JP4794414B2 - 血小板測定用試薬、血小板測定用試薬キット並びに血小板測定方法 - Google Patents
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Description
しかし、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)などの血小板減少症や急性白血病などの疾患に罹患すると、血液中の血小板数が減少することが知られている。一般に、血液中の血小板数が10000個/μlより低くなると、輸血の必要性があると判断される。したがって、血小板数を迅速にかつ正確に測定することは、臨床現場において重要である。
血小板を染色するための色素としてカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも1種の色素を含有する血小板測定用試薬である。
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて血小板を検出する
ことを含む血小板測定方法でもある。
なお、本明細書において、血液中の「夾雑物」とは、血小板の測定に影響を与え得る血液中の成分のことであり、脂質粒子、破砕赤血球などを含む。
このような濃度範囲であれば、血小板と、他の血球成分及び夾雑物との区別がより良好になるので好ましい。
上記の浸透圧を保つために、本発明の血小板測定用試薬は、浸透圧補償剤を含有することができる。浸透圧補償剤としては、通常用いられるものを用いることができ、例えばプロピオン酸などのアルカリ金属塩、グルコース、マンノースなどの糖類を挙げることができる。また、NaClのようなアルカリ金属ハロゲン化物やアルカリ土類金属ハロゲン化物も用いることができる。上記の浸透圧補償剤は、1種又は2種以上を用いることができる。なお、上記の緩衝剤を用いて、試薬の浸透圧を上記の範囲に調整できる場合には、浸透圧補償剤は用いなくてもよい。
で表されるものである。
上記の式(I)において、炭素数8〜12のアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれであってもよく、例えばオクチル基、デシル基、ラウリル基、セチル基、ミリスチル基などが挙げられる。
炭素数1〜6のアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれであってもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル及びヘキシル基が挙げられる。なかでも、メチル又はエチル基が好ましい。
Y-のアニオンとしては、臭素イオン又は塩素イオンが好ましい。
上記の各成分を溶媒に溶解する順序としては特に限定されず、任意の順序で溶解させることができる。また、上記の各成分をそれぞれ別々に適切な溶媒にあらかじめ溶解させておき、用時に各溶液を混合して試薬を使用することもできる。このような形態も、本発明の範囲内である。例えば、上記の色素が水溶液中で不安定な場合には、色素を水溶性有機溶媒に溶解しておき、使用時に他の成分を含有する水溶液と混合して使用することができる。
用いるフローサイトメータの光源は特に限定されず、上記の色素の励起に好適な波長(例えば600〜680nm付近)の光源を用いることができる。光源としては、例えば、赤半導体レーザ、He−Neレーザなどが挙げられる。特に半導体レーザは気体レーザに比べて非常に安価であり、好適である。
該第1試薬における緩衝剤は、上記と同様のものを用いることができる。
これらの第1試薬及び第2試薬は、上記の緩衝剤及び血小板を染色するための色素をそれぞれ適切な溶媒に溶解したものであってよい。
測定用試料を調製し、散乱光及び蛍光を測定し、これらに基づいて血小板を検出する方法については、上記と同様のことが当てはまる。
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて血小板を検出する
ことを含む血小板測定方法でもある。
実施例1〜3及び比較例1〜12
次の組成の血小板測定用試薬を製造した。
(1)色素液
血小板を染色するための色素 以下に記載の濃度
エチレングリコール 1L
(2)希釈液
トリシン(緩衝剤) 1.8g
ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド(LTAC) 0.15g
精製水 1L
(pH9.0、浸透圧200mOsm/Kg・H2Oに調整)
実施例
1 カプリブルーGON(クロマ社製) 20.5ppm(0.4ppm)
2 ナイルブルークロリド(東京化成社製) 20.5ppm(0.4ppm)
3 ブリリアントクレシルブルーALD(シグマ社製) 51.25ppm(1ppm)
比較例
1 アズールA(シグマ社製) 102.5ppm(2ppm)
2 アズールD(シグマ社製) 102.5ppm(2ppm)
3 アズールC(シグマ社製) 102.5ppm(2ppm)
4 メチレンブルーNNX(シグマ社製) 102.5ppm(2ppm)
5 クレシルバイオレットアセテート(シグマ社製) 1025ppm(20ppm)
6 ベーシックグリーン5(東京化成社製) 1025ppm(20ppm)
7 メチレンブルー(シグマ社製) 102.5ppm(2ppm)
8 ニューメチレンブルー(Croma社製) 1025ppm(20ppm)
9 トルイジンブルー(東京化成社製) 102.5ppm(2ppm)
10 オキサジン750(ナカライ社製) 102.5ppm(2ppm)
11 オキサジン1(Exciton社製) 1025ppm(20ppm)
12 オキサジン4(Exciton社製) 1025ppm(20ppm)
これに、得られた色素液20μL及び検体として健康なヒトの全血5μLを添加して40℃で25秒間反応させ、633nmの励起光源を有するフローサイトメータの検出部に導き、測定用試料中の細胞に励起光を照射し、該細胞から発せられる散乱光信号及び蛍光信号を検出し、得られた信号を解析して測定用試料中の血小板を測定した。
図1の結果から、血小板を染色するための色素としてカプリブルー、ナイルブルー又はブリリアントクレシルブルーを用いる場合、他の色素を用いた場合と比べて、血小板の蛍光強度が強く、他の血球成分とより良好に区別できることがわかる。また、血液中に脂質粒子などの夾雑物が混入している場合、スキャッタグラム上では蛍光強度の低い位置に夾雑物の集団が出現することから、血小板を染色するための色素としてカプリブルー、ナイルブルー又はブリリアントクレシルブルーを用いることにより、血小板と夾雑物とを区別できることがわかる。
ここでは、実施例1の血小板測定用試薬において、カプリブルーGONを、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が0.1〜5.0ppmとなるように色素液に含有させた。それ以外は実施例1と同様にして、血小板の測定を行った。検体として、健康なヒトの全血、破砕赤血球含有血液、及び脂質含有血液をそれぞれ用いた。
ここでは、実施例2の血小板測定用試薬において、ナイルブルークロリドを、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が0.05〜5ppmとなるように色素液に含有させた。それ以外は実施例2と同様にして、血小板の測定を行った。検体として、健康なヒトの全血、破砕赤血球を増加させた破砕赤血球含有血液、及び脂質含有血液をそれぞれ用いた。
ここでは、実施例3の血小板測定用試薬において、ブリリアントクレシルブルーALDを、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が0.1〜10ppmとなるように色素液に含有させた。それ以外は実施例3と同様にして、血小板の測定を行った。検体として、健康なヒトの全血、破砕赤血球含有血液、及び脂質含有血液をそれぞれ用いた。
本願の測定方法と、免疫染色を用いる従来技術の方法との相関関係を調べるために、本実施例を行った。
<免疫染色による血小板の測定>
従来技術の方法として、American journal of Clinical Pathologists (2001):115, p.460-464に記載される国際血液学標準化委員会(ICSH)により推奨される標準的な方法に従って血小板の数の測定を行った。この方法は、血小板の表面抗原に特異的な抗体を用いる免疫染色に基づく。すなわち、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗ヒトCD41a抗体(ベクトンデッキンソン社製)5μL、FITC標識抗ヒトCD61抗体(ベクトンデッキンソン社製)5μL及びリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.2〜7.4、和光社製)100μLをチューブに分注した。ここに、検体(血液)5μLを加え、静かに攪拌した。暗所で、室温にて15分間インキュベートした。ここにPBSを4.85mL加え、FACS Canto(ベクトンデッキンソン社製)で測定し、血小板の測定結果(a)及び赤血球の測定結果(b)を得た。さらに、ここで用いた全血を、自動血球計数装置XE−2100(シスメックス社製)を用いて測定して赤血球数(c)を求め、最終的に、次の計算式を利用して、従来の方法を使用した場合の血小板数を算出した。
血小板数=赤血球数(c)×(血小板の測定結果(a)/赤血球の測定結果(b))
ここでは、実施例1の血小板測定用試薬において、カプリブルーGONを、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が1.2ppmとなるように色素液に含有させた。また、実施例2の血小板測定用試薬において、ナイルブルークロリドを、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が0.5ppmとなるように色素液に含有させた。これら以外は、それぞれ実施例1及び2と同様にして、免疫染色に用いたのと同じ血液を検体として用いて血小板を検出し、血小板数を算出した。
これらの結果から、本発明の方法は、従来の免疫染色を用いる方法と比較しても結果のばらつきが少なく、良好な相関関係を示すことがわかる。
Claims (11)
- フローサイトメータを用いて血液中の血小板を測定する測定用試薬であって、
血小板を染色するための色素としてカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも1種の色素を含有する血小板測定用試薬。 - pHが6.0〜11.0である請求項1に記載の血小板測定用試薬。
- 浸透圧が150〜600mOsm/kgである請求項1又は2に記載の血小板測定用試薬。
- 色素の透過性を促進するための染色促進剤をさらに含む請求項1〜3のいずれか1項に記載の血小板測定用試薬。
- 前記染色促進剤がカチオン界面活性剤である請求項4に記載の血小板測定用試薬。
- 前記色素が、血小板を脂質粒子から識別可能に染色する請求項1〜5のいずれか1項に記載の血小板測定用試薬。
- 前記色素が、血小板を破砕赤血球から識別可能に染色する請求項1〜5のいずれか1項に記載の血小板測定用試薬。
- 測定時のpHを一定に保つための緩衝剤を含有する第1試薬と、血小板を染色するための色素を含有する第2試薬とを含み、該色素がカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも1種の色素である血小板測定用試薬キット。
- カプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも1種である血小板を染色するための色素と検体とを混合して測定用試料を調製し、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて血小板を検出することを含む血小板測定方法。 - 前記測定用試料が、フローサイトメータのフローセルに導入され、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に光が照射される請求項9に記載の血小板測定方法。
- 検出された血小板をさらに計数する請求項9又は10に記載の方法。
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