CN111602052B - 一种血液检测方法及血液分析系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血液检测方法，包括：用第一试剂处理血液样本以获得待测试样，所述第一试剂包括溶血剂，所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片；使待测试样中的粒子逐个通过光学检测系统的检测区，获取所述待测试样的光学信息；和根据所述光学信息中的至少两种获得血小板的光学信息。本发明的方法通过裂解血液样本中的红细胞获取血小板计数，并可同时区分白细胞亚群。

Description

一种血液检测方法及血液分析系统
技术领域
本发明涉及血液检测，特别涉及血小板的光学检测方法及其血液分析系统。
背景技术
人血液中含有红细胞、白细胞、血小板等各种细胞，其中血小板是直径为2-3微米的无核细胞，正常人的血液中含有15万至35万个/微升血小板。
众所周知，血小板的常用测定方法之一是电阻抗法。该方法是使含血细胞的样本从具有两个电极的小孔间通过，当有血细胞(例如血小板)通过时，电阻发生变化，从而产生电阻脉冲，然后将检测到的脉冲绘制成直方图进行分析。正常的血液中，血小板的体积最小，白细胞体积最大，红细胞体积居中。检测到的脉冲强度与经过小孔的细胞体积相关，因而通过体积划分，就能够区分不同细胞种类。然而，在测试有些特殊样本时(如含有体积较大的血小板和体积较小的红细胞的样本)会影响血小板的检测准确性和精确度。这些特殊样本通常来自患有疾病的受试者，因而检测值的偏差会给临床诊断带来不利影响。
针对这种情况，已提出了用对血小板的表面抗原有特异性的标记抗体对血小板进行标记并计数的方法(美国临床病理学杂志(2001)：115，p460-464)。该方法，由于在测试过程中需要使用抗原抗体反应，因而得到结果需要花很长时间。因此，该方法不适用于诸如判断是否需要输血等需紧急作出判断的测定。而且该方法中的检测试剂也相对昂贵。
流式细胞技术可以迅速测定血液中的细胞，比如美国专利US 6,114,173、US 4,882,284及US 5,891,731中都公开了在非溶血条件下，利用染料对血细胞进行染色以更好地区分出血小板的方法。但是在血液中有时会出现破碎的红细胞和脂质等，其大小与血小板类似，也同样被染色，因此成为影响血小板测定的杂质。特别是在测定需要输血的血小板低的样本时，这些杂质的影响会更大。
针对这种情况，SYSMEX公司的中国专利申请公开CN 101173921中公开了一种特异性染色剂，能够在荧光方向有效地从其他血细胞和脂质颗粒等杂质中区分出血小板。但这种方法需要在单独的测试通道中进行，并且这种染色剂仍不能对红细胞碎片和血小板进行有效的区分。
因此，仍存在进一步改进血小板的测定方法的需求。
发明内容
针对以上情况，本发明的目的是提供一种新颖的血液检测方法，该方法利用经溶血的试样，并根据光学信息就能够准确检测血液样本中的血小板。
本发明进一步的目的是在上述检测方法中，根据光学信息进一步检测血液中白细胞，以及更进一步的报警网织红细胞或检测网织红细胞。
本发明的另一目的是提供实施上述方法的血液检测系统。
为实现上述目的，本发明首先提供第一种血液检测方法，所述方法包括：
用第一试剂处理血液样本以获得待测试样，所述第一试剂包括溶血剂，所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片；
使待测试样中的粒子逐个通过光学检测系统的检测区，获取所述待测试样的光学信息；和
根据所述光学信息中的至少两种获得血小板的光学信息。
根据一种实施方式，所述至少两种光学信息为前向散射光强度和侧向散射光强度，以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开。
在该实施方式中，所述方法进一步包括根据前向散射光强度和侧向散射光强度的光学信息获得白细胞的光学信息，优选地根据所获得的白细胞光学信息区分白细胞亚群以获得白细胞的至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的亚群。
具体地，所述溶血剂为选自烷基糖苷、三萜皂苷、甾族皂苷中的至少一种。
根据优选的实施方式，所述烷基糖苷选自具有通式I的糖苷类化合物：
R-(CH2)n-CH3 (I)
其中，R选自由单糖、去氧单糖和多糖所组成的组，n为5～17的整数。
所述单糖可选自五碳糖、甲基五碳糖和六碳糖，其中五碳糖诸如阿拉伯糖、木糖、核糖、来苏糖等；甲基五碳糖诸如夫糖、鼠李糖、鸡那糖等；六碳糖诸如葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、山梨糖；所述去氧单糖，诸如去氧核糖、去氧葡萄糖等；所述多糖诸如麦芽糖、蔗糖等。
n优选为6～14的整数，更优选为7～11的整数。
进一步优选，所述第一试剂进一步包括：
具有通式II的非离子型表面活性剂：
R1-R2-(CH2CH2O)m-H (II)
其中，R1为C8-C23的烷基，R2为-O-、
Figure BDA0002582370060000021
或-COO-，m为10～50的整数；和
可选地，至少一种有机酸或其盐，其中所述有机酸或其盐选自由具有至少一个羧基或磺酸基的有机酸及其碱金属的盐所组成的组中。
所述通式II的非离子型表面活性剂中，优选地，R1为C8-C18的直链烷基。C8-C18的直链烷基具体可为辛基、葵基、月桂基、十四烷基、十六烷基或硬脂基。更优选R1为C12-C16的直链烷基，具体可为月桂基、十四烷基或十六烷基。R2优选为-O-。m优选为15～30。
该实施方式中，所述第一试剂优选含有0.025g/L～10g/L、优选0.1g/L～5.0g/L的具有通式I的糖苷类化合物，和0.03～1.5g/L、优选0.05～1.0g/L的具有通式II的非离子型表面活性剂。
所述第一试剂还可包括选自缓冲剂、金属螯合剂、渗透压调节剂和防腐剂中的一种或多种。
在一种具体的实施方式中，所述血液样本与所述第一试剂的体积混合比可为1:40～1:60。用所述第一试剂在诸如40～60℃的温度下，反应15～100秒，优选反应40～80秒来处理所述血液样本。
根据该实施方式，所述试样中的红细胞经第一试剂处理后被深度裂解，而血小板仍保持其细胞形态，这样所得红细胞碎片的散射光性质与血小板的散射光性质出现了显著差异。由前向散射光和侧向散射光的强度获得的散点图就能够准确获得血小板的光学信息，从而实现溶血条件下对血小板的准确计数。
根据另一种实施方式，所述方法进一步包括用第二试剂处理所述血液样本，所述第二试剂包括荧光染料。
在该实施方式中，使待测试样中的粒子逐个通过光学检测系统的检测区，获取所述待测试样的光学信息进一步包括荧光信息，并且根据侧向散射光强度和荧光强度信息区分白细胞亚群以获得白细胞的至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的亚群和/或识别幼稚粒细胞。
在该实施方式中，根据一种方案，所述荧光染料包括选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种第一荧光染料。
优选地，所述膜特异性染料选自DiA、DiD、DiI、DiO、DiR、DiS、FDA、Alexa Fluor488、Super Fluor 488及以它们为母体的变形结构所组成的组，以及所述线粒体特异性染料选自Janus Green B、MitoLite Red、罗丹明123和Mitotracker系列及以它们的母体的变形结构所组成的组。
在更优选的实施方式中，所述线粒体特异性染料为罗丹明123、Mitotracker DeepRed或Mitotracker Red。
在本发明中Mitotracker系列染料可包括Mitotracker Green、Mitotracker DeepRed和Mitotracker Red等。
在该方案中，根据荧光强度和前向散射光强度信息识别血小板。
进一步地，当根据前向散射光强度和荧光强度构成的散点图的预设区域中的粒子数超过预定阈值时报警网织红细胞。
在该实施方式中，根据又一种方案，所述荧光染料包括选自核酸特异性染料中的一种的第二荧光染料。优选地，所述核酸特异性染料为对网织红细胞的核酸特异性的染料。
在该方案中，所述方法进一步包括根据荧光强度和散射光强度信息识别网织红细胞。
更进一步地，所述方法还包括根据荧光强度和前向散射光强度信息进行网织红细胞计数。
在该实施方式中，根据再一种方案，所述荧光染料包括选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种的第一荧光染料和选自核酸特异性染料中的一种的第二荧光染料。
在该方案中，所述方法进一步包括：根据荧光强度和侧向散射光强度信息区分血小板和网织红细胞。
本发明前述的血液检测方法，均能够根据所获得血小板的光学信息对血小板计数。
根据本发明的再一种实施方式，本发明的方法进一步在能够消除反射光对激光器的干扰的光学检测系统中进行检测，其中所述光学检测系统，包括：光学子系统、流动室、第一检测器；
所述光学子系统包括：激光器、前光组件及后光组件，所述前光组件包括光隔离器；其中，
所述激光器，配置为发射激光光束；
所述前光组件，配置为对所述激光光束进行前光处理，经所述前光处理的激光光束在第一方向上汇聚于所述流动室的血细胞被测样本处并产生散射光；
所述后光组件，沿所述激光光束的传播方向设置于所述流动室之后，配置为对所述散射光进行后光处理，使得经所述后光处理的所述散射光进入所述第一检测器进行光强检测；
所述光隔离器，配置为将反射光与所述激光器隔离；所述反射光为所述激光光束经所述流动室所产生。
根据具体实施方式，所述光隔离器由采用粘合方式相互连接的分光棱镜及偏振态转换组件构成；
所述分光棱镜，配置为反射入射的所述激光光束的S偏振分量，透射入射的所述激光光束的P偏振分量；
所述偏振态转换组件，配置为改变经所述分光棱镜透射的所述P偏振分量的偏振态，使所述P偏振分量从线偏振光变成圆偏振光，并改变所述圆偏振光反射后的偏振态为S偏振光而被所述分光棱镜反射。
根据另一具体实施方式，所述光隔离器由采用粘合方式相互连接的检偏器及偏振态转换组件组成；
所述检偏器，配置为仅允许所述激光光束的P偏振分量通过；
所述偏振态转换组件，配置为改变经所述检偏器的所述P偏振分量的偏振态，使所述P偏振分量从线偏振光变成圆偏振光，并改变所述圆偏振光的反射光偏振态为S偏振光而被所述检偏器隔离。
在一种实施方式中，所述前光组件还包括准直透镜；所述准直透镜，沿所述激光光束的传播方向设置于所述激光器与所述光隔离器之间，配置为对所述激光光束进行准直处理，使所述激光光束成为平行光束。
在一种实施方式中，所述后光组件还包括挡直光阑；所述前光组件，还配置为对所述激光光束进行前光处理，使得经所述前光处理的激光光束在第二方向上汇聚于所述挡直光阑处。
在一种实施方式中，所述前光组件还包括第一光汇聚组件及第二光汇聚组件；所述第一光汇聚组件，配置为对所述激光光束进行第一聚焦，使所述激光光束在第一方向上汇聚于所述流动室的血细胞被测样本处并产生散射光；所述第二光汇聚组件，配置为对所述激光光束进行第二聚焦，使所述激光光束在第二方向上汇聚于所述后光组件包括的挡直光阑处。
在一种实施方式中，所述后光组件还包括第三汇聚组件及小孔光阑；所述第三汇聚组件，配置为对所述散射光进行第三聚焦，使所述散射光汇聚于所述小孔光阑处，并经所述小孔光阑的小孔进入所述第一检测器。
上述方案中，所述光学检测系统还包括第二检测器及荧光检测器；
所述第二检测器，配置为对与所述激光光束的传播方向所呈角度处于设定的角度范围内(如60°至120°)的散射光进行光强检测；
所述荧光检测器，配置为对所述血细胞被测样本所产生的荧光进行荧光检测。
上述方案中，所述第二方向与所述血细胞被测样本的流动方向垂直；
所述第一方向与所述血细胞被测样本的流动方向相同。
上述方案中，所述光隔离器的光隔离度不小于30db。
上述方案中，所述挡直光阑的光收集角度为1～10°。
上述方案中，所述激光光束的波长为630nm～640nm。
上述方案中，所述激光光束为P线偏振光。上述光学检测系统能够很好的隔离激光光束在光路中传播时产生的反射光，使得激光器能够稳定输出激光光束，进而避免反射光进入激光器产生的功率尖峰出现的小脉冲，也避免了这种干扰小脉冲和血小板粒子形成的小脉冲相互混淆的情况，更进一步提高了本发明方法对血小板的检测精度。
本发明在此还提供了第二种血液检测方法，所述方法包括：
用第一试剂处理血液样本以获得待测试样，所述第一试剂包括溶血剂，所述溶血剂裂解所述血液样本中的红细胞；
使待测试样中的粒子逐个通过光学检测系统的检测区，获取所述待测试样的光学信息；和
根据所述光学信息中的至少两种光学信息获得血小板的光学信息。
根据第一实施方式，所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片。
在该第一实施方式中，所述第一试剂包括选自烷基糖苷、三萜皂苷、甾族皂苷中的至少一种溶血剂。
根据该第一实施方式，所述烷基糖苷选自具有通式I的糖苷类化合物：
R-(CH2)n-CH3 (I)
其中，R选自由单糖、去氧单糖和多糖所组成的组，n为5～17的整数。
所述单糖可选自五碳糖、甲基五碳糖和六碳糖，其中五碳糖诸如阿拉伯糖、木糖、核糖、来苏糖等；甲基五碳糖诸如夫糖、鼠李糖、鸡那糖等；六碳糖诸如葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、山梨糖；所述去氧单糖，诸如去氧核糖、去氧葡萄糖等；所述多糖诸如麦芽糖、蔗糖等。
n优选为6～14的整数，更优选为7～11的整数。
根据一种优选的实施方式，所述第一试剂进一步包括具有通式II的非离子型表面活性剂：
R1-R2-(CH2CH2O)m-H (II)
其中，R1为C8-C23的烷基，R2为-O-、
Figure BDA0002582370060000041
或-COO-，m为10～50的整数；和
可选地，至少一种有机酸或其盐，其中所述有机酸或其盐选自由具有至少一个羧基或磺酸基的有机酸及其碱金属的盐所组成的组中。
所述通式II的非离子型表面活性剂中，优选地，R1为C8-C18的直链烷基。C8-C18的直链烷基具体可为辛基、葵基、月桂基、十四烷基、十六烷基或硬脂基。更优选R1为C12-C16的直链烷基，具体可为月桂基、十四烷基或十六烷基。R2优选为-O-。m优选为15～30。
该实施方式中，所述第一试剂优选含有0.025g/L～10g/L、优选0.1g/L～5.0g/L的具有通式I的糖苷类化合物，和0.03～1.5g/L、优选0.05～1.0g/L的具有通式II的非离子型表面活性剂。
所述第一试剂还可包括选自缓冲剂、金属螯合剂、渗透压调节剂和防腐剂中的一种或多种。
在一种具体的实施方式中，所述血液样本与所述第一试剂的体积混合比可为1:40～1:60。用所述第一试剂在诸如40～60℃的温度下，反应15～100秒，优选反应40～80秒来处理所述血液样本。
根据该第一实施方式的血液检测方法，其中所述至少两种光学信息是前向散射光强度和侧向散射光强度。
根据该实施方式，所述试样中的红细胞经第一试剂处理后被深度裂解，而血小板仍保持其细胞形态，这样所得红细胞碎片的散射光性质与血小板的散射光性质出现了显著差异。由前向散射光和侧向散射光的强度获得的散点图就能够准确获得血小板的光学信息，从而实现溶血条件下对血小板的准确计数。
在该实施方式中，根据一种优选方案，所述方法进一步包括：在用所述第一试剂处理所述血液样本后，进一步用第二试剂进行处理，以获得待测样本。
其中所述第二试剂包含选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种。
在一个优选的实施方式中，所述膜特异性染料选自DiA、DiD、DiI、DiO、DiR、DiS、FDA、Alexa Fluor 488和Super Fluor 488。
根据另一种优选的实施方式，所述线粒体特异性染料选自Janus Green B、MitoLite Red、罗丹明123和Mitotracker系列。
在更优选的实施方式中，所述线粒体特异性染料为罗丹明123、Mitotracker DeepRed或Mitotracker Red。
在本发明中Mitotracker系列染料可包括Mitotracker Green、Mitotracker DeepRed和Mitotracker Red等。
在某些实施方式中，本发明的第二试剂进一步包括以上述染料为母体的变形结构。
当血液样本经含溶血剂的第一试剂和包含膜特异性染料或线粒体特异性染料的第二试剂处理后，血小板和被裂解的红细胞产生了差异性更为显著的荧光特性，因而可通过检测荧光强度和选自前向散射光强度和侧向散射光强度中的至少一种，特别是通过检测荧光强度和前向散射光强度可更进一步地使血小板区分于被裂解的红细胞碎片。
因此，在该方案中，可根据荧光强度和侧向散射光强度信息识别血小板；根据侧向散射光强度和荧光强度信息区分白细胞亚群以获得白细胞的至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的亚群和/或识别幼稚粒细胞；和/或当根据前向散射光强度和荧光强度构成的散点图的预设区域中的粒子数超过预定阈值时报警网织红细胞。
在该实施方式中，根据另一种优选方案，所述第二试剂包含一种核酸特异性染料，或者同时包含一种选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的染料以及一种核酸特异性染料。该方案中，红细胞裂解后散落的细胞器，经核酸特异性染料染色，可进一步使具有细胞核的网织红细胞的碎片与血小板区分，并同时可以获得网织红细胞的准确光学信息，从而利用该第一实施方式的方法，可在一次光学检测中同时获得血小板、白细胞和网织红细胞的光学信息。
因此，根据该优选方案，所述血液检测方法进一步包括：根据荧光强度和散射光强度信息区分血小板和网织红细胞。并更优选地，根据荧光强度和前向散射光强度信息区分血小板和网织红细胞，并能对网织红细胞进行计数。在该第二种血液检测方法中的第一实施方式中的全部内容可同样适用于本发明的第一种血液检测方法。同样的，前述第一种血液检测方法中的全部内容也适用于第二种血液检测方法中的第一实施方式。
根据本发明的第二实施方式，所述血液检测方法包括：用第一试剂处理所述血液样本，并用第二试剂进行处理，以获得待测样本，其中所述第一试剂包括溶血剂。
根据该第二实施方式，所述溶血剂没有特别限制，本领域常规的红细胞溶血剂都可用于该实施方式中。
该实施方式的所述第二试剂与上述第一实施方式相同，可包含选自上述膜特异性染料和上述线粒体特异性染料中的一种。
同样的，当血液样本经含溶血剂的第一试剂和含膜特异性染料或线粒体特异性染料的第二试剂处理后，血小板和被裂解的红细胞产生了差异性更为显著的荧光特性，因而可通过检测荧光强度和选自前向散射光强度和侧向散射光强度中的至少一种，特别是通过检测荧光强度和前向散射光强度可使血小板区分于被裂解的红细胞碎片。由于膜特异性染料或线粒体特异性染料的使用，在该实施方式中，红细胞仅经常规溶血剂裂解就可通过二维散点图与血小板明显区分，而不必如第一实施方式中那样对红细胞进行深度裂解。
在该实施方式中，可根据荧光强度和侧向散射光强度信息区分白细胞亚群以获得白细胞的至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的亚群和/或识别幼稚粒细胞；根据荧光强度和前向散射光强度信息全区分血小板；和/或当根据前向散射光强度和荧光强度构成的散点图的预设区域中的粒子数超过预定阈值时报警网织红细胞。
同样地，该实施方式中，所述第二试剂可进一步包含选自核酸特异性染料中的一种荧光染料。并同样地由此可进一步根据荧光强度和前向散射光强度信息区分血小板和网织红细胞，优选地进一步对网织红细胞计数。
根据第三实施方式，上述本发明的血液检测方法，可通过光学检测系统的检测获得所述光学信息，所述光学检测系统包括：
包括：光学子系统、流动室、第一检测器；
所述光学子系统包括：激光器、包括光隔离器的前光组件及包括挡直光阑的后光组件；其中，
所述激光器，配置为发射激光光束；
所述前光组件，配置为对所述激光光束进行前光处理，经所述前光处理的激光光束在第二方向上汇聚于所述挡直光阑处，在第一方向上汇聚于所述流动室的血细胞被测样本处并产生散射光；
所述后光组件，沿所述激光光束的传播方向设置于所述流动室之后，配置为对所述散射光及汇聚于所述挡直光阑处的激光光束进行后光处理，使得经所述后光处理的所述散射光进入所述第一检测器进行光强检测；
所述光隔离器，配置为隔离所述激光光束经所述流动室及所述后光组件所产生的反射光。
上述方案中，所述光隔离器由采用粘合方式相互连接的分光棱镜及偏振态转换组件构成；
所述分光棱镜，配置为反射入射的所述激光光束的S偏振分量，透射入射的所述激光光束的P偏振分量；
所述偏振态转换组件，配置为改变经所述分光棱镜透射的所述P偏振分量的偏振态，使所述P偏振分量从线偏振光变成圆偏振光，并改变所述圆偏振光反射后的偏振态为S偏振光而被所述分光棱镜反射。
上述方案中，所述光隔离器由采用粘合方式相互连接的检偏器及偏振态转换组件组成；
所述检偏器，配置为仅允许所述激光光束的P偏振分量通过；
所述偏振态转换组件，配置为改变经所述检偏器的所述P偏振分量的偏振态，使所述P偏振分量从线偏振光变成圆偏振光，并改变所述圆偏振光的反射光偏振态为S偏振光而被所述检偏器隔离。
上述方案中，当所述激光光束垂直入射所述光隔离器时，所述分光棱镜的第一入射面的反射率不大于0.5％。
上述方案中，所述光隔离器由采用粘合方式相互连接的带通滤光片及倍频晶体组成；
所述带通滤光片，配置为使波长为λ的所述激光光束通过；
所述倍频晶体，配置为对经所述带通滤光片的激光光束进行倍频，并对所述倍频后的激光光束的反射光再次进行倍频，而被所述带通滤光片滤除。
上述方案中，所述前光组件还包括准直透镜；
所述准直透镜，沿所述激光光束的传播方向设置于所述激光器与所述光隔离器之间，配置为对所述激光光束进行准直处理，使所述激光光束成为平行光束。
上述方案中，所述前光组件还包括第一光汇聚组件及第二光汇聚组件；
所述第一光汇聚组件，配置为对所述激光光束进行第一聚焦，使所述激光光束在第一方向上汇聚于所述流动室的血细胞被测样本处并产生散射光；
所述第二光汇聚组件，配置为对所述激光光束进行第二聚焦，使所述激光光束在第二方向上汇聚于所述挡直光阑处。
上述方案中，所述后光组件还包括第三汇聚组件及小孔光阑；
所述第三汇聚组件，配置为对所述散射光进行第三聚焦，使所述散射光汇聚于所述小孔光阑处，并经所述小孔光阑的小孔进入所述第一检测器。
上述方案中，所述光学检测系统还包括第二检测器及荧光检测器；
所述第二检测器，配置为对与所述激光光束的传播方向所呈角度处于设定的角度范围内(如60°至120°)的散射光进行光强检测；
所述荧光检测器，配置为对所述血细胞被测样本所产生的荧光进行荧光检测。
上述方案中，所述第二方向与所述血细胞被测样本的流动方向垂直；
所述第一方向与所述血细胞被测样本的流动方向相同。
上述方案中，所述光隔离器的光隔离度不小于30db。
上述方案中，所述挡直光阑的光收集角度为1～10°。
上述方案中，所述激光光束的波长为630nm～640nm。
上述方案中，所述激光光束为P线偏振光。上述光学检测系统能够很好的隔离激光光束在光路中传播时产生的反射光，使得激光器能够稳定输出激光光束，进而避免反射光进入激光器产生的功率尖峰出现的小脉冲，也避免了这种干扰小脉冲和血小板粒子形成的小脉冲相互混淆的情况，更进一步提高了本发明方法对血小板的检测精度。
根据本发明另一方面的目的，本发明还提供一种血液分析系统，包括：
采样部，用于获取血液样本，并将所述血液样本输送到所述反应部；
试剂供应部，用于贮存至少第一试剂并根据需要供应到所述反应部；
反应部，包括混合室，用于将所述血液样本与第一试剂混合以形成待测试样，其中所述第一试剂包括溶血剂，所述溶血剂裂解所述血液样本中的红细胞；
光学检测系统，包括流动室和至少第一检测器，用于当所述待测试样由所述混合室被输送到所述光学系统并使所述待测试样中的粒子逐个通过流动室到达检测区时，所述第一检测器对待测试样中的粒子进行检测以获得所述待测试样中的光学信息；和
数据处理模块，其与所述光学系统可操作地连接，并包括处理器和存储有计算机程序的非暂时性计算机可读存储介质，其中当所述计算机程序被所述处理器执行时，执行以下步骤：根据所述光学信息中的至少两种光学信息获得血小板的光学信息。
根据本发明血液分析系统的第一实施方式，所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片，且其中所述处理模块中，当所述计算机程序被所述处理器执行时，进一步执行以下步骤：
根据所获得的光学信息中的前向散射光强度和侧向散射光强度对血小板计数；和/或
根据前向散射光强度和侧向散射光强度将白细胞区分为至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的亚群。
根据本发明血液分析系统的第二实施方式，其中，
所述混合室用于所述血液样本与第二试剂混合以形成待测试样，其中所述第二试剂包含选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种荧光染料；
所述光学检测系统包括第二检测器，所述第二检测器为荧光检测器，以便当所述待测试样中的粒子逐个通过检测区时进一步获得荧光信号；和
所述数据处理模块中，当所述计算机程序被所述处理器执行时，进一步执行以下步骤：
根据荧光强度和侧向散射光强度信息区分白细胞亚群以获得白细胞的至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的亚群和/或识别幼稚粒细胞；
根据荧光强度和前向散射光强度信息全区分血小板；和/或
当根据前向散射光强度和荧光强度信息构成的散点图的预设区域中的粒子数超过预定阈值时报警网织红细胞。
在该第二实施方式中，根据另一方案，所述第二试剂进一步包含选自核酸特异性染料中的一种荧光染料，和当所述计算机程序被所述处理器执行时，进一步执行以下步骤：根据荧光强度和前向散射光强度信息区分血小板和网织红细胞，优选地进一步对网织红细胞计数。
根据本发明血液分析系统的第三实施方式，其中所述光学检测系统，进一步包括：光学子系统，
所述光学子系统包括：激光器、前光组件及后光组件，所述前光组件包括光隔离器；其中，
所述激光器，配置为发射激光光束；
所述前光组件，配置为对所述激光光束进行前光处理，经所述前光处理的激光光束在第一方向上汇聚于所述流动室的血细胞被测样本处并产生散射光；
所述后光组件，沿所述激光光束的传播方向设置于所述流动室之后，配置为对所述散射光进行后光处理，使得经所述后光处理的所述散射光进入所述第一检测器进行光强检测；
所述光隔离器，配置为将反射光与所述激光器隔离；所述反射光至少为所述激光光束经所述流动室所产生。
应理解，前述本发明的光学检测系统的全部特征可应用于在本发明的血液分析系统的光学检测系统中。
本发明提供了一种全新的血液检测方法，该方法对血液样本进行溶血处理，并通过光学检测能够实现对血小板的准确检测，并且该方法能够同时获得白细胞的分析结果，并在使用核酸特异性染料的情况下进一步获得网织红细胞的检测信息，从而首次实现了溶血条件下利用光学信息区分血小板，并且在单一通道中能够同时获得白细胞，甚至网织红细胞的检测信息，从而简化了血液检测、降低了检测成本。
附图说明
图1为本发明实施例提供的光学检测系统的组成结构示意图一；
图2为本发明实施例提供的光学检测系统的组成结构示意图二；
图3为本发明实施例提供的光隔离器的原理示意图；
图4为本发明实施例提供的光隔离器的第一入射面的示意图；
图5为本发明实施例提供的第二柱面镜的光汇聚原理示意图；
图6为本发明实施例提供的挡直光阑的正面视图；
图7为本发明实施例提供的血细胞分析仪的组成结构示意图；
图8为本发明实施例提供的光学检测系统的组成结构示意图三；
图9为本发明实施例提供的光学检测系统的组成结构示意图四；
图10为实施例1中获得的经深度溶血的试样在流式细胞仪上收集血小板(A)与白细胞(B)的散点图；
图11为实施例2经深度溶血的试样(A)和经常规溶血剂溶血后的试样(B)PLT展出对比；
图12为实施例3在深度溶血状态下对血小板和网织红细胞检测得到的荧光-前向散射光的光强度散点图(A)，和白细胞的荧光-侧向散射光的光强度散点图(B)；
图13为实施例4在深度溶血状态下对血小板和网织红细胞检测得到的荧光-前向散射光的光强度散点图(A)，和白细胞的荧光-侧向散射光的光强度散点图(B)；
图14为实施例5在深度溶血状态下加入核酸染料对血小板和网织红细胞检测得到的荧光-前向散射光的光强度散点图(A)，和白细胞的荧光-侧向散射光的光强度散点图(B)；
图15为实施例6在深度溶血状态下加入膜染料对血小板和网织红细胞检测得到的荧光-前向散射光的光强度散点图(A)，和白细胞的荧光-侧向散射光的光强度散点图(B)；
图16为实施例7在深度溶血状态下加入线粒体染料对血小板和网织红细胞检测得到的荧光-侧向散射光的光强度散点图；
图17为实施例8在深度溶血状态下加入膜染料和核酸染料对血小板和网织红细胞检测得到的荧光-前向散射光的光强度散点图(A)，和白细胞的荧光-侧向散射光的光强度散点图(B)；
图18为实施例9测试血小板(A)及网织红细胞(B)相关的图；
图19示出了实施例10溶血状态下，染料Alexa Fluor 488对(A)血小板和(B)白细胞的染色及区分效果；
图20示出了实施例11溶血状态下，染料DiD对(A)血小板和(B)白细胞的染色及区分效果；
图21示出了实施例12溶血状态下，染料罗丹明123对(A)血小板和(B)白细胞的染色及区分效果；
图22示出了实施例13溶血状态下，染料Mitotracker Deep Red对(A)血小板和(B)白细胞的染色及区分效果；
图23示出了实施例14溶血状态下，染料Mitotracker Red对(A)血小板和(B)白细胞的染色及区分效果；
图24为实施例15的染色法与迈瑞6800仪器上在测试值上的相关性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
需要说明的是，在本发明实施例中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的方法或者装置不仅包括所明确记载的要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为实施方法或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的方法或者装置中还存在另外的相关要素(例如方法中的步骤或者装置中的单元，这里的单元可以是部分电路、部分处理器、部分程序或软件等等)。
需要说明的是，本发明实施例所涉及的术语“第一\第二\第三”仅仅是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序，可以理解地，“第一\第二\第三”在允许的情况下可以互换特定的顺序或先后次序。应该理解“第一\第二\第三”区分的对象在适当情况下可以互换，以使这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。
如前所述，检测血小板的方法中，常规采用电阻抗法，然而电阻抗法在检测一些特殊血样时，对血小板的检测不够准确。为此，用光学检测方法结合特定的检测试剂在单独的检测通道中对血小板进行检测。这些方法都是在不溶血的前提下，在单独的检测通道中进行。
通常，红细胞溶血剂在破坏红细胞膜的同时也会对其他细胞膜造成损伤。而且，溶血后产生的大量红细胞碎片，通常会认为将对血小板的检测造成更大的干扰。因此，目前已知的光学检测血小板的方法中大多采用不溶血的方法。
美国专利US 7,344,890B2中公开了一种采用血影剂(ghosting reagent)处理含有干扰物的血液样品，使红细胞的散射特性发生改变，从而可通过测定样品中细胞的前向散射光的强度和飞行时间，在所得的二维散点图中明显地将血小板与红细胞区分开。该方法通过使正常红细胞失去血红素，从而显著地改变了红细胞的折射率。然而该方法不能有效区分大尺寸血小板和白细胞。而且该方法需要测定飞行时间，并不能仅由光学信息对血小板进行检测。
本发明人开发了一种在对血液样本进行溶血处理的前提下，通过光学方法检测血小板的方法，该方法能够利用光学信息使血小板与经溶血处理而裂解的红细胞区分开，并且，还能同时获得白细胞的光学信息，并且在采用核酸特异性染料的情况下进一步获得网织红细胞的光学信息。
以下对本发明的第二种血液检测方法及相应的血液分析系统示例性地详细说明本发明。
根据本发明的血液检测方法，首先用包括溶血剂的第一试剂处理血液样本以获得待测试样，然后通过光学检测设备对所述试样进行检测，并利用至少两种光学信息将血小板与试样中的其他粒子区分开，从而获得血小板的光学信息。经验证，本发明的方法获得的血小板计数与现有的血液分析仪以其他方法检测得到的结果具有高度的一致性。
更进一步地，本发明的方法在常规的白细胞计数通道中，对白细胞的计数不产生影响。在所获得的散点图(可进一步参考以下详述的实施例)中，白细胞区域显著远离血小板的区域。因而，本发明的方法也不会产生白细胞干扰大尺寸血小板和血小板聚集体的情况。因此，本发明的方法能够同时获得至少三分类，甚至在利用荧光染料的情况下可获得四分类的白细胞检测结果，并可对网织红细胞报警，或者计数。
以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的方法。
根据本发明的第一实施方式，所述第一试剂中包含能够使红细胞深度裂解的溶血剂。所述溶血剂没有特别限制，可采用本发明中红细胞深度溶血剂。举例来说，这样的溶血剂可为烷基糖苷、三萜皂苷、甾族皂苷等等。
一种具体的溶血剂可为具有通式I的糖苷类化合物：
R-(CH2)n-CH3 (I)
其中，R选自由单糖、去氧单糖和多糖所组成的组，n为5～17的整数。
上述糖苷类化合物能够起到快速溶解红细胞的作用。糖苷类化合物是由糖(或多糖)的半缩醛羟基同烷醇的羟基脱水形成的化合物。本发明的溶血剂中糖苷类化合物可以是单一的化合物，也可以是符合上述通式的两种或更多种糖苷类化合物的混合物。
通式(I)中，单糖没有特别限制，常用的可选自五碳糖、甲基五碳糖和六碳糖，但不限于此。五碳糖诸如阿拉伯糖、木糖、核糖、来苏糖等。甲基五碳糖诸如夫糖、鼠李糖、鸡那糖等。六碳糖诸如葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、山梨糖。去氧单糖也没有特别限制，诸如去氧核糖、去氧葡萄糖等，但不限于此。多糖诸如麦芽糖、蔗糖等，但不限于此。n优选为6～14的整数，更优选为7～11的整数。
所述通式I的糖苷类化合物具体可为辛基葡萄糖苷，壬基葡萄糖苷，葵基葡萄糖苷，十二烷基麦芽糖苷，十四烷基麦芽糖苷，十二烷基葡萄糖苷，优选辛基葡萄糖苷，壬基葡萄糖苷，葵基葡萄糖苷，十二烷基麦芽糖苷，更优选葵基葡萄糖苷，十二烷基麦芽糖苷。
所述通式I的糖苷类化合物在本发明的溶血剂中的浓度根据所选糖苷的性质、反应时间、反应温度和其他成分的使用量而有所不同，通常用量为0.025g/L～10g/L范围内，优选0.1g/L～5.0g/L。
该第一实施方式中的第一试剂，优选进一步包括具有通式II的非离子型表面活性剂：
R1-R2-(CH2CH2O)m-H (II)
其中，R1为C8-C23的烷基，R2为-O-、
Figure BDA0002582370060000111
或-COO-，m为10～50的整数；和
可选地，至少一种有机酸或其盐，其中所述有机酸或其盐选自由具有至少一个羧基或磺酸基的有机酸及其碱金属的盐所组成的组中。
通式II的非离子型表面活性剂，在一定程度上能够与细胞膜结合，起到保护白细胞和血小板的细胞膜不受前述糖苷类化合物的影响而保持或基本保持其细胞形态的作用。
根据优选的实施方式，所述通式II的非离子型表面活性剂中，R1为C8-C18的直链烷基。C8-C18的直链烷基具体可为辛基、葵基、月桂基、十四烷基、十六烷基或硬脂基。更优选R1为C12-C16的直链烷基，具体可为月桂基、十四烷基或十六烷基。R2优选为-O-。m为10～50，优选为15～30。
所述通式II的非离子型表面活性剂具体实例可为十六烷醇聚氧乙烯(15)醚、十二烷醇聚氧乙烯(21)醚、十六烷醇聚氧乙烯(23)醚、十六烷醇聚氧乙烯(25)醚、十六烷醇聚氧乙烯(30)醚，但不限于此。
通式II的非离子型表面活性剂的浓度没有特别限制，但可为0.03～1.5g/L，优选0.05～1.0g/L。
在本发明中，该非离子表面活性剂可以以单一物质使用，也可以两者或更多种的混合物来使用。取决于所使用的非离子表面活性剂的种类，其在溶血剂中的浓度也是不同的。通常来说，烷基链越长、聚氧乙烯部分的重复单元数目越多的非离子型表面活性剂，其浓度相对较低。
在本发明中，通式I和通式II的化合物配合使用，一方面能够获得对红细胞的快速深度裂解的效果，另一方面，为了能够有效检测血小板，起到对血小板细胞膜的保护作用。
根据所选取的通式I和通式II的化合物，二者之间的用量比例也有所不同。但是，通常来说，通式I和通式II的化合物的用量比为1:100～1:3，优选1:25～1:5，更优选1:10～1:5。
根据本发明的优选实施方式，所述第一试剂可进一步包括至少一种有机酸或其盐以使白细胞侧散射光的区分度更好。所述有机酸优选为未取代的或被羟基或氨基取代的C1-6烷基的一元、二元或三元羧酸；未取代的或被羟基或氨基取代的C1-6烷基的磺酸；C6-10芳基C1-6烷基酸；C6-10芳基二(C1-6烷基酸)；和C6-10芳基磺酸所组成的组中。
所述有机酸及其盐的具体实例可为甲酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸(3-羟基-1,3,5-戊三酸)、苹果酸(2－羟基丁二酸)、苯二甲酸、苯磺酸、α-萘磺酸、牛磺酸等及它们的碱金属盐，诸如钠盐、钾盐，但不限于此。
所述有机酸或有机酸盐在溶血剂中的浓度为0.05g/L到2g/L，优选0.1g/L到0.5g/L。
本发明的第一试剂还可进一步包括常规的添加剂。这些添加剂可根据需要选择性加入，例如(但不限于)缓冲剂、金属螯合剂、渗透压调节剂、防腐剂等。这些试剂均为本领域常用的试剂，只要不妨碍本发明溶血剂中的上述成分发挥作用即可。缓冲剂，例如可以为选自磷酸及其盐、柠檬酸及其盐、TRIS等中一种，通常为两种或更多种构成的缓冲体系。金属螯合剂，用作抗凝剂，常见的如EDTA钠。渗透压调节剂，通常为无机盐类，诸如氯化钠、硫酸钠、硫酸钾，硼酸钠等。防腐剂，例如异噻唑啉酮、叠氮钠，咪唑烷基脲。
根据第一实施方式的第一试剂与血液样本的混合比例并没有特别限制。举例来说，血液样本与第一试剂的体积混合比可为1:40～1:60。溶血反应在诸如40～60℃的温度下，反应15～100秒，优选反应40～80秒。反应温度和时间可根据具体条件进行调节。
通常来说，较高的反应温度和较长的反应时间，可以获得对于红细胞程度较深的裂解。但是由于任何溶血剂会对任何细胞膜产生作用，因此，本文中红细胞深度裂解(深度溶血)指反应条件的选择使红细胞相比常规被进一步地裂解，但血小板可基本保持其细胞形态，优选也使白细胞能基本保持其细胞形态。在光信号的散点图上，血小板和被裂解的红细胞能形成区分开的两个群。于此相对，本文中的红细胞常规裂解指使用常规的溶血剂，反应后，被裂解的红细胞会混在血小板粒子群的情况。
通过以下具体实施例将详述的，第一实施方式的方法，能够对红细胞造成更深程度的裂解，使红细胞的细胞膜破碎成更小的碎片，从而通过光学检测得到的前向和侧向散射光强度的散点图中能够清晰地区分出红细胞碎片区域和血小板区域，实现对血小板的准确和精确的检测、计数。此外，还能获得至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的白细胞亚群。
根据一种优选方案，经第一试剂处理的血液样本还使用第二试剂进行处理。
该第二试剂包含选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种染料，和/或一种核酸特异性染料。
所述膜特异性染料可以选自DiA、DiD、DiI、DiO、DiR、DiS、FDA、Alexa Fluor 488、Super Fluor 488及以它们为母体的变形结构中的一种或多种。优选地，所述膜特异性染料为Alexa Fluor 488。
所述线粒体特异性染料可选自Janus Green B、MitoLite Red、罗丹明123和Mitotracker系列及以它们的母体的一种或多种。优选地，所述线粒体特异性染料为Mitotracker Deep Red或Mitotracker Red。
本发明中，染料的变形结构包括商业化的变形结构或非商业化的变形结构，根据染料的名称、结构等，本领域技术人员能够从现有技术中确认出以已知染料为母体的变形结构(如商业化变形结构)；同时，能够根据母体结构和/或已存在变形结构来得到非商业化的变形结构，并可以合理预期这些变形结构能实现与其母体类似的染色效果。这些变形结构均落入本发明的保护范围之中。
本发明中，“膜特异性染料”是指能够对血小板膜进行特异性染色的荧光染料；类似地，“线粒体特异性染料”是指能够对血小板线粒体进行特异性染色的荧光染料。当血液样本经第一试剂和包含膜特异性染料或线粒体特异性染料的第二试剂处理后，血小板和被裂解的红细胞产生了差异性更为显著的荧光特性，因而可通过检测荧光强度和选自前向散射光强度和侧向散射光强度中的至少一种，特别是通过检测荧光强度和前向散射光强度可更进一步地使血小板区分于被裂解的红细胞碎片。
本发明的第一实施方式中的第一试剂包含溶血能力强的表面活性剂，使得红细胞的碎片体积更小。溶血后从网织红细胞(RET)中散出的细胞器颗粒，其数目与RET的值有一定的相关性。由于网织红细胞是有核红细胞，因而加入核酸特异性荧光染料后，就能够对这些粒子进行特异性能染色。
此外，我们在研究中发现，对于一些存在较大量网织红细胞(RET)的血液样本，单纯用前散射光和侧散射光信号检测时，会出现网织红细胞对血小板的干扰。可利用上述含膜或线粒体特异性染料的第二试剂，针对该现象进行网织红细胞报警。具体可在前散射光和荧光信号的二维散点图的预设区域对粒子进行计数，当计数值超过预定值(例如超过血小板数量达到一定程度)时，可进行网织红细胞报警，以便进一步对受试者进行检查。
采用该优选的方案，可获得上述三分类甚至四分类的白细胞亚群，并可识别幼稚粒细胞。
根据优选的方案，第二试剂可包含核酸特异性染料，特别是针对网织红细胞的核酸特异性的染料。该优选方案可对血液样本用核酸染料进行染色，这样不但能获得网织红细胞的信息，还能进一步使血小板区分于网织红细胞溶解后散落的细胞器颗粒。
因此，本发明的该优选方案包括能够进一步实现在检测血小板的同时实现对网织红细胞的有效测定。此外这些核酸荧光染料也能对白细胞核有效染色，进而利用荧光信号也能实现对白细胞的分类检测。
用于本发明的核酸特异性染料没有特别限制。商品化的核酸荧光染料及一些专利申请中已经公开的核酸特异性荧光染料均可用于本发明。其中商品化的核酸荧光染料，可列举的有Thermofisher公司的SYTO系列核酸染料。此外，中国专利申请CN201010022414.6中公开的荧光染料、CN200910109215.6中公开的花青素类染料、CN200810216864.1中公开的荧光染料等，均可用于本发明。以上专利文献的全部内容通过引用并入本申请。
所述核酸染料的浓度范围根据具体采用的染料性质而不同，并没有特别限制，通常在0.002ppm到2000ppm。优选的浓度范围为0.03ppm到20ppm。
所述第二试剂优选还包含有机溶剂。所述有机溶剂可为甲醇、乙醇、甘油等，但不限于此。
在进一步优选的方案中，第二试剂可包含膜或线粒体特异性染料中的一种以及核酸特异性染料中的一种，以获得更准确和精确的血小板计数，并同时获得白细胞的分类计数及网织红细胞的计数。
在上述利用含有荧光染料的第二试剂的方法中，可根据荧光和前向散射光的信息使血小板与试样中的其他粒子区分开，获得血小板的计数(以及在使用核酸染料情况下获得网织红细胞的计数)，并进一步利用荧光和侧向散射光的信息获得白细胞的分类信息和计数。进一步地，还可同时利用荧光、前向散射光和侧向散射光的强度，获得体积分布的三维散点图，从而完成各粒子的分类和计数。
以上详述的本发明第二种血液检测方法中的第一实施方式可全部应用于本发明第一种血液检测方法中。因此根据本发明的第一种血液检测方法就不再赘述。
本发明的第二实施方式，用第一试剂和第二试剂对血液样本进行处理来获得待测试样。
在该实施方式中，第一试剂包含任意的溶血剂，只要能裂解红细胞即可，对其溶血程度没有特别限制，可以是常规的溶血剂。示例性的溶血剂例如季铵盐类阳离子表面活性剂(如十四烷基三甲基氯化铵)，但本发明不限于此。
第二试剂包含选自上述膜特异性染料和上述线粒体特异性染料中的一种。
该实施方式中，当血液样本经含溶血剂的第一试剂和含膜特异性染料或线粒体特异性染料的第二试剂处理后，血小板和被裂解的红细胞的荧光特性显著不同，因而可通过检测荧光强度和一种散射光强度，特别是通过检测荧光强度和前向散射光强度可使血小板很好地区分于被裂解的红细胞碎片。由于膜特异性染料或线粒体特异性染料的使用，在该实施方式中，红细胞仅经溶血剂裂解就可通过二维散点图与血小板明显区分，而不必如第一实施方式中那样对红细胞进行深度裂解。而且该方案可同样通过荧光强度和侧向散射光强度信息获得白细胞的亚群和计数，以及当存在网织红细胞时进行报警。
该实施方式中，所述第二试剂可进一步包含一种核酸特异性染料。并同样地，由此可进一步获得网织红细胞的光学信息，并优选地计数。
在第三实施方式中，本发明的血液检测方法可在对血液样本按照前述第一实施方式或第二实施方式进行红细胞裂解后，进一步采用消除了激光器对血小板光信号的脉冲波产生干扰的光学检测系统中进行检测，以获取更为准确的血小板计数。
常规的光学检测系统中的激光器易受到光路中反射光的影响而不稳定，产生振幅变化、频率移动或功率尖峰等。在实际应用中，当激光器不稳定振荡产生功率尖峰时，其在光学前向信号上的表现是小脉冲。这些干扰小脉冲和血小板粒子在检测中形成的小脉冲相互混淆，造成干扰。
参考图1～9，对本发明的光学检测系统进行详细说明。
发明人在研究过程中发现，为阻止反射光回馈到激光器中，可以采用基于法拉第效应的磁光器件作为光隔离器，放置于光路中。这种隔离器机械尺寸较大，一般只能放置在光源组件外部，而光源组件外部的光束为非平行光，当非平行光入射光隔离器时，其光隔离的效果会受到严重削弱。因此这种方案存在尺寸大、成本高、隔离效果不好的缺点。
在本发明实施例中，光学检测系统包括：光学子系统、流动室、第一检测器；所述光学子系统包括：激光器、包括光隔离器的前光组件及包括挡直光阑的后光组件；其中，
所述激光器，配置为发射激光光束；
所述前光组件，配置为对所述激光光束进行前光处理，经所述前光处理的激光光束在第二方向上汇聚于所述挡直光阑处，在第一方向上汇聚于所述流动室的血细胞被测样本处并产生散射光；
所述后光组件，沿所述激光光束的传播方向设置于所述流动室之后，配置为对所述散射光及汇聚于所述挡直光阑处的激光光束进行后光处理，使得经所述后光处理的所述散射光进入所述第一检测器进行光强检测；
所述光隔离器，配置为隔离所述激光光束经所述流动室及所述后光组件所产生的反射光。
接下来对本发明实施例提供的光学检测系统进行详细说明。
图1为本发明实施例提供的光学检测系统的组成结构示意图一，图2为本发明实施例提供的光学检测系统200的组成结构示意图二，结合图1、图2所示，本发明实施例提供的光学检测系统200包括：光学子系统1、流动室2、第一检测器3；
所述光学子系统1包括：激光器11、包括光隔离器121的前光组件12及包括挡直光阑131的后光组件13；其中，
所述激光器11，配置为发射激光光束；
所述前光组件12，配置为对所述激光光束进行前光处理，经所述前光处理的激光光束在第二方向上汇聚于所述挡直光阑131处，在第一方向上汇聚于所述流动室2的血细胞被测样本处并产生散射光；
所述后光组件13，沿所述激光光束的传播方向设置于所述流动室2之后，配置为对所述散射光及汇聚于所述挡直光阑131处的激光光束进行后光处理，使得经所述后光处理的所述散射光进入所述第一检测器3进行光强检测；
所述光隔离器121，配置为隔离所述激光光束经所述流动室及所述后光组件所产生的反射光。
接下来对光学子系统中的激光器11进行说明，在一实施例中，所述激光器11为半导体激光器，实际实施时，可以为P线偏振激光器；在实际应用中，激光器发射激光光束的波长决定了光路主要参数的设计，比如透镜的选型、信号收集角度的选择等，且激光光束的波长，也和检测中用到的试剂如荧光染料有关，在一实施例中，激光器11发出的激光光束的波长为630nm～640nm。
接下来对光学子系统中的前光组件12中的各部分进行说明。在一实施例中，前光组件12中的光隔离器121由采用粘合方式相互连接的分光棱镜及偏振态转换组件构成；
所述分光棱镜，配置为反射入射的所述激光光束的S偏振分量，透射入射的所述激光光束的P偏振分量；
所述偏振态转换组件，配置为改变经所述分光棱镜透射的所述P偏振分量的偏振态，使所述P偏振分量从线偏振光变成圆偏振光，并改变所述圆偏振光反射后的偏振态为S偏振光而被所述分光棱镜反射。
以偏振态转换组件为1/4波片为例，参见图3，图3为本发明实施例提供的光隔离器的原理示意图，当激光光束L(TM模)垂直入射分光棱镜35时，激光光束L中的P偏振光31(即平行纸面的偏振分量)能够通过分光棱镜35，而激光光束L中的S偏振光32(即垂直纸面的偏振分量)被分光棱镜35的45°斜面反射出去；继而，P偏振光31透过1/4波片36，经过1/4波片36后的P偏振光31的偏振态发生改变，由线偏振光变成圆偏振光33；圆偏振光33的反射光(被后级光路37反射形成的反射光)再次经过1/4波片36后，偏振态发生改变，由圆偏振光转换成S偏振光34，而S偏振光34会被分光棱镜35的45°斜面反射出去，不会回馈到激光器，从而实现对光路反射光的隔离。
这里，在实际应用中，当激光光束垂直入射光隔离器时，分光棱镜的第一入射面的反射率不大于0.5％，或者不大于0.1％，或者不大于0.05％。这里的第一入射面参见图4，图4为本发明实施例提供的光隔离器的第一入射面的示意图，其中，标号41所示即为第一入射面，在实际实施时，第一入射面的光反射率可由第一入射面的镀膜设计与工艺实现。
在一实施例中，光隔离器121还可由采用粘合方式相互连接的检偏器及偏振态转换组件组成；
所述检偏器，配置为仅允许所述激光光束的P偏振分量通过；
所述偏振态转换组件，配置为改变经所述检偏器的所述P偏振分量的偏振态，使所述P偏振分量从线偏振光变成圆偏振光，并改变所述圆偏振光反射后的反射光的偏振态为S偏振光而被所述检偏器隔离。
以偏振态转换组件为磁光晶体为例进行说明，当激光光束入射检偏器时，仅激光光束中的P偏振光能够通过检偏器，经过检偏器的P偏振光进入磁光晶体，经过磁光晶体的P偏振光的偏振态发生改变，其偏振方向旋转45°。该偏振光被后级光路反射形成的反射光再次经过磁光晶体后，偏振方向再次旋转45°，形成与原P偏振光的偏振态垂直的S偏振光而被检偏器隔离，不会回馈到激光器。
在实际应用中，所述偏振态转换组件还可以为旋光晶体，在实际应用中，分光棱镜、检偏器可以和1/4波片、磁光晶体、旋光晶体中任一个进行组合实现光路中反射光的隔离。
在一实施例中，所述光隔离器121由采用粘合方式相互连接的带通滤光片及倍频晶体组成；
所述带通滤光片，配置为使波长为λ的所述激光光束通过；
所述倍频晶体，配置为对经所述带通滤光片的激光光束进行倍频，并对所述倍频后的激光光束的反射光再次进行倍频，而被所述带通滤光片滤除。
在一实施例中，所述光隔离器的光隔离度不小于30db。
在一实施例中，所述前光组件12还包括准直透镜122；
所述准直透镜122，沿所述激光光束的传播方向(光轴方向)设置于所述激光器11与所述光隔离器121之间，配置为对所述激光光束进行准直处理，使所述激光光束成为平行光束。
在一实施例中，所述前光组件12还包括第一光汇聚组件123及第二光汇聚组件124；
所述第一光汇聚组件123，配置为对所述激光光束进行第一聚焦，使所述激光光束在第一方向上汇聚于所述流动室的血细胞被测样本处并产生散射光；
所述第二光汇聚组件124，配置为对所述激光光束进行第二聚焦，使所述激光光束在第二方向上汇聚于所述档直光阑131处。
这里，在实际应用中，所述第二方向为横向，即与所述血细胞被测样本的流动方向垂直的方向；所述第一方向为纵向，即与所述血细胞被测样本的流动方向相同的方向。在实际应用中，第一光汇聚组件123和第二光汇聚组件124可以为光学参数(如焦距等)不同的柱面镜实现，如第一光汇聚组件123由第一柱面镜实现，第二光汇聚组件124由第二柱面镜实现。
以第二光汇聚组件124为第二柱面镜为例进行说明，参见图5，图5为本发明实施例提供的第二柱面镜的光汇聚原理示意图，激光光束经过第二柱面镜，第二柱面镜在纵向上不对激光光束进行处理，经第二柱面镜的激光光束在横向上被压缩，激光光束在横向(垂直于血细胞被测样本的流动方向)上聚焦，在本发明实施例中聚焦于档直光阑处。
接下来对后光组件13中各部分进行说明，参见图6，图6为本发明实施例提供的挡直光阑的正面视图，照射到流动室中血细胞样本处的激光光束发生散射，产生的散射光被挡直光阑所收集，在实际实施时，挡直光阑对低角度散射信号的收集角度进行约束；同时，挡直光阑在第二方向上汇聚于挡直光阑处的激光光束进行阻挡。在一实施例中，挡直光阑的光收集角度可以为1～10°。
在一实施例中，所述后光组件13还包括第三汇聚组件132及小孔光阑133；
所述第三汇聚组件132，配置为对所述散射光进行第三聚焦，使所述散射光汇聚于所述小孔光阑处，并经所述小孔光阑的小孔进入所述第一检测器，以进行光强检测。
在一实施例中，第三汇聚组件可以为以下之一：
至少一个平凸透镜与至少一个双凸透镜构成的透镜组；
至少两个平凸透镜构成的透镜组；
至少两个双凸透镜构成的透镜组；
至少两个球面透镜构成的透镜组；
非球面镜。
在一实施例中，所述光学检测系统还包括第二检测器4及荧光检测器5；
所述第二检测器，沿与所述激光光束的传播方向所呈角度处于设定的角度范围内的方向设置，配置为对与所述激光光束的传播方向所呈角度处于设定的角度范围内的散射光进行光强检测；
所述荧光检测器，沿与所述激光光束的传播方向所呈角度处于设定的角度范围内的方向设置，配置为对所述血细胞被测样本所产生的荧光进行荧光检测。
接下来对本发明实施例提供的血液分析系统进行说明，图7为本发明实施例提供的血液分析系统的组成结构示意图。根据本发明的血液分析系统大体上包括采样部，试剂供应部、反应部、光学检测系统和数据处理模块。
图7示出了根据本发明的一种具体的血液分析系统。该血液分析系统具体第一机壳100、第二机壳200、采样部10、试剂供应部(未示出)、反应部30、光学检测系统50、数据处理模块70及输出部90。在实际应用中输出部90可以为用户界面。本实施方式中，光学检测系统50及数据处理模块70设置在第二机壳200的内部，分别设置在第二机壳200两侧。反应部30设置在第一机壳100的内部，输出部90、采样部10在第一机壳100的外表面。
所述采样部10，具有采样针，采集血液样本，并将采集的血液样本输送至反应部30。
试剂供应部贮存用于与血液样本反应的试剂(例如至少储存有前述第一试剂)并根据需要将相应的试剂供应到所述反应部。
所述反应部30，配置为使得来自采样部的所述血液样本和来自试剂供应部的试剂进行反应，得到包含多个所述血小板粒子的待测试液，使得所述血小板粒子逐一流经光学检测系统的流动室。
所述光学检测系统50包括：光学子系统、流动室和第一检测器。所述光学子系统包括：激光器、前光组件及后光组件，所述前光组件包括光隔离器；其中，所述激光器，发射激光光束；所述前光组件，配置为对所述激光光束进行前光处理，经所述前光处理的激光光束在第一方向上汇聚于所述流动室的血液粒子(如血小板粒子)处并产生散射光；所述后光组件，沿所述激光光束的传播方向设置于所述流动室之后，配置为对所述散射光进行后光处理，使得经所述后光处理的所述散射光进入所述第一检测器进行光强检测；所述光隔离器，配置为将反射光与所述激光器隔离；所述反射光为所述激光光束经所述流动室及所述后光组件所产生。所述流动室，供诸如血小板粒子的血液粒子排队通过。第一检测器用于检测经过流动室的血液粒子的光学信息，尤其是光强度信息。
所述数据处理模块70，配置为根据所述第一检测器检测得到的所述散射光的光强信号，检测出流经所述流动室的血液(例如，血小板)粒子，得到对应血液粒子的检测结果。
所述输出部90，配置为输出对应所述血液(例如血小板)粒子的检测结果。
接下来对血液分析系统包括的光学检测系统50所包括的各部分进行说明。
图8为本发明实施例提供的光学检测系统的组成结构示意图，如图8所示，本发明实施例提供的光学检测系统包括：激光器71、前光组件72、流动室73、后光组件74、前向检测器75、侧向检测器76及荧光检测器77。
在实际应用中，血液粒子(尤其以血小板粒子为例)从流动室穿过而被检测(如光强检测)、计数等，在本实施例中，血小板粒子的流动方向为垂直于纸面方向，激光器71发射的激光光束的传播方向为平行于纸面方向。
在实际实施时，激光器71为P线偏振激光器，激光器71发出的激光光束的波长为630nm—640nm。
参见图8，前光组件72包括沿所述激光光束的传播方向依次设置的准直透镜721、光隔离器722、第一柱面镜723及第二柱面镜724；后光组件74包括沿所述激光光束的传播方向依次设置的挡直光阑741、平凸透镜742、双凸透镜743及小孔光阑744。
激光器71发出的激光光束经准直透镜721的准直处理，形成平行激光光束，然后透过光隔离器722，经第一柱面镜723在纵向(垂直于纸面方向)上聚焦于流动室73中心处作为检测光斑，所述激光光束的传播方向与所述流动室的光入射面之间的夹角呈直角，聚焦于流动室的激光光束照射到流动室中的血小板粒子而产生光散射，经第一柱面镜723在纵向的压缩，激光光束在纵向上的尺寸与血小板粒子的尺寸相匹配，经第一柱面镜723的激光光束，进入第二柱面镜724，在横向(平行于纸面方向)上被压缩，在横向上汇聚于挡直光阑741处。
其中，照射到流动室中的血小板粒子产生的散射光经挡直光阑的收集，进而被平凸透镜742、双凸透镜743组成的透镜组聚焦，汇聚于小孔光阑744处，经小孔光阑744的小孔进入前向检测器75，而被前向检测器75进行前向光信号强度检测。
在实际应用中，如图8所示，侧向检测器76及荧光检测器77沿与所述激光光束的传播方向垂直的方向设置；其中，侧向检测器76配置为对与所述激光光束的传播方向垂直的散射光进行光强检测；荧光检测器77，沿与所述激光光束的传播方向垂直的方向设置，配置为对所述散射光进行荧光检测。
在实际实施时，由激光器71发出的激光光束在图8所示光路中传播会形成反射光，光隔离器722配置为隔离激光器71发出的激光光束在光路中传播所产生的反射光。
在实施例中，光隔离器722由采用粘合方式相互连接的分光棱镜及1/4波片构成；
所述分光棱镜，配置为反射入射的所述激光光束的S偏振分量，透射入射的所述激光光束的P偏振分量；
所述1/4波片，配置为改变经所述分光棱镜透射的所述P偏振分量的偏振态，使所述P偏振分量从线偏振光变成圆偏振光，并改变所述圆偏振光反射后的偏振态为S偏振光而被所述分光棱镜反射。
当激光光束垂直入射分光棱镜时，激光光束中的P偏振光(即平行纸面的偏振分量)能够通过分光棱镜，而激光光束中的S偏振光(即垂直纸面的偏振分量)被分光棱镜的45°斜面反射出去；继而，P偏振光透过1/4波片，经过1/4波片后的P偏振光的偏振态发生改变，由线偏振光变成圆偏振光；圆偏振光的反射光(被后级光路反射形成的反射光)再次经过1/4波片后，偏振态发生改变，由圆偏振光转换成S偏振光，而S偏振光会被分光棱镜的45°斜面反射出去，不会回馈到激光器，从而实现对光路反射光的隔离。
这里，在实际应用中，当激光光束垂直入射光隔离器时，分光棱镜的第一入射面的反射率不大于0.5％。这里的第一入射面参见图4，图4为本发明实施例提供的光隔离器的第一入射面的示意图，其中，标号41所示表面即为第一入射面，在实际实施时，第一入射面的光反射率可由第一入射面的镀膜设计与工艺实现。
在一实施例中，光隔离器121还可由采用粘合方式相互连接的检偏器及偏振态转换组件组成；
所述检偏器，配置为仅允许所述激光光束的P偏振分量通过；
所述磁光晶体，配置为改变经所述检偏器的所述P偏振分量的偏振态，使其偏振方向旋转45°。该偏振光被后级光路反射形成的反射光再次经过磁光晶体后，偏振方向再次旋转45°，形成与原P偏振光的偏振态垂直的S偏振光，从而被所述检偏器隔离。
当激光光束入射检偏器时，仅激光光束中的P偏振光能够通过检偏器，经过检偏器的P偏振光进入磁光晶体，经过磁光晶体的P偏振光的偏振态发生改变，其偏振方向旋转45°。该偏振光被后级光路反射形成的反射光再次经过磁光晶体后，偏振方向再次旋转45°，形成与原P偏振光的偏振态垂直的S偏振光，从而被所述检偏器隔离，不会回馈到激光器。
在一实施例中，所述光隔离器还可由采用粘合方式相互连接的带通滤光片及倍频晶体组成；
所述带通滤光片，配置为使波长为λ的所述激光光束通过；
所述倍频晶体，配置为对经所述带通滤光片的激光光束进行倍频，并对所述倍频后的激光光束的反射光再次进行倍频，而被所述带通滤光片滤除。
在一实施例中，所述光隔离器的光隔离度不小于30db。
在一实施例中，所述激光光束的传播方向与所述流动室的光入射面之间的夹角可以为非直角，即对上述实施例中的流动室的位置在x-y平面即纸面进行一定角度的偏转，使得所述流动室倾斜放置，图9为本发明实施例提供的光学检测系统的组成结构示意图，如图9所示，激光光束的传播方向与所述流动室的光入射面之间的夹角θ为锐角，在一实施例中，θ角的范围为80°～90°，如此，当激光光束照射至流动室内部时，光束在流动室内部表面发生反射后，反射光偏离光轴(激光光束传播方向)，从而减少进入激光器的反射光的光通量。本领域技术人员可知，只要能使流动室光入射面的反射光不进入前光组件的θ角都可以适用本申请。通过深入研究发现，虽然流动室倾斜放置可能会使前向散射光的光路偏移，荧光和侧向散射光的收集角度发生变化，但进一步深入研究发现，可以通过调整后光组件在光路中的位置弥补前向散射光的影响，同时，通过大量的研究实验证明对荧光和侧向散射光的检测可以接受，不影响最终的检测结果。
应用本发明上述实施例，血小板粒子较小，流经流动室形成小脉冲，由于上述血细胞分析仪中的光学检测系统中光隔离器能够很好的隔离激光光束在光路中传播时产生的反射光，使得激光器能够稳定输出激光光束，避免了反射光进入激光器产生的功率尖峰出现的小脉冲，也即避免了干扰小脉冲和血小板粒子形成的小脉冲相互混淆，极大的提高了检测精度。
本发明实施例还提供了一种血小板检测方法，应用于上述包括光学检测系统的血细胞分析仪，所述光学检测系统包括：激光器、包括光隔离器的前光组件、后光组件、流动室及第一检测器；所述方法包括：
提供含有血小板的待测试液；
使待测试液中的血小板粒子逐个通过流动室的检测区；
使用所述前光组件对激光器发射的激光光束进行前光处理，使得经所述前光处理的激光光束在第一方向上汇聚于流动室的检测区，所述血小板粒子经过所述检测区产生散射光；
使用所述后光组件对所述散射光进行后光处理，使得经所述后光处理的所述散射光进入第一检测器；
其中，所述激光光束经所述流动室及所述后光组件所产生的反射光被所述光隔离器所隔离；
使用所述第一检测器对进入的所述散射光进行光强检测，得到第一检测结果，以基于所述第一检测结果识别所述血小板粒子。
在一实施例中，还包括：
对采集的血液样本进行溶血处理，使得所述血液样本中的红细胞被裂解，得到包含多个所述血小板粒子的待测试液。
在一实施例中，还包括：
使用前光组件对所述激光光束进行前光处理，使得经所述前光处理的激光光束在第二方向上汇聚于所述后光组件包括的挡直光阑处。
在一实施例中，所述血细胞分析仪还包括第二检测器；相应的，所述方法还包括：
使用所述第二检测器对与所述激光光束的传播方向所呈角度处于设定的角度范围内的散射光进行光强检测，得到第二检测结果，以结合所述第一检测结果及所述第二检测结果识别所述血小板粒子。
在一实施例中，所述血细胞分析仪还包括荧光检测器；相应的，所述方法还包括：
所述待测试液中的血小板粒子经特定荧光染料染色处理；所述特定荧光染料可以为膜染料、线粒体染料中至少一种；
所述待测试样中的血小板粒子经过所述检测区时，还产生荧光，所述荧光检测器，配置为对所述血小板粒子所产生的荧光进行检测，得到第三检测结果，以结合所述第一检测结果及所述第三检测结果识别所述血小板粒子。
在一实施例中，所述血细胞分析仪还包括第二检测器及荧光检测器；相应的，所述方法还包括：
所述待测试液中的血小板粒子经荧光染色处理；
所述待测试液中的血小板粒子经过所述检测区时，还产生荧光，
所述第二检测器，配置为对与所述激光光束的传播方向所呈角度处于设定的角度范围内的散射光进行光强检测，得到第二检测结果；其中，所述设定的角度范围可以为60°120°。
所述荧光检测器，配置为对所述血小板粒子所产生的荧光进行检测，得到第三检测结果；
结合所述第一检测结果、所述第二检测结果及所述第三检测结果识别所述血小板粒子和白细胞计数和分类。
应用本发明上述实施例，能够很好的隔离激光光束在光路中传播时产生的反射光，使得激光器能够稳定输出激光光束，进而避免反射光进入激光器产生的功率尖峰出现的小脉冲，也避免了当血细胞被测样本为血小板时，出现干扰小脉冲和血小板粒子形成的小脉冲相互混淆的情况，极大的提高了血细胞分析仪的检测精度。
以下通过具体实施例来进一步说明本发明及其优点。
实施例1深度溶血处理检测血小板
按以下配方配制本发明的溶血剂。
Figure BDA0002582370060000191
将20微升新鲜血液样本加入到1mL上述配制好的溶液中，在45℃条件下孵育60秒制备得到待测试样，然后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行测定。收集数据设置增益为500，采集测定角度为90度的侧向散射光获取试样中粒子的侧向散射光强度信息；并收集0度的前向散射光信号。血小板和白细胞的散点分布图如图10所示，从图10可以看出，红细胞碎片、血小板及白细胞的区分度较大，可以非常清晰的对这三团粒子进行区分，可以同时对血小板和白细胞进行有效的分类统计。通过计算划分白细胞和PLT的比例，结合流式细胞仪的进样量，可以计算出该样本的白细胞和PLT的浓度分别为9.8×109/L和166×109/L。
用同样的样本，利用贝克曼粒子计数器Z2测得白细胞的浓度为9.6×109/L；通过人工镜检计数得出PLT的浓度为171×109/L。本发明的方法获得的血小板和白细胞计数与传统方法的测定结果具有较好的一致性。
实施例2对比深度溶血处理和常规溶血处理对血小板的展出情况
按以下配方配制本发明的检测试剂。
Figure BDA0002582370060000192
将20微升新鲜血液样本加入到1mL按上述配方配制的溶液中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行检测。设置激发波长488nm，增益为500，采集0°前向散射光强度和90°侧向散射光强度信息，得到二维细胞散点图如图11中A所示。
作为对比，取同一血样的20微升新鲜血液加入到1mL迈瑞血液分析仪BC-6800配套的LD溶血剂(其中含有常规溶血剂)中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行检测。设置激发波长488nm，增益为500，采集应该是0°前向散射光强度和90°侧向散射光强度信息，得到二维细胞散点图如图11中B所示。
对比图11中的A、B两图可明显看出采用本发明方法中对血样进行深度溶血(A)后可明显将血小板(中部的粒子团)和红细胞的碎片区(左下部的粒子团)分开；而用常规溶血剂处理的样本完全无法区分血影与血小板。
实施例3深度溶血并加入核酸染料通过侧向光散射和荧光信号对血小板和白细胞计数
按以下配方配制本发明的检测试剂。
Figure BDA0002582370060000201
将20微升新鲜血液样本加入到1mL按上述配方配制的溶液中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行检测。设置激发波长488nm，增益为500，采集90度侧向荧光强度和0度的前向散射光强度信息，得到二维细胞散点图如图12A所示。
从图中可以看出，在溶血状态下，加入核酸染料，能够有效的将血小板和RET在荧光方向有效的区分展出。通过划分PLT散点的比例，以及根据流式细胞仪的进样量，可以计算出该样本的PLT浓度为198×109/L。而用人工镜检的方法计算的PLT浓度为202×109/L。本实施例的核酸染色方法能有效的使血小板与红细胞碎片区分。
此外，本实施例的方法对白细胞的分类计数没有影响。另用20微升同一血样进行与上述相同的处理，并在同一流式细胞仪中测定，设置激发波长488nm，增益为100000，采集90度侧向荧光强度信息和90度的侧向散射光强度信息，得到细胞散点分布图，如图12B所示。从图中可以看出，染料在染色PLT的同时，也对白细胞有效染色，并可清晰分群。通过划分WBC散点的比例，结合流式细胞仪的进样量，可以计算出该样本的WBC浓度为7.86×109/L。用传统参考方法结合贝壳曼粒子计数器深度Z2对同一样本测量的WBC浓度为8.01×109/L。两种方法间具有较好的一致性。
通过划分图12B中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞、和嗜酸性粒细胞，获得其比例分别为21.2％、3.5％、74.8％和0.5％。在迈瑞6800型血细胞分析上对该样本进行测试后，获得淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞、和嗜酸性粒细胞的比例分别为20.8％、3.2％、75.1％和0.9％。从上述结果可以看出，本发明方法对白细胞进行划分与市售血细胞分析仪获得的比例具有较好的相关性。
实施例4深度溶血并加入核酸染料通过光散射和荧光信号对血小板、网织红细胞和白细胞计数
按以下配方配制本发明的检测试剂。
Figure BDA0002582370060000202
荧光染料结构式：
Figure BDA0002582370060000211
将20微升新鲜血液样本加入到1mL按上述配方配制的溶液中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行检测。设置激发波长633nm，增益为500，采集90度侧向荧光强度信息和0度的前向散射光强度信息，得到二维细胞散点图如图13A所示。
如图所示，RET和PLT分别通过荧光和前向散射光信号可以清晰地区分出来。通过划分PLT及RET散点的比例，结合流式细胞仪的进样量，可以计算出该样本的PLT浓度为165×109/L，RET的浓度为18.8×109/L。用传统的人工镜检测得PLT的数值为175×109/L，RET的浓度为20.1×109/L。说明本发明的方法能有效的区分和计数血样中的PLT和RET。
另用20微升同一血样进行与上述相同的处理，并在同一流式细胞仪中测定，设置激发波长633nm，增益为100000，采集90度侧向荧光强度信息和90度的侧向散射光强度信息，得到细胞散点分布图，如图13B所示。
参见图13B白细胞可以清晰地划分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞、和嗜酸性粒细胞四类。通过划分WBC散点的比例，结合流式细胞仪的进样量，可以计算出该样本的WBC浓度为8.32×109/L。用传统参考方法结合贝壳曼粒子计数器Z2对同一样本测量的WBC浓度为8.45×109/L。可见，两种方法间具有较好的一致性。
通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和幼稚粒细胞，获得其比例分别为15.1％、6.1％、75.5％、2.3％和1.0％。在迈瑞6800型血细胞分析上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和幼稚粒细胞的比例分别为14.8％、5.7％、76.2％、1.9％和1.4％。从上述结果可以看出，本发明方法对白细胞进行划分与市售血细胞分析仪获得的比例具有较好的相关性。
实施例5深度溶血并加入核酸染料通过光散射和荧光信号检测血小板和白细胞
按以下配方配制本发明的检测试剂。
Figure BDA0002582370060000212
荧光染料结构式：
Figure BDA0002582370060000213
将20微升新鲜血液样本加入到1mL按上述配方配制的溶液中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行检测。设置激发波长633nm，增益为500，采集90度侧向荧光强度信息和0度的前向散射光强度信息，得到二维细胞散点图如图14A所示。
如图所示，RET和PLT分别通过荧光信号和前向散射光信号可以清晰地区分出来。通过划分PLT及RET散点的比例，结合流式细胞仪的进样量，可以计算出该样本的PLT浓度为189×109/L，RET的浓度为101×109/L。用传统人工镜检测得PLT的数值为201×109/L，RET的浓度为112×109/L。说明本发明的方法能有效的区分和计数血样中的PLT和RET。
另用20微升同一血样进行与上述相同的处理，并在同一流式细胞仪中测定，设置激发波长633nm，增益为100000，采集90度侧向荧光强度信息和90度的侧向散射光强度信息，得到细胞散点分布图，如图14B所示。
白细胞可以清晰划分为淋巴细胞，单核细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞、和嗜酸性粒细胞四类。通过划分WBC散点的比例，结合流式细胞仪的进样量，可以计算出该样本的WBC浓度为6.54×109/L。用传统参考方法结合贝壳曼粒子计数器Z2对同一样本测量的WBC浓度为6.32×109/L。可见，两种方法间具有较好的一致性。
通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞，和嗜酸性粒细胞的比例分别为19.8％、3.2％、75.8％和1.2％。在迈瑞6800型血细胞分析上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞、和嗜酸性粒细胞的比例分别为20.3％、2.9％、75.1％和1.7％，从从上述结果可以看出，本发明方法对白细胞进行划分与市售血细胞分析仪获得的比例具有较好的相关性。
实施例6深度溶血并加入膜染料通过光散射和荧光信号检测血小板和白细胞
按以下配方配制本发明的检测试剂。
Figure BDA0002582370060000221
将20微升新鲜血液样本加入到1mL按上述配方配制的溶液中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行检测。设置激发波长488nm，增益为500，采集90度侧向荧光强度信息和0度的前向散射光强度信息，得到二维细胞散点图如图15所示。
由图15A可见两个深色粒子团(下部及右侧)均为被裂解的红细胞碎片，中间的粒子团为血小板，说明该方法同样能够明显地将血小板和红细胞的碎片区分开。
另用20微升同一血样进行与上述相同的处理，并在同一流式细胞仪中测定，设置激发波长633nm，增益为100000，采集90度侧向荧光强度信息和90度的侧向散射光强度信息，得到细胞散点分布图。
如图15B所示，通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞+嗜酸性粒细胞的比例分别为16.4％、6.1％、77.5％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的比例分别为16％、5.8％、78.2％、1.9％。从上述结果可以看出，本发明方法对白细胞进行划分与市售血细胞分析仪获得的比例具有较好的相关性。
实施例7深度溶血并加入线粒体染料通过光散射和荧光信号检测血小板和白细胞
按以下配方配制本发明的检测试剂。
Figure BDA0002582370060000222
将20微升新鲜血液样本加入到1mL按上述配方配制的溶液中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行检测。设置激发波长633nm，增益为500，采集90度侧向荧光强度信息和90度的侧向散射光强度信息，得到二维细胞散点图如图16所示。
由图16可见两个粒子团，其中右侧为被裂解的红细胞碎片，左侧为血小板，说明该方法同样能够明显地将血小板和红细胞的碎片区分开。
实施例8深度溶血并加入膜染料和核酸染料通过光散射和荧光信号检测血小板和网织红细胞
按以下配方配制本发明的检测试剂。
Figure BDA0002582370060000231
将20微升新鲜血液样本加入到1mL按上述配方配制的溶液中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行检测。设置激发波长488nm，增益为500，采集90度侧向荧光强度信息和0度的前向散射光强度信息，得到二维细胞散点图如图17所示。
如图17A所示，两个深色粒子团均为被裂解的红细胞碎片，中间的粒子团为血小板，说明该方法能够更加明显地将血小板和红细胞的碎片区分开；最右侧的粒子团识别为网织红细胞，因而该方法能够进一步获得网织红细胞的信息。
另用20微升同一血样进行与上述相同的处理，并在同一流式细胞仪中测定，设置激发波长633nm，增益为100000，采集90度侧向荧光强度信息和90度的侧向散射光强度信息，得到细胞散点分布图。
如图17B所示，通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞+嗜酸性粒细胞的比例分别为16.8％、6.4％、76.8％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的比例分别为16％、5.8％、78.2％、1.9％。从上述结果可以看出，本发明方法对白细胞进行划分与市售血细胞分析仪获得的比例具有较好的相关性。
实施例9测试PLT及RET相关性
按以下配方配制本发明的检测试剂。
Figure BDA0002582370060000232
荧光染料结构式：
Figure BDA0002582370060000233
选取12支新鲜血液样本，每支样本分别取20微升加入到1mL上述溶液中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6，激发波长633nm，设置增益为500)收集数据。采集90度侧向荧光强度信息和0度的前向散射光强度信息。RET和PLT分别通过荧光信号和前向散射光信号可以区分出来。通过划分PLT及RET散点的比例，以及流式细胞仪的进样量，可以计算出对应样本的PLT浓度和RET的浓度。接着将同样的12支样本放置于迈瑞6800型血细胞分析仪中测试，记录仪器给出的PLT及RET浓度。根据检测数据，分别作出针对RET浓度和PLT浓度用本发明的方法在流式细胞仪上的检测结果与按常规方法在迈瑞6800型血细胞分析仪上的检测结果的相关性图，如图18A和B所示：
从图中可以看出，与迈瑞6800型血细胞分析仪的测试结果相比，采用核酸染料在深度溶血状态下，能够对PLT及RET进行区分染色，并能够对相关粒子进行计数，两种方法的测试结果具有很好的相关性。
实施例10使用染料Alexa Fluor 488分析血样
试剂配制：
第一试剂
Figure BDA0002582370060000241
第二试剂
染料Alexa Fluor 488 30mg
乙二醇 950ml
甲醇 50ml
将20微升的新鲜血加入到1mL的上述第一试剂溶液中，并加入20微升的第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长488nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息，细胞散点分布如图19所示。
从图19A中可以看出，在使用膜染料Alexa Fluor 488时，不仅能够将血小板(圈中)与血影有效区分开，同时，该染料对白细胞的染色效果也较好，能够实现对白细胞的分类计数。通过进样量体积以及血小板的测试粒子数，计算出样本的血小板值为216×109/L，而通过经典人工镜检的计数方法测量值同样为216×109/L。
根据图19B，使用相同的方法对白细胞进行计数，所得结果为8.86×109/L，而通过贝克曼粒子计数器Z2测试数值为8.81×109/L，两者具有较好的一致性。通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的比例分别为17.8％、4.8％、75.8和1.6％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的比例分别为18.1％、5.1％、74.8％和2.0％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例11使用染料DiD分析血样
试剂配制：
第一试剂
Figure BDA0002582370060000242
第二试剂
染料DiD 30mg
乙二醇 950ml
甲醇 50ml
将20微升的新鲜血加入到1mL的上述第一试剂溶液中，并加入20微升第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长633nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息，细胞散点分布如图20所示。
从图20A中可以看出，染料染色后，能够有效地的将血小板和血影区分，通过对其散点数进行划分，进而计算出血小板的浓度为158×109/L，而通过经典人工镜检的计数方法测量值为160×109/L，因此，染料能够对血小板粒子在溶血状态下进行有效的区分并计数。
根据图20B，使用相同的方法对白细胞进行计数，所得结果为4.35×109/L，而通过参考方法结合贝克曼粒子计数器Z2的测量值为4.28×109/L，两者具有较好的一致性。通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的比例分别为14.8％、6.8％、74.5％和3.9％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的比例分别为15.9％、7.2％、72.2％和4.7％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例12使用染料罗丹明123分析血样
试剂配制：
Figure BDA0002582370060000251
第二试剂
染料罗丹明123 30mg
乙二醇 950ml
甲醇 50ml
将20微升的新鲜血加入到1mL的上述第一试剂溶液中，并加入20微升第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长488nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息，细胞散点分布如图21A所示。
从图21A中可以看出，染料罗丹明123染色后，能够有效地的将血小板和血影区分，通过对其散点数进行划分，进而计算出血小板的浓度为208×109/L，而通过经典人工镜检的计数方法测量值为201×109/L，因此，染料罗丹明123能够对血小板粒子在溶血状态下进行有效的区分并计数。
根据图21B，使用相同的方法对白细胞进行计数，所得结果为4.02×109/L，而通过参考方法结合贝克曼粒子计数器Z2的测量值为3.98×109/L，两者具有较好的一致性。通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的比例分别为15.9％、7.1％、71.5％和5.5％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的比例分别为15.9％、6.8％、72.2％和5.1％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例13使用染料Mitotracker Deep Red分析血样
试剂配制：
第一试剂
Figure BDA0002582370060000252
Figure BDA0002582370060000261
第二试剂
染料Mitotracker Deep Red 30mg
乙二醇 950ml
甲醇 50ml
将20微升的新鲜血加入到1mL的上述第一试剂溶液中，并加入20微升的第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长633nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息，细胞散点分布如图22所示。
从图22A中可以看出，在使用Mitotracker Deep Red时，能够将血小板(图中虚线范围)与血影区分开，其中，浅色散点表示为血小板，通过对其散点数进行划分，进而计算出PLT的浓度为165×109/L，而通过经典人工镜检计数的方法对其进行计数，其浓度为201×109/L，可以看出染料Mitotracker Deep Red也能将血小板区分出来。
根据图22B，使用相同的方法对白细胞进行计数，所得结果为5.12×109/L，而通过参考方法结合贝克曼粒子计数器Z2的测量值为5.08×109/L，两者具有较好的一致性。通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的比例分别为14.8％、7.8％、74.5％和2.9％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的比例分别为15.9％、7.2％、73.2％和3.7％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例14使用染料Mitotracker Red分析血样
试剂配制：
第一试剂
Figure BDA0002582370060000262
第二试剂
染料Mitotracker Red 30mg
乙二醇 950ml
甲醇 50ml
将20微升的新鲜血加入到1mL的上述第一试剂溶液中，并加入20微升的第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长488nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息，细胞散点分布如图23所示。
从图23A可以看出，在使用染料Mitotracker Red时，不仅能够较为有效的将血小板(图中虚线范围)和血影区分，同时从图23B可以看出在该染料对白细胞的染色性能上，也能够有效的对白细胞进行分类，从而实现了在检测白细胞的同时，对血小板进行了有效的分类计数。通过进样量体积以及血小板的测试粒子数，计算出样本的血小板值为176×109/L，而通过经典人工镜检的计数方法测量值为172×109/L，两者具有较好的一致性。
根据图23B，使用相同的方法对白细胞进行计数，所得结果为7.65×109/L，而通过参考方法结合贝克曼粒子计数器Z2的测量值为7.73×109/L，两者具有较好的一致性。通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞和幼稚粒细胞的比例分别为13.7％、6.1％、77.5％、0.7％和2.0％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和幼稚粒细胞的比例分别为14.1％、5.8％、76.2％、1.9％和2.0％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例15以实施例10为例验证血小板测试的相关性
试剂配制：同实施例10。
取将20支新鲜血样本，每支血样的测试方法如下：取20微升血样加入到上述配置第一试剂溶液1mL中，并加入20微升第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长488nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息。通过划分出血小板的散点，结合流式细胞仪中的进样量，计算出血样的血小板浓度，测试完毕后，将血样在迈瑞6800仪器上进行测试，记下其血小板的测试值，用两种测试方法所得的结果作出相关性曲线：
从图24中可以看出，使用膜染料Alexa Fluor 488在测试血小板时，其测试数值与迈瑞6800仪器测试值具有较好的一致性，在100×109/L～250×109/L的数值范围内，相关系数为0.9817。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (54)

1.一种血液检测方法，所述方法包括：
用第一试剂处理血液样本以获得待测试样，所述第一试剂包括溶血剂，所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片；
使待测试样中的粒子逐个通过光学检测系统的检测区，获取所述待测试样的光学信息；和
根据所述光学信息中的至少两种获得血小板的光学信息以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，所述光学信息为光强度。
2.根据权利要求1所述血液检测方法，其中所述至少两种光学信息为前向散射光强度和侧向散射光强度。
3.根据权利要求2所述血液检测方法，所述方法进一步包括根据前向散射光强度和侧向散射光强度的光学信息获得白细胞的光学信息。
4.根据权利要求3所述血液检测方法，其中根据所获得的白细胞光学信息区分白细胞亚群以获得白细胞的至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的亚群。
5.根据权利要求1所述血液检测方法，其中所述溶血剂为选自烷基糖苷、三萜皂苷、甾族皂苷中的至少一种。
6.根据权利要求5所述血液检测方法，其中所述烷基糖苷选自具有通式I的糖苷类化合物：
R-(CH2)n-CH3 (I)
其中，R选自由单糖、去氧单糖和多糖所组成的组，n为5～17的整数。
7.根据权利要求1所述的血液检测方法，其中所述第一试剂进一步包括：
具有通式II的非离子型表面活性剂：
R1-R2-(CH2CH2O)m-H (II)
其中，R1为C8-C23的烷基，R2为-O-、
Figure FDA0003229269050000011
或-COO-，m为10～50的整数。
8.根据权利要求7所述的血液检测方法，其中所述第一试剂进一步包括：至少一种有机酸或其盐，其中所述有机酸或其盐选自由具有至少一个羧基或磺酸基的有机酸及其碱金属的盐所组成的组中。
9.根据权利要求1所述的血液检测方法，所述方法进一步包括用第二试剂处理所述血液样本，所述第二试剂包括荧光染料。
10.根据权利要求9所述的血液检测方法，其中使待测试样中的粒子逐个通过光学检测系统的检测区，获取所述待测试样的光学信息进一步包括荧光信息，并且根据侧向散射光强度和荧光强度信息区分白细胞亚群以获得白细胞的至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的亚群和/或识别幼稚粒细胞。
11.根据权利要求9或10所述的血液检测方法，其中所述荧光染料包括选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种第一荧光染料。
12.根据权利要求11所述的血液检测方法，其中所述膜特异性染料选自DiA、DiD、DiI、DiO、DiR、DiS、FDA、Alexa Fluor 488、Super Fluor 488及以它们为母体的变形结构所组成的组，以及所述线粒体特异性染料选自Janus Green B、MitoLite Red、罗丹明123和Mitotracker系列及以它们的母体所组成的组。
13.根据权利要求11所述的血液检测方法，其中根据荧光强度和前向散射光强度信息识别血小板。
14.根据权利要求12所述的血液检测方法，其中根据荧光强度和前向散射光强度信息识别血小板。
15.根据权利要求11所述的血液检测方法，其中所述方法进一步包括：当根据前向散射光强度和荧光强度构成的散点图的预设区域中的粒子数超过预定阈值时报警网织红细胞。
16.根据权利要求12所述的血液检测方法，其中所述方法进一步包括：当根据前向散射光强度和荧光强度构成的散点图的预设区域中的粒子数超过预定阈值时报警网织红细胞。
17.根据权利要求9或10所述的血液检测方法，其中所述荧光染料包括选自核酸特异性染料中的一种的第二荧光染料。
18.根据权利要求17所述的血液检测方法，其中所述核酸特异性染料为对网织红细胞的核酸特异性染料。
19.根据权利要求17所述的血液检测方法，其中所述方法进一步包括：根据荧光强度和散射光强度信息识别网织红细胞。
20.根据权利要求19所述的血液检测方法，其中根据荧光强度和前向散射光强度信息区分血小板和网织红细胞。
21.根据权利要求19所述的血液检测方法，其中所述方法进一步包括：根据荧光强度和前向散射光强度信息对网织红细胞进行计数。
22.根据权利要求9或10所述的血液检测方法，其中所述荧光染料包括选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种的第一荧光染料和选自核酸特异性染料中的一种的第二荧光染料。
23.根据权利要求22所述的血液检测方法，其中所述方法进一步包括：根据荧光强度和侧向散射光强度信息区分血小板和网织红细胞。
24.根据权利要求1所述的血液检测方法，其中所述方法进一步包括：根据所获得血小板的光学信息对血小板计数。
25.根据权利要求1所述的血液检测方法，其中所述光学检测系统，包括：光学子系统、流动室、第一检测器；
所述光学子系统包括：激光器、前光组件及后光组件，所述前光组件包括光隔离器；其中，
所述激光器，配置为发射激光光束；
所述前光组件，配置为对所述激光光束进行前光处理，经所述前光处理的激光光束在第一方向上汇聚于所述流动室的血细胞被测样本处并产生散射光；
所述后光组件，沿所述激光光束的传播方向设置于所述流动室之后，配置为对所述散射光进行后光处理，使得经所述后光处理的所述散射光进入所述第一检测器进行光强检测；
所述光隔离器，配置为将反射光与所述激光器隔离；所述反射光为所述激光光束经所述流动室所产生。
26.根据权利要求25所述的血液检测方法，其中所述光隔离器由采用粘合方式相互连接的分光棱镜及偏振态转换组件构成；
所述分光棱镜，配置为反射入射的所述激光光束的S偏振分量，透射入射的所述激光光束的P偏振分量；
所述偏振态转换组件，配置为改变经所述分光棱镜透射的所述P偏振分量的偏振态，使所述P偏振分量从线偏振光变成圆偏振光，并改变所述圆偏振光反射后的偏振态为S偏振光而被所述分光棱镜反射。
27.如权利要求25所述的血液检测方法，其中所述光隔离器由采用粘合方式相互连接的检偏器及偏振态转换组件组成；
所述检偏器，配置为仅允许所述激光光束的P偏振分量通过；
所述偏振态转换组件，配置为改变经所述检偏器的所述P偏振分量的偏振态，使所述P偏振分量从线偏振光变成圆偏振光，并改变所述圆偏振光的反射光偏振态为S偏振光而被所述检偏器隔离。
28.如权利要求25所述的血液检测方法，所述光隔离器由采用粘合方式相互连接的带通滤光片及倍频晶体组成；
所述带通滤光片，配置为使波长为λ的所述激光光束通过；
所述倍频晶体，配置为对经所述带通滤光片的激光光束进行倍频，并对所述倍频后的激光光束的反射光再次进行倍频，而被所述带通滤光片滤除。
29.如权利要求25所述的血液检测方法，其中所述前光组件还包括准直透镜；
所述准直透镜，沿所述激光光束的传播方向设置于所述激光器与所述光隔离器之间，配置为对所述激光光束进行准直处理，使所述激光光束成为平行光束。
30.如权利要求25所述的血液检测方法，其中所述后光组件还包括挡直光阑；
所述前光组件，还配置为对所述激光光束进行前光处理，使得经所述前光处理的激光光束在第二方向上汇聚于所述挡直光阑处。
31.如权利要求25所述的血液检测方法，其中所述前光组件还包括第一光汇聚组件及第二光汇聚组件；
所述第一光汇聚组件，配置为对所述激光光束进行第一聚焦，使所述激光光束在第一方向上汇聚于所述流动室的血细胞被测样本处并产生散射光；
所述第二光汇聚组件，配置为对所述激光光束进行第二聚焦，使所述激光光束在第二方向上汇聚于所述后光组件包括的挡直光阑处。
32.如权利要求25所述的血液检测方法，其中所述后光组件还包括第三汇聚组件及小孔光阑；
所述第三汇聚组件，配置为对所述散射光进行第三聚焦，使所述散射光汇聚于所述小孔光阑处，并经所述小孔光阑的小孔进入所述第一检测器。
33.一种血液检测方法，所述方法包括：
用第一试剂处理血液样本以获得待测试样，所述第一试剂包括溶血剂，所述溶血剂裂解所述血液样本中的红细胞；
使待测试样中的粒子逐个通过光学检测系统的检测区，获取所述待测试样的光学信息；和
根据所述光学信息中的至少两种光学信息获得血小板的光学信息以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，其中所述至少两种光学信息包括前向散射光信息。
34.根据权利要求33所述的血液检测方法，其中所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片。
35.根据权利要求34所述的血液检测方法，其中所述方法根据前向散射光强度和侧向散射光强度对血小板计数。
36.根据权利要求34或35所述的血液检测方法，其中所述方法进一步根据前向散射光强度和侧向散射光强度将白细胞区分为至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的亚群。
37.根据权利要求33所述的血液检测方法，所述方法进一步包括：用第二试剂对血液样本进行处理其中所述第二试剂包含选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种荧光染料，或者包含选自核酸特异性染料中的一种荧光染料，以进一步获得荧光信号，根据散射光强度和荧光强度信息区分血小板和网织红细胞。
38.根据权利要求37所述的血液检测方法，其中所述方法进一步包括：根据荧光强度和侧向散射光强度信息区分白细胞亚群以获得白细胞的至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的亚群和/或识别幼稚粒细胞。
39.根据权利要求37所述的血液检测方法，其中根据荧光强度和前向散射光强度信息全区分血小板。
40.根据权利要求37所述的血液检测方法，其中所述方法进一步包括：当根据前向散射光强度和荧光强度构成的散点图的预设区域中的粒子数超过预定阈值时报警网织红细胞。
41.根据权利要求33所述的血液检测方法，其中，所述方法进一步包括：用第二试剂对血液样本进行处理，其中所述第二试剂包含选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种荧光染料，和选自核酸特异性染料中的一种荧光染料，获得荧光信号，根据散射光强度和荧光强度信息区分血小板和网织红细胞。
42.根据权利要求41所述的血液检测方法，其中所述方法进一步包括：根据荧光强度和前向散射光强度信息区分血小板和网织红细胞。
43.根据权利要求42所述的血液检测方法，其中所述方法进一步包括：根据荧光强度和前向散射光强度信息对网织红细胞计数。
44.根据权利要求37或41所述的血液检测方法，其中所述膜特异性染料选自DiA、DiD、DiI、DiO、DiR、DiS、FDA、Alexa Fluor 488、Super Fluor 488及以它们为母体的变形结构所组成的组，以及所述线粒体特异性染料选自Janus Green B、MitoLite Red、罗丹明123和Mitotracker系列及以它们的母体所组成的组。
45.根据权利要求41所述的血液检测方法，其中所述核酸特异性染料为对网织红细胞的核酸特异性染料。
46.根据权利要求33所述的血液检测方法，其中所述光学检测系统，包括：光学子系统、流动室、第一检测器；
所述光学子系统包括：激光器、前光组件及后光组件，所述前光组件包括光隔离器；其中，
所述激光器，配置为发射激光光束；
所述前光组件，配置为对所述激光光束进行前光处理，经所述前光处理的激光光束在第一方向上汇聚于所述流动室的血细胞被测样本处并产生散射光；
所述后光组件，沿所述激光光束的传播方向设置于所述流动室之后，配置为对所述散射光进行后光处理，使得经所述后光处理的所述散射光进入所述第一检测器进行光强检测；
所述光隔离器，配置为将反射光与所述激光器隔离；所述反射光为所述激光光束经所述流动室所产生。
47.根据权利要求46所述的血液检测方法，其中所述光隔离器由采用粘合方式相互连接的分光棱镜及偏振态转换组件构成；
所述分光棱镜，配置为反射入射的所述激光光束的S偏振分量，透射入射的所述激光光束的P偏振分量；
所述偏振态转换组件，配置为改变经所述分光棱镜透射的所述P偏振分量的偏振态，使所述P偏振分量从线偏振光变成圆偏振光，并改变所述圆偏振光反射后的偏振态为S偏振光而被所述分光棱镜反射；或者
其中所述光隔离器由采用粘合方式相互连接的检偏器及偏振态转换组件组成；
所述检偏器，配置为仅允许所述激光光束的P偏振分量通过；
所述偏振态转换组件，配置为改变经所述检偏器的所述P偏振分量的偏振态，使所述P偏振分量从线偏振光变成圆偏振光，并改变所述圆偏振光的反射光偏振态为S偏振光而被所述检偏器隔离。
48.如权利要求33所述的血液检测方法，所述两种光学信息为前向散射光强度信息和侧向散射光强度信息，根据所述前向散射光强度信息和侧向散射光强度信息对血小板进行计数和/或将白细胞至少区分为单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞亚群。
49.一种血液分析系统，包括采样部、试剂供应部、反应部、光学检测系统和数据处理模块，其中：
采样部，用于获取血液样本，并将所述血液样本输送到所述反应部；
试剂供应部，用于贮存至少第一试剂并根据需要供应到所述反应部；
反应部，包括混合室，用于将所述血液样本与第一试剂混合以形成待测试样，其中所述第一试剂包括溶血剂，所述溶血剂裂解所述血液样本中的红细胞；
光学检测系统，包括流动室和至少第一检测器，用于当所述待测试样由所述混合室被输送到所述光学系统并使所述待测试样中的粒子逐个通过流动室到达检测区时，所述第一检测器对待测试样中的粒子进行检测以获得所述待测试样中的光学信息；和
数据处理模块，其与所述光学系统可操作地连接，并包括处理器和存储有计算机程序的非暂时性计算机可读存储介质，其中当所述计算机程序被所述处理器执行时，执行以下步骤：根据所述光学信息中的至少两种光学信息获得血小板的光学信息以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，其中所述至少两种光学信息包括前向散射光强度。
50.根据权利要求49所述的血液分析系统，其中所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片，且其中所述处理模块中，当所述计算机程序被所述处理器执行时，进一步执行以下步骤：
根据所获得的光学信息中的前向散射光强度和侧向散射光强度对血小板计数；和/或
根据前向散射光强度和侧向散射光强度将白细胞至少区分为单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞亚群。
51.根据权利要求49所述的血液分析系统，其中，
所述混合室用于所述血液样本与第二试剂混合以形成待测试样，其中所述第二试剂包含选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种荧光染料；
所述光学检测系统包括第二检测器，所述第二检测器为荧光检测器，以便当所述待测试样中的粒子逐个通过检测区时进一步获得荧光信号；和
所述数据处理模块中，当所述计算机程序被所述处理器执行时，进一步执行以下步骤：
根据荧光强度和侧向散射光强度信息区分白细胞亚群以获得白细胞的至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的亚群和/或识别幼稚粒细胞；
根据荧光强度和前向散射光强度信息全区分血小板；和/或
当根据前向散射光强度和荧光强度信息构成的散点图的预设区域中的粒子数超过预定阈值时报警网织红细胞。
52.根据权利要求51所述的血液分析系统，其中所述第二试剂进一步包含选自核酸特异性染料中的一种荧光染料，和当所述计算机程序被所述处理器执行时，进一步执行以下步骤：根据荧光强度和散射光强度信息区分血小板和网织红细胞。
53.根据权利要求52所述的血液分析系统，其中当所述计算机程序被所述处理器执行时，进一步执行以下步骤：对网织红细胞计数。
54.根据权利要求49所述的血液分析系统，其中所述光学检测系统，进一步包括：光学子系统，
所述光学子系统包括：激光器、前光组件及后光组件，所述前光组件包括光隔离器；其中，
所述激光器，配置为发射激光光束；
所述前光组件，配置为对所述激光光束进行前光处理，经所述前光处理的激光光束在第一方向上汇聚于所述流动室的血细胞被测样本处并产生散射光；
所述后光组件，沿所述激光光束的传播方向设置于所述流动室之后，配置为对所述散射光进行后光处理，使得经所述后光处理的所述散射光进入所述第一检测器进行光强检测；
所述光隔离器，配置为将反射光与所述激光器隔离；所述反射光为所述激光光束经所述流动室所产生。
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