CN111656188B - 试剂、分析血小板的方法及血液细胞分析仪 - Google Patents

试剂、分析血小板的方法及血液细胞分析仪 Download PDF

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Abstract

一种试剂、使用该试剂在溶血条件下区分血小板的方法及血液细胞分析仪。该试剂包括：作为溶血剂的第一试剂；以及第二试剂，该第二试剂为膜特异性染料或线粒体特异性染料。使用该试剂、方法及分析仪可以在溶血条件实现对血小板的区分和网织红细胞报警，进一步的可以对白细胞进行分类计数，从而能够快速准确地在单一通道内对血样进行分析。

Description

试剂、分析血小板的方法及血液细胞分析仪
技术领域
本发明涉及分析血小板的方法，特别涉及用染料分析血小板的方法。
背景技术
人血液中含有红细胞、白细胞、血小板等各种细胞，其中血小板是直径为2～3微米的无核细胞，正常人的血液中含有15万至35万个/微升血小板。
众所周知，血小板的常用测定方法之一是电阻抗法。该方法是使含血细胞的样本从具有两个电极的小孔间通过，当有血细胞(例如血小板)通过时，电阻发生变化，从而产生电阻脉冲，然后将检测到的脉冲绘制成直方图进行分析。正常的血液中，血小板的体积最小，白细胞体积最大，红细胞体积居中。检测到的脉冲强度与经过小孔的细胞体积相关，因而通过体积划分，就能够区分不同细胞种类。然而，在测试有些特殊样本时(如含有体积较大的血小板和体积较小的红细胞的样本)会影响血小板的检测准确性和精确度。这些特殊样本通常来自患有疾病的受试者，因而检测值的偏差会给临床诊断带来不利影响。
针对这种情况，已提出了用对血小板的表面抗原有特异性的标记抗体对血小板进行标记并计数的方法(美国临床病理学杂志(2001)：115，p460-464)。该方法，由于在测试过程中需要使用抗原抗体进行反应，因而需要花很长时间才能得到结果。因此，该方法不适用于诸如判断是否需要输血等需紧急作出判断的测定。另外该方法中的检测试剂也相对昂贵。
目前，流式细胞技术已广泛用于迅速地测定血液中的细胞，比如美国专利US6，114，173公开了一种网织红细胞与红细胞测定以及血小板计数的方法，该方法使用了球形化试剂处理血样，并用阳离子染料(恶嗪750)来快速染色网织红细胞的RNA，再用流式细胞仪中测定样品的散射光和吸收光，从而实现网织红细胞、红细胞及血小板的区分。
US 4,882,284公开了一种从红细胞和血小板中识别未溶解的全血中的白细胞的方法，该方法中使用含有吸收红色光的荧光染料(恶嗪170)与未溶解的全血接触，之后使用流式细胞仪从红细胞和血小板中区分白细胞并分类。
US 5,891,731公开了一种用于测定网织红细胞的试剂其方法，该试剂具有至少一种特异性染色网织红细胞的染料(恶嗪750)和至少另一种特异性染色白细胞的染料，经处理后可明显区分网织红细胞群体及白细胞群体。
上述文献虽然均使用了染料对血细胞进行染色对来分析血样，但一方面，它们均是在非溶血的情况下进行的；另一方面，它们都不涉及使用染料来对血小板进行染色的方式来对血小板进行区分。
对此，SYSMEX公司的中国专利申请公开CN 101173921A中公开了一种特异性染色剂，能够在荧光方向从其他血细胞和脂质颗粒等杂质中区分出血小板。然而，这种方法在区分血小板时需要在单独的测试通道中进行，使得仪器复杂化程度增加，由此将不可避免地导致成本上升；另外，与前述文献相同，该方法同样是在非溶血的条件下进行的，并未提及在溶血条件下对血小板进行检测。
实际上，在传统的血液分析系统中，对白细胞的分类计数意义尤为重要，而在检测白细胞时一般需要将红细胞破碎溶解(即在溶血条件下)，但由此产生大量细胞碎片等杂质增大了血小板的测定难度。因此，目前血小板的测定通常在非溶血的条件下于单独通道内进行。
由上述内容可知，在环境更加恶劣且难度更大的溶血条件下检测血小板具有较大的临床意义。若能在溶血条件下快速、准确检测血小板，就可以将阻抗通道检测血小板容易受小红细胞影响的因素消除，同时还能在实现对白细胞进行分类计数，从而有利于实现单一通道内完成血液中各成分的分析。
因此，在血液检测领域中，存在着在溶血条件下快速、便捷地检测血小板的迫切需要。
发明内容
针对以上情况，本发明的一个目的是提供一种能够在溶血条件下对血小板进行检测的试剂及分析方法。
本发明的进一步目的是提供一种能够在溶血条件下对血小板进行检测，同时可以对网织红细胞提供报警的试剂及分析方法。
本发明的更进一步目的是提供一种在单个通道内可以同时对血小板和白细胞进行有效检测并提供对网织红细胞报警的试剂及分析方法。
本发明再进一步的目的是提供一种在单个通道内同时对血小板、白细胞和/或网织红细胞进行有效检测的试剂及分析方法。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供一种试剂，所述试剂包括：
作为溶血剂的第一试剂；以及
第二试剂，所述第二试剂为膜特异性染料或线粒体特异性染料。
在一个优选的实施方式中，所述膜特异性染料选自DiA、DiD、DiI、DiO、DiR、DiS、FDA、Alexa Fluor 488和Super Fluor 488。
根据另一种优选的实施方式，所述线粒体特异性染料选自Janus Green B、MitoLite Red、罗丹明123和Mitotracker系列。
在更优选的实施方式中，所述线粒体特异性染料为罗丹明123、Mitotracker DeepRed或Mitotracker Red。
在本发明中Mitotracker系列染料可包括Mitotracker Green、Mitotracker DeepRed和Mitotracker Red等。
在某些实施方式中，本发明的第二试剂进一步包括以上述染料为母体的变形结构。
根据再一优选的实施方式，本发明的试剂进一步包括作为核酸染料的第三试剂。
根据一些的实施方式，所述第一试剂可包括选自烷基糖苷、三萜皂苷、甾族皂苷中的至少一种溶血剂。
优选的，所述烷基糖苷选自具有通式I的糖苷类化合物：
R-(CH2)n-CH3 (I)
其中，R选自由单糖、去氧单糖和多糖所组成的组，n为5～17的整数。
在一些的实施方式中，所述第一试剂进一步包括：
具有通式II的非离子型表面活性剂：
R1-R2-(CH2CH2O)m-H (II)
其中，R1为C8-C23的烷基，R2为-O-、
Figure GPA0000291282450000041
或-COO-，m为10～50的整数；和
可选地，至少一种有机酸或其盐，其中所述有机酸或其盐选自由具有至少一个羧基或磺酸基的有机酸及其碱金属的盐所组成的组中。
在第二方面，本发明提供了一种分析血样的方法，包括：
获得经第一试剂和第二试剂处理后血样；
获取所述血样的光学信息；
根据所述光学信息来区分血小板和/或对血小板进行计数；
其中，所述第一试剂为溶血剂，第二试剂为膜特异性染料或线粒体特异性染料。
在一个优选的实施方式中，所述膜特异性染料选自DiA、DiD、DiI、DiO、DiR、DiS、FDA、Alexa Fluor 488和Super Fluor 488。
根据另一种优选的实施方式，所述线粒体特异性染料选自Janus Green B、MitoLite Red、罗丹明123和Mitotracker系列。
在本发明中，Mitotracker系列染料可包括Mitotracker Green、MitotrackerDeep Red和Mitotracker Red等。
在本发明中，溶血剂可将血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片。
在优选的实施方式中，所述溶血剂可选自烷基糖苷、三萜皂苷和甾族皂苷中的至少一种。
在一个实施方式中，所述方法还包括根据所述光学信息来区分白细胞。
在另一个实施方式中，所述方法还包括根据所述光学信息来对白细胞进行分类。
在一个实施方式中，所述方法还包括根据所述光学信息来提供对网织红细胞的报警。
在又一个实施方式中，除第一试剂和第二试剂外，本发明的方法还使用第三试剂处理血样，所述第三试剂为核酸染料。
在一个实施方式中，本发明的方法还包括根据所述光学信息来区分网织红细胞。
在一个实施方式中，所述光学信息为荧光强度和散射光强度信息。
优选的，所述散射光强度信息选自前向散射光强度信息和侧向散射光强度信息的一种或两种。
在另一个实施方式中，所述散射光强度信息为前向散射光强度信息。
在第三方面，本发明提供了一种在溶血条件下在单个通道内分析血样的方法，其特征在于，将膜特异性染料或线粒体特异性染料与血样进行接触。
在一个实施方式中，所述膜特异性染料或线粒体特异性染料对血样中的血小板膜或线粒体进行了染色，从而将血小板与血影区分开来。
在第四方面，本发明提供了一种血液细胞分析仪，包括：
采样模块，包括采样器，所述采样器用于吸取血样；
反应模块，包括混合室和试剂供应部，所述混合室与采样器和试剂供应部流体连接，所述混合室用于将血样与第一试剂和第二试剂混合、溶血并染色以生成将处理后的血样，所述试剂供应部用于将试剂提供至混合室，其中，所述第一试剂为溶血剂，所述第二试剂为膜特异性染料或线粒体特异性染料；
检测模块，包括光源、检测区和至少一个光学检测器，所述光源用将光束对准与所述混合室流体连通的所述检测区，所述检测室被配置为使处理后的血样中的粒子逐个通过，所述至少一个光学检测器被配制用来采集所述检测区中粒子的荧光信号、前向散射光强度信号和任选的侧向散射光强度信号；以及
分析模块，包括处理器和编程有计算机应用程序的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述处理器与所述光学检测器可操作地连接，当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，使所述处理器基于所述荧光信号和前向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图区分血小板和对血小板进行计数。
在一个优选的实施方式中，当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，进一步使得处理器基于所述荧光信号和前向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图对网织红细胞报警。
在一些实施方式中，当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，进一步使得处理器基于所述荧光信号和侧向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图区分白细胞和对白细胞进行计数或者对白细胞进行分类和对白细胞进行分类计数。
在更优选的实施方式中，所述混合室用于将血样与第一试剂、第二试剂和第三试剂混合，所述第三试剂是核酸染料；并且
当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，使所述处理器基于所述荧光信号和前向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图区分网织红细胞和对网织红细胞进行计数。
使用本发明试剂来分析血样时具有以下优势：该过程无需对血小板进行抗体标记，节约了时间及成本；能够有效地将血小板与破碎血细胞和杂质区分开，分析结果准确；在溶血条件下进行血小板分析，为后续在单一通道内进行白细胞分类计数提供基础。
附图说明
图1示出了溶血状态下，染料Alexa Fluor 488对(A)血小板和(B)白细胞的染色及区分效果；
图2示出了溶血状态下，染料DiD对(A)血小板和(B)白细胞的染色及区分效果；
图3示出了溶血状态下，染料罗丹明123对(A)血小板和(B)白细胞的染色及区分效果；
图4示出了溶血状态下，染料Mitotracker Deep Red对(A)血小板和(B)白细胞的染色及区分效果；
图5示出了溶血状态下，染料Mitotracker Red对(A)血小板和(B)白细胞的染色及区分效果；
图6为在深度溶血状态下加入膜染料对血小板和网织红细胞检测得到的荧光-前向散射光的光强度散点图(A)，和白细胞的荧光-侧向散射光的光强度散点图(B)；
图7为在深度溶血状态下加入线粒体染料对血小板和网织红细胞检测得到的荧光-前向散射光的光强度散点图；
图8为在深度溶血状态下加入膜染料和核酸染料对血小板和网织红细胞检测得到的荧光-前向散射光的光强度散点图(A)，和白细胞的荧光-侧向散射光的光强度散点图(B)；
图9示出了本发明的染色法与迈瑞6800仪器上在测试值上的相关性；
图10为本发明实施例提供的血细胞分析仪的组成结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方式进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
如前所述，常规检测血小板的方法中，常规的是采用电阻抗法，然而电阻抗法在检测一些特殊血样时，对血小板的检测不够准确。而使用血小板特异性抗体的方法虽然检测结果相对准确，但检测花费时间很长且价格昂贵，故其适用范围有很大的限制。
为此，中国专利CN 101173921A用光学检测方法结合特定的染色剂在单独的通道中对血小板进行检测，在一定程度上解决了上述问题，但是仍不够理想。这主要是因为该方法是在非溶血的条件下进行的，非溶血条件下不存在因溶血而产生的大量红细胞碎片，所以避免了对血小板的检测造成干扰，使得血小板的检测更易实现。但反过来说，在非溶血条件下进行常规的血细胞分析时，将不可避免地使用到额外的检测通道，这不但消耗了更多样品量，还导致了仪器构造复杂化。
如能在溶血情况下实现对血小板的分析，则将利于实现在单通道内实现对血小板及其他血细胞的区分。为此，本发明人对现有技术中的商业染料进行研究，意外发现使用血小板膜特异性染料或血小板线粒体特异性染料能够实现在溶血条件下区分血小板，从而完成了本发明。采用本发明的染料对溶血条件下的血小板进行分析，可避免特殊样品中诸如易碎红细胞、小红细胞等异常红细胞及杂质对血小板检测的干扰。
进一步地，令人惊奇的是，采用本发明的染料在溶血条件下处理血液样品，不但能够检测血小板，还能实现对白细胞的分类计数(参考以下详述的实施例)，从而在一个溶血通道内使用一种(类)染料就完成血小板分析和白细胞的分类计数，极大的节约了检测时间、简化了操作流程和仪器的复杂度。
更进一步地，一方面，采用本发明的染料对血小板进行染色的同时，还能够展出高荧光网织红细胞，从而提示样品中存在网织红细胞，即使用本发明的染料在展出血小板的同时亦能实现对网织红细胞的报警；另一方面，本发明的染料可以与核酸染料相结合，从而在一个溶血通道内完成血小板分析、网织红细胞分析和白细胞的分类计数。
再进一步地，为了在溶血条件下使血小板更好地与红细胞碎片区分，实现对血小板的准确和精确的检测，可在使用本发明的染料的同时可以对红细胞进行较深程度的裂解，使红细胞的细胞膜破碎成更小的碎片，从而通过光学检测得到的散点图中能够清晰地区分出红细胞碎片区域和血小板区域。
试剂
在第一方面，本发明提供了一种用于分析血样的试剂，所述试剂包括：
作为溶血剂的第一试剂；以及
第二试剂，所述第二试剂为膜特异性染料或线粒体特异性染料。
如本文所使用的，作为第二试剂，“膜特异性染料”是指能够对细胞膜进行特异性染色的荧光染料，从而可从细胞碎片等杂质中识别出血小板的染料；类似地，“线粒体特异性染料”是指能够对细胞线粒体进行特异性染色的荧光染料，从而可从细胞碎片等杂质中识别出血小板的染料。
本发明中的膜特异性染料可以是任何商业化的膜特异性染料，包括但不限于DiA、DiD、DiI、DiO、DiR、DiS、FDA、Alexa Fluor 488和/或Super Fluor 488。
在优选的实施方式中，所述膜特异性染料为Alexa Fluor 488和/或DiD。
本发明中的线粒体特异性染料可以是任何商业化的线粒体染料，包括但不限于Janus Green B、MitoLite Red、罗丹明123和Mitotracker系列。
在优选的实施方式中，所述线粒体特异性染料为Mitotracker Deep Red、罗丹明123或Mitotracker Red。
本发明中的Mitotracker系列包括但不限于Mitotracker Green、MitotrackerDeep Red和Mitotracker Red。
本发明的试剂中，所述第一试剂和所述第二试剂可存在于同一个包装中，也可分别以单独的包装形式存在。
优选的，本发明的第一和第二试剂以单独的包装形式存在，其中，第一试剂可配制为水溶液形式，第二试剂可配制为非水溶液形式。
类似地，在包含第三试剂时，第一、第二和第三试剂可存在于同一个包装中，也可分别以单独的包装形式存在。优选的，本发明的第一、第二和第三试剂以单独的包装形式存在，其中第一试剂可配制为水溶液形式，第二和第三试剂可配制为非水溶液形式。
作为第二试剂的本发明的染料还进一步包括以上述膜特异性染料或线粒体特异性染料为母体的变形结构，这些变形结构具有与母体相似的染色性质。示例性的变形结构包括：以DiD为母体的DiD高氯酸盐和DiD三氟甲磺酸盐；以DiI为母体的DiIC12(3)高氯酸盐、DiIC12(3)三氟甲磺酸盐、DiIC16(3)高氯酸盐、DiIC18(3)-DS、DiIC18(5)-DS、DiIC1(5)碘化物、9-DiI甲磺酸盐、DiI碘化物、DiI高氯酸盐和DiI三氟甲磺酸盐；以DiO为母体的DiOC2(3)碘化物、DiOC3(3)碘化物、DiOC7(3)碘化物、DiOC16(3)高氯酸盐、DiOC5(3)碘化物、DiOC6(3)碘化物、1，1′-双十八醇酯基-5，5′-二苯基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚碳箐盐酸盐和DiO高氯酸盐；以DiR为母体的DiR碘化物；以DiS为母体的DiSC2(3)和DiSC3(5)；但本发明不限于此，以本发明的膜特异性染料或线粒体特异性染料为母体，进行改变的变形结构，只要具有与其母体近似性质、能实现与母体相似效果，均落入本发明的保护范围之内。
本发明中，染料的变形结构包括商业化的变形结构或非商业化的变形结构，根据染料的名称、结构等，本领域技术人员能够从现有技术中确认出以已知染料为母体的变形结构(如商业化变形结构)或衍生结构；同时，能够根据母体结构和/或已存在变形结构来得到非商业化的变形结构或衍生结构，并可以合理预期这些变形结构能实现与其母体类似的染色效果。这些变形结构均落入本发明的保护范围之中。
本发明的第二试剂优选溶解于合适的有机溶剂中，本领域技术人员能够选择合适的溶剂，例如，甲醇、乙醇、乙二醇和甘油等。本发明的第二试剂在溶剂中的浓度约为20～40mg/L，优选约为30mg/L。
如本发明所使用的，作为第一试剂，“溶血剂”是指用来破坏红细胞膜、从而便于对白细胞分类的试剂。
对于溶血剂，本发明没有任何特别地限制，任何本领域已知的溶血剂，只要能达到常规的溶血效果，都可以用于本发明的试剂及方法中。示例性的溶血剂为M-68LD、M-60LD、M-50LEO(I)和M-50LEO(II)(迈瑞公司)；WDF(Sysmex公司)等。但本发明不限于此。
作为示例，本发明的溶血剂也可以是具有较深程度的裂解能力的溶血剂，所述“较深程度的裂解的溶血剂”是指与通常的溶血情况相比，能使红细胞的细胞膜破碎成更小的碎片，从而更利于将血小板与细胞膜碎片区分。例如，中国专利CN200910109215.6中公开的糖苷类化合物，该专利文献的全部内容通过引用并入本申请。
举例来说，可以作为“较深程度的裂解的溶血剂”使用的糖苷类化合物可为烷基糖苷、三萜皂苷、甾族皂苷等等，可以通过加大用量或者选择合适的糖苷类化合物，达到使红细胞的细胞膜裂解成更小的碎片的程度。
一种具体的溶血剂可为具有通式I的糖苷类化合物：
R-(CH2)n-CH3 (I)
其中，R选自由单糖、去氧单糖和多糖所组成的组，n为5～17的整数。
上述糖苷类化合物能够起到快速溶解红细胞的作用。糖苷类化合物是由糖(或多糖)的半缩醛羟基同烷醇的羟基脱水形成的化合物。本发明的溶血剂中糖苷类化合物可以是单一的化合物，也可以是符合上述通式的两种或更多种糖苷类化合物的混合物。
通式(I)中，单糖没有特别限制，常用的可选自五碳糖、甲基五碳糖和六碳糖，但不限于此。五碳糖诸如阿拉伯糖、木糖、核糖、来苏糖等。甲基五碳糖诸如夫糖、鼠李糖、鸡那糖等。六碳糖诸如葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、山梨糖。去氧单糖也没有特别限制，诸如去氧核糖、去氧葡萄糖等，但不限于此。多糖诸如麦芽糖、蔗糖等，但不限于此。n优选为6～14的整数，更优选为7～11的整数。
所述通式I的糖苷类化合物具体可为辛基葡萄糖苷，壬基葡萄糖苷，葵基葡萄糖苷，十二烷基麦芽糖苷，十四烷基麦芽糖苷，十二烷基葡萄糖苷，优选辛基葡萄糖苷，壬基葡萄糖苷，葵基葡萄糖苷，十二烷基麦芽糖苷，更优选葵基葡萄糖苷，十二烷基麦芽糖苷。
所述通式I的糖苷类化合物在本发明的溶血剂中的浓度根据所选糖苷的性质、反应时间、反应温度和其他成分的使用量而有所不同，通常用量为0.025g/L～10g/L范围内，优选0.1g/L～5.0g/L。
该第一实施方式中的第一试剂，优选进一步包括具有通式II的非离子型表面活性剂：
R1-R2-(CH2CH2O)m-H (II)
其中，R1为C8-C23的烷基，R2为-O-、
Figure GPA0000291282450000091
或-COO-，m为10～50的整数；和
可选地，至少一种有机酸或其盐，其中所述有机酸或其盐选自由具有至少一个羧基或磺酸基的有机酸及其碱金属的盐所组成的组中。
通式II的非离子型表面活性剂，在一定程度上能够与白细胞的细胞膜结合，起到保护白细胞和血小板的细胞膜不受前述糖苷类化合物的影响而保持其细胞形态的作用。
根据优选的实施方式，所述通式II的非离子型表面活性剂中，R1为C8-C18的直链烷基。C8-C18的直链烷基具体可为辛基、葵基、月桂基、十四烷基、十六烷基或硬脂基。更优选R1为C12-C16的直链烷基，具体可为月桂基、十四烷基或十六烷基。R2优选为-O-。m为10～50，优选为15～30。
所述通式II的非离子型表面活性剂具体实例可为十六烷醇聚氧乙烯(15)醚、十二烷醇聚氧乙烯(21)醚、十六烷醇聚氧乙烯(23)醚、十六烷醇聚氧乙烯(25)醚、十六烷醇聚氧乙烯(30)醚，但不限于此。
通式II的非离子型表面活性剂的浓度没有特别限制，但可为0.03～1.5g/L，优选0.05～1.0g/L。
在本发明中，该非离子表面活性剂可以以单一物质使用，也可以两者或更多种的混合物来使用。取决于所使用的非离子表面活性剂的种类，其在溶血剂中的浓度也是不同的。通常来说，烷基链越长、聚氧乙烯部分的重复单元数目越多的非离子型表面活性剂，其浓度相对较低。
在本发明中，通式I和通式II的化合物配合使用，一方面能够获得对红细胞的快速深度裂解的效果，另一方面，为了能够有效检测血小板，起到对血小板细胞膜的保护作用。
根据所选取的通式I和通式II的化合物，二者之间的用量比例也有所不同。但是，通常来说，通式I和通式II的化合物的用量比为1∶100～1∶3，优选1∶25～1∶5，更优选1∶10～1∶5。
根据本发明的优选实施方式，所述第一试剂进一步包括至少一种有机酸或其盐以使白细胞侧散射光的区分度更好。所述有机酸优选为未取代的或被羟基或氨基取代的C1-6烷基的一元、二元或三元羧酸；未取代的或被羟基或氨基取代的C1-6烷基的磺酸；C6-10芳基C1-6烷基酸；C6-10芳基二(C1-6烷基酸)；和C6-10芳基磺酸所组成的组中。
所述有机酸及其盐的具体实例可为甲酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸(3-羟基-1，3，5-戊三酸)、苹果酸(2-羟基丁二酸)、苯二甲酸、苯磺酸、α-萘磺酸、牛磺酸等及它们的碱金属盐，诸如钠盐、钾盐，但不限于此。
所述有机酸或有机酸盐在溶血剂中的浓度为0.05g/L到2g/L，优选0.1g/L到0.5g/L。
如本发明所使用的，作为第三试剂，“核酸染料”是指能将网织红细胞核酸染色，使其能与血细胞或杂质区分开的染料。
对用于本发明的核酸染料没有特别的限制，商品化的核酸荧光染料及一些专利申请中已经公开的核酸特异性荧光染料均可用于本发明。其中，商品化的核酸荧光染料例如为Thermofisher公司的SYTO系列核酸染料。此外，中国专利申请CN201010022414.6中公开的荧光染料、CN200910109215.6中公开的花青素类染料以及CN200810216864.1中公开的荧光染料等，均可用作本发明的核酸染料。以上专利文献的全部内容通过引用并入本申请。
本发明的第三试剂优选溶解于有机溶剂中，其浓度范围在0.002ppm到2000ppm，优选的浓度范围为0.03ppm到20ppm。
方法
一方面，本发明提供了一种分析血样的方法，包括：
使用第一试剂和第二试剂处理血样；
获取经处理后的血样的光学信息；
根据所述光学信息来分析血小板；
其中，所述第一试剂为溶血剂，第二试剂为膜特异性染料或线粒体特异性染料。
在一个实施方式中，所述方法还包括根据所述光学信息来区分白细胞。
在另一个实施方式中，所述方法还包括根据所述光学信息来对白细胞进行分类。
在一个实施方式中，所述方法还包括根据所述光学信息来提供对网织红细胞的报警。
在又一个实施方式中，除第一试剂和第二试剂外，本发明的方法还使用第三试剂处理血样，所述第三试剂为核酸染料。
在一个实施方式中，本发明的方法还包括根据所述光学信息来区分网织红细胞。
在一个实施方式中，所述光学信息为荧光强度和散射光强度信息。
优选的，所述散射光强度信息选自前向散射光强度信息和侧向散射光强度信息的一种或两种。
在另一个实施方式中，所述散射光强度信息为前向散射光强度信息。
在一个具体的实施方式中，可使用荧光强度和前向散射光强度信息来区分血小板。
在另一个具体的实施方式中，可使用荧光强度、前向散射光强度和侧向测设光强度信息来区分血小板。
在一个具体的实施方式中，可使用荧光强度和侧向散射光强度信息来实现白细胞分类计数。
另一方面，本发明还提供了一种在溶血条件下处理血样的方法，其特征在于，将膜特异性染料或线粒体特异性染料与血样进行接触。
在一个实施方式中，其特征在于，所述膜特异性染料或线粒体特异性染料对血样中的血小板进行了染色。
又一方面，本发明还提供了一种分析方法，包括：
1)将血样加入到本发明的第一试剂中，以使血样中的红细胞破裂；
2)加入本发明的第二试剂，对血小板进行染色；
3)确定血小板的数目；
其中，步骤1)与步骤2)同步进行或依次进行。
在一个优选的实施方式中，本发明的分析方法还包括：2’)加入本发明的第三试剂，以识别网织红细胞；其中，步骤2’)可与步骤2)同步进行、与步骤1)同步进行、在步骤1)和2)之间或之后进行。
本发明的分析方法还可包括：4)确定网织红细胞数目，其中，步骤4)可以与步骤3)以任意次序进行。
在一个优选实施方式中，本发明还包括：5)白细胞分类计数。其中，步骤5)可以与步骤3)、4)以任意次序进行。
在一个实施方式中，本发明的方法是血小板的分析方法，可以将血小板与细胞碎片及杂质等区分；优选地，该方法可以实现对网织红细胞的报警。
在另一个实施方式中，本发明的方法是血小板及白细胞的分析方法，可以区分血小板以及对白细胞进行分类计数，该方法可以在单一通道内进行；优选地，该方法可以实现对网织红细胞的报警。
再又一个实施方式中，本发明的方法是血小板、网织红细胞及白细胞的分析方法，可以区分血小板、区分网织红细胞并对白细胞进行分类计数，该方法可以在单一通道内进行。
在本发明的方法中，血样是指采集自动物的血液样本，优选全血样本。所述动物优选为哺乳纲动物，更优选为灵长目动物，最优选为人。
在本发明的方法中，第一试剂可以与第二试剂同时或依次使用来处理血样。此外，当存在第三试剂时，可以按以下顺序进行处理：依次使用第一、第二和第三试剂；依次使用第一、第三和第二试剂；先同时使用第一和第二试剂，再使用第三试剂；先同时使用第一和第三试剂，再使用第二试剂；先使用第一试剂，再同时使用第二和第三试剂；同时使用第一、第二和第三试剂。
在本发明的方法中，使用第一试剂处理或使红细胞破裂的步骤可通过孵育实现，同样的，使用第二和/或第三试剂处理或染色的步骤可通过孵育实现。对于孵育的条件(如混合比例、孵育温度和孵育时长)，本发明没有特别限制，本领域技术人员根据所使用的试剂种类，依据常规参数进行调整获得，只要能实现使血样中的红细胞破裂、对血小板进行染色或对网织红细胞进行染色即可。举例来说，在使用第一试剂时，血样与试剂的比例可为1∶40～1∶60，可在诸如40～60℃的温度下，反应15～100秒，优选反应40～80秒；使用第二试剂时，血样与试剂的比例可为1∶40～1∶60，可在诸如25～60℃的温度下，反应15～100秒，优选反应40～80秒；在使用第三试剂时中血样与试剂的比例可为1∶0.1～1∶50，优选1∶1～1∶5，可在诸如20～50℃的温度下，反应15～100秒，优选反应40～80秒。
在本发明的分析方法中，在将第一、第二和/或第三试剂加入到血样中后，可选地进行混合操作，以缩短反应时间。所述混合操作可使用使试剂与血样混合均匀的任何方式，例如，振荡、搅拌等。
在本发明的分析方法中，经处理的血样进行光学检测，所述光学检测包括采集荧光强度和散射光强度，其中，散射光强度可包括前向散射光强度(受光角度在0°附近)和/或侧向散射光强度(受光角度在90°附近)。优选通过流式细胞仪对处理后的样品进行分析。
在本发明的方法中，实现了对血小板的计数；当使用了第三试剂时，本发明的方法实现了对网织红细胞的计数。
在本发明的方法中，“白细胞分类”是指白细胞三分类、四分类、五分类等。
通过以下具体实施例将详述的，使用本发明试剂的分析方法能够在溶血条件下对血小板进行染色，在测定难度更大的溶血条件下，通过光学检测得到的散点图中能够清晰地区分出红细胞碎片区域和血小板区域，实现溶血条件下的血小板的快速和精确的检测。
进一步地，本发明的分析方法不仅能够在溶血条件下将血小板与细胞碎片等杂质区分，而且还很好地对白细胞进行染色，从而能对白细胞进行计数和分类，从而实现在一个通道内进行血小板区分和白细胞分类计数。
更进一步地，在存在第三试剂的情况下，本发明的分析方法还能进一步识别网织红细胞，从而实现在一个通道内进行血小板区分、网织红细胞区分和白细胞分类计数。
仪器
本发明还提供了一种血液细胞分析仪，下面结合图10对其进行示例性说明，该血细胞分析仪中包括第一机壳100、第二机壳200、采样模块10、反应模块30、检测模块50、分析模块70及输出模块90，在实际应用中输出部90可以为用户界面。在该示例中，检测模块50及分析模块70设置在第二机壳200的内部，分别设置在第二机壳200两侧。反应模块30设置在第一机壳100的内部，输出模块90、采样模块10在第一机壳100的外表面。
所述采样模块包括采样器，用于吸取血样；
所述反应模块包括混合室和试剂供应部，所述混合室与采样器和试剂供应部流体连接，所述混合室用于将血样与本发明的第一试剂和第二试剂混合、溶血并染色以生成将处理后的血样，所述试剂供应部用于将试剂提供至混合室；
所述检测模块，包括光源、检测区和至少一个光学检测器，所述光源用将光束对准与所述混合室流体连通的所述检测区，所述检测室被配置为使处理后的血样中的粒子逐个通过，所述至少一个光学检测器被配制用来采集所述检测区中粒子的荧光信号、前向散射光强度信号和侧向散射光强度信号；
所述分析模块，包括处理器和编程有计算机应用程序的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述处理器与所述光学检测器可操作地连接，当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，使所述处理器基于所述荧光信号和前向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图区分血小板和对血小板进行计数；以及
输出模块，输出模块与分析模块可操作地连接，用于将分析模块得到的结果展现给用户。
在一些实施方式中，当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，进一步使得处理器基于所述荧光信号和前向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图对网织红细胞报警。
在一些优选实施方式中，当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，进一步使得处理器基于所述荧光信号和侧向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图区分白细胞和对白细胞进行计数或者对白细胞进行分类和对白细胞进行分类计数。
在一个优选的实施方式中，所述混合室用于将血样与本发明的第一试剂、第二试剂和第三试剂混合；并且
当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，使所述处理器基于所述荧光信号和前向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图区分网织红细胞和对网织红细胞进行计数。
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1使用染料Alexa Fluor 488分析血样
试剂配制：
第一试剂
Figure GPA0000291282450000131
第二试剂
染料Alexa Fluor 488 30mg
乙二醇 950ml
甲醇 50ml
将20微升的新鲜血加入到1mL的上述第一试剂溶液中，并加入20微升的第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长488nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息，细胞散点分布如图1所示。
从图1A中可以看出，在使用膜染料Alexa Fluor 488时，不仅能够将血小板(圈中)与血影有效区分开，同时，该染料对白细胞的染色效果也较好，能够实现对白细胞的分类计数。通过进样量体积以及血小板的测试粒子数，计算出样本的血小板值为216×109/L，而通过经典人工镜检的计数方法测量值同样为216×109/L。
根据图1B，使用相同的方法对白细胞进行计数，所得结果为8.86×109/L，而通过贝克曼粒子计数器Z2测试数值为8.81×109/L，两者具有较好的一致性。通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的比例分别为17.8％、4.8％、75.8和1.6％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的比例分别为18.1％、5.1％、74.8％和2.0％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例2使用染料DiD分析血样
试剂配制：
第一试剂
Figure GPA0000291282450000132
第二试剂
染料DiD 30mg
乙二醇 950ml
甲醇 50ml
将20微升的新鲜血加入到1mL的上述第一试剂溶液中，并加入20微升第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长633nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息，细胞散点分布如图2所示。
从图2A中可以看出，染料染色后，能够有效地的将血小板和血影区分，通过对其散点数进行划分，进而计算出血小板的浓度为158×109/L，而通过经典人工镜检的计数方法测量值为160×109/L，因此，染料能够对血小板粒子在溶血状态下进行有效的区分并计数。
根据图2B，使用相同的方法对白细胞进行计数，所得结果为4.35×109/L，而通过参考方法结合贝克曼粒子计数器Z2的测量值为4.28×109/L，两者具有较好的一致性。通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的比例分别为14.8％、6.8％、74.5％和3.9％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的比例分别为15.9％、7.2％、72.2％和4.7％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例3使用染料罗丹明123分析血样
试剂配制：
第一试剂
Figure GPA0000291282450000141
第二试剂
染料罗丹明123 30mg
乙二醇 950ml
甲醇 50ml
将20微升的新鲜血加入到1mL的上述第一试剂溶液中，并加入20微升第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长488nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息，细胞散点分布如图3所示。
从图3A中可以看出，染料罗丹明123染色后，能够有效地的将血小板和血影区分，通过对其散点数进行划分，进而计算出血小板的浓度为208×109/L，而通过经典人工镜检的计数方法测量值为201×109/L，因此，染料罗丹明123能够对血小板粒子在溶血状态下进行有效的区分并计数。
根据图3B，使用相同的方法对白细胞进行计数，所得结果为4.02×109/L，而通过参考方法结合贝克曼粒子计数器Z2的测量值为3.98×109/L，两者具有较好的一致性。通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的比例分别为15.9％、7.1％、71.5％和5.5％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的比例分别为15.9％、6.8％、72.2％和5.1％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例4使用染料Mitotracker Deep Red分析血样
试剂配制：
第一试剂
Figure GPA0000291282450000142
Figure GPA0000291282450000151
第二试剂
染料Mitotracker Deep Red 30mg
乙二醇 950ml
甲醇 50ml
将20微升的新鲜血加入到1mL的上述第一试剂溶液中，并加入20微升的第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长633nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息，细胞散点分布如图4所示。
从图4A中可以看出，在使用Mitotracker Deep Red时，能够将血小板与血影区分开，其中，浅色散点表示为血小板，通过对其散点数进行划分，进而计算出PLT的浓度为165×109/L，而通过经典人工镜检计数的方法对其进行计数，其浓度为201×109/L，可以看出染料Mitotracker Deep Red也能将血小板区分出来。
根据图4B，使用相同的方法对白细胞进行计数，所得结果为5.12×109/L，而通过参考方法结合贝克曼粒子计数器Z2的测量值为5.08×109/L，两者具有较好的一致性。通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的比例分别为14.8％、7.8％、74.5％和2.9％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的比例分别为15.9％、7.2％、73.2％和3.7％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例5使用染料Mitotracker Red分析血样
试剂配制：
第一试剂
Figure GPA0000291282450000152
第二试剂
染料Mitotracker Red 30mg
乙二醇 950ml
甲醇 50ml
将20微升的新鲜血加入到1mL的上述第一试剂溶液中，并加入20微升的第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长488nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息，细胞散点分布如图5所示。
从图5A可以看出，在使用染料Mitotracker Red时，不仅能够较为有效的将血小板和血影区分，同时在该染料对白细胞的染色性能上，也能够有效的对白细胞进行分类，从而实现了在检测白细胞的同时，对血小板进行了有效的分类计数。通过进样量体积以及血小板的测试粒子数，计算出样本的血小板值为176×109/L，而通过经典人工镜检的计数方法测量值为172×109/L，两者具有较好的一致性。
根据图5B，使用相同的方法对白细胞进行计数，所得结果为7.65×109/L，而通过参考方法结合贝克曼粒子计数器Z2的测量值为7.73×109/L，两者具有较好的一致性。通过划分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞和幼稚粒细胞的比例分别为13.7％、6.1％、77.5％、0.7％和2.0％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和幼稚粒细胞的比例分别为14.1％、5.8％、76.2％、1.9％和2.0％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例6使用深度溶血剂和膜染料分析血样
试剂配制：
Figure GPA0000291282450000161
将20微升新鲜血液样本加入到1mL按上述配方配制的溶液中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行检测。设置激发波长488nm，增益为500，采集90度侧向荧光强度信息和0度的前向散射光强度信息，得到二维细胞散点图如图6所示。
由图6A可见两个深色粒子团(下部及右侧)均为被裂解的红细胞碎片，中间的粒子团为血小板，说明该方法同样能够明显地将血小板和红细胞的碎片区分开。
另用20微升同一血样进行与上述相同的处理，并在同一流式细胞仪中测定，设置激发波长633nm，增益为100000，采集90度侧向荧光强度信息和90度的侧向散射光强度信息，得到细胞散点分布图。
如图6B所示，通过划分淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞及嗜酸的比例分别为16.4％、6.1％、77.5％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的比例分别为16％、5.8％、78.2％、1.9％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例7使用深度溶血剂和线粒体染分析血样
试剂配制：
Figure GPA0000291282450000162
将20微升新鲜血液样本加入到1mL按上述配方配制的溶液中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行检测。设置激发波长633nm，增益为500，采集90度侧向荧光强度信息和90度的侧向散射光强度信息，得到二维细胞散点图如图7所示。
由图7可见两个粒子团，其中右侧为被裂解的红细胞碎片，左侧为血小板，说明该方法同样能够明显地将血小板和红细胞的碎片区分开。
实施例8使用深度溶血剂、膜染料和核酸染料分析血样
按以下配方配制本发明的检测试剂。
Figure GPA0000291282450000171
将20微升新鲜血液样本加入到1mL按上述配方配制的溶液中，在45℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)进行检测。设置激发波长488nm，增益为500，采集90度侧向荧光强度信息和0度的前向散射光强度信息，得到二维细胞散点图如图8所示。
如图8A所示，两个深色粒子团均为被裂解的红细胞碎片，中间的粒子团为血小板，说明该方法能够更加明显地将血小板和红细胞的碎片区分开；最右侧的粒子团识别为网织红细胞，因而该方法能够进一步获得网织红细胞的信息。
另用20微升同一血样进行与上述相同的处理，并在同一流式细胞仪中测定，设置激发波长633nm，增益为100000，采集90度侧向荧光强度信息和90度的侧向散射光强度信息，得到细胞散点分布图。
如图8B所示，通过划分淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞及嗜酸粒细胞的比例分别为16.8％、6.4％、76.8％，而在迈瑞6800血细胞分析仪上对该样本进行测试后，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的比例分别为16％、5.8％、78.2％、1.9％，从上述结果可以看出，上述方法对白细胞进行划分与血细胞分析仪中的比例具有较好的相关性。
实施例9以实施例1为例验证血小板测试的相关性
试剂配制：同实施例1。
取将20支新鲜血样本，每支血样的测试方法如下：取20微升血样加入到上述配置第一试剂溶液1mL中，并加入20微升第二试剂，在35℃条件下孵育60秒后用流式细胞仪(迈瑞BriCyte E6)收集数据(激发波长488nm)设置增益为500，采集90度侧向荧光信号收集荧光染色信息，并采用测定角度为0度的前向散射光强度信息。通过划分出血小板的散点，结合流式细胞仪中的进样量，计算出血样的血小板浓度，测试完毕后，将血样在迈瑞6800仪器上进行测试，记下其血小板的测试值，用两种测试方法所得的结果作出相关性曲线：
从图9中可以看出，使用膜染料Alexa Fluor 488在测试血小板时，其测试数值与迈瑞6800仪器测试值具有较好的一致性，在100×109/L～250×109/L的数值范围内，相关系数为0.9817。

Claims (35)

1.一种试剂在分析血样中血小板并对白细胞进行分类及计数的用途，所述试剂包括：
作为溶血剂的第一试剂；以及
第二试剂，所述第二试剂为膜特异性染料或线粒体特异性染料，
其中，所述膜特异性染料是指能够对细胞膜进行特异性染色的荧光染料，而线粒体特异性染料是指能够对细胞线粒体进行特异性染色的荧光染料。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述膜特异性染料选自DiA、DiD、DiI、DiO、DiR、DiS、FDA、Alexa Fluor 488、Super Fluor 488及以它们为母体的变形结构中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述膜特异性染料为Alexa Fluor 488和/或DiD。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述线粒体特异性染料选自Janus Green B、MitoLite Red、罗丹明123和Mitotracker系列及以它们的母体的变形结构中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述Mitotracker系列染料为Mitotracker Red、Mitotracker Green或Mitotracker Red。
6.根据权利要求4所述的用途，其中，所述线粒体特异性染料为罗丹明123、Mitotracker Deep Red和/或Mitotracker Red。
7.根据权利要求1所述的用途，其中，所述试剂进一步包括作为核酸染料的第三试剂。
8.根据权利要求1所述的用途，其中，所述第一试剂为选自烷基糖苷、三萜皂苷和甾族皂苷中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述烷基糖苷选自具有通式I的糖苷类化合物：
R-(CH2)n-CH3 （I）
其中，R选自由单糖、去氧单糖和选自所述单糖和/或所述去氧单糖中的两种或更多种的单糖形成的多糖所组成的组，n为5~17的整数。
10.根据权利要求1所述的用途，其中，所述第一试剂进一步包括：
具有通式II的非离子型表面活性剂：
R1-R2-(CH2CH2O)m-H （II）
其中，R1为C8-C23的烷基，R2为-O-、
Figure DEST_PATH_IMAGE001
或-COO-，m为10~50的整数。
11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述第一试剂进一步包括：
至少一种有机酸或其盐，其中所述有机酸或其盐选自由具有至少一个羧基或磺酸基的有机酸及其碱金属的盐所组成的组中。
12.一种分析血样的方法，包括：
使用第一试剂和第二试剂处理血样；
获取经处理后的血样的光学信息；
根据所述光学信息来区分血小板和/或对血小板进行计数；以及
根据所述光学信息来区分白细胞并对白细胞进行分类及计数，
其中，所述第一试剂为溶血剂，第二试剂为膜特异性染料或线粒体特异性染料，并且所述光学信息为荧光强度和散射光强度信息。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述膜特异性染料选自DiA、DiD、DiI、DiO、DiR、DiS、FDA、Alexa Fluor 488、Super Fluor 488及以它们为母体的变形结构中的一种或多种。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述膜特异性染料为Alexa Fluor 488和/或DiD。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述线粒体特异性染料选自Janus Green B、MitoLite Red、罗丹明123和Mitotracker系列及以它们为母体的变形结构中的一种或多种。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述Mitotracker系列染料为MitotrackerRed、Mitotracker Green或Mitotracker Red。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述线粒体特异性染料为罗丹明123、Mitotracker Deep Red和/或Mitotracker Red。
18.根据权利要求12所述的方法，其中，所述溶血剂将所述血样中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述溶血剂为选自烷基糖苷、三萜皂苷和甾族皂苷中的至少一种。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述烷基糖苷选自具有通式I的糖苷类化合物：
R-(CH2)n-CH3 （I）
其中，R选自由单糖、去氧单糖和选自所述单糖和/或所述去氧单糖中的两种或更多种的单糖形成的多糖所组成的组，n为5~17的整数。
21.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一试剂进一步包括：
具有通式II的非离子型表面活性剂：
R1-R2-(CH2CH2O)m-H （II）
其中，R1为C8-C23的烷基，R2为-O-、
Figure 472912DEST_PATH_IMAGE002
或-COO-，m为10~50的整数。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一试剂进一步包括：
至少一种有机酸或其盐，其中，所述有机酸或其盐选自由具有至少一个羧基或磺酸基的有机酸及其碱金属的盐所组成的组中。
23.根据权利要求12所述的方法，其中，所述方法还包括根据所述光学信息来对白细胞进行分类或对白细胞进行分类计数。
24.根据权利要求23所述的方法，进一步包括对幼稚粒细胞进行分类或计数。
25.根据权利要求12~24中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括根据所述光学信息来提供对网织红细胞的报警。
26.根据权利要求12~24中任一项所述的方法，其中，除第一试剂和第二试剂外，还使用第三试剂处理血样，所述第三试剂为核酸染料。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述方法还包括根据所述光学信息来区分网织红细胞或对网织红细胞进行计数。
28.根据权利要求12所述的方法，所述散射光强度信息选自前向散射光强度信息和侧向散射光强度信息的一种或两种。
29.根据权利要求12所述的方法，所述散射光强度信息为前向散射光强度信息。
30.根据权利要求12所述的方法，其中，在处理血样之前还包括获得血样、将血样转移到合适的容器中并从所述容器中吸取血样的步骤；在处理血样时，将所述吸取的血样与第一试剂和第二试剂混合；随后使经处理的血样中的粒子逐个通过检测区、使用光源照射所述粒子并通过荧光检测器采集荧光信号并通过散射光检测器采集前向散射光强度信号和侧向散射光强度信号；从所述荧光信号和前向散射光强度信号的散点图中划分血小板区域并获取网织红细胞的报警信息，随后基于所述血小板区域中的散点数量实现对血小板进行计数，进一步从荧光信号和侧向散射光强度信号的散点图中划分白细胞区域并对对白细胞进行分类，并基于所述白细胞区域或白细胞分类区域的散点数量实现对白细胞的计数或白细胞的分类计数；
或者，在处理样品时，除所述第一试剂第二试剂外，进一步将所述吸取的血样与第三试剂混合，所述第三试剂为核酸染料；从而在检测后，进一步从所述荧光信号和前向散射光强度信号的散点图中划分网织红细胞区域，随后基于所述网织红细胞区域中的散点数量实现对网织红细胞进行计数。
31.血液细胞分析仪，包括：
采样模块，包括采样器，所述采样器用于吸取血样；
反应模块，包括混合室和试剂供应部，所述混合室与采样器和试剂供应部流体连接，所述混合室用于将血样与第一试剂和第二试剂混合、溶血并染色以生成将处理后的血样，所述试剂供应部用于将试剂提供至混合室，其中，所述第一试剂为溶血剂，所述第二试剂为膜特异性染料或线粒体特异性染料；
检测模块，包括光源、检测区和至少一个光学检测器，所述光源用将光束对准与所述混合室流体连通的所述检测区，所述检测区被配置为使处理后的血样中的粒子逐个通过，所述至少一个光学检测器被配制用来采集所述检测区中粒子的荧光信号和前向散射光强度信号；以及
分析模块，包括处理器和编程有计算机应用程序的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述处理器与所述光学检测器可操作地连接，当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，使所述处理器基于所述荧光信号和前向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图区分血小板和对血小板进行计数。
32.根据权利要求31所述的血液细胞分析仪，其中，所述至少一个光学检测器进一步被配制用来采集所述检测区中粒子的侧向散射光强度信号。
33.根据权利要求31所述的血液细胞分析仪，其中，当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，进一步使得处理器基于所述荧光信号和前向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图对网织红细胞报警。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的血液细胞分析仪，其中，当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，进一步使得处理器基于所述荧光信号和侧向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图区分白细胞和对白细胞进行计数或者对白细胞进行分类和对白细胞进行分类计数。
35.根据权利要求31至33中任一项所述的血液细胞分析仪，其中，所述混合室用于将血样与第一试剂、第二试剂和第三试剂混合，所述第三试剂是核酸染料；并且
当所述计算机应用程序被所述处理器执行时，使所述处理器基于所述荧光信号和前向散射光强度生成血细胞的散点图，基于所述散点图区分网织红细胞和对网织红细胞进行计数。
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