JP5058171B2 - 血小板の測定を実施するための方法および装置 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、血小板分析を実施するための光学的測定に基づく新規な血液システムに関する。軸方向の光損失（ａｘｉａｌ ｌｉｇｈｔ ｌｏｓｓ）は、分析される血液試料中の血小板を定量化するために使用され得る。更に、所定の光散乱トリガー機構が、２ｆＬ未満の細胞のサンプリングを可能にするために使用され得る。

（発明の背景）
現在使用されているほとんどの血液分析システムは、電気系および／または光学系測定によって、血小板を計数する。電気またはインピーダンス系測定システムにおいて、フローサイトメータの検出口を通過するキャリア液中の粒子は、その流量に比例して電気パルスを発生させる。パルスに基づく閾値化技法を使用して、パルスを立ち上げる粒子は、血小板、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌまたはＲＢＣ）または白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌまたはＷＢＣ）および屑片として分類される。ただし、ほとんどの場合に、電気系測定システムは比較的正確な結果となるが、制限がないわけではない。

たとえば、インピーダンス系測定分析器は、血小板とその他の妨害粒子、たとえば小赤血球、分裂赤血球（断片化したＲＢＣ）、屑片および電子雑音を識別することができず、その結果、偽の高い血小板計数となる。反対に、血小板凝集体および過大の血小板は、上限閾値外に属し、ＲＢＣに分類されることがあり、その結果、偽の低い血小板読取り値となる。

患者の処置経過を判定するために、非常に正確な血小板数を得ることは、一般に、定まった臨床業務である。たとえば、血小板計数が極度に低い（たとえば、１μＬ当たり血小板数５，０００〜２０，０００の範囲）場合には、血小板を輸血するかまたは手術を先行させることが必要になることがある。他方、妊娠女性の限界閾値はかなり高い（たとえば、好適な血小板計数は１μＬ当たり血小板数１４０，０００を超える必要がある）。

代表的な血液分析器において、ダイナミックレンジ、たとえば７０ｆＬまで拡大するために、２〜２０ｆＬ間の血小板量分布に基づいて数学的な適合が行われる。分布の一部を導出する血小板計数を除いて、生データが対数分布に適合しない場合、平均血小板量が正常範囲外にある場合、モードが正常範囲外にある場合、または血小板分布の上限が減少しない場合、正確な血小板計数を得ることはできない。このような事例において、試料は印が付けられ、２〜２０ｆＬの範囲内にある血小板のみが記録される。

比較的低レベルで正確な血小板計数を得ることの難しさは、ＤＣノイズの識別不良、より小さいＲＢＣおよび、フローセルの検出開口をＲＢＣおよび血小板が同時通過することに起因していることもある。血小板分布は、血小板の寿命に依存して、量に対して変動することもあり、これによって分布の形状が変化して、その結果、不正確な外挿を行う可能性がある。血小板の平均寿命はたった３〜５日にすぎないため、変動はかなり速く生じ得る。以下に述べるように、他の（たとえば、光学系）技法、たとえば光散乱の差異による血小板の解像はこれらの矛盾を減少させるのに有用である。

血小板を計数するためのさまざまなタイプの光学系の従来技法の例としては、Ｂｅｓｓｉｓらの特許文献１に記載されたシステムが挙げられ、この文献は、散乱光を集め、その強度を最低限の２つの異なった方位角で測定するシステムを詳述している。この特許は、球状粒子が円形散乱パターンを作り出すが、他方、検出開口を通過する縦長のＲＢＣは光を楕円パターンで散乱し、これは楕円主軸が縦長の細胞の主軸に直交するように配向されることを開示している。したがって、このシステムにより、互いに直交する集光角度に関する光散乱比を測定すると共に、個々のＲＢＣおよび他の細胞体の長さ対幅の比を求めることができる。

Ｗｅｉｎｅｒらの特許文献２では、光散乱を使用し、ノイズ、血小板パルスおよびＲＢＣパルスを増幅することによってＲＢＣをし、それらを所定のノイズ閾値と比較するシステムを記載している。それぞれのシグナルの相対振幅は、血小板またはＲＢＣのいずれかを表す。

Ｏｍｓｔｅｉｎらの特許文献３では、異なった角度の前方光散乱を用いて決定される、個々のまたは集団量の決定に対する形状効果を除去するために、ＲＢＣを等容量で球状化し、固定する方法を開示している。この技法は刊行物Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３／６，１９８３，ｐｐ ４１９〜４２７にも論じられており、ここで、高および低角度光散乱を使用することにより、正常および異常なＲＢＣ試料のいずれもが、球状化されないＲＢＣと比較して、球状ＲＢＣと血小板との間のより良好な分別を実現することが記載されている。

Ｈａｎｓｅｎの特許文献４では、低角度散乱を使用し、細胞体積、細胞屈折度および散乱光の持続時間に基づいて、ＲＢＣと血小板を識別するシステムを記載している。

白血球および有核赤血球（ＮＲＢＣ）の決定に関するもう１つの特許において、（Ｋｉｍらの）特許文献５では、有核赤血球と白血球のフローサイトメトリ分析の方法を開示している。この方法は、有核赤血球の核を生体核染色に付するため全血試料から赤血球およびＮＲＢＣ細胞質を溶解させること、白血球への生体核染色染料の浸透を最小化すること、そして、蛍光と２つの角度の光散乱との測定によって試料を分析することからなっている。この方法は、屑片からのシグナル（蛍光および非蛍光）を遮断して、軸方向の光損失（ＡＬＬ）トリガーを下回るが、蛍光トリガー（ＦＬ３）を上回るシグナルをＮＲＢＣとして特定する三重トリガー法を特徴としている。この方法には、ＮＲＢＣと白血球との区別を得るために、試薬を４２℃に加熱することが必要である。

Ｆｒａｎｋらの特許文献６では、特定の角度象限で収集された細胞のレーザ照射によって生成された光散乱パターンの非対称性を測定することによって個々のＲＢＣの形状を決定するシステムを開示している。

Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃらの特許文献７および特許文献８では、光散乱が５〜２０°の高角度間隔および１〜５°の低角度間隔にわたって測定される、光散乱系血小板識別システムを記載している。第１および第２の光チャネル光散乱シグナルは、血小板体積値と、血小板成分濃度値に変換される血小板の屈折率とに変換される。血小板乾燥質量値は、血小板成分濃度値と血小板体積との積として計算される。次いで、血小板体積、血小板成分濃度および血小板乾燥質量につきヒストグラムが形成される。血小板は非血小板から除かれ、血小板パラメータは、体積対屈折率マップ内の光散乱系血小板シグナルの存在によって決定される。

Ｇｉｌｌらの特許文献９では、インピーダンスフロー変換器を使用してＲＢＣと血小板を検出し、計数すると共に、多角度光散乱および蛍光も使用してオプチカルフロー変換器内で血小板または血小板凝集体または両者を計数し、識別する自動血液・蛍光サイトメトリーシステムを記載している。

Ｈｏｒｔｏｎらの特許文献１０では、核酸染料と球状化剤（ｓｐｈｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含んだ薬剤組成物の使用によって網状ＲＢＣと血小板を同定する光学システムを詳述している。

Ｋｕｂｏｔａの特許文献１１では、試料中の各粒子から抽出された複数のパラメータに基づいて、分布ダイヤグラムを作成する、光散乱系血液分析器を記載している。血小板を含んだクラスターが分布ダイヤグラム中の他の情報から分離され、弁別器が、血小板を含んだ分離されたクラスターの識別関数であって、クラスター内のその他の粒子と血小板を識別するためのこの識別関数を、計算後の識別関数からの距離に基づいて計算して、血小板計数の計数を実施する。

上記の一連の特許ならびに商業的に入手可能な光学式血小板測定実施装置から、光学系血小板測定システムは光学的血小板計数を実行するために幾つかのアプローチを採用していることが理解される。代表的には、光学系方式は、粒子の量を決定するのに、少なくとも１つの低角度前方散乱測定を採用する。

光が粒子と相互作用する場合には、いくつかの入射光は散乱過程を通じて方向を変え（つまり光散乱である）、光の一部は粒子によって吸収されることを指摘しておかなければならない。これらのプロセスはいずれも入射光からエネルギーを取り除く。光減少がビームの入射軸に沿っている場合、光減少は消光または軸方向の光損失と呼ばれる。

Ｗｅｉｎｅｒらの上記引用特許では、赤血球と血小板は、光散乱を使用して分離可能であることを教示しているが、光散乱と光減少とは物理的に異なった測定であることを指摘しておかなければならない。これは光が粒子と相互作用する場合に生成されるもう１つのシグナルである蛍光シグナルに関する識別と同様である。さらにその他の参考として、非特許文献１に注意されたい。

非制限的な一例として、Ｏｒｔｈｏ ＥＬＴ−８システムは、単一の光散乱測定を使用している。上記引用のＧｉｌｌらの特許の指定代理人であるＡｂｂｏｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００は、血小板計数から非血小板粒子を除去するために、第２の散乱測定すなわち直角方向光散乱（ＳＳ）を連結し、粒子の内部の複雑さを決定する。上記引用のＺｅｌｍａｎｏｖｉｃらの特許の指定代理人であるＢａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．，製のＡｄｖｉａ １２０システムは、血小板特定のために粒子の屈折率を決定する第２の前方光散乱測定を付け加えている。上記引用のＫｕｂｏｔａの特許の指定代理人であるＳｙｓｍｅｘ Ｃｏｒｐ．，製のＸＥ−２１００システムは、蛍光染料で染色された細胞の付加的な蛍光測定を通じて血小板を特定する。一般に血小板の免疫学的特定によって多数の紛らわしい粒子の存在下における真の血小板の計数が可能になることが認識されていることを指摘しておかなければならない。上記引用のＣＥＬＬ−ＤＹＮ ４０００もモノクローナル抗体ＣＤ−６１を用いた免疫学的測定を考慮している。
米国特許第３，９５５，８９０号明細書 米国特許第４，２０２，６２５号明細書 米国特許第４，４１２，００４号明細書 米国特許第４，５７７，９６４号明細書 米国特許第５，５５９，０３７号明細書 米国特許第５，７９８，８２７号明細書 米国特許第５，８１７，５１９号明細書 米国特許第６，０２５，２０１号明細書 米国特許第５，８９１，７３４号明細書 米国特許第６，０６０，３２２号明細書 米国特許第６，１３３，９９５号明細書 Ｈ．Ｃ．ｖａｎ ｄｅ Ｈｕｌｓｔの著作、"Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｂｙ Ｓｍａｌｌ Ｐａｒｉｃｌｅｓ"，ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９５７，Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，ＮＹ

（発明の要旨）
本発明は、ａ）血液試料輸送路の開口を通して血液試料を通過させる工程、ｂ）上記開口を通して光ビームを向ける工程、ｃ）軸方向の光損失シグナルの測定によって上記開口中の上記血液試料を分析する工程、ｄ）工程ｃ）で得られる上記シグナルに基づいて、上記血液試料中の血小板を記録する工程を含む、血液試料中の血小板を非血小板粒子と識別して定量化する方法に関する。

好ましい１実施形態において、上記血液試料は、軸方向の光損失シグナルと光散乱パラメータ、たとえば下方メジアン角度（ｌｏｗｅｒ ｍｅｄｉａｎ ａｎｇｌｅ）光散乱シグナルとの双方によって分析される。

上記双方の実施形態において、光学トリガー、たとえば軸方向の光損失トリガーまたは下方メジアン角度光散乱トリガーが使用される。

さらに別の実施形態において、本発明は、（ａ）血液試料の輸送路の開口を通して血液試料を通過させる工程、（ｂ）上記開口を通して光ビームを向ける工程、（ｃ）上記開口を通過する上記血液試料から軸方向の光損失を検出する工程、（ｄ）工程（ｃ）における上記軸方向の光損失の検出から得られる軸方向の光損失トリガーシグナルに応答して上記光ビームの少なくとも１つのパラメータを測定する工程、および（ｅ）工程（ｄ）で得られる上記測定されたパラメータに基づいて、上記血液試料中の血小板を記録する工程を含む、血液試料中の血小板を非血小板粒子と識別して定量化する方法を目的としている。

さらに別の好ましい１実施形態において、血液試料中の血小板を非血小板粒子と識別して定量化するという本発明は、軸方向の光損失の検出に基づいてトリガーを行って、軸方向の光損失と、上記光ビームの側方散乱、上記装置のフローセルを通過する上記光ビームの最小メジアン角度光散乱および下方メジアン角度光散乱からなる群から選択される少なくとも１つのその他のパラメータとを測定することを含んでいる。

本発明の好ましい１実施形態において、計測システムに導入される前に、全血標本は等張ＲＢＣ球状化剤に稀釈され、次いで、システムに吸引される前に徐々に混合される。

（詳細な説明）
本説明において、低角度光散乱シグナルは１０°未満、好ましくは約１°〜約７°の範囲内にあると理解される。下方メジアン角度光散乱は、６°〜２６°程度、好ましくは９°〜２０°、上方メジアン角度（ｕｐｐｅｒ ｍｅｄｉａｎ ａｎｇｌｅ）光散乱は、１５°〜５０°程度、好ましくは２１°〜４３°だけ、それぞれビーム軸からずれている。

軸方向の光損失（ＡＬＬ、順方向消光としても知られている）は一般に、入射光のビームを通過する粒子に起因する光エネルギーの減少であり、光検出器によって検出される。入射光のビームが粒子に当たると、光は散乱されるかまたは吸収され、これらはいずれも入射光からエネルギーを取り除き、入射光は減衰される。この減衰は消光と称される。入射光のビームの軸に沿って向かう場合、軸方向の光損失と呼ばれる。一般に、ＡＬＬシグナルは、入射光から約０°〜約１°の角度で検出される。本発明の好ましい１実施形態において、ＡＬＬシグナルは入射光軸から約０．５°未満の円形エリア内で集光される。ＡＬＬシグナルは細胞または粒子のサイズに強く影響を受ける。

軸方向の光損失測定は、入射光のビームからのエネルギー損失を測定し、他方、低角度光散乱測定は光の増加を測定することから、これら２つの異なった光学特性の測定には異なった電子回路が必要である。ＡＬＬシグナルの測定に使用される電子回路は、反転増幅器を使用し、他方、低角度光散乱シグナルの測定に使用される電子回路は、非反転増幅器を使用する。

ＡＬＬおよび光散乱シグナルの測定には光学検出アセンブリが使用される。本発明の目的には多くの設計の光学検出ハードウェアを使用することができる。１実施形態において、光学検出アセンブリは、プリント回路基板（ＰＣＢ）上に配置された適切なサイズおよび形状の２つの別個の光検出器を含んでいる。一方の光検出器は、ＡＬＬシグナルの測定に使用され、他方の光検出器は光散乱シグナルの測定に使用される。これらの光検出器からのシグナルは、以下に説明する試験血液分析器内の調整回路に送られる。

別途実施形態において、光学検出アセンブリは、ＡＬＬと光散乱シグナルを測定するための適切なサイズおよび形状のセンシング領域付きプレーナフォトダイオードアレイを含んでいる。フォトダイオードアレイからのシグナルは、試験血液分析器内の調整回路に送られる。さらに別の１実施形態において、光学検出アセンブリはＡＬＬと光散乱シグナルを測定するための光ファイバーアレイを含んでいる。非制限的な一例として、その開示内容が本引証により本願に含まれる米国特許第６，７９８，５０８号に詳細に記載された光ファイバーアレイを採用することができる。

本発明の血液システムはレーザ照射源を含み、その光出力ビームは分析される血液試料を含有するキャリア液が通過するフローセルの照射開口に向けられる。フローセル周りには、散乱光集光用の複数の光学センサが空間的に分散配置されている。レーザビーム軸に沿って、光学検出器である第１の一般にプレーナ型の光学センサがメジアン角度光散乱検出器として機能し、ビーム軸から約６°〜２６°、好ましくは９°〜２０°だけずれた程度の下方メジアン角度光散乱、およびビーム軸から約１５°〜５０°、好ましくは２１°〜４３°だけずれた程度の上方メジアン角度光散乱のそれぞれの角度範囲の散乱光を集光し、ビーム軸から約９°〜４３°だけずれた程度の混成最適動作範囲を得る。第１の光学センサの幾何的中心は照射レーザのビーム軸と一致している。この光学検出器はその幾何的中心のまわりに、入射ビームと第１の光検出器で感知されなかった散乱光との通過を可能にする開口を有している。

多素子フォトダイオードアレイの形の第２の散乱光光学センサは、第１の光学センサの直後に配置され、この第２の光学センサの中心は、レーザビーム軸と一致しているため、第２の光学センサは第１の光学センサと同軸整列されている。第２の光学センサはビーム軸から０〜１．１°、１．２°〜３．３°、３．３°〜４．６°および４．６°〜６．１°だけずれた角度領域からの散乱光を集光し、ビーム軸から０°〜６．１°だけずれた混成範囲を得る。

第２の光学検出器の中心素子は、軸方向の光損失として知られた消光パラメータを供する。このパラメータは、この実施形態において単一シグナルとして実現されるが、多シグナルを使用して実現されることも可能である。

多くの軸方向の光損失シグナルは、１つ以上の照射源を含み、各々固有の放出波長を有する実施形態のために、トリガー／測定パラメータを供するのに有用である。測定される軸方向の光損失パラメータは、レーザビームが向けられるフローセルの照射開口中の粒子の存在によって生ずる。

光学素子に合わされた、光電子増倍管アセンブリの形の第３の光学センサは、ビーム軸に垂直にまたはビーム軸に対して９０°で散乱された光または側方散乱を捕捉するように配置されている。

上述したセンサの出力は、関連する増幅器チャンネルを通じて連結され、１２個のパラメータを生成し、これらはデジタル化され、システム制御プロセッサおよび解析プロセッサに連結される。これらのパラメータは６個の固有な光学測定値を含んでいる。好ましい光学測定値は、９°〜２０°程度の下方メジアン角度光散乱と、２１°〜４３°程度の上方メジアン角度散乱の光散乱を含み、下方メジアン角度光散乱と上方メジアン角度光散乱との混成は、９°〜４３°程度のメジアン角度光散乱、１．２°〜６．１°の程度の最小メジアン角度光散乱および側方散乱（ＳＳ）とも称される垂直な（または約９０°の）光散乱、そして軸方向の光損失（約０°〜１．１°）となる。

４個の光散乱パラメータが２つの利得設定で収集される。一方はＲＢＣに対する所定の低利得で収集され、他方は血小板に対する所定の高利得で収集される。これは数学的変換、たとえば、ＲＢＣおよび血小板の双方の事象を任意の特定の角度の光散乱に対する１つのビューに適合させるための対数の使用を補うか、または省くかするために使用することができる。結果として、利得設定・シグナル処理電子回路を容易に血小板設定用または赤血球設定用にカスタマイズすることができる。

ＶＣＳ血液分析器に電気（インピーダンス）トリガーに基づくデータを捕捉させる一般的な方法とは異なり、本発明によるシステムは新規なトリガー方式を採用している。新規なトリガー方式は、光トリガー、たとえば軸方向の光損失トリガーおよび下方メジアン角度光散乱トリガーの使用を含んでいる。光に基づくトリガーの選択は、ＤＣおよびＲＦチャネルが、計器のシグナル対雑音比から、血小板よりも大きな細胞しか解像することができないという事実に基づいている。結果として、そうした電気パラメータに基づいて、血小板またはそれ以下のサイズに対するトリガーが行われれば、システムノイズとしばしば識別不能な不規則なシグナルが得られる。

他方、光学センサはシステムノイズが低く、かつ、血小板サイズの細胞を解像することができる。光学センサによれば、血小板シグナルはノイズと容易に識別され、従来の技術に付随する問題のないトリガーソースが得られる。この実施形態において使用される光学トリガー方式の感度は、低レベルの光学ノイズしか発生しない固体レーザの使用によってさらに利点を得る。

本発明による光学式血小板測定システムを詳述する前に、本発明は主として、新規コンビネーションにおいて、制御・解析ソフトウェアと共に、従来の自動血液システム要素の所定の配置にあることを述べておかなければならない。したがって、これらの要素の編成配置と、それらが自動血液システムのソフトウェアと接続される様式が図面中で分かり易いシステム図によって示される。

さらに、既定の検査試料に対応する一連のパラメータ相関図は、本説明により当業者に容易に判明すると思われる詳細な開示を不明瞭ならしめないように、本発明の説明に関係する特定の態様のみを示している。それゆえ、図１の絵図は、本発明の構成、機能および動作がいっそう容易に理解できるよう、本発明による自動血液システムの主要素を簡便な機能的グループ化によって示すことを主眼としている。

上述したように、血液検査試料は稀釈されて試料混合物を形成し、フローセル中で軸方向の光損失測定によって分析される。血小板は、得られた軸方向の光損失シグナルを使用して、他のタイプの細胞と識別される。

試料混合物はまたフローセル中で下方メジアン角度光散乱および軸方向の光損失シグナルの測定によっても分析することが可能である。血小板は、得られた下方メジアン角度光散乱および軸方向の光損失を使用して、他のタイプの細胞と識別される。

図１は、本発明の好ましい１実施形態によるＶＣＳ^ＴＭフローサイトメータまたは自動血液システムの全体構造を示している。図１に示したように、光学検出アセンブリはＡＬＬおよび低角度光散乱シグナルの測定に使用される。

図１に示したように、システムは、分析されるべき血液試料を含んだキャリア液が通過するフローセル２０の照射開口または窓２１に向けられる出力光ビームを発生するように機能する照射源１０を含んでいる。非制限的な一例として、照射開口２１は、正方形の内部（５０ミクロン）および正方形の外部（０．１６７“）幾何学的窓からなっていてよく、他方、照射源１０は単相モデルＮｏ．１１２２Ｐ，２ｍＷ ＨｅＮｅレーザからなっていてもよい。レーザ出力ビームは集束レンズ１２によってビーム軸１３に沿ってフローセル開口２１に集束される。固体ＲＦユニット２２はフローセル内にＤＣ／ＲＦ双方の電気パラメータを発生させるために使用される。

フローセル周りには、複数の光学センサが集光のために空間的に分散配置されている。特に、一般に、第１のプレーナ型の光学センサ３１は、メジアン角度光散乱（ＬＳ２）検出器として動作して、ビーム軸から９°〜２０°程度および２１°〜４３°程度だけずれたそれぞれの角度範囲内の散乱光を集光するように機能し、従って、９°〜４３°程度の混成範囲を得る。第１の光学センサ３１の幾何的中心３２は、照射レーザ１０のビーム軸１３に一致している。

第２の光学センサ３３は、第１の光学センサ３１の直後に位置する多素子フォトダイオードアレイからなっている。この第２の光学センサ３３は、レーザビーム軸１３に一致した中心３４を有しているため、第２の光学センサ３３は、第１の光学センサ３１と同軸整列されている。第２の光学センサ３３は、１．２°〜３．３°、３．３°〜４．６°および４．６°〜６．１°の角度範囲からの散乱光を集光し、ビーム軸から１．２°〜６．１°だけずれた混成範囲を得る。

第３の光学センサ３５は、レーザビーム軸１３と一致した検出窓を有している。この第３の光学センサは、第２の光学センサの直後に配置され、レーザビームが向けられるフローセルの照射開口２１内の粒子の存在によって得られる軸方向の光損失を測定する。

第４の光学センサ３６、たとえば光電子増倍管アセンブリは、ビーム軸１３に垂直にまたは対して９０°で散乱された光を捕捉するために配置されている。

上述したセンサの出力は、対応する増幅器チャネルを通じて連結されて、以下の表１にリストアップした総計１２個のパラメータを生成する。これらのパラメータはデジタル化され、システムプロセッサに連結される。

表１は、１つはＲＢＣそして１つは血小板に関する２つの解像度または利得で得られた４つの角度と共に６つの固有な光散乱角度（ＬＳ１、ＬＳ２、ＡＬＬ、ＬＳ３、ＬＳ４および垂直ＳＳ）をリストアップしている。これらのパラメータはＬＳ３光散乱チャネルトリガーを使用して作られた。

光学センサの採用に加えて、本装置はＤＣおよびＲＦパラメータを含む電気パラメータをフローセル内に発生させる固体ＲＦユニットを含んでいる。トリガーのための光チャネル使用と電気チャネル使用との比較は、図２に示されている。特に、パルストレース２０１と２０２は、それぞれ、ＤＣインピーダンスの変化とＲＦインピーダンスの変化を表す、フローセル開口の粒子通過によって生み出されるインピーダンス波形を示している。パルストレース２０３と２０４は、それぞれ、ＡＬＬと下方メジアン角度光散乱を含む光の変化と光電子増倍管によって検出される側方散乱光の変化とを表す、フローセル開口を通過する粒子によって生成される光学波形を示している。

図２において、インピーダンス波形２０１、２０２と光学波形２０３、２０４との間の相対時間変位は、それらの相対整列、センサ特性およびそれぞれのセンシングエリア長さの関数である。

さらに図２に示されているように、センサは相互に整列されている。一般に、波形ピーク間の位相差が所定の（たとえば約５マイクロ秒未満の）時間窓の範囲内にあれば、センサは相互に整列されていると見なされる。

本発明に採用されたデータ獲得システムは、すべての波形ピークが既定の時間窓の内部にあれば、それらのうちの１つを、マスタならびに残りの“スレーブ”パラメータ波形の双方からのデータ収集を開始する獲得シーケンスをトリガーするマスタ参照パルスとして指定することができるようにプログラムされている。

シグナル対雑音比は、採用されたセンサの各々のタイプによって異なる。たとえば、ＤＣおよびＲＦの波形２０１、２０２は、器具のノイズから、血小板よりも大きな細胞しか解像することができない。結果として、細胞に関するこれらのパラメータに基づいて、血小板またはそれ以下のサイズに対して、トリガーが行われれば、システムノイズとしばしば識別不能なシグナルが得られる。

他方、光学センサの波形２０３、２０４は、血小板サイズの細胞を解像する。光学センサは低いシステムノイズしか生成しないため、血小板シグナルは計器ノイズと容易に識別される。したがって、光学センサは信頼性の高いトリガーソースである。

本発明者の研究によれば、表１にリストアップされたＬＳ３パラメータは血小板データ収集に必要とされる感度および低ノイズを実現することが明らかになった。さらに、ＡＬＬパラメータは血小板集団を特定するために使用し得ることが見出された。また、ＤＣおよびＲＦパラメータはトリガーには使用されないとはいえ、それらはなおその他の細胞集団を特定するのに有用であり、血小板分析を高度化するとのことに注目しなければならない。

本発明の好ましい１実施形態において、全血液標本は、フローサイトメータシステムで分析される前に、等張ＲＢＣ球状化剤に稀釈される。

ＲＢＣおよび血小板集団に対するさまざまな試薬の作用を評価するため、同一全血試料のアリコートが種々の等張液と混合され、顕微鏡下で観察された。図３、４および５は、得られた倍率４０倍でとられた顕微鏡像を表している。

特に、図３は、血液と等張球状化試薬系液とが１：１で稀釈された、ホルムアルデヒド成分を含んだ等張球状化試薬系液中の全血液の調製の像を示している。この試料中で、ＲＢＣは一様に球状化されている。

図４は、１；１の比で稀釈された、ホルムアルデヒド成分を含むが球状化剤を含まないＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．ＩＳＯＴＯＮＩＩＩ希釈剤中の全血液の調製の像を示している。この像は、ＲＢＣが図３に示されているほど一様ではなく、楕円形状を有していることを明らかにしている。

図５は、１；１の比で、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．ＩＳＯＴＯＮ ＩＩＩ希釈剤によって稀釈された全血液の無ホルムアルデヒド調製を示している。この像もＲＢＣは図３に示されているほど一様ではないことを明らかにしている。

したがって、これらの図によって示されているように、等張球状化剤系の使用は血小板の光学的差別化にとっては任意である。ただし、球状化剤の使用は、それが含まれていなかった場合に比較して良好な結果をもたらす。

図６〜１７は、球状化試料と非球状化試料の双方につき、収集された多様なデータ集団関係を表している。図６〜１１は球状化血液細胞試料であり、図１２〜１７は非球状化血液細胞試料である。これらの図は、データが解析されて血小板集団が識別される様式を示している。

試料データは、１６ビットアナログ対デジタル解像で収集され、各実行につき合計５０，０００事象が収集された。必要とされるパラメータの数の最小化とパフォーマンス全体の最適化との兼ね合いによる２つのゲーティング戦略が示される。

好ましいゲーティング戦略は、複数（５つ）のパラメータ、特にＬＳ３、ＬＳ４、側方散乱（ＳＳ）、ＤＣ、および軸方向の光損失（ＡＬＬ）を使用する。ただし、本発明によれば、光学的血小板測定値は、ＬＭＡＬＳまたはＡＬＬ光散乱トリガーを使用し、もっぱらＡＬＬパラメータを用いて得られる。

軸方向の光損失（ＡＬＬ）および側方散乱（ＳＳ）パラメータは、利得設定の異なる２つの別個のチャネル（そのうち一方は血小板向けに最適化され、他方はＲＢＣ向けに最適化されている）で処理される。上述したように、球状化剤の使用はＲＢＣ集団をいっそう一様化するために使用され、これはゲーティング戦略を支援する。電気パラメータ、たとえばＤＣパラメータの使用によって、追加的な測定値、たとえば血小板量が記録されるようにすることができる。さらに、ＤＣパラメータはＲＢＣの重複または重なり合いを特定するのに役立つ。

図６〜９は、好ましいゲーティング戦略を示し、他方、図１０および１１は、それほど好ましくないゲーティング戦略を示している。図６〜１１において、全血液試料は球状化剤と混合された。

好ましいアプローチに基づき、図６は、ＲＢＣと血小板集団を区別するため、側方散乱（ＳＳ）対軸方向の光損失（ＡＬＬ）を表している。特に、図６において、ＲＢＣ集団は包囲ゲート６０１によって示され、他方、残りの原点近傍の集団６０２は血小板集団に対応している。

図７は、ＡＬＬおよびＬＳ４を使用して、血小板集団が屑片と識別される様式を示している。特に、図７において、血小板集団は包囲ゲート７０１によって示され、他方、屑片集団は包囲ゲート７０２によって示されている。

図８は、軸方向の光損失およびＤＣセンサ出力間の関係から重複または重なり合ったＲＢＣの存在を示している。特に、重複したＲＢＣはゲーティング領域８０１によって示されている。

図９は、ＡＬＬおよびＬＳ３間の関係を、ＲＢＣと血小板以外の粒子を包囲するゲーティング領域９０１と共に示している。

図６〜９の検討から、軸方向の光損失（ＡＬＬ）は各々のゲーティング戦略に共通の１つのパラメータであることが判明する。本発明によれば、この軸方向の光損失の共通性を利用して、血小板計数に必要とされる分析を行うために他の一切のパラメータとは独立にこのパラメータを使用することができる。

この知見は、近接した屑片および血小板集団（図１０において、それぞれ１００１および１００２で表されている）の分布と、近接したＲＢＣおよびその他の粒子集団（図１１において、それぞれ１１０１および１１０２で表されている）の分布を示すヒストグラムである図１０および１１に具体的に示されている。

図１２〜１５は好ましいゲーティング戦略を示し、他方、図１６および１７はそれほど好ましくないゲーティング戦略を示している。図１２〜１７において、全血液試料は球状化剤と混合されなかった。

またも、好ましいアプローチに基づき、図１２に表されているように、側方散乱（ＳＳ）対軸方向の光損失（ＡＬＬ）を使用して、ＲＢＣおよび血小板集団を区別する。図１２において、ＲＢＣ集団は包囲ゲート１２０１によって表され、他方、残りの原点近傍の集団１２０２は血小板集団に対応している。

図１３は、ＡＬＬとＬＳ４を使用して、球状化剤を含まない血小板集団が屑片と識別される様式を示している。特に、図１３において、血小板集団は包囲ゲート１３０１によって表され、他方、屑片集団は包囲ゲート１３０２によって表されている。

図１４は、軸方向の光損失およびＤＣセンサ出力間の関係から重複または重なり合ったＲＢＣの存在を示している。特に、重複したＲＢＣはゲーティング領域１４０１によって表されている。

図１５は、ＡＬＬおよびＬＳ３間の関係を、ＲＢＣと血小板以外の粒子を包囲するケーティング領域１５０１と共に示している。

図６〜９の場合と同様に、図１２〜１５の検討から、軸方向の光損失（ＡＬＬ）は、各々のゲーティング戦略に共通の１つのパラメータであることが判明する。さらに、非球状化試薬血液試料の場合にも、この軸方向の光損失の共通性を利用して、血小板計数に必要とされる分析を行うために他の一切のパラメータとは独立にこのパラメータを使用することができる。それゆえ、図１２〜１５のすべての集団のゲーティングに必要とされる唯一のパラメータは、軸方向の光損失である。これは、近接した屑片および血小板集団（図１６において、それぞれ１６０１および１６０２で表されている）の分布と、近接したＲＢＣおよびその他の粒子集団（図１７において、それぞれ１７０１および１７０２で表されている）の分布を示すヒストグラムである図１６および１７に図示によって具体的に示されている。

以上に本発明による１実施形態を示しかつ説明したが、本発明はそれに制限されるものではなく、当業者に周知の数々の変更および修正を施すことが可能であると理解されなければならない。それゆえ、本発明者らは、本願明細書に示し、かつ説明した詳細に制限されることを望むものではなく、通常の技術者にとって明白な変更および修正をも本願発明の範囲に含めることを意図するものである。

本発明の好ましい１実施形態によるＶＣＳフローサイトメータまたは自動血液システムの全体構造の概略的な斜視図である。 光散乱チャネルと電流チャネルとに対応したパルス波形の時間的変化を示す図である。 １：１の比で稀釈された等張球状化試液中の全血の調製の像を示している。 １：１の比で稀釈されたＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．ＩＳＯＴＯＮ（登録商標）ＩＩＩ希釈剤中の全血の調製の像を示している。 １：１の比で、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．ＩＳＯＴＯＮＩＩＩＥ希釈剤によって稀釈された全血のホルムアルデヒドを含まない調製を示している。 図１に示した自動血液システムを用いて処理された、球状化試薬を含んだ調製全血試料に関して得られた軸方向の光損失対側方散乱のヒストグラムであり、図中、赤血球と血小板集団は容易に識別される。 図１に示した自動血液システムを用いて処理された調製全血試料に関する下方メジアン角度光散乱対軸方向の光損失のヒストグラムであり、図中、血小板と屑片集団とは容易に識別される。 図１に示した自動血液システムを用いて処理された調製全血試料について得られたＤＣ電圧対軸方向の光損失のヒストグラムであり、同図はＲＢＣの重複または重なり合いの存在を示している。 図１に示した自動血液システムを用いて処理された調製全血試料に関する下方メジアン角度光散乱対軸方向の光損失のヒストグラムであり、図中、その他の粒子集団はＲＢＣと容易に識別される。 図１に示した自動血液システムを用いて処理された調製全血試料に関する軸方向の光損失と共に、近接した屑片および血小板集団の分布を示すヒストグラムである。 図１に示した自動血液システムを用いて処理された調製全血試料に関する軸方向の光損失と共に、近接したＲＢＣおよびその他の粒子集団の分布を示すヒストグラムである。 図１に示した自動血液システムを用いて処理された、球状化試薬を含まない所定の全血試料に関して得られた軸方向の光損失対側方散乱のヒストグラムであり、図中、赤血球および血小板集団は容易に識別される。 図１に示した自動血液システムを用いて処理された、球状化試薬を含まない所定の全血試料に関する下方メジアン角度光散乱対軸方向の光損失のヒストグラムであり、図中、血小板および屑片集団は容易に識別される。 図１に示した自動血液システムを用いて処理された、球状化試薬を含まない所定の全血試料に関するＤＣ電圧対軸方向の光損失のヒストグラムであり、同図はＲＢＣの重複または重なり合いの存在を示している。 図１に示した自動血液システムを用いて処理された、球状化試薬を含まない所定の全血試料に関する下方メジアン角度光散乱対軸方向の光損失のヒストグラムであり、図中、その他の粒子集団はＲＢＣと容易に識別される。 図１に示した自動血液システムを使用して処理された、球状化試薬を含まない所定の全血試料に関する軸方向の光損失と共に、近接した屑片および血小板集団の分布を示すヒストグラムである。 図１に示した自動血液システムを使用して処理された、球状化試薬を含まない所定の全血試料に関する軸方向の光損失と共に、近接したＲＢＣおよびその他の粒子集団の分布を示すヒストグラムである。

Claims (21)

1. 血液試料中の血小板を非血小板粒子から識別する方法であって、
   （ａ）血液サンプルを試薬で希釈して、試料混合物を形成する工程；
   （ｂ）フローセルの開口を通して該試料混合物を通過させる工程；
   （ｃ）該開口に光ビームを向ける工程；
   （ｄ）該開口を通過する該試料混合物中の該血小板および該非血小板粒子からの光ビームから０°〜１．１°の角度範囲における軸方向の光損失シグナルを測定する工程；および
   （ｅ）工程（ｄ）において得られた該光ビームから０°〜１．１°の角度範囲における該軸方向の光損失シグナルのみを用いて、該血液試料中の該非血小板粒子から該血小板を識別する工程
   を含む、方法。
2. 前記軸方向の光損失シグナルを測定する工程が、２つの異なる利得設定で実行される、請求項１に記載の方法。
3. 前記利得設定は、赤血球に対する低利得設定および血小板に対する高利得設定を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記血液試料の既知量を用いて前記血小板の絶対計数を得る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記試薬は、希釈剤または球状化剤である、請求項１に記載の方法。
6. 血液試料中の血小板を非血小板粒子から識別する方法であって、
   （ａ）血液サンプルを希釈剤で希釈して、試料混合物を形成する工程；
   （ｂ）フローセルの開口を通して該試料混合物を通過させる工程；
   （ｃ）該開口に光ビームを向ける工程；
   （ｄ）該開口を通過する該試料混合物中の該血小板および該非血小板粒子からの光ビームから０°〜１．１°の角度範囲における軸方向の光損失シグナルと、該光ビームから９°〜２０°の角度範囲における光散乱シグナルとを測定する工程；および
   （ｅ）工程（ｄ）において得られた該光ビームから０°〜１．１°の角度範囲における軸方向の光損失シグナルと、該光ビームから９°〜２０°の角度範囲における該光散乱シグナルとの組み合わせを用いて、該血液試料中の該血小板を該非血小板粒子から識別する工程
   を含む、方法。
7. 工程（ｄ）において、前記開口を通過する前記試料混合物中の前記血小板および前記非血小板粒子からの光ビームから１．２°〜６．１°の角度範囲における光散乱シグナルを測定すること；および
   工程（ｅ）において、該光ビームから０°〜１．１°の角度範囲における得られた軸方向の光損失シグナルと、該光ビームから９°〜２０°および該光ビームから１．２°〜６．１°の角度範囲における得られた光散乱シグナルとの組み合わせを用いて、血液試料中の血小板を非血小板粒子から識別すること
   をさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. 工程（ｄ）において、前記開口を通過する前記試料混合物中の前記血小板および前記非血小板粒子からの光ビームから約９０°の光散乱シグナルを測定すること；および
   工程（ｅ）において、該光ビームから０°〜１．１°の角度範囲における得られた軸方向光損失シグナルと、該光ビームから９°〜２０°および該光ビームから約９０°の角度範囲における得られた光散乱シグナルとの組み合わせを用いて、血液試料中の血小板を非血小板粒子から識別すること
   をさらに含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記軸方向の光損失シグナルおよび前記光散乱シグナルを測定する工程が、２つの異なる利得設定で実行される、請求項６に記載の方法。
10. 前記利得設定は、赤血球に対する低利得設定および血小板に対する高利得設定を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記軸方向の光損失シグナルおよび前記光散乱シグナルを測定する工程が、前記光ビームから０°〜１．１°の角度範囲における軸方向の光損失トリガーシグナルによってトリガーされる、請求項６に記載の方法。
12. 前記軸方向の光損失シグナルおよび前記光散乱シグナルを測定する工程が、前記光ビームから９°〜２０°の角度範囲における光散乱トリガーシグナルによってトリガーされる、請求項６に記載の方法。
13. 前記血液試料の既知量を用いて前記血小板の絶対計数を得る工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
14. 前記試薬は、希釈剤または球状化剤である、請求項６に記載の方法。
15. 血液試料中の血小板を非血小板粒子から識別する方法であって、
    （ａ）血液サンプルを試薬で希釈して、試料混合物を形成する工程；
    （ｂ）フローセルの開口を通して該試料混合物を通過させる工程；
    （ｃ）該開口に光ビームを向ける工程；
    （ｄ）該開口を通過する該試料混合物中の該血小板および該非血小板粒子の光ビームから０°〜１．１°の角度範囲における軸方向の光損失シグナル、電気インピーダンスシグナル、光散乱シグナルを測定する工程であって、該光散乱シグナルは、該光ビームから９°〜２０°、該光ビームから１．２°〜６．１°、または該光ビームから約９０°の角度範囲内にある、工程；および
    （ｅ）工程（ｄ）において得られた該光ビームから０°〜１．１°の角度範囲における該軸方向の光損失シグナル、インピーダンスシグナル、光散乱シグナルの組み合わせを用いて、該血液試料中の該血小板を該非血小板粒子から識別する工程であって、該光散乱シグナルは、該光ビームから９°〜２０°、該光ビームから１．２°〜６．１°、または該光ビームから約９０°の角度範囲内にある、工程
    を含む、方法。
16. 前記軸方向の光損失シグナルおよび前記光散乱シグナルを測定する工程が、２つの異なる利得設定で実行される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記利得設定は、赤血球に対する低利得設定および血小板に対する高利得設定を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記軸方向の光損失シグナルおよび前記光散乱シグナルを測定する工程が、前記光ビームから０°〜１．１°の角度範囲における軸方向の光損失トリガーシグナルによってトリガーされる、請求項１５に記載の方法。
19. 前記軸方向の光損失シグナルおよび前記光散乱シグナルを測定する工程が、前記光ビームから９°〜２０°の角度範囲における光散乱トリガーシグナルによってトリガーされる、請求項１５に記載の方法。
20. 前記血液試料の既知量を用いて前記血小板の絶対計数を得る工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
21. 前記試薬は、希釈剤または球状化剤である、請求項１５に記載の方法。

Images