população ECG 406 é suficientemente distinta da população de neutrófilos 403 e da população indefinida 408. No diagrama de dispersão ilustrado, a população 406 representa 8,8% da população de WBC e a população indefinida 408 representa 7,8% da população WBC. A população de ECG parece ser quase inteiramente compreendida de metamielócitos, mielócitos, e promielócitos. Em alguns casos, uma pequena porcentagem de células blásticas mi- eloides, em transição para um estágio de promielócito, pode ser incluída na população ECG. A população indefinida parece ser compreendida de neutrófilos desgranulados, neutrófilos amadurecidos, e bandas.

[00053] Com respeito aos parâmetros derivados das modalidades descritas, deve ser entendido que valores de coeficiente apropriados podem ser uma combinação de coeficientes que produz uma separação substancialmente ótima entre as populações de uma amostra de célula. A seleção de valores de coeficiente pode ser dinamicamente calculada. Por exemplo, de acordo com uma modalidade, os valores de coeficiente pode ser respectivamente recalibrados, até um prede-terminado conjunto de limites ser atendido com respeito à separação entre as populações de célula mapeadas em um diagrama de dispersão. Combinando LALS com AL para Identificar ECG

[00054] Em outra modalidade da presente especificação, a LALS pode ser considerada junto com medição ALL. A magnitude da ALL de uma célula é representativa de suas propriedades superficiais e carac-terísticas de absorbância. A Patente U.S. No 7.009.792, incorporada por referência nesta em sua integralidade, provê uma descrição da medição ALL, como parte de um método para enumerar NRBCs.

[00055] Os inventores observaram que os parâmetros LALS e ALL se movem em direções opostas com respeito às ECGs e neutrófilos. Por conseguinte, de acordo com uma modalidade da presente especificação, criou-se uma medição derivada baseada em LALS e ALL, em particular na diferença entre LALS e ALL,. Considera-se que a diferença entre LALS e ALL contribua para aumentar a separação entre as populações de ECGs e neutrófilos.

[00056] Os inventores também observaram que, em geral, as ECGs apresentam parâmetros CC maior e OP menor em relação a neutrófilos. Assim, de acordo com uma modalidade da presente especificação, con-siderou-se uma medição derivada baseada na diferença entre OP e CC, para aumentar a separação entre a população de ECGs e população de neutrófilos.

[00057] Translação, rotação, e escala adicional pode ser realizada nos parâmetros derivados iniciais para obter um posicionamento ótimo das populações de ECGs e neutrófilos.

[00058] Parâmetros derivados intermediários, adicionalmente, podem ser estendidos e dimensionados para ocupar a área de exibição desejada. A extensão e dimensão contribuem para aumentar a separação entre as populações, de modo que captação e enumeração automáticas sejam realizadas com mais precisão.

[00059] Os parâmetros derivados podem ser usados para gerar histogramas, diagramas de dispersão, e/ou representações gráficas, nas quais populações de ECGs e neutrófilos são separadas em extensão suficiente, de modo que uma enumeração automática das respectivas populações possa ser realizada.

[00060] A Figura 5 ilustra uma população de neutrófilos 502 incluindo ECGs em um diagrama de dispersão CC versus MALS convencional. Como ilustrado, o diagrama de dispersão CC versus MALS convencional não separa suficientemente a população ECGs da população de neutrófilos.

[00061] A Figura 6 ilustra a mesma amostra de célula, como mostrado nas Figura 5, em um diagrama de dispersão, localizando parâmetros derivados de acordo com uma modalidade da presente especificação. Na Figura 6, população de ECGs 604 é distintamente separada da população de neutrófilos 602. Método para identificar e enumerar ECG usando LALS

[00062] A Figura 7 ilustra um método para identificar e enumerar ECGs em uma amostra de sangue de acordo com uma modalidade da especificação. O método 700 pode ser implementado em um detector e analisador de partícula, como aquele ilustrado na Figura 1.

[00063] Na etapa 702, uma amostra de sangue é preparada para análise. Por exemplo, e sem perda de generalidade, uma análise hematológica de amostra de sangue total pode ser lisada para remover células vermelhas de sangue antes de um teste Diferencial de 5 partes para células de sangue brancas. A etapa de preparação também pode incluir adicionar um diluente à amostra e opcionalmente um fluído de cobertura (sheath fluid) para facilitar o fluxo da amostra através da região de medição. A amostra de partícula preparada, então, é injetada em uma trajetória incluindo a região de medição, a uma taxa substancialmente constante, usando um processo, tal como focalização hidro-dinâmica, para garantir uma pressão suficiente para mover as partículas em uma única fila através da trajetória.

[00064] Na etapa 704, as células da amostra de sangue são medidas em uma região de medição do analisador de partículas. As células, em um diluente, e, opcionalmente, em um fluído de cobertura pas- sam uma a uma por uma região de medição. Enquanto a célula está na região de medição, uma pluralidade de fontes de energia e sensores opera para submeter a célula a um interrogatório, e coletar os sinais gerados pelas respectivos interrogatórios. Como descrito, de acordo com uma modalidade da presente especificação, uma pluralidade de fontes de energia e sensores operam para coletar sinais de medição para uma medição LALS e um ou mais de parâmetros OP, MALS, e ALL.

[00065] Na etapa 706 são gerados dados de evento celular que correspondem aos sinais de medição coletados. Por exemplo, dados de evento celular de uma célula podem compreender dados que representem todos parâmetros daquela célula, durante o tempo no qual aquela célula passa pela região de medição. A geração de dados de evento celular pode incluir geração de sinais elétricos, óticos, RF, e outros sinais detectados nos vários sensores.

[00066] Na etapa 708 são acessados os dados de evento celular, por exemplo, por um componente do analisador. De acordo com uma modalidade, alguns ou todos os processos das etapas 708 a 716 podem ser realizados em tempo real ou próximo disso, enquanto as células são medidas no detector de partícula. De acordo com outra modalidade, o processamento das etapas 708 a 716 pode ser realizado sobre os dados de medição previamente gerados pelo detector de partícula.

[00067] Na etapa 710, a população de ECG é diferenciada a partir dos dados de evento celular, de acordo com uma modalidade da presente especificação. A diferenciação da população de ECGs será adicionalmente descrita abaixo com referência à Figura 8.

[00068] Na etapa 712, a população diferenciada de ECGs pode ser relatada. De acordo com a modalidade, o relatório inclui informações representadas em vídeo, ou impressas de uma ou mais populações de célula em um ou mais histogramas, diagramas de dispersão, ou outras formas gráficas e/ou textuais de representação. De acordo com outra modalidade, prover relatórios inclui gravar vários dados de população de célula em uma mídia de armazenamento legível por computador, de modo que as informações armazenadas fiquem disponíveis para recuperação e análise posterior.

[00069] Na etapa 714, as ECGs são enumeradas. Depois de separada a população de ECGs do resto das populações de célula, incluindo população de neutrófilos, as ECGs podem ser contadas. A contagem das ECGs pode ser baseada em eventos celulares individuais, contidas em uma área, retendo os eventos de célula na área, e/ou estimando os eventos celulares na área.

[00070] Na etapa 716, as ECGs enumeradas são relatadas. As ECGs enumeradas podem ser relatadas como contagem absoluta e/ou porcentagem da contagem total de células de sangue brancas. As ECGs enumeradas também podem ser relatadas como porcentagem e/ou fração de qualquer outra população de célula, tal como, por exemplo, de neutrófilos. Como para relatar população de ECGs diferenciada, as informações podem incluir representação em vídeo, em texto impresso, e/ou armazenamento em uma mídia de armazenamento legível por computador.

[00071] A Figura 8 ilustra um método 800, para diferenciar a população de ECGs de outras populações celulares da amostra de célula.

[00072] Na etapa 802 se cria uma primeira medição derivada compreendendo LALS. De acordo com uma modalidade, um primeiro parâmetro derivado compreende medição LALS e medição CC.

[00073] Na etapa 804 se cria uma segunda medição compreendendo OP. De acordo com uma modalidade, um segundo parâmetro derivado compreende medição OP e medição MALS.

[00074] Na etapa 806 realiza um agrupamento durante eventos ce- lulares. De acordo com uma modalidade, cria-se um diagrama de dispersão tendo uma primeira medição em um eixo geométrico e uma segunda medição em outro eixo geométrico. O agrupamento de populações de célula pode ser realizado manualmente e/ou automaticamente. A realização do agrupamento pode incluir calibrar interativamente os coeficientes e/ou termos de medição até separar as populações selecionadas uma distância limite predeterminada. A etapa de agrupamento também pode incluir reter uma ou mais populações de células.

[00075] Na etapa 808, a população de ECG é identificada com base no agrupamento realizado na etapa anterior. O agrupamento de ECG pode ser diferenciado do agrupamento de neutrófilos, com base nos primeiro e segundo parâmetros, como mostrado na Figura 4c.

[00076] De acordo com outra modalidade, os primeiro e segundo parâmetros derivados podem ser criados nas etapas 802 e 804. A primeira medição derivada, por conseguinte, pode incluir parâmetros de LALS e MALS. O segundo parâmetro derivado pode incluir parâmetros CC e OP. De acordo com esta modalidade, a etapa de agrupamento 806 pode incluir a criação de diagrama de dispersão com um eixo baseado nos primeiro e segundo parâmetros derivados. Outras Modalidades Exemplares

[00077] Outras modalidades exemplares da presente especificação podem incluir identificação e/ou enumeração de granulócitos imaturos com base em LALS e dois ou mais parâmetros. Diagramas de dispersão, histogramas, e/ou outros tipos de gráficos em duas ou mais dimensões podem ser usados para diferenciar e enumerar populações de ECG. Por exemplo, uma modalidade pode incluir a geração de imagens de superfície tridimensionais com base baseado em parâmetros derivados e em outras medições físicas ou derivadas, e a população de ECG pode ser identificada e enumerada com base nas posições dos correspondentes eventos de célula na superfície tridimensional.

[00078] A Figura 9 ilustra outra modalidade da presente especificação. Um sistema 900, de acordo com uma modalidade da presente especificação, inclui um detector de partícula 124 acoplado a um analisador 122. O analisador 122 também pode ser acoplado a um monitor de vídeo 920 e dispositivo de armazenamento 921. O detector de partícula 124 detecta eventos de partícula usando um ou mais parâmetros de medição, e inclui processador de sinal 118 que processa parâmetros de medição detectados para formar um sinal para cada evento de partícula, representando a duração daquela partícula em uma região de medição. O processador de sinal 118, como indicado, gera eventos de célula que correspondem às medições das respectivas células na região de medição. O processador de sinal 118 pode realizar o processamento dos sinais recebidos para otimizar a geração de eventos de célula, por exemplo, reduzindo o ruído nos sinais recebidos. As instruções para montar o sinal que corresponde à duração de uma partícula na região de medição e determinar parâmetros que correspondem àquele sinal podem ser implementadas em qualquer linguagem de programação adequada, incluindo linguagem de descrição de hardware (HDL) Assembly, C e C++ e i um ou mais componentes de hardware, firmware, ou software.

[00079] Como descrito com respeito à Figura 1, o analisador 122 pode ser quer localizado dentro do analisador de partículas 100 ou separado, acoplado ao detector de partícula 124 através de uma mídia de comunicação. O analisador 122 recebe dados de evento da célula, que correspondem a cada partícula detectada pelo detector de partícula 124. Os dados de evento podem incluir, dentre outras coisas, parâmetros para LALS, OP, CC, MALS.

[00080] O analisador 122 inclui componentes incluindo processador 902, dispositivo de memória 903, dispositivo de armazenamento 904, dispositivo de entrada 905, dispositivo de saída 906, módulo determinador ECG 907, e infra estrutura de comunicação 908. O processador 902 pode ser qualquer micro-processador ou processador capaz de executar instruções de programa. O dispositivo de memória 903 pode incluir uma memória de acesso randômico. O dispositivo de armazenamento 904 inclui uma mídia de armazenamento persistente legível por computador, tal como memória flash ou disco rígido. O processador 902 executa instruções para receber dados de evento a partir do analisador de partículas, processar os dados recebidos, e emitir os dados processados resultantes. O dispositivo de memória 903 e o dispositivo de armazenamento 904 atendem qualquer requisito de memória e armazenamento persistente do processador 902. A infraestrutura de comunicação 908 interconecta componentes de analisador 122 e pode incluir uma mídia de comunicação, incluindo, sem limitação, bar- ramento de interconexão de comunicação periférica (PCI), barramento de arquitetura padrão de indústria estendida (EISA) dispositivo EHER- NET e/ou WIFI 905, e pode incluir conectividade para o analisador de partículas 100 através da infra-estrutura de comunicação 908 e capacidade para receber dados, incluindo dados de evento, a partir do analisador de partícula 100.

[00081] O módulo determinador de ECG 907 inclui uma funcionali dade para processar dados de evento de célula, e detector de partícula 124 para identificar e enumerar populações ECG na amostra de sangue. Por exemplo, o módulo determinador ECG 907 pode incluir instruções ou programa de computador para implementar etapas 708 a 716 do método 700. O módulo determinador 907 pode compreender módulo de acesso de dados 942, módulo diferenciador ECG 944, e módulo informador de ECG 946. O módulo de acesso de dados 942 pode acessar de dados de evento de controle recebidos do detector de partícula. O acesso aos dados pode compreender acessar um disposi- tivo de armazenamento para recuperar dados de evento de célula previamente armazenados ou receber dados de evento de célula em tempo real a partir de um detector de partícula. O módulo diferenciador 944 pode incluir funcionalidade para identificar e enumerar população de ECG, por exemplo, como descrito em relação às etapas 710 e 714 do método 700. O módulo informador ECG pode incluir funcionalidade de representar informação de ECG, por exemplo, como descrito com respeito às etapas 712 e 716 do método 700.

[00082] O módulo determinador de ECG 907 pode ser implementado em qualquer linguagem de programação adequada, incluindo linguagem de descrição de hardware (HDL), Assembly, C e C++ e incluir um ou mais componentes de hardware, firmware, ou software. As instruções e/ou programas de computador que implementam o módulo de determinador ECG 907, por exemplo, podem ser armazenadas em uma mídia de armazenamento legível por computador.

[00083] O módulo de saída 906 inclui a funcionalidade de lidar com informação de população de célula, incluindo informação de população de ECG, determinada no módulo determinador ECG 907, de maneira apropriada para aplicação. Em uma modalidade, o módulo de saída 906 pode gerar um ou mais gráficos, de acordo com um ajuste de gráfico pré-configurado, para representar populações de célula diferenciadas, determinadas nos módulos de processamento, incluindo o módulo determinador de ECG 907.

[00084] O módulo de saída 906 é acoplado com uma infraestrutura de comunicação 908 para o monitor de vídeo 920 e/ou dispositivo de armazenamento 921. Os dados resultantes do módulo de saída 906 são transmitidos para o monitor de vídeo 920 para serem representados e analisados pelo operador. Por exemplo, o monitor de vídeo 920 pode ilustrar dados resultantes em forma de histograma, diagrama de dispersão, ou em qualquer outra forma de representação gráfica ou textual. Em outra modalidade, os dados resultantes podem ser armazenados em um dispositivo de armazenamento externo 921 para posterior processamento e análise.

[00085] Na descrição, métodos e sistemas foram descritos para melhorar o valor do diagnóstico de enumeração de células de sangue automatizada. Em particular, modalidades da presente especificação permitem identificação e enumeração automatizada de ECGs nas amostras de células de sangue, que pode ser crítico para detecção e tratamento de várias condições de infecção. Os métodos e sistemas descritos provem melhorias substanciais em custo e eficiência em relação aos métodos e sistemas correntes, e podem propiciar significativos melhoramentos na análise de dados de analisadores de partículas.

[00086] A descrição acima da especificação foi apresentada apenas com propósito de ilustração e descrição, e não pretendem esgotar ou limitar a especificação à forma precisa apresentada, sendo que outras modificações e variações serão possíveis à luz dos ensinamentos constantes nesta. A modalidade foi escolhida e descrita para explicar melhor os princípios da especificação e suas aplicações práticas, para, desta forma, permitir que aqueles habilitados na técnica utilizem melhor a especificação em várias modalidades e várias modificações, como mais adequadas para o particular uso contemplado. Pretende-se que as reivindicações anexas tenham sido construídas, de modo a englobar outras modalidades alternativas da especificação, exceto como limitado pela técnica anterior. Exemplos

[00087] Os exemplos não limitantes que se seguem são providos somente com propósitos ilustrativos, para facilitar um entendimento mais completo das modalidades representativas contempladas. Estes exemplos não foram construídos para limitar quaisquer das modalidades descritas na presente especificação, incluindo aquelas que per- tencem a métodos, sistemas e/ou aparelhos para identificar e/ou enumerar células prematuramente granuladas. Exemplo 1

[00088] Uma avaliação de enumeração de ECGs versus diferencial manual de célula de referência 400 em um conjunto de 1536 amostras únicas coletadas em sete locais diferentes é mostrada na Tabela 1. Determinou-se o coeficiente de correlação r comparando ECG % contra a soma de promielócitos %, mielócitos % e metacielócitos %. O critério de positivo usado para cálculo da área sob curva ROC foi a soma de promielócitos %, mielócitos %, e metacielócitos % maior ou igual a 1%.

[00089] Neste exemplo, 502 das 1536 as amostras foram classificadas por técnicos hematológicos treinados como contendo ECGs. As mesmas amostras, então, foram analisadas com instrumento DxH800 programado com o protocolo de detecção ECG da presente especificação. O coeficiente de correlação (r) foi determinado em função do número de amostras classificado pelo instrumento como contendo ECG em relação ao número de amostras classificado pelos técnicos treinados.

[00090] Sensibilidade é a razão de ECGs positivo real em relação a contagens de ECGs positivo real e falso negativo. Especificidade, por outro lado, é a razão de ECGs negativo reais em relação a contagens de ECGs negativo real e falso negativo. A área sob a curva ROC (curva de operação de receptor) é uma medida da precisão da solução analítica, combinando sensibilidade e especificidade do método de enumeração ECG. O critério para sensibilidade e especificidade reflete a escala deslizante de valores, que trocam sensibilidade por especificidade, e vice-versa. Assim, por exemplo, o critério de 1,0 seria quando a especificidade é aumentada ao custo de diminuição na sensibilidade. Deve ser entendido que o valor ótimo pode ser alcançado por aqueles versados na técnica.

[00091] Uma avaliação similar em um conjunto de 315 amostras coletado com marcador CD16 de citometria de fluxo como referência em dois locais diferentes providos nos resultados mostrados na Tabela 2. O CD 16 é um marcador associado a neutrófilo, mas não ECGs. Assim, os anticorpos marcados CD16 podem ser usados para reter neutrófilos, e separá-los em uma região proximamente sobreposta de um diagrama de dispersão com respeito à população de neutrófilo. Células menos maduras têm menos dispersão de luz que células maduras. Assim, usando combinação de anticorpos CD 16 e disper- sores de luz, populações ECGs podem ser classificadas. Com o mé-todo, 315 amostras foram classificadas, e 164 amostras foram identificadas como contendo ECGs. Quando a solução de análise de retenção CD 16 foi comparada com um método analítico da presente especificação, a especificação provê os resultados determinados na Tabela 2.

[00092] Por conseguinte, o presente método também demonstrou que a presença de células com níveis mais altos ou mais baixos de imaturidade, tal como células blásticas ou Neutrófilos juvenis (isto é, bandas), não exerce um impacto significativo na precisão.

[00093] A análise de’ dados acima das amostras coletadas demonstra que a presente especificação apresenta altos níveis de correlação, sensibilidade, e especificidade em relação à inspeção manual das amostras.

Claims (5)

1. Método não-fluorescente para enumerar células de gra- nulócitos prematuras (ECGs) compreendendo promielócitos, mielócitos e metamielócitos em uma amostra de sangue, caracterizado pelo fato de que compreende: analisar células brancas do sangue da amostra de sangue usando um parâmetro de dispersão de luz de ângulo baixo (LALS); separar as ECGs de outras células brancas do sangue usando parâmetro de LALS; enumerar as ECGs separadas, em que a separação das ECGs de outras células brancas do sangue é ainda baseada em opa-cidade (OP).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de separação compreende: agrupar dados de análise, para a partir daí gerar uma plura-lidade de populações; e identificar a população de ECG da pluralidade de populações.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a população de ECG é substancialmente separada de uma população de neutrófilos da pluralidade de populações.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: enumerar a ECG com base na população separada de ECG; e relatar a ECG enumerada.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a ECG enumerada é relatada como uma porcentagem do número total de células brancas do sangue.

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