CN103424540A

CN103424540A - 一种白细胞分类试剂盒及其分类方法

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Publication number: CN103424540A
Application number: CN2012101544282A
Authority: CN
Inventors: 邵建辉
Original assignee: JIASHAN JUST-TECH MEDICAL EQUIPMENT Co Ltd
Current assignee: JIASHAN JUST-TECH MEDICAL EQUIPMENT Co Ltd
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2013-12-04

Abstract

本发明公开了一种白细胞分类计数试剂盒及其分类方法，该试剂盒由水溶性量子点-菁染料探针和红细胞和血小板溶血剂组成。其中量子点-菁染料探针由多肽类物质作为量子点的稳定剂和与发射光谱在近红外区的Cy5菁染料共价连接分子构成，具有量子产率高且灵敏度高的特点；红细胞和血小板溶血剂能够迅速的溶解血液中的红细胞，由阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、pH缓冲剂或它们的组合构成。本发明的白细胞分类试剂可以对血液样本白细胞中的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞进行准确的亚类识别，并能进一步识别出未成熟细胞和/或异常细胞。

Description

一种白细胞分类试剂盒及其分类方法

技术领域

本发明涉及白细胞分类计数试剂盒及其分类方法，具体地讲，本发明涉及在流式细胞分析仪上用于对白细胞亚群进行分类计数的试剂盒及采用所述试剂盒进行白细胞亚群分类计数的方法。

背景技术

人体外周血中的白细胞可以分为单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞五个亚类。正常健康人的末梢血中的白细胞的各个亚类的比例是恒定的，当人体出现一些疾病时，就会表现出某一类白细胞数量的增大或减小。例如在急性化脓性感染、粒细胞白血病、剂型出血、术后、重金属中毒等症状下会出现中性粒细胞增多。在变态反应、寄生虫病、某些皮肤病和血液病、术后、烧伤等症状下会出现嗜酸性粒细胞增加。在百日咳、病毒性肝炎、结核、传染性单核细胞增多、慢性淋巴细胞白血病等症状下会出现淋巴细胞的增加。而出现伤寒、副伤寒、疟疾、流感、X线照射、化疗、再障等症状时则会出现中性粒细胞的减少。在伤寒、副伤寒、肾上腺激素治疗后则会出现嗜酸性粒细胞减少。因此在临床检验领域，用患者血液对白细胞进行分类计数，测定不同类型的正常和异常白细胞亚群能获得疾病的多方面信息，以此对某些病症进行筛查判断是非常重要的。

与传统的手工血液涂片检测方法相比，采用流式技术的自动细胞分析仪具有检测速度快，准确性好等优点。流式技术是将经过试剂处理的血液细胞在流体力学的作用下逐一通过流动室，在激光的照射下形成多种信号，如散射光信号、荧光信号、光吸收信号等，通过这些信号将不同类型的白细胞的差异表现出来，以此将白细胞分成5类。除了白细胞分类以外，这些信号还可能反映出血液细胞的其他信息，如有核红细胞及网织红细胞等。现在，医院多采用基于细胞荧光染色技术的自动血细胞分析仪对白细胞进行分类计数。细胞荧光染色是指将荧光染料附着在细胞上，激光照射细胞时，荧光物质被激发发光，发光强度被检测，并以发光强度表征附着荧光染料的多少。不同的细胞亚群、不同的成熟阶段，其核酸的含量，核酸的结构，DNA/RNA的比例不同，表现不同的着色性。荧光强度信息再配合前向散射反映的体积信息和侧向散射反映的亚细胞结果信息实现对白细胞的分类。

美国专利3883247公开了一种白细胞五分类方法，它是通过吖啶橙对白细胞核酸进行染色，通过不同的白细胞亚类红色和绿色荧光量的差异来对白细胞进行分类。该方法采用的吖啶橙可以和核酸形成复合物，使荧光增强。这类染料分子相互之间在能量传递的过程中可能会导致光淬灭，使得染料核酸复合物没有荧光发出，影响检测结果真实性。同时在流式细胞分析仪中，吖啶橙和塑料管路有较强的作用，会增加背景荧光强度。为了清除测试后残留的染料和保证测试结果的准确性，需要仪器进行长时间的管路清洗，这就降低了仪器的分析效率。

美国专利4882284公开了一种白细胞五分类方法，它是通过采用非溶血的方法利用噁嗪类荧光染料对血细胞中的各种细胞进行染色，然后通过不同细胞的前向散射光、侧向散射光和红色荧光强度来对白细胞进行分类。这些染料的荧光量子效率较低，降低了荧光增强的程度，影响检测结果的准确性，同时由于需要测定红细胞、白细胞和血小板，则一些异常红细胞如大红细胞等会影响白细胞准确计数。

美国专利6004816公开了一种白细胞五分类方法，它是在溶血剂的作用下通过菁类荧光染料对白细胞内的核酸物质进行标记，然后测定侧向散射光和荧光强度信号分类和计数白细胞亚群，但该类荧光染料容易光漂白，同时具有较低的量子产率，这就增加了每次检测的使用量，提高了检测成本。

因此需要开发新的白细胞分类试剂盒，该白细胞分类试剂盒具有以下特点：可以准确的对白细胞中单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞进行区分和计数，同时识别血液中的异常白细胞，试剂盒单次使用量低。

发明内容

本发明的目的：本发明一种白细胞分类试剂盒及其分类方法是利用多肽类物质作为量子点的稳定剂和与发射光谱在近红外区的Cy5菁染料共价连接分子构成的量子点-菁染料作为染色剂，在细胞溶血剂作用下将血液中的红细胞溶解，然后对白细胞中的核酸物质进行染色，采用流式分析原理测定侧向散射光和荧光信号，对白细胞中的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞进行准确的亚类识别。

本发明的技术方案：本发明一方面提供了一种用于白细胞分类计数的试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)由多肽类物质作为量子点的稳定剂和与发射光谱在近红外区的Cy5菁染料共价连接形成的水溶性量子点-菁染料探针，其中所述多肽类物质为三肽类分子，优选为谷胱甘肽，更优选为还原型谷胱甘肽。

(2)红细胞和血小板溶血剂。红细胞和血小板溶血剂由阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、pH缓冲剂或它们的任意组合构成。

本发明另一方面提供了一种用于白细胞分类计数的试剂盒，所述试剂盒包括本发明任一项实施方案的白细胞分类计数试剂。

本发明再一方面提供了一种对白细胞进行分类计数的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将待测样本加入到本发明所提供的试剂盒所含的试剂中混合反应一段时间，以溶解红细胞和血小板，损伤白细胞，使白细胞各亚类产生形态变化，(2)由多肽类物质作为量子点的稳定剂和与发射光谱在近红外区的Cy5菁染料共价连接形成的水溶性量子点-菁染料探针对白细胞内部核酸物质进行荧光标记；(3)通过测定白细胞的荧光强度信息和散射光强度信息，将血液样本中白细胞进行分类计数。

本发明的有益效果：本发明利用由多肽类物质作为量子点的稳定剂和与发射光谱在近红外区的Cy5菁染料共价连接形成的水溶性量子点-菁染料探针对白细胞内部核酸物质进行荧光标记后利用流式技术进行检测，不仅可以对白细胞的各个亚群准确识别，而且单次检测的试剂消耗量低，从而降低了检测成本。

本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。

附图说明

图1是本发明测定方法中使用的细胞分析仪的光学系统示意图。

图2是使用本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂测定正常血液样本的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图。

图3是使用本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂测定正常血液样本的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图。

图4是使用本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂测定异常血液样本的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图。

图5是使用本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂测定异常血液样本的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图。

图6是单独采用Cy5菁染料进行白细胞分类计数试剂测定与图5中相同异常血液样本的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图。

具体实施方式

使用本实施方式的白细胞分类试剂，可以将试样中所含红细胞和血小板溶解，而对白细胞进行计数，同时进一步将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞至少四个亚类集团。

作为供测试的生物试样，是指包含血细胞的体液样本，比如外周血，骨髓穿刺液等，没有具体的限定。

本实施方式中的试剂包括：

其中的水溶性量子点-菁染料探针能够对核酸特异性染色。在这种探针作用下，无核的红细胞几乎不被染色，而有核的白细胞却重度染色。根据其染色强度的不同即可分辨出红细胞和白细胞。不同类型细胞由于细胞内部核酸类物质量的不同从而在荧光强度上产生差异，并能通过荧光信号强度加以放大和识别。而且，在溶血剂作用下白细胞各个亚群膜被不同程度的破坏，使血液中白细胞的各个亚群收缩成适当的大小以造成内部结构产生不同的凝聚，从而在散射光特性上产生差别。通过测定白细胞的荧光强度信息和散射光强度信息，将血液样本中自细胞进行分类计数。

用于本发明的水溶性量子点-菁染料探针具有通式I，为由多肽类物质作为量子点的稳定剂和与发射光谱在近红外区的Cy5菁染料共价连接形成的水溶性量子点-菁染料探针，其中所述多肽类物质为三肽类分子，优选为谷胱甘肽，更优选为还原型谷胱甘肽。

通式I所示的荧光探针及其制备方法已在申请号为201210090812.0中国专利申请中公开，在此通过引用将其全文结合于此。

上述水溶性-量子点荧光探针在本发明各实施例中的合适浓度范围在0.001ppm到1000ppm，优选的浓度范围为0.005ppm到200ppm，更优选的浓度为0.01ppm到20ppm。

其中的红细胞和血小板溶血剂由阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、pH缓冲剂或它们的任意组合构成。阳离子表面活性剂的作用是用于溶解红细胞和血小板，并对成熟白细胞膜进行部分损伤，使得荧光探针可以顺利通过膜结构而和其中的核酸物质结合。所述的阳离子表面活性剂可以为溴化辛基三甲基铵(OTAB)，溴化癸基三甲基铵(DTAB)，十二烷基三甲基氯化铵(LTAC)，十二烷基三甲基溴化铵(LTAB)，十四烷基三甲基溴化铵(CTAB)，十四烷基三甲基氯化铵(CTAC)等及其组合。它们使用的浓度范围在50mg/L-5000mg/L。非离子表面活性剂的作用是用于损伤白细胞，并能够固缩细胞内部物质，放大不同白细胞亚类内部结构的散射光强度差异。所述非离子表面活性剂为选自具有如下通式II结构的聚氧乙烯类非离子表面活性剂的至少一种或其组合，

R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H

II

其中

R1为C8-23的烷基或链烯基，优选选自辛基、癸基、月桂基、十四烷基、十六烷基和硬脂基的直链烷基，特别优选选自月桂基、十四烷基和十六烷基的直链烷基；

R2为-O-、或-COO-；

n为8到30的整数。

所述非离子表面活性剂具体可选自十二烷基醇聚氧乙烯(23)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(25)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(30)醚及其组合。

其中的pH缓冲剂可以将试剂的pH维持在6-8范围内，由此可以稳定白细胞各个亚群的染色效果。只要适用于本发明的pH范围的缓冲液均可以使用，例如适当浓度的磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等都可以用于本发明。缓冲剂的使用量通常在0.1-500mM。

本发明的白细胞分类计数试剂盒还可以包含有适量的防腐剂、金属螯合剂等，其种类没有具体的限定。

本实施方式中的用于白细胞分类计数的试剂盒，可用于处理血液样本，并对血液样本中白细胞实现单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞区分和计数。所述试剂盒中的荧光探针可以单独作为储存液形式，和溶血剂一起构成双试剂体系，也可以和溶血剂配制在一起形成单试剂体系。

所述样本为外周全血或者成分血。血样与本发明所公开的试剂的混合比例没有特别限制。所述的混合反应在样品孵育池中完成，孵育时间在2秒-40秒内即可，优选15秒-25秒。孵育室的温度为任何合适的温度即可，比如可以在室温到40℃范围内。

本发明所述荧光强度信息采用光学法对白细胞进行检测。经过处理后的各个白细胞子类在内部颗粒度(复杂度)上和核酸含量上有差异。采用激光流式检测技术，激光经准直、聚焦之后，照射到被检测细胞上，散射的光信号被3个传感器检测，其中前向散射光反映细胞的体积信息，测向散射光反映细胞内部结构，激光激发的侧向荧光反映细胞内的核酸信息。其中激光器光源可以选择同所使用的荧光染料激发波长相适应的激光器。分色镜和滤色镜的波长和发射波长相匹配。图1为激光流式法采用的光路示意图。

实施例1水溶性CdTe量子点-菁染料探针

(1)谷胱甘肽稳定的水溶性CdTe量子点的制备

a、NaHTe溶液的制备

在磁力加热搅拌器上安装50mL洁净三口烧瓶，氮气保护条件下，向其中加入0.09g Te粉和0.06g NaBH4，恒温75℃，注入3mL煮沸后冷却的双蒸水。反应10min，待黑色粉末消失，溶液变为紫红色的NaHTe溶液，标记为A溶液。

b、谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的制备

在氮气保护条件下，向洁净的200mL三口烧瓶中加入100mL 1.0mmol/L Cd²⁺溶液和0.1mmol/L谷胱甘肽(GSH)溶液，用1mol/L NaOH溶液调节pH为10，再加入A溶液300uL，加热回流100min，制得谷胱甘肽稳定的CdTe(CdTe-GSH)量子点。

(2)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的活化

取10mmol/L CdTe-GSH量子点20mL加入洁净的三口烧瓶中，在氮气保护条件下，加入10倍摩尔比例的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和10倍摩尔比例的N-羟基琥珀酰亚胺水溶液，反应30min后，得到活化的量子点，标记为溶液B。

(3)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点与菁染料偶联

在洁净的三口烧瓶中加入溶液B 10ml，磁力搅拌条件下，缓慢加入2倍摩尔比例的Cy5菁染料溶液，反应10小时后，得到量子点-Cy5菁染料探针。

实施例2配制白细胞分类试剂(A)

配制含有如下物质的白细胞分类试剂用于测试。

在1mL白细胞分类测定试剂中加入10uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入3uL0.2ppm的水溶性CdTe量子点-菁染料探针，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息，结果如图2所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。

实施例3配制白细胞分类试剂(B)

配制含有如下物质的白细胞分类试剂用于测试。

在1mL白细胞分类测定试剂中加入10uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入3uL0.3ppm的探针水溶性ZnTe量子点-菁染料探针，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息，结果如图3所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。

实施例4配制白细胞分类试剂(C)

配制含有如下物质的白细胞分类试剂用于测试。

在1mL白细胞分类测定试剂中加入10uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入3uL0.3ppm的探针水溶性ZnTe量子点-菁染料探针，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息，结果如图4所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。同时也能够识别出异常淋巴细胞。

实施例5配制白细胞分类试剂(D)

配制含有如下物质的白细胞分类试剂用于测试。

在1mL白细胞分类测定试剂中加入10uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入3uL0.3ppm的探针水溶性ZnSe量子点-菁染料探针，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息，结果如图5所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。同时也能够识别出异常淋巴细胞和幼稚粒细胞。

实施例6对比实施例

配制含有如下物质的白细胞分类试剂用于测试。

在1mL白细胞分类测定试剂中加入10uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入3uL50ppm的Cy5菁染料探针，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息，结果如图6所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。同时也能够识别出幼稚粒细胞。但是与水溶性量子点-菁染料探针相比，其单次检测的使用量增加了大约15倍。

已通过上述各实施方案和具体实施例对本发明作出说明，但本领域技术人员会理解，在不偏离本发明宗旨和范围的情况下，可对本发明作出各种修改、变更和替换。

Claims

1.一种白细胞分类试剂，所述试剂包括：

(1)水溶性量子点-菁染料探针，其特征在于由多肽类物质作为量子点的稳定剂和与发射光谱在近红外区的Cy5菁染料共价连接分子。

(2)红细胞和血小板溶血剂。其特征在于由阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、pH缓冲剂或它们的任意组合构成。

2.权利要求1所述的白细胞分类试剂，其中所述多肽类物质为三肽类分子，优选为谷胱甘肽，更优选为还原型谷胱甘肽。

3.权利要求1-2所述的白细胞分类试剂，其中所述的水溶性量子点-菁染料探针的使用浓度为0.01-1000ppm，优选为0.05-500ppm，更优选为0.1-100ppm。

4.权利要求1-3所述的白细胞分类试剂，其中包括红细胞和血小板溶血剂。

5.权利要求1-4所述的白细胞分类试剂，其中红细胞和血小板溶血剂由阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、pH缓冲剂或它们的任意组合构成。

6.一种白细胞分类试剂盒，其特征在于包括权利要求1-5中的白细胞分类试剂。

7.一种对白细胞进行分类计数的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将待测样本加入到本发明所提供的试剂盒所含的试剂中混合反应一段时间，以溶解红细胞和血小板，损伤白细胞，使白细胞各亚类产生形态变化；

(2)由多肽类物质作为量子点的稳定剂和与发射光谱在近红外区的Cy5菁染料共价连接形成的水溶性量子点-菁染料探针对白细胞内部核酸物质进行荧光标记；

(3)通过测定白细胞的荧光强度信息和散射光强度信息，将血液样本中白细胞进行分类计数。

8.权利要求7的方法，其特征在于所述方法可以识别出白细胞中的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞5个亚群。并能进一步识别出未成熟细胞和/或异常细胞。