JPH11508353A

JPH11508353A - 網状赤血球を迅速に分析するための組成物及び方法

Info

Publication number: JPH11508353A
Application number: JP8531975A
Authority: JP
Inventors: キム，ヤング・ラン; カンター，ジヨハンナ
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1995-04-21
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 1999-07-21
Anticipated expiration: 2016-04-19
Also published as: JP3600247B2; EP0842410A1; ATE242877T1; US5773299A; US5691204A; DE69628651T2; ES2201182T3; WO1996033396A1; EP0842410B1; DE69628651D1

Abstract

(57)【要約】サンプル及び試薬の個別のインキュベートを要せずに全血サンプル中の網状赤血球を同時または個別に計数するための方法及び試薬。試薬は、網状赤血球染色量の非対称シアニン染料と、イミダゾール、Ｔｒｉｓ及びＢｉｓ−Ｔｒｉｓから成るグループから選択された約４０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファと、Ｎ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド及びポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とを含む。試薬は、ｐＨ約６．８〜約７．２を有しており、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂及びＺｎＣｌ₂から成るグループから選択された一価もしくは二価のアルカリ金属塩によって約２８０〜約３１０ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有している。方法は、全血球及び網状赤血球のカウント数と成熟指数とを同時に測定することもできる非インキュベーションプロセスにおける試薬を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】網状赤血球を迅速に分析するための組成物及び方法本発明は、網状赤血球を迅速に分析するための方法及び安定な水性試薬組成物に関する。より特定的には本発明は、光散乱及び蛍光によるフローサイトメトリーの技術を用いて網状赤血球を迅速に分析するための全自動方法及び安定な試薬組成物に関する。本発明の方法及び安定な水性試薬組成物の使用によって、高処理能力のマルチパラメーター血液計測装置において網状赤血球を迅速に分析し、その結果をカウント数及び成熟度によって報告することが可能になる。方法はまた、別個のインキュベーション段階を要せずに、網状赤血球カウント数及び有核赤血球（“ＮＲＢＣ”）カウント数を含む全血球（“ＣＢＣ”）カウント数をリアルタイムで分析し得る。背景赤血球（“ＲＢＣ”）は正常には網状赤血球として血流に入る。血球増生は赤芽細胞の発生に始まり、骨髄でほぼ五世代の中間有核細胞が存続し、最後に網状赤血球が形成される。網状赤血球は幼若赤血球であり、細胞から核が排除された発達のこの段階でも細網物質（リボソームＲＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡ）をまだ含んでいる。貧血症または低酸素症の状態ではこの過程が短縮されていると考えられる。これらの症状があるとき、正常よりも早い時期の網状赤血球が血流に入ると考えられる。これらの初期網状赤血球は、過剰量のＲＮＡを含むこと、サイズが普通よりも大きいこと、ヘモグロビン含量が低いこと、血流中に網状赤血球として維持される時間が長いこと、などによって認識される。１９３０年代初期に、Ｌ．Ｈｅｉｌｍｅｙｅｒ（Ｚｔｓｃｈｒ．Ｋｌｉｎ．Ｎｅｄ．１２１：３６１−３７９，１９３２）は、網状赤血球を、それらに含まれる網糸質（網状赤血球に含まれている生体染色可能物質）の量に従って４つの年齢集団に分類した。それ以来の伝統として、グループＩは３０以上の網糸質、グループIIは１５−３０の網糸質、グループIIIは３−１５の網糸質及びグループI Vは１−２の網糸質を含むという分類が用いられている。正常な網状赤血球のカウント数は、成人ではＲＢＣカウント数の約０．５〜２．５％、新生児ではＲＢＣカウント数の約２．０〜６．０％である。年齢集団でみると、正常な成人の網状赤血球の大部分はグループIVに分類され、グループＩのものは殆どない。網状赤血球のカウント数は赤血球産生の尺度である。従って、貧血症の診断及び治療に有用である。歴史的に、網状赤血球のカウント数は貧血症の病因及び分類に極めて密接に関連付けられてきた。溶血性貧血、ピルビン酸キナーゼ欠損、鎌状細胞貧血、タラセミア（地中海貧血）では網状赤血球のカウント数が増加し、巨大赤芽球性貧血、再生不良性貧血、全身性骨髄機能不全では網状赤血球カウント数が減少する。最近ではまた、化学療法剤の骨髄毒性作用を検査するために網状赤血球カウント数が使用されている。従って、網状赤血球のカウント数と網状赤血球の成熟指数とが極めて有効な情報であるということはどの血液学者も例外なく認める処である。最も頻用されている網状赤血球のカウント方法は手動操作による鏡検法である。１９４９年にＧ．Ｂｒｅｃｈｅｒ（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９：８９５−８９６，１９４９）によってニュー・メチレン・ブルー（“ＮＭＢ” ）が導入されるまではブリリアント・クレゾール・ブルーが主として使用されていた。最新のＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓ（“ＮＣＣＬＳ”）刊行物（ＮＣＣＬＳＤＯＣ．Ｈ４４−Ｐ）は、等容量の血液をＮＭＢ染料と混合し、約１５分間インキュベートしてＲＮＡを沈降させるＮＢＭ染色を承認している。次いで、血液塗抹標本を作製し、染色された網状赤血球を顕微鏡でカウントする。Ｍｉｌｌｅｒ接眼ディスクを接眼レンズに挿入する。接眼レンズ内部の小さいほうの視野の面積は大きいほうの視野の面積の１／９である。小さいほうの視野でＲＢＣ数を計測し、大きいほうの視野で網状赤血球数を計測する。連続する２０個の視野でカウントを実施し、大きいほうの視野の網状赤血球の総数を小さいほうの視野の赤血球総数の９倍の値で除算することによって網状赤血球の％を計算する。手動操作による方法の欠点は、労働集約的であること、不正確であること、時間が掛かること、主観的であること、などである。フローサイトメトリーの技術によってこれらの欠点を是正するために様々な実験が試みられた。１９８０年代には、フローサイトメーターによって網状赤血球を染色及びカウントするためにピロニン・ワイ（“ＰＹ”）及びアクリジン・オレンジ（“ＡＯ”）が使用された。現在では、全血サンプル中の網状赤血球を計数するために使用できる半自動的フローサイトメトリーの方法がいくつか知られている。既存の方法の各々では、オーラミン・オー（“ＡｕＯ”）またはチアゾール・オレンジ（“ＴＯ”）のような有機カチオン性染料を含む希釈剤を使用して網状赤血球内部のＲＮＡを染色する。インキュベーション期間中に、染料がゆっくりと細胞膜に浸透し、各網状赤血球の内部のＲＮＡに結合する。サンプルが検出ゾーンを通過するときに被染色網状赤血球が発生する信号の量は、各網状赤血球内部のＲＮＡ含量にほぼ比例する。従って、適正な励起光源及び発光検出システムを備えたフローサイトメーターを使用して、全血サンプル中の網状赤血球のパーセンテージを測定し得る。しかしながら、特に計器がマルチパラメーター血液分析システムである場合、網状赤血球測定方法の全自動化を難しくする問題の原因が数多く存在する。最大の問題は、染色サンプルを“オフライン（非直結）”で調製しなければならないことである。フローサイトメーターによるサンプル処理を可能にするためには、染料が細胞に浸透して網状赤血球のＲＮＡを十分に染色するように、サンプル調製段階で数分またはそれ以上の長いインキュベーション期間が必要である。更に、網状赤血球中のＲＮＡを染色するために常用されている染料の多くは、水溶液中で不安定であり、ＲＮＡ及びＤＮＡに結合するだけでなく、フローセルも含めて計器のプラスチック管、ガラス表面などにも結合する。このため、試験の実施後に、全システムに対して時間及び手間の掛かる洗浄作業が必要となる。Ｋａｍｉｎｓｋｙらの米国特許第３，６８４，３７７号、Ａｄａｍの米国特許第３，８８３，２４７号及びＮａｔａｌｅの米国特許第４，３３６，０２９号はいずれも、網状赤血球を染色するためにＡＯを使用することを開示している。ＡＯは網状赤血球に対して優れた染色性を有しているが（ＲＮＡに結合して赤色蛍光を発生させる）、血漿にも結合してサンプル流の高いバックグラウンド蛍光を発生させるので、良好なシグナル対ノイズ（“Ｓ／Ｎ”）比を得ることが極めて難しい。検出の問題に加えて、フローサイトメーターでＡＯを使用すると、ＡＯがプラスチック管及びフローセル表面に結合し易いことも難しい問題である。更に、ＡＯ法は５〜７分間のインキュベートを必要としており、最新の高処理能力のマルチチャンネル血液分析装置を用いて方法を実施するためにはこの所要時間はあまりにも長い。Ｓａｇｅ，Ｊｒ．の米国特許第４，７０７，４５１号はチオフラビン・ティー（ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎＴ）またはクリサニリン（ｃｈｒｙｓａｎｉｌｉｎｅ）から成る試薬組成物を開示している。この方法では網状赤血球が染料を吸収するまでに約７分間を要し、また、バックグラウンド蛍光があまりにも高いのでグループIVの網状赤血球の検出に適した良好なＳ／Ｎ比が得られない。Ｌｅｅらの米国特許第４，８８３，８６７号は、ＲＮＡ及びＤＮＡを染色するための染料を開示している。網状赤血球の分析に好適な染料はＴＯであり、方法は最短でも３０分のインキュベーション時間を要する。ＴＯは高い核酸結合親和性及び量子効率を有しているが、ＴＯの膜透過速度は極めて遅い（３０分）ので、高処理能力の臨床用マルチパラメーター血液計測装置における使用には不適である。Ｋｕｒｏｄａの米国特許第４，９７１．９１７号は、成熟赤血球の非特異的染色を抑制するためのＡｕＯと炭酸塩とを含有する試薬組成物を教示している。米国特許第４，９８５，１７６号は、フローサイトメトリーで使用するための別の網状赤血球染色試薬を開示しており、この試薬は、好ましい染料としてＡｕＯを含み、染色に必要なサンプルインキュベーション時間が３０秒〜２０分の範囲である。フローサイトメーターでＡｕＯを使用するときの欠点は、ＡＯのような染料はＤＮＡ及びＲＮＡだけに親和性を有しているのでなく、多様な種類のプラスチック及びガラスの表面にも親和性を有しているので、マルチパラメーター血液計測装置を用いて方法を実施することが極めて難しいことである。ＴＯＡＭｅｄｉｃａｌＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＣｏ．，Ｌｔｄ．は、そのＳｙｓｍｅｘ（登録商標）Ｒ−１０００及びＲ−３０００単独型全自動網状赤血球分析装置にＡｕＯ法を組込むことには成功したが、ＮＥ８０００またはＳＥ９０００計器のようなマルチパラメーター血液計測装置で同方法を使用することはできなかった。Ｃｏｌｅｌｌａらの米国特許第５，２８４，７７１号は、網状赤血球中のＲＮＡを染色するカチオン性染料(オキサジン(登録商標)７５０)と、染色サンプルをフローサイトメトリー的光計測システムで処理するときに偏平な赤血球の方向性ノイズを除去する両性球状化剤とを含む単一試薬溶液によって全血サンプルを処理する段階から成る方法及び試薬組成物を開示している。最近になってＭｉｌｅｓＩｎｃ．は、彼らの最新のＨ＊３（登録商標）血液計測装置に上記方法を組込んだ。この計器は、へリウム／ネオン（“ＨｅＮｅ”）電子光学的検出システムを備えており、網状赤血球を染色するためのオキサジン（登録商標）７５０核酸染料と、容量分析の準備として赤血球と網状赤血球とを球状化する両性界面活性剤とを使用している。Ｈ３＊（登録商標）を用いた網状赤血球計測方法は、血液と網状赤血球試薬とを手動操作で混合し次いでオフラインで１５分間のインキュベーションを必要とする半自動方法でしかない。この方法は、グループIVの網状赤血球の検出感度が低い。ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎもまた、彼らのＳＴＫＳ（登録商標）及びＭａｘｉｍ（登録商標）の血液分析装置に半自動の網状赤血球分析方法を組込んだ。Ｃｏｕｌｔｅｒは彼らの技術をＶＣＳ（Ｖｏｌｕｍｅ，ＣｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＳｃａｔｔｅｒ（容量、導電率及び散乱））と呼ぶ。ＶＣＳを実施するためには、先ず血液サンプルをＣｏｕｌｔｅｒの網状赤血球用染料（ＮＭＢ含有）と混合する。次いで、混合物を室温で５分間インキュベートする。次に、染色された少量の血液サンプルを、硫酸を含有する清澄化溶液で希釈する。方法が低感度であること及び赤血球の分離度がよくないことが方法の精度に極めて不利な影響を与えている。これは、（清澄化溶液によって溶解された）網状赤血球間質、他の細胞落屑及び血小板がノイズを発生し、適正な信号の識別を難しくするからである。凝集した血小板だけは拡大された信号を発生し得るので、血小板の信号はＲＢＣ及び網状赤血球間質によって発生した信号と干渉しない。Ｋｕｒｏｄａの米国特許第４，９８１，８０３号は、フローサイトメトリーの方法によって網状赤血球をカウントするためのＡｕＯを含有する試薬を開示している。試薬は２種類の溶液、即ち、染料（ＡｕＯ）を非水性溶媒に溶解した染色用原液と、網状赤血球中のＲＮＡの最適染色条件を充たすバッファ溶液とから成る。Ｋｕｒｏｄａは、これらの２つの溶液を染色直前に混合することによって、網状赤血球をカウントするための安定な最終染色用溶液が常に得られると主張している。この方法にも問題は多い。最大の問題は、彼らが選択した非水性溶媒のグループ（エチレングリコール、トリエチレングリコール、ジエチレングリコール）が高い屈折率を有していることである。このような屈折率はマルチパラメーター血液分析装置における使用に不適である。その理由は、（リン酸緩衝生理食塩水のような）水性被覆溶液を使用する必要があり、このような被覆溶液が屈折率約１．３３４を有しているからである。Ｋｕｒｏｄａ特許に記載されているメタノール、エタノールまたはプロパノールのような（被覆溶液である生理食塩水に近い屈折率をもつ）他の溶媒は極めて揮発性であり、従ってこれらも適当でない。更にこの方法においては、安定な網状赤血球試薬を提供するために、少量の原液と多量の水性バッファとをオンライン（直結）で混合する必要があるが、このような混合は技術的に極めて難しい。上記のような理由から、水性環境で安定な試薬を使用し、フローサイトメーターまたは高処理能力のマルチパラメーター血液分析装置において実施できる迅速で正確な網状赤血球の分析方法が久しく要望されている。発明の概要網状赤血球を計数するための別個のインキュベーション段階を必要とすることなく全血サンプル中のＣＢＣ及び網状赤血球を同時に計数する方法が提供される。１つの実施態様は、網状赤血球染色量の非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ、Ｂｉｓ− Ｔｒｉｓバッファ及びＴｒｉｓバッファから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファ溶液と、Ｎ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピレン− ポリオキシエチレンブロックコポリマー、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マルトシド、デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシドから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とから成る水性の核酸染色用試薬を提供する。試薬はｐＨ約６．０〜約８．０を有しており、水性試薬溶液中でシアニン染料と干渉しないかまたは沈殿しない一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整された浸透性（オスモル濃度(osmolarity)）を有している。別の実施態様は、網状赤血球の計数方法を提供する。先ず、全血サンプルのアリコートを水性の核酸染色用試薬と混合する。次いで、このサンプル／試薬アリコートを別個にインキュベートすることなく分析用光学フローセルに搬送する。細胞がほぼ一度に１個の割合で被照射光学フローセルを通過する際に、光散乱特性値及び蛍光特性値が検出され、この特性値に基づいてサンプル中の網状赤血球の計数が行われる。別の実施態様は、Ｓｙｂｒ１１、Ｓｙｂｒ１４、Ｓｙｂｒ１６及びｓｙｔｏ１２（すべてＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手可能）から成るグループから選択された約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．３μ ｇ／ｍｌの染料と、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭのイミダゾールバッファと、Ｎ，Ｎ −ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミドとポリオキシプロピレン −ポリオキシエチレンブロックコポリマーとから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とから成り、ｐＨ約６．８〜約７．２を有しており、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂及びＺｎＣｌ₂から成るグループから選択された一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２８０〜約３１０ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有している水性の核酸染色用試薬を提供する。更に別の実施態様は、網状赤血球数と全血球数との同時計数方法を提供する。ＣＢＣ（全血球）数を測定するために全血サンプルの第一アリコートの分析を進行させながら、サンプルの第二のアリコートを水性の核酸染色用試薬と混合し、サンプルの網状赤血球成分を上記の手順で分析する。図面の簡単な説明図１ａは、５．６３％の網状赤血球を含む臨床サンプルの前方散乱（“ＦＳＣ ”）信号対緑色蛍光（“ＦＬ１”）信号の二次元のＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）表示（細胞図）である。図１ｂは、図１ａのゲートされた赤血球（“ＲＢＣ”）集団のＦＬ１ヒストグラムである。図１ｃは、２．６３％の網状赤血球と増加濃度の白血球（“ＷＢＣ”）集団とを含む臨床サンプルのＦＳＣ信号対ＦＬ１信号のＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）細胞図である。図１ｄは、図１ｃのゲートされたＲＢＣ集団のＦＬ１ヒストグラムである。図２ａ及び図２ｂは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）計器で実施した経時試験の結果を表すグラフである。図３ａは、増加濃度の網状赤血球を含む臨床サンプルのＦＳＣ信号対ＦＬ１信号を示すＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）細胞図である。図３ｂは、図３ａの血液サンプルのゲートされた赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムである。図４ａは、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ血液分析装置で測定した正常血液サンプルの細胞図であり、中角光散乱（“ＩＡＳ”）対ＦＬ１をいずれも４桁の対数で表す。図４ｂは、図４ａのゲートされたＲＢＣ集団及び網状赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムを示す。ヒストグラムの１×目盛表示はＲＢＣピークを示し、ヒストグラムの５×目盛表示は網状赤血球集団を示す。図５ａは、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ血液分析装置で測定した極めて低い濃度の網状赤血球及び増加濃度のＷＢＣを含む臨床血液サンプルのＩＡＳ対ＦＬ１の細胞図である。図５ｂは、図５ａのゲートされたＲＢＣ及び網状赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムを示す。ヒストグラムの１×目盛表示及び５×目盛表示の双方が示されている。図６ａは、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ血液分析装置で測定した高レベルの網状赤血球（２０．５％）とＲＢＣ（９６．４ｋ／リットル）とを含む抗凝固処理した臨床血液サンプルのＩＡＳ対ＦＬ１の細胞図である。図６ｂは、図６ａのゲートされたＲＢＣ及び網状赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムを示す。ヒストグラムの１×目盛表示及び５×目盛表示の双方が示されている。図７は、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓ（“ＮＣＣＬＳ”）の方法と本発明の全自動方法とを実施することによって得られた網状赤血球の結果を比較するグラフである。図８は、網状赤血球を検出するためにチアゾールオレンジ染色方法及び本発明の全自動方法を実施し、得られた網状赤血球分析結果の線形回帰データの比較を示すグラフである。分析用サンプルとしては図７に示したサンプルと同じサンプルを使用した。図９は、本発明の全自動方法を実施することによって測定した網状赤血球％の線形性を示すグラフである。図１０は、種々の非イオン性界面活性剤の存在下及び非存在下の、ＲＮＡ結合した有標シアニン染料、Ｓｙｂｒ１１（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の保存寿命試験における発光スペクトルである。試薬を室温で３ヵ月半保存した。図１１は、ＲＮＡ結合した有標シアニン染料、Ｓｙｂｒ１１の保存寿命試験における発光スペクトルであり、冷蔵下で４ヵ月の安定性が証明される。図１２は、ＲＮＡ結合した有標シアニン染料、Ｓｙｂｒ１１の保存寿命試験における発光スペクトルであり、高温下で３週間の安定性が証明される。図１３は、１．０％のポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー（“Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７”）を添加するかまたは非添加のＢｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ中のＲＮＡ結合した有標シアニン染料、Ｓｙｂｒ１６（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の経時試験における発光スペクトルを示す。試薬を室温で６カ月半保存した。図１４は、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加した種々のバッファ中のＲＮＡ結合した有標シアニン染料、Ｓｙｂｒ１１（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の保存寿命試験における発光スペクトルを示す。全部の試薬を室温で６週間保存した。図１５ａは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）サイトメーターで測定したＦＳＣ信号対ＦＬ１信号の二次元表示である。図１５ｂは、図１５ａのゲートされた赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムである。図１５ｃは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターで行った経時試験の結果を、１５秒から４．０分までの網状赤血球％として表すグラフである。発明の詳細な説明本発明の実施態様は、フローサイトメトリーの方法論を利用して血液サンプル中の網状赤血球を迅速かつ正確に分析する方法及び安定な水性試薬系を包含する。これらの実施態様は概して、網状赤血球と有核赤血球（“ＮＲＢＣ”）を含む全血球（“ＣＢＣ”）とを計数するための迅速な同時分析を行うものである。本発明の実施態様は、分析用計器及び血液分析方法の使用を含む。一般にこのような分析用計器の１つは全自動インピーダンス分析装置から成る。このような全自動計器の１つにおいては、全自動光散乱分析装置が全自動インピーダンス分析装置に統合され、全自動蛍光分析装置が全自動光散乱分析装置に統合されている。本発明の開示において、全自動分析装置なる用語は、サンプルを分析するためにオペレーターの介入が不要な装置、即ち、オペレーターは全自動分析装置にサンプルを導入するがその後はオペレーターがもはや介入する必要がない装置を意味する。更に、血液分析装置は、細胞を実質的に絶対項として定量及び分類する。このような分析装置は、細胞を大きさ及び形状によって分類するために電気的インピーダンス及び光学的散乱特性の少なくとも１つを使用する。本発明を実施するために、種々の分析装置をモニター及び制御し、分析装置からデータを収集し、結果を報告する制御装置を備えた全自動血液分析装置を普遍的に利用し得る。例えば、分析装置に制御装置が統合されているとき、オペレーターは全血サンプルに関するデータを制御装置に入力し得る。オペレーターは制御装置を用いて全血サンプルに対して実施すべき試験バンクを選択する。オペレーターは統合分析装置の集中的サンプル処理領域に全血サンプルを導入する。制御装置が分析装置を起動し、分析装置は制御装置の指令下で全血サンプルに対する分析を自動的に実行し得る。制御装置は分析装置から得られたデータを利用し、結果を公式化する。制御装置は結果をオペレーターに報告する。全血サンプルを統合分析装置に導入した後はオペレーターの操作が全く不要であることに注目されたい。好ましい実施態様では全血サンプルの調製が完全に自動化されているので、先ず従来の血液分析試験が行われ、次いでインキュベートされたサンプルの試験が行われる。分析装置に制御装置が統合されているので、血液分析装置及びフローサイトメトリー分析装置の双方から制御装置にデータが供給される。従って、制御装置は患者の血液分析の総合結果をオペレーターに報告し得る。明確な理解を得るために以下の記載では本発明の特定実施態様について詳細に説明するが、他の実施態様も可能であることに留意されたい。記載の実施態様の諸要素の所望の任意の組合せも可能である。本発明の１つの目的は、安定な水性試薬組成物を提供することである。この試薬は、網状赤血球を染色し得る非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファと４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スルホン酸（“Ｈｅｐｅｓ”）バッファとビス（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スルホン酸（“Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ”）バッファとトリスヒドロキシメチルアミノメタン（“Ｔｒｉｓ”）バッファとから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのバッファとを含み、ｐＨ約６．０〜約８．０を有し、一価もしくは二価のアルカリ金属塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有しており、更に、膜透過を容易にし水性等張溶液中のシアニン染料を安定化する非イオン性界面活性剤（界面活性剤次第で約５ｍｇ／ｄｌ〜約１．０ｇ／ｄｌ）を含む。好ましくは、染料が環置換されており、ＤＮＡまたはＲＮＡと結合したときに増強された蛍光を示す。更に好ましくは、試薬が、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．３μｇ／ｍｌの環置換された非対称シアニン染料を含む。本発明の別の目的は、本発明の試薬系を使用して網状赤血球及びＣＢＣの差分（differential）を迅速かつ連続的に検出及び算定する方法を提供することである。このような方法の特に顕著な特徴は、別個のインキュベーション段階を設ける必要がないことである。約１０秒〜約６０秒という必要最小限のインキュベーション期間が必要とされるだけである。このような実施態様の１つは、全血サンプル中の網状赤血球数の計測が、全血球（“ＣＢＣ”）分析を得るためのサンプルの別のアリコートの区別(differentiating)と同時進行的に行われる方法を提供する。この方法は、サンプルの１つ以上のアリコートを分析及び区別すべく全自動分析装置の夫々異なる場所に案内する段階を含み、この段階中にサンプルの網状赤血球アリコートを染色用試薬と混合することを特徴とする。該試薬は、網状赤血球染色量の非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファとＨｅｐｅｓバッファとＢｉｓ−ＴｒｉｓバッファとＴｒｉｓバッファとから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファ溶液と、Ｎ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、ｎ−テトラデシル−Ｄ −マルトシド、デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシドから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とから成り、試薬が、ｐＨ約６．０〜約８．０を有し、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂及びＺｎＣｌ₂のような、水性試薬溶液中でシアニン染料と干渉しないかまたは沈殿しない一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有している。試薬／網状赤血球アリコートを全自動分析装置の光学的検出ゾーンに案内する。次いで、試薬／網状赤血球アリコートは被照射検出ゾーンをほぼ一度に１細胞の割合で通過し、蛍光イベント及び散乱光イベントを生じる。これらのイベントを検出し、検出結果に基づいてサンプル中に存在する網状赤血球の数を決定する。本発明の試薬系に使用できる非対称染料は一般に以下の特性値を有している：１．最大吸光度：４８８＋２０ｎｍ２．高い核酸結合親和性３．高い量子効率：≧０．１４．モル吸光係数：≧１０，０００５．ＲＮＡまたはＤＮＡに結合したときに増強された蛍光：≧２０６．膜透過速度：≦２分典型的には、本発明の水性試薬及び網状赤血球計数方法において使用される染料は水性環境で極めて不安定である。このクラスで試験した複数の染料の安定度データを図１０から図１４に示す。本発明の試薬系の１つの実施態様は、約０．０５μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌの濃度のＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によって販売されている有標染料Ｓｙｂｒ１１と、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのイミダゾールバッファと、約５ｍｇ／ｄｌ〜約２０ｍｇ／ｄｌのＮ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド（“ＢＩＧＣＨＡＰ”）と、約０．０２％〜約０．０５５％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン＋２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）とから成る。ｐＨは１ＮのＨＣｌによって約６．８〜約７．２に調整され、オスモル濃度はＮａＣｌによって約２７０〜約３１９ｍＯｓｍ／リットルに調整されている。試薬系の第一の成分は染料である。このような染料の１つのクラスは、参照によって本発明に含まれる国際特許第ＷＯ９４／２４２１３号，「環置換された非対称染料（ＣＹＣＬＩＣ−ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤＵＮＳＹＭＭＥＴＲＩＣＤＹＥＳ）」に開示されたような非対称シアニン染料である。更に、本発明で使用される染料は、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合したときに増強された蛍光を示す。かかる有用な染料はまた、ＲＮＡ及びＤＮＡに対する高い結合親和性と高い量子効率とを有していなければならない。本文及び請求の範囲に記載の特徴を示す種々の非対称シアニン染料を使用できると予測される。このような染料のいくつかの非限定例としては、同じくＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）（“ＭＰＩ”）から得られるＳｙｂｒ１１、Ｓｙｂｒ１４、Ｓｙｂｒ１６がある。同じくＭＰＩから供給されるＳｙｔｏ１２のような他の非対称シアニン染料も本発明の実施に役立つ。Ｓｙｔｏ１２は、メチンブリッジを介してピリジニン環系またはキノリン環系に結合した置換ベンザゾリウム環系を含む中性の非対称シアニン染料である。試薬の第二の成分は、約６．０〜約８．０のｐＫａを有し、（ＲＮＡまたはＤＮＡの染色に必要な）水溶液中のシアニン染料の所要濃度を長期間維持し得るバッファである。このようなバッファは、本発明を実施する際に使用されるシアニン染料または染料を安定化するために使用される非イオン性界面活性剤と反応してはならない。代表的なバッファは、イミダゾール、Ｈｅｐｅｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｓである。試薬系の第三の成分は非イオン性界面活性剤である。この界面活性剤の種類に従ってまたは使用される複数の非イオン性界面活性剤の組合せ次第で、濃度を約５ｍｇ／ｄｌ〜約１ｇ／ｄｌにしなければならない。（１種または複数の）界面活性剤は、シアニン染料の細胞膜透過速度を促進すると考えられる（３０秒以内）。界面活性剤は更に、等張性水溶液中のシアニン染料の溶解度及び安定度を向上させる。しかしながら、（１種または複数の）このような界面活性剤は、たとえ低濃度であっても、沈殿したり、シアニン染料と反応したり、ＲＢＣを溶解したりしてはならない。このような界面活性剤の非限定例は、ＢＩＧＣＨＡＰ、ｎ −ドデシル−Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー（“Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７”）、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マルトシド、デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル− Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシドである。試薬系の更に別の成分は、網状赤血球を含む赤血球または白血球の溶解を防止するために試薬のオスモル濃度を約２３０ｍＯｓｍ／リットル〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整する一価または二価のアルカリ金属塩である。このような塩は、溶液中でシアニン染料と反応したりまたは沈殿してはならない。このような塩の例としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂、ＺｎＣｌ₂などがある。任意成分としては、試薬中での微生物の増殖を防止する防腐剤がある。このような防腐剤は、細胞または被染色細胞の光散乱特性または蛍光発光特性を変化させてはならない。このような防腐剤の例としては、Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）１５０、ナトリウムアジドなどがある。上記の試薬系を使用することによって、フローサイトメーターまたは他の全自動血液分析装置における網状赤血球の迅速な分析が可能である。１つの実施態様では、５μｌの全血サンプルを、本文及び請求の範囲に記載の１．０ｍｌの試薬系と混合し、サンプルと試薬との混合物を、混合後３０〜６０秒以内、最速では１０秒という短い時間内に市販のフローサイトメーターに導入する。図１ａから図１ｄは、実施例１に記載の手順で調製した正常血液のサンプルを用いて行ったこのような方法の結果を示す。本発明の別の実施態様は、全自動的な高処理能力のマルチパラメーター血液分析装置によって網状赤血球を迅速に定量分析し得る。参照によって本発明に含まれる１９９４年８月１日出願の「全自動分析の実施方法及び装置（ＭＥＴＨＯＤＡＮＤＡＰＰＡＲＡＴＵＳＦＯＲＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧＡＵＴＯＭＡＴＥＤＡＮＡＬＹＳＩＳ）」という表題の米国特許出願第０８／２８３，３７９号は、特に光散乱信号の軸方向光減損（“ＡＬＬ”）と中角散乱（“ＩＡＳ” ）とを利用し、計器が全血サンプル中の細胞及び細胞サブクラスを全自動的に識別できるように種々の蛍光信号を検出する全自動血液分析装置を開示している。しかしながら一般には、本発明を実施する方法は、全血サンプルを、存在するいかなる網状赤血球に対してもそのＲＮＡを染色する試薬と混合し、ほぼ一度に１細胞が被照射光学フローセルを通過するように混合物を流動させ、細胞からの散乱光及び放出蛍光を検出し、サンプル／試薬混合物を別個のインキュベーション段階または期間で処理することなくサンプル中に存在する網状赤血球の量を決定する段階から成る。本発明の試薬の１つは、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．３μｇ／ｍｌの非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ及びＴｒｉｓバッファから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファと、界面活性剤の種類または複数の界面活性剤の組合せ次第で約５ｍｇ／ｄｌ〜約１．０ｇ／ｄｌの非イオン性界面活性剤とから成り、試薬が約６．０〜約８．０のＰＨを有し、一価または二価のアルカリ金属塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有している。上記のマルチパラメーター血液分析装置において全血サンプル中の網状赤血球のパーセンテージと絶対カウント数とを分析するために、約７８５６μｌの希釈／被覆（シース）溶液（等張性生理食塩水）を収容したＲＢＣカップにサンプル吸引プローブで約１８．７５μｌの全血サンプルを導入し、双方の流体を混合する。次いで、サンプル中のＲＢＣの絶対カウント数を電子的に測定するために希釈サンプルをシースドインピーダンスアパーチャー（ｓｈｅａｔｈｅｄｉｍｐｅｄａｎｃｅａｐｅｒｔｕｒｅ）に搬送する（参照によって本発明に含まれる１９９４年８月１日出願の“ＭＥＴＨＯＤＡＮＤＡＰＰＡＲＡＴＵＳＦＯＲＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧＡＵＴＯＭＡＴＥＤＡＮＡＬＹＳＩＳ”という表題の米国特許出願第０８／２８３，３７９号のＲＢＣ分析用計器校正の詳細な記載参照）。同時に、約２００μｌの希釈サンプルを６００μ ｌの本発明の試薬を収容した別の容器（“網状赤血球受容カップ”）に移送し、混合する。準備（混合）したサンプルを、シース付きの検出用光学フローセルに搬送する。希釈／被覆溶液によって包囲された層状サンプル流の形態で細胞がほぼ一度に１個ずつフローセルを通過するときに測定プロセスが開始される。被測定容積（ｖｏｌｕｍｅ）は光ビームによって照射されており、流動軸に垂直な２つの次元の寸法は流体力学的に収束した細胞流によって限定され、流動軸に平行な１つの次元の寸法は約１７ミクロンというレーザービームの垂直方向狭窄ビーム幅によって限定されている。この試験を実施するとき、サンプルの流速は約２．０μｌ／秒であり、ＲＢＣ及び網状赤血球のサンプル流の対応する被照射検出容積は約８０×５×１７ミクロンの寸法をもつ楕円筒である。１７ミクロンは円筒の軸に沿って測定された寸法である。この時点で、図４ａの細胞図のＩＡＳ及びＦＬ１の二次元特徴空間に示すように、細胞の存在は、３°〜１０°のコーン内の光を検出する中角散乱ホトダイオード及び青色蛍光ＦＬ１を検出する光電子増倍管（“ＰＭＴ” ）によって検出される。細胞が上記被照射容積を通過するときにパルスが発生し、パルスはこれらの検出器によって測定される。次にこれらのパルスの振幅が濾過され、増幅され、デジタル化され、対応するＩＡＳ及びＦＬ１の二次元特徴空間にリストモードで記憶される。細胞は８秒間カウントされる。上記の流速及び希釈率を用いた場合、血液１マイクロリットルあたりＲＢＣカウント数が５百万個の正常被験サンプル中で生じるイベントカウントの割合は毎秒５９５０であろう。次に、上記のＩＡＳ及びＦＬＩの特徴空間のリストモードデータにアルゴリズムが応用され、２０秒以内の計算時間で以下のパラメーターが決定される。１．ＲＢＣゲート：網状赤血球を含むＲＢＣ集団をゲートするがＷＢＣ及び血小板を排除することによって、ＷＢＣ及び血小板を排除する。２．網状赤血球のパーセント：ゲートされたＲＢＣ集団をそれらのＦＬ１信号の大きさに従って再分析する。成熟ＲＢＣに属する領域を定義するために、対数適合度（ｌｏｇｆｉｔ）をＦＬ１ヒストグラムに適用し、この領域よりも上にあるＦＬ１信号を有する細胞を網状赤血球として標識する。網状赤血球のカウント数をＲＢＣカウント総数で除算することによって網状赤血球の％を計算する。３．網状赤血球の絶対カウント数：網状赤血球のパーセントにＣＢＣモードで得られたサンプル中のＲＢＣの絶対カウント数を乗算することによって得られる。４．網状赤血球成熟指数（“ＲＭＩ”）：ＲＭＩは、正常な網状赤血球集団の平均蛍光を１倍以上の標準偏差（“Ｓ．Ｄ．”）で上回るＦＬ１信号を有している網状赤血球のパーセントとして表す。上記は単なる便宜的な記載であり、本発明のＲＭＩの式が上記のアルゴリズムにのみ限定されることは全くない。以下の実施例は、光散乱及び蛍光によるフローサイトメトリーの技術を用いて網状赤血球を迅速に分析するための試薬組成物及び該組成物を組込んだ方法を示す。これらの実施例は単なる代表例であり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないことは理解されよう。実施例１５マイクロリットルの臨床サンプルを１．０ｍｌの試薬と混合した。試薬は、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０＋０．１に調整した５０ｍＭのイミダゾールバッファと、６．４ｇ／リットルのＮａＣｌと、０．１マイクログラム／ｍｌのＳｙｂｒ１４（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７と、０．０３％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００とから成る。次いで、サンプルと試薬との混合物を３０〜６０秒以内にＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．）に導入し、試薬組成物中の染料によって膜透過速度を測定した。図１ａは、前方散乱（ＦＳＣ）信号対緑色蛍光（ＦＬ１）信号の二次元表示である。図１ｂは、ゲートされた赤血球集団のＦＬ１ストグラムであり、染色された網状赤血球集団が成熟ＲＢＣ集団の右側に示されている。図１ｃ及び図１ｄは夫々、第二の臨床サンプルの結果を示す図１ａ及び図１ｂと同様のグラフである。実施例２図２ａは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターで実施した経時試験の結果を長時間（３０秒〜３０分）にわたる網状赤血球の％として表すグラフであり、図２ｂは、網状赤血球の平均ＦＬ１として表すグラフである。双方の図から理解されるように、網状赤血球の％は３０秒以内に定常状態に到達し、染色濃度は３０秒以内にピークの約８０％に到達する。本発明によってこのように迅速な染色が得られるので、別個のインキュベーション装置または方法を要せずに本文中に開示した方法及び試薬を全自動血液分析装置及びフローサイトメーターに組込むことが可能である。実施例３約１５％の網状赤血球を含む５マイクロリットルの臨床サンプルを１．０ｍｌの本発明試薬と混合した。試薬は、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０＋０．１に調整した５０ｍＭのイミダゾールバッファと、６．４ｇ／リットルのＮａＣｌと、０．２マイクログラム／ｍｌのＳｙｂｒ１１（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７と、０．０３％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００とから成る。次いで、サンプルと試薬との混合物を３０秒以内にＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターに導入し、サンプル中の網状赤血球の％を測定した。図３ａは、ＦＳＣ信号対ＦＬ１信号の二次元表示であり、図３ｂは、ゲートされた赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムである。データが示すように、ＷＢＣ及び血小板はＲＢＣ及び網状赤血球の集団から十分に分離され、染色された網状赤血球のＦＬ１強度は、赤血球のＦＬ１ヒストグラム上で血液サンプル中の網状赤血球濃度の定量分析に用いる網状赤血球領域を容易に定義できるような強度である。実施例４この実施例では、全自動的な高処理能力のマルチパラメーター血液分析装置（１９９４年８月１日出願の“ＭＥＴＨＯＤＡＮＤＡＰＰＡＲＡＴＵＳＦＯＲＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧＡＵＴＯＭＡＴＥＤＡＮＡＬＹＳＩＳ”という表題の米国特許出願第０８／２８３，３７９号）を使用した。正常被験者から採取した１８．７５μｌのＥＤＴＡ−抗凝固処理全血サンプルを、サンプル吸引プローブを用いて、約７８５６μｌの希釈／被覆溶液（等張性生理食塩水）を収容したＲＢＣカップに導入し、混合した。次いで、サンプルのＲＢＣ絶対カウント数を測定するために希釈サンプルをシースドインピーダンスアパーチャーに搬送した。同時に、約２００マイクロリットルの希釈全血サンプルを、６００マイクロリットルの本発明試薬を収容した網状赤血球のカップに移した。この試薬は、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０＋０．１に調整した５０ｍＭのイミダゾールバッファと、６．４ｇ／リットルのＮａＣｌと、０２μｇ／ｍｌのＳｙｂｒ１１と、１０ｍｇ／ｍｌのＢＩＧＣＨＡＰと、０．０３％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００とを含んでいた。次いで、サンプル／試薬混合物を散乱及び蛍光を検出するシース付きの光学フローセルに搬送した。システム検出プロセスは前述の通りであり、１９９４年８月１日出願の“ＭＥＴＨＯＤＡＮＤＡＰＰＡＲＡＴＵＳＦＯＲＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧＡＵＴＯＭＡＴＥＤＡＮＡＬＹＳＩＳ”という表題の米国特許出願第０８／２８３，３７９号の記載内容全部が参照によって本明細書に含まれるものとする。サンプル／試薬混合物の搬送に要する処理停止時間は僅か１０秒に短縮される。ＩＡＳ対ＦＬ１細胞図上で網状赤血球を含むＲＢＣ集団がゲートされ（図４ａ）、ゲートされたＲＢＣ集団のＦＬ１ヒストグラム（図４ｂ）を利用して網状赤血球のカウント数及びＲＭＩの測定値が得られる。ＦＬ１ヒストグラムの１×表示はＲＢＣ集団ピークを示す目盛りであり、５×表示は網状赤血球集団を示す。これらの結果は、付加的なサンプルインキュベーション用装置もしくは方法またはオフラインのサンプル調製段階を要せずに、サンプル中の網状赤血球とＣＢＣとの同時分析が可能であることを示す。実施例５標準方法で測定して低濃度の網状赤血球及び増加濃度のＷＢＣを含むことが判明した臨床サンプルを、サンプル吸引プローブを用いて、約７８５６μｌの希釈／被覆溶液（等張性生理食塩水）を収容した米国特許出願第０８／２８３，３７９号に記載の計器のＲＢＣカップに導入する。次いで、希釈したサンプルをシースドインピーダンスアパーチャーに搬送し、サンプルのＲＢＣ絶対カウント数を測定する。同時に、約２００マイクロリットルの希釈サンプルを、６００マイクロリットルの本発明試薬を収容した網状赤血球のカップに移送し、混合した。この試薬は、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０＋０．１に調整した５０ｍＭのイミダゾールバッファと、６．４ｇ／リットルのＮａＣｌと、１．０ｍｌあたり０．２μｇのＳｙｂｒ１１と、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７と、２．５ｍｇ／ｄｌのｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシドと、０．０３％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００とを含んでいた。次に、サンプル／試薬混合物をシース付きの検出用光学フローセル１００に搬送した。システム検出プロセスについては前述した。ＩＡＳ対ＦＬ１細胞図では網状赤血球を含むＲＢＣ集団がゲートされ（図５ａ）、ゲートされたＲＢＣ集団のＦＬ１ヒストグラム（図５ｂ）を使用して網状赤血球のカウント数及びＲＭＩの測定値を得る（このサンプルの網状赤血球のカウント数はＲＭＩの測定には少なすぎた）。図５ｂのＦＬ１ヒストグラムは、ＲＢＣ集団ピーク（１×表示）及び網状赤血球集団（５×表示）の双方を示す目盛りを有している。このサンプルでは、検出可能な網状赤血球集団は観察できない。実施例６この実施例では、増加濃度の網状赤血球（標準方法で測定して２０％）及び増加濃度のＷＢＣ（９６ｋ／リットル）を含む臨床サンプルを使用した。サンプルを実施例４に記載の手順で処理した。結果を図６ａ及び６ｂに示す。データが示すように、本発明は、ＷＢＣ及び血小板を正確に排除し、暗い網状赤血球と明るい網状赤血球との双方を同定及びカウントし得る。上記のアルゴリズムを使用するとこのサンプルは６９．２％という高いＲＭＩ値を示した。実施例７実施例４に記載の高処理能力のマルチパラメーター血液分析装置及び実施例１に記載のＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターにおいて、室温で３０分のインキュベーションを要するチアゾールオレンジ（ＴＯ）法（米国特許第４，８８３，８６７号）を用いて７７の臨床サンプルを分析した。各サンプルに対してＮＣＣＬＳ標準方法（詳細に関しては従来技術の項参照）による処理も実施した。次に、本発明の非インキュベーション方法の結果を、ＴＯ法及びＮＣＣＬＳ法の結果に比較した。線形回帰プロットを図７及び図８に示す。データが示すように、本発明の結果は、ＮＣＣＬＳ鏡検法（Ｒ＝０．９８２、勾配＝１．０５、Ｙ軸切片＝０．００２）及びＴＯ法（Ｒ＝０．９８６、勾配＝０．９６４、Ｙ軸切片＝０．００５）の結果と十分な相関関係を有している。実施例８一方は正常ウサギ（サンプル♯１）及び他方は網状赤血球増加症のウサギ（サンプル♯２）から２つのＥＤＴＡ−抗凝固処理ウサギ血液サンプルを作製した。サンプル♯１は１．９％の網状赤血球を含み、サンプル♯２は９０％を上回る濃度の網状赤血球を含んでいた。以下のプロトコルに従って線形性サンプルを調製した。１．双方のサンプルのＲＢＣ濃度を３．５＋０．０５Ｍ／リットルに調整した。２．以下の表に示す割合で２つのサンプルを混合することによって６レベルの線形性サンプルを調製した。３．米国特許第０８／２８３，３７９号の血液分析装置でサンプルを分析した。４．全血サンプル１μｌあたりの網状赤血球の％及び絶対数の理論値を以下の式に従って計算した：サンプルの網状赤血球の理論的％＝〔（ｎ／１．５）×Ａ％〕＋〔（ｍ／１．５）×Ｂ％〕×１００但し、ｎ＝線形性サンプル中のサンプル♯１の容量ｍ＝線形性サンプル中のサンプル♯２の容量１．５＝線形性サンプルの総容量Ａ％＝非希釈サンプル♯１中の網状赤血球の％Ｂ％＝非希釈サンプル♯２中の網状赤血球の％、及び、網状赤血球の理論的絶対数＝〔（ｎ×Ａ♯）＋（ｍ×Ｂ♯）〕／１．５×サンプルの網状赤血球の理論的％但し、ｎ＝線形性サンプル中のサンプル♯１の容量ｍ＝線形性サンプル中のサンプル♯２の容量１．５＝線形性サンプルの総容量Ａ♯＝非希釈サンプル♯１中の網状赤血球の♯ Ｂ♯＝非希釈サンプル♯２中の網状赤血球の♯。５．理論値を横座標、マルチパラメーター血液計測装置から得られた値を縦座標として線形性曲線をプロットした。結果を図９に示す。データが示すように、本発明の方法及び試薬は、網状赤血球濃度９０％まで線形応答を示す。実施例９種々の界面活性剤を評価するために本発明に従って調製した数種類の試薬の安定度を図１０〜１４に示す。安定度試験は、ＨＩＴＡＣＨＩＦ４５００（登録商標）計器（励起波長４８８ｎｍ）を用い、以下のプロトコルに従って試薬にＲＮＡを添加し、ＲＮＡに結合したシアニン核酸染料の発光スペクトルを走査することによって行った。１．脱イオン水中のＲＮＡ（仔ウシ肝臓ＲＮＡ、ＳｉｇｍａＣａｔ．Ｎｏ．Ｒ７２５０）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。２．各ＲＮＡ溶液の１００μｌの原液を１．６ｍｌの本発明の試験試薬に添加し、混合した。３．次いで、ＨＩＴＡＣＨＩＦ４５００（登録商標）計器（励起波長４８８ｎｍ）を用い、ＲＮＡ結合シアニン核酸染料の発光スペクトルを４５０ｎｍから６５０ｎｍまで走査した。全部の試験試薬でＲＮＡ結合シアニン染料の全目盛りを２，０００に設定する。実施例１０図１０は、水溶液中のシアニン染料Ｓｙｂｒ１１を安定化させる効果を異なる５種類の界面活性剤について試験した以外は、実施例４に記載の手順で調製した５０ｍＭのイミダゾールバッファ中のＲＮＡ結合Ｓｙｂｒ１１染料（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の発光スペクトルである。全部の試薬を室温で３．５ヵ月間保存した。ピークの高い順に：Ａ＝ＢＩＧＣＨＡＰ（１０ｍｇ％）；Ｂ＝マルトシド（５ｍｇ％）；Ｃ＝Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（０．２％）；Ｄ＝コール酸、ナトリウム塩（１０ｍｇ％）；Ｅ＝界面活性剤非添加；Ｆ＝カプリル酸、ナトリウム塩（１０ｍｇ％）を示す。データが示すように、ＢＩＧＣＨＡＰ、マルトシド及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７は水性緩衝溶液中で染料を極めて有効に維持することができたが、コール酸のナトリウム塩及びカプリル酸のナトリウム塩は有効でなかった。実際、試薬にカプリル酸を添加すると染料の保存寿命が短縮された。実施例１１図１１は、ＢＩＧＣＨＡＰまたはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を界面活性剤として用いて実施例４に記載の手順で調製し４℃で４ヵ月間保存したＲＮＡ結合シアニン染料Ｓｙｂｒ１１の発光スペクトルである。ピークの高い順に：Ａ＝新しく調製した対照試薬；Ｂ＝ＢＩＧＣＨＡＰ（１０ｍｇ％）；Ｃ＝Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（０．２％）；Ｄ＝Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（１．０％）；Ｅ＝界面活性剤非添加を示す。図から判るように、４ヵ月の試験期間中に本発明の染料の有意な劣化は生じない。実施例１２図１２は、ＲＮＡ結合シアニン染料Ｓｙｂｒ１１の発光スペクトルであり、５ｍｇ％のＢＩＧＣＨＡＰを含む本発明試薬中の３週間の高い温度での安定度を証明する。実施例４に記載の手順で試験試薬を調製し、実施例９のプロトコルに従ってＲＮＡを添加した。ピークの高い順に：Ａ＝４℃；Ｂ＝２５℃；Ｃ＝３７℃；Ｄ＝４５℃ を示す。データが証明するように、適当な水性緩衝溶液に非イオン性界面活性剤ＢＩＧＣＨＡＰを添加すると、シアニン染料の高温に対する感受性が低下し、従ってより安定になる。実施例１３図１３は、１．０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加するかまたは非添加のＢｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ中のＲＮＡ結合Ｓｙｂｒ１６の発光スペクトルである。イミダゾールバッファをＢｉｓ−Ｔｒｉｓバッファによって置換し、Ｓｙｂｒ１１をＳｙｂｒ１６染料（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によって置換し、室温で６．５ヵ月間保存した以外は、実施例４に記載の手順で試薬を調製した。ピークの高い順に：Ａ＝１．０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加したＳｙｂｒ１６；Ｂ＝界面活性剤を全く添加しないＢｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ中のＳｙｂｒ１６試薬；Ｃ＝界面活性剤を全く添加しないイミダゾールバッファ中のＳｙｂｒ１６；Ｄ＝１．０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加したグリシル−グリシンバッファ中のＳｙｂｒ１６を示す。結果は、このシアニン染料の安定化にはバッファと界面活性剤との適正な組合せが必要であることを示す。実施例１４図１４は、バッファと共に０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を含む種々のバッファ中のＲＮＡ結合Ｓｙｂｒ１１シアニン染料の発光スペクトルである。全部の試薬を室温で６週間保存した。ピークの高い順に：Ａ＝Ｔｒｉｓバッファ；Ｂ＝Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ；Ｃ＝イミダゾール；Ｄ＝Ｈｅｐｅｓバッファ；Ｅ＝グリシル−グリシンバッファ；Ｆ＝リン酸バッファを示す。このデータが示すように、Ｔｒｉｓバッファ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ及びイミダゾールバッファは染料を十分に維持するが、グリシル−グリシンバッファ及びリン酸バッファは維持しない。実施例１５約２．３％の網状赤血球を含む５マイクロリットルの正常サンプルを、１．０ｍｌの本発明試薬と混合した。試薬は、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０＋０．１に調整し、ＮａＣｌで２９０ｍＯｓｍ／リットルのオスモル濃度に調整した５０ｍＭのＴｒｉｓバッファと、０．２μｇ／ｍｌのＳｙｔｏ１２（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７と、０．０３％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００とを含んでいた。次いで、サンプル中の網状赤血球の％を測定するために、１５秒以内にサンプル／試薬混合物をＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターに導入した。図１５ａは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）サイトメーターのＦＳＣ信号対ＦＬ１信号の二次元表示であり、図１５ｂは、ゲートされた赤血球集団のＦＬ１ヒトスグラムを示す。図１５ｃは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターで行った経時試験の結果を、１５秒から４．０分までの網状赤血球の％として表す。図から判るように、ＲＢＣ＋網状赤血球のゲートは網状赤血球を血小板及びＷＢＣから明確に分離する。また、網状赤血球が極めて迅速に染色されるので網状赤血球の％が１５秒以内に定常状態に到達する。このような迅速な染色性が得られたので、全自動血液分析装置及びフローサイトメーターに検出方法を組込むことが可能になる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年６月３０日【補正内容】網状赤血球を迅速に分析するための組成物及び方法本発明は、網状赤血球を迅速に分析するための方法及び安定な水性試薬組成物に関する。より特定的には本発明は、光散乱及び蛍光によるフローサイトメトリーの技術を用いて網状赤血球を迅速に分析するための全自動方法及び安定な試薬組成物に関する。本発明の方法及び安定な水性試薬組成物の使用によって、高処理能力のマルチパラメーター血液計測装置において網状赤血球を迅速に分析し、その結果をカウント数及び成熟度によって報告することが可能になる。該方法はまた、別個のインキュベーション段階を要せずに、網状赤血球及び有核赤血球細胞（“ＮＲＢＣ”）カウント数を含む全血球細胞（“ＣＢＣ”）カウント数をリアルタイムで分析し得る。背景赤血球（“ＲＢＣ”）は正常には網状赤血球として血流に入る。血球増生は赤芽細胞の発生に始まり、骨髄でほぼ五世代の中間有核細胞が存続し、最後に網状赤血球が形成される。網状赤血球は幼若赤血球であり、細胞から核が排除された発達のこの段階でも細網物質（リボソームＲＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡ）をまだ含んでいる。貧血症または低酸素症の状態ではこの過程が短縮されていると考えられる。これらの症状があるとき、正常よりも早い時期の網状赤血球が血流に入ると考えられる。これらの初期網状赤血球は、過剰量のＲＮＡを含むこと、サイズが普通よりも大きいこと、ヘモグロビン含量が低いこと、血流中に網状赤血球として維持される時間が長いこと、などによって認識される。１９３０年代初期に、Ｌ．Ｈｅｉｌｍｅｙｅｒ（Ｚｔｓｃｈｒ．Ｋｌｉｎ．Ｎｅｄ．１２１：３６１−３７９，１９３２）は、網状赤血球を、それらに含まれる網糸質（網状赤血球に含まれている生体染色可能物質）の量に従って４つの年齢集団に分類した。それ以来の伝統として、グループＩは３０以上の網糸質、グループIIは１５−３０の網糸質、グループIIIは３−１５の網糸質及びグループIVは１−２の網糸質を含むという分類が用いられている。正常な網状赤血球のカウント数は、成人ではＲＢＣカウント数の約０．５〜２．５％、新生児ではＲＢＣカウント数の約２．０〜６．０％である。年齢集団でみると、正常な成人の網状赤血球の大部分はグループIVに分類され、グループＩのものは殆どない。網状赤血球のカウント数は赤血球産生の尺度である。従って、貧血症の診断及び治療に有用である。歴史的に、網状赤血球のカウント数は貧血症の病因及び分類に極めて密接に関連付けられてきた。溶血性貧血、ピルビン酸キナーゼ欠損、鎌状細胞貧血、タラセミア（地中海貧血）では網状赤血球のカウント数が増加し、巨大赤芽球性貧血、再生不良性貧血、全身性骨髄機能不全では網状赤血球カウント数が減少する。最近ではまた、化学療法剤の骨髄毒性作用を検査するために網状赤血球カウント数が使用されている。従って、網状赤血球のカウント数と網状赤血球の成熟指数とが極めて有効な情報であるということはどの血液学者も例外なく認める処である。最も頻用されている網状赤血球のカウント方法は手動操作による鏡検法である。１９４９年にＧ．Ｂｒｅｃｈｅｒ（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９：８９５−８９６，１９４９）によってニュー・メチレン・ブルー（“ＮＭＢ” ）が導入されるまではブリリアント・クレゾール・ブルーが主として使用されていた。最新のＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓ（“ＮＣＣＬＳ”）刊行物（ＮＣＣＬＳＤＯＣ．Ｈ４４−Ｐ）は、等容量の血液をＮＭＢ染料と混合し、約１５分間インキュベートしてＲＮＡを沈降させるＮＢＭ染色を承認している。次いで、血液塗抹標本を作製し、染色された網状赤血球を顕微鏡でカウントする。Ｍｉｌｌｅｒ接眼ディスクを接眼レンズに挿入する。接眼レンズ内部の小さいほうの視野の面積は大きいほうの視野の面積の１／９である。小さいほうの視野でＲＢＣ数を計測し、大きいほうの視野で網状赤血球数を計測する。連続する２０個の視野でカウントを実施し、大きいほうの視野の網状赤血球の総数を小さいほうの視野の赤血球総数の９倍の値で除算することによって網状赤血球の％を計算する。手動操作による方法の欠点は、労働集約的であること、不正確であること、時間が掛かること、主観的であること、などである。フローサイトメトリーの技術によってこれらの欠点を是正するために様々な実験が試みられた。１９８０年代には、フローサイトメーターによって網状赤血球を染色及びカウントするためにピロニン・ワイ（“ＰＹ”）及びアクリジン・オレンジ（“ＡＯ”）が使用された。現在では、全血サンプル中の網状赤血球を計数するために使用できる半自動的フローサイトメトリーの方法がいくつか知られている。既存の方法の各々では、オーラミン・オー（“ＡｕＯ”）またはチアゾール・オレンジ（“ＴＯ”）のような有機カチオン性染料を含む希釈剤を使用して網状赤血球内部のＲＮＡを染色する。インキュベーション期間中に、染料がゆっくりと細胞膜に浸透し、各網状赤血球の内部のＲＮＡに結合する。サンプルが検出ゾーンを通過するときに被染色網状赤血球が発生する信号の量は、各網状赤血球内部のＲＮＡ含量にほぼ比例する。従って、適正な励起光源及び発光検出システムを備えたフローサイトメーターを使用して、全血サンプル中の網状赤血球のパーセンテージを測定し得る。しかしながら、特に計器がマルチパラメーター血液分析システムである場合、網状赤血球測定方法の全自動化を難しくする問題の原因が数多く存在する。最大の問題は、染色サンプルを“オフライン（非直結）”で調製しなければならないことである。フローサイトメーターによるサンプル処理を可能にするためには、染料が細胞に浸透して網状赤血球のＲＮＡを十分に染色するように、サンプル調製段階で数分またはそれ以上の長いインキュベーション期間が必要である。更に、網状赤血球中のＲＮＡを染色するために常用されている染料の多くは、水溶液中で不安定であり、ＲＮＡ及びＤＮＡに結合するだけでなく、フローセルも含めて計器のプラスチック管、ガラス表面などにも結合する。このため、試験の実施後に、全システムに対して時間及び手間の掛かる洗浄作業が必要となる。Ｋａｍｉｎｓｋｙらの米国特許第３，６８４，３７７号、Ａｄａｍの米国特許第３，８８３，２４７号及びＮａｔａｌｅの米国特許第４，３３６，０２９号はいずれも、網状赤血球を染色するためにＡＯを使用することを開示している。ＡＯは網状赤血球に対して優れた染色性を有しているが（ＲＮＡに結合して赤色蛍光を発生させる）、血漿にも結合してサンプル流の高いバックグラウンド蛍光を発生させるので、良好なシグナル対ノイズ（“Ｓ／Ｎ”）比を得ることが極めて難しい。検出の問題に加えて、フローサイトメーターでＡＯを使用すると、ＡＯがプラスチック管及びフローセル表面に結合し易いことも難しい問題である。更に、ＡＯ法は５〜７分間のインキュベートを必要としており、最新の高処理能力のマルチチャンネル血液分析装置を用いて方法を実施するためにはこの所要時間はあまりにも長い。Ｓａｇｅ，Ｊｒ．の米国特許第４，７０７，４５１号はチオフラビン・ティー（ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎＴ）またはクリサニリン（ｃｈｒｙｓａｎｉｌｉｎｅ）から成る試薬組成物を開示している。この方法では網状赤血球が染料を吸収するまでに約７分間を要し、また、バックグラウンド蛍光があまりにも高いのでグループIVの網状赤血球の検出に適した良好なＳ／Ｎ比が得られない。Ｌｅｅらの米国特許第４，８８３，８６７号は、ＲＮＡ及びＤＮＡを染色するための染料を開示している。網状赤血球の分析に好適な染料はＴＯであり、方法は最短でも３０分のインキュベーション時間を要する。ＴＯは高い核酸結合親和性及び量子効率を有しているが、ＴＯの膜透過速度は極めて遅い（３０分）ので、高処理能力の臨床用マルチパラメーター血液計測装置における使用には不適である。Ｋｕｒｏｄａの米国特許第４，９７１．９１７号は、成熟赤血球の非特異的染色を抑制するためのＡｕＯと炭酸塩とを含有する試薬組成物を教示している。米国特許第４，９８５，１７６号は、フローサイトメトリーで使用するための別の網状赤血球染色試薬を開示しており、この試薬は、好ましい染料としてＡｕＯを含み、染色に必要なサンプルインキュベーション時間が３０秒〜２０分の範囲である。フローサイトメーターでＡｕＯを使用するときの欠点は、ＡＯのような染料はＤＮＡ及びＲＮＡだけに親和性を有しているのでなく、多様な種類のプラスチック及びガラスの表面にも親和性を有しているので、マルチパラメーター血液計測装置を用いて方法を実施することが極めて難しいことである。ＴＯＡＭｅｄｉｃａｌＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＣｏ．，Ｌｔｄ．は、そのＳｙｓｍｅｘ（登録商標）Ｒ−１０００及びＲ−３０００単独型全自動網状赤血球分析装置にＡｕＯ法を組込むことには成功したが、ＮＥ８０００またはＳＥ９０００計器のようなマルチパラメーター血液計測装置で同方法を使用することはできなかった。Ｃｏｌｅｌｌａらの米国特許第５，２８４，７７１号は、網状赤血球中のＲＮＡを染色するカチオン性染料(オキサジン(登録商標)７５０)と、染色サンプルをフローサイトメトリー的光計測システムで処理するときに偏平な赤血球の方向性ノイズを除去する両イオン性球状化剤とを含む単一試薬溶液によって全血サンプルを処理する段階から成る方法及び試薬組成物を開示している。最近になってＭｉｌｅｓＩｎｃ．は、彼らの最新のＨ＊３（登録商標）血液計測装置に上記方法を組込んだ。この計器は、ヘリウム／ネオン（“ＨｅＮｅ”）電子光学的検出システムを備えており、網状赤血球を染色するためのオキサジン（登録商標）７５０核酸染料と、容量分析の準備として赤血球と網状赤血球とを球状化する両イオン性界面活性剤とを使用している。Ｈ３＊（登録商標）を用いた網状赤血球計測方法は、血液と網状赤血球試薬とを手動操作で混合し次いでオフラインで１５分間のインキュベーションを必要とする半自動方法でしかない。この方法は、グループIVの網状赤血球の検出感度が低い。ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎもまた、彼らのＳＴＫＳ（登録商標）及びＭａｘｉｍ（登録商標）の血液分析装置に半自動の網状赤血球分析方法を組込んだ。Ｃｏｕｌｔｅｒは彼らの技術をＶＣＳ（Ｖｏｌｕｍｅ，ＣｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＳｃａｔｔｅｒ（容量、導電率及び散乱））と呼ぶ。ＶＣＳを実施するためには、先ず血液サンプルをＣｏｕｌｔｅｒの網状赤血球用染料（ＮＭＢ含有）と混合する。次いで、混合物を室温で５分間インキュベートする。次に、染色された少量の血液サンプルを、硫酸を含有する清澄化溶液で希釈する。方法が低感度であること及び赤血球の分離度がよくないことが方法の精度に極めて不利な影響を与えている。これは、（清澄化溶液によって溶解された）網状赤血球間質、他の細胞落屑及び血小板がノイズを発生し、適正な信号の識別を難しくするからである。凝集した血小板だけは拡大された信号を発生し得るので、血小板の信号はＲＢＣ及び網状赤血球間質によって発生した信号と干渉しない。Ｋｕｒｏｄａの米国特許第４，９８１，８０３号は、フローサイトメトリーの方法によって網状赤血球をカウントするためのＡｕＯを含有する試薬を開示している。試薬は２種類の溶液、即ち、染料（ＡｕＯ）を非水性溶媒に溶解した染色用原液と、網状赤血球中のＲＮＡの最適染色条件を充たすバッファ溶液とから成る。Ｋｕｒｏｄａは、これらの２つの溶液を染色直前に混合することによって、網状赤血球をカウントするための安定な最終染色用溶液が常に得られると主張している。この方法にも問題は多い。最大の問題は、彼らが選択した非水性溶媒のグループ（エチレングリコール、トリエチレングリコール、ジエチレングリコール）が高い屈折率を有していることである。このような屈折率はマルチパラメーター血液分析装置における使用に不適である。その理由は、（リン酸緩衝生理食塩水のような）水性被覆溶液を使用する必要があり、このような被覆溶液が屈折率約１．３３４を有しているからである。Ｋｕｒｏｄａ特許に記載されているメタノール、エタノールまたはプロパノールのような（被覆溶液である生理食塩水に近い屈折率をもつ）他の溶媒は極めて揮発性であり、従ってこれらも適当でない。更にこの方法においては、安定な網状赤血球試薬を提供するために、少量の原液と多量の水性バッファとをオンライン（直結）で混合する必要があるが、このような混合は技術的に極めて難しい。上記のような理由から、水性環境で安定な試薬を使用し、フローサイトメーターまたは高処理能力のマルチパラメーター血液分析装置において実施できる迅速で正確な網状赤血球の分析方法が久しく要望されている。発明の概要網状赤血球を計数するための別個のインキュベーション段階を必要とすることなく全血サンプル中のＣＢＣ及び網状赤血球を同時に計数する方法が提供される。１つの実施態様は、網状赤血球染色量の非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ、Ｂｉｓ−ＴＴｒｉｓバッファ及びＴｒｉｓバッファから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファ溶液と、Ｎ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピレン− ポリオキシエチレンブロックコポリマー、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マルトシド、デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシドから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とから成る水性の核酸染色用試薬を提供する。試薬はｐＨ約６．０〜約８．０を有しており、水性試薬溶液中でシアニン染料と干渉しないかまたは沈殿しない一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整された浸透性（オスモル濃度(osmolarity)）を有している。別の実施態様は、網状赤血球の計数方法を提供する。先ず、全血サンプルのアリコートを水性の核酸染色用試薬と混合する。次いで、このサンプル／試薬アリコートを別個にインキュベートすることなく分析用光学フローセルに搬送する。細胞がほぼ一度に１個の割合で被照射光学フローセルを通過する際に、光散乱特性値及び蛍光特性値が検出され、この特性値に基づいてサンプル中の網状赤血球の計数が行われる。別の実施態様は、ヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル− （ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム、ヨウ化２−ジエチルアミノ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル− （ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム、ヨウ化２−メチルチオ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム、及び、４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムトシレート（すべてＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手可能）から成るグループから選択された約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．３μｇ／ｍｌの染料と、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭのイミダゾールバッファと、Ｎ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ− グルコン−アミドプロピル〕コラミドとポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーとから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とから成り、ｐＨ約６．８〜約７．２を有しており、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂及びＺｎＣｌ₂から成るグループから選択された一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２８０〜約３１０ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有している水性の核酸染色用試薬を提供する。更に別の実施態様は、網状赤血球数と全血球数との同時計数方法を提供する。ＣＢＣ（全血球）数を測定するために全血サンプルの第一アリコートの分析を進行させながら、サンプルの第二のアリコートを水性の核酸染色用試薬と混合し、サンプルの網状赤血球成分を上記の手順で分析する。図面の簡単な説明図１ａは、５．６３％の網状赤血球を含む臨床サンプルの前方散乱（“ＦＳＣ ”）信号対緑色蛍光（“ＦＬ１”）信号の二次元のＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）表示（細胞図）である。図１ｂは、図１ａのゲートされた赤血球（“ＲＢＣ”）集団のＦＬ１ヒストグラムである。図１ｃは、２．６３％の網状赤血球と増加濃度の白血球（“ＷＢＣ”）集団とを含む臨床サンプルのＦＳＣ信号対ＦＬ１信号のＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）細胞図である。図１ｄは、図１ｃのゲートされたＲＢＣ集団のＦＬ１ヒストグラムである。図２ａ及び図２ｂは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）計器で実施した経時試験の結果を表すグラフである。図３ａは、増加濃度の網状赤血球を含む臨床サンプルのＦＳＣ信号対ＦＬ１信号を示すＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）細胞図である。図３ｂは、図３ａの血液サンプルのゲートされた赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムである。図４ａは、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ血液分析装置で測定した正常血液サンプルの細胞図であり、中角光散乱（“ＩＡＳ”）対ＦＬ１をいずれも４桁の対数で表す。図４ｂは、図４ａのゲートされたＲＢＣ集団及び網状赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムを示す。ヒストグラムの１×目盛表示はＲＢＣピークを示し、ヒストグラムの５×目盛表示は網状赤血球集団を示す。図５ａは、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ血液分析装置で測定した極めて低い濃度の網状赤血球及び増加濃度のＷＢＣを含む臨床血液サンプルのＩＡＳ対ＦＬ１の細胞図である。図５ｂは、図５ａのゲートされたＲＢＣ及び網状赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムを示す。ヒストグラムの１×目盛表示及び５×目盛表示の双方が示されている。図６ａは、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ血液分析装置で測定した高レベルの網状赤血球（２０．５％）とＲＢＣ（９６．４ｋ／リットル）とを含む抗凝固処理した臨床血液サンプルのＩＡＳ対ＦＬ１の細胞図である。図６ｂは、図６ａのゲートされたＲＢＣ及び網状赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムを示す。ヒストグラムの１×目盛表示及び５×目盛表示の双方が示されている。図７は、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓ（“ＮＣＣＬＳ”）の方法と本発明の全自動方法とを実施することによって得られた網状赤血球の結果を比較するグラフである。図８は、網状赤血球を検出するためにチアゾールオレンジ染色方法及び本発明の全自動方法を実施し、得られた網状赤血球分析結果の線形回帰データの比較を示すグラフである。分析用サンプルとしては図７に示したサンプルと同じサンプルを使用した。図９は、本発明の全自動方法を実施することによって測定した網状赤血球％の線形性を示すグラフである。図１０は、種々の非イオン性界面活性剤の存在下及び非存在下の、ＲＮＡ結合した有標シアニン染料、ヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の保存寿命試験における発光スペクトルである。試薬を室温で３ヵ月半保存した。図１１は、ＲＮＡ結合したシアニン染料、ヨウ化２−ブチル−４−（２，３− ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムの保存寿命試験における発光スペクトルであり、冷蔵下で４ヵ月の安定性が証明される。図１２は、ＲＮＡ結合したシアニン染料、ヨウ化２−ブチル−４−（２，３− ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムの保存寿命試験における発光スペクトルであり、高温下で３週間の安定性が証明される。図１３は、１．０％のポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー（“Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７”）を添加するかまたは非添加のＢｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ中のＲＮＡ結合したシアニン染料、ヨウ化２− メチルチオ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の経時試験における発光スペクトルを示す。試薬を室温で６ヵ月半保存した。図１４は、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加した種々のバッファ中のＲＮＡ結合したシアニン染料、ヨウ化２−ブチル−４−（２，３ −ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムの保存寿命試験における発光スペクトルを示す。全部の試薬を室温で６週間保存した。図１５ａは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）サイトメーターで測定したＦＳＣ信号対ＦＬ１信号の二次元表示である。図１５ｂは、図１５ａのゲートされた赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムである。図１５ｃは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターで行った経時試験の結果を、１５秒から４．０分までの網状赤血球％として表すグラフである。発明の詳細な説明本発明の実施態様は、フローサイトメトリーの方法論を利用して血液サンプル中の網状赤血球を迅速かつ正確に分析する方法及び安定な水性試薬系を包含する。これらの実施態様は概して、網状赤血球と有核赤血球（“ＮＲＢＣ”）を含む全血球（“ＣＢＣ”）とを計数するための迅速な同時分析を行うものである。本発明の実施態様は、分析用計器及び血液分析方法の使用を含む。一般にこのような分析用計器の１つは全自動インピーダンス分析装置から成る。このような全自動計器の１つにおいては、全自動光散乱分析装置が全自動インピーダンス分析装置に統合され、全自動蛍光分析装置が全自動光散乱分析装置に統合されている。本発明の開示において、全自動分析装置なる用語は、サンプルを分析するためにオペレーターの介入が不要な装置、即ち、オペレーターは全自動分析装置にサンプルを導入するがその後はオペレーターがもはや介入する必要がない装置を意味する。更に、血液分析装置は、細胞を実質的に絶対項として定量及び分類する。このような分析装置は、細胞を大きさ及び形状によって分類するために電気的インピーダンス及び光学的散乱特性の少なくとも１つを使用する。本発明を実施するために、種々の分析装置をモニター及び制御し、分析装置からデータを収集し、結果を報告する制御装置を備えた全自動血液分析装置を普遍的に利用し得る。例えば、分析装置に制御装置が統合されているとき、オペレーターは全血サンプルに関するデータを制御装置に入力し得る。オペレーターは制御装置を用いて全血サンプルに対して実施すべき試験バンクを選択する。オペレーターは統合分析装置の集中的サンプル処理領域に全血サンプルを導入する。制御装置が分析装置を起動し、分析装置は制御装置の指令下で全血サンプルに対する分析を自動的に実行し得る。制御装置は分析装置から得られたデータを利用し、結果を公式化する。制御装置は結果をオペレーターに報告する。全血サンプルを統合分析装置に導入した後はオペレーターの操作が全く不要であることに注目されたい。好ましい実施態様では全血サンプルの調製が完全に自動化されているので、先ず従来の血液分析試験が行われ、次いでインキュベートされたサンプルの試験が行われる。分析装置に制御装置が統合されているので、血液分析装置及びフローサイトメトリー分析装置の双方から制御装置にデータが供給される。従って、制御装置は患者の血液分析の総合結果をオペレーターに報告し得る。明確な理解を得るために以下の記載では本発明の特定実施態様について詳細に説明するが、他の実施態様も可能であることに留意されたい。記載の実施態様の諸要素の所望の任意の組合せも可能である。本発明の１つの目的は、安定な水性試薬組成物を提供することである。この試薬は、網状赤血球を染色し得る非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファと４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スルホン酸（“Ｈｅｐｅｓ”）バッファとビス（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スルホン酸（“Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ”）バッファとトリスヒドロキシメチルアミノメタン（“Ｔｒｉｓ”）バッファとから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのバッファとを含み、ｐＨ約６．０〜約８．０を有し、一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有しており、更に、膜透過を容易にし水性等張溶液中のシアニン染料を安定化する非イオン性界面活性剤（界面活性剤次第で約５ｍｇ／ｄｌ〜約１．０ｇ／ｄｌ）を含む。好ましくは、染料が環置換されており、ＤＮＡまたはＲＮＡと結合したときに増強された蛍光を示す。更に好ましくは、試薬が、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．３μｇ／ｍｌの環置換された非対称シアニン染料を含む。本発明の別の目的は、本発明の試薬系を使用して網状赤血球及びＣＢＣの差分（differential）を迅速かつ連続的に検出及び算定する方法を提供することである。このような方法の特に顕著な特徴は、別個のインキュベーション段階を設ける必要がないことである。約１０秒〜約６０秒という必要最小限のインキュベーション期間が必要とされるだけである。このような実施態様の１つは、全血サンプル中の網状赤血球数の計測が、全血球（“ＣＢＣ”）分析を得るためのサンプルの別のアリコートの区別(different iating)と同時進行的に行われる方法を提供する。この方法は、サンプルの１つ以上のアリコートを分析及び区別すべく全自動分析装置の夫々異なる場所に案内する段階を含み、この段階中にサンプルの網状赤血球アリコートを染色用試薬と混合することを特徴とする。該試薬は、網状赤血球染色量の非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファとＨｅｐｅｓバッファとＢｉｓ−ＴｒｉｓバッファとＴｒｉｓバッファとから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファ溶液と、Ｎ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピレン−ポオキシエチレンブロックコポリマー、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マルトシド、デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシドから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とから成り、該試薬が、ｐＨ約６．０〜約８．０を有し、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂及びＺｎＣｌ₂のような、水性試薬溶液中でシアニン染料と干渉しないかまたは沈殿しない一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２３０〜約３４００ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有している。試薬／網状赤血球の結合アリコートを全自動分析装置の光学的検出ゾーンに案内する。次いで、試薬／網状赤血球アリコートは被照射検出ゾーンをほぼ一度に１細胞の割合で通過し、蛍光イベント及び散乱光イベントを生じる。これらのイベントを検出し、検出結果に基づいてサンプル中に存在する網状赤血球の数を決定する。本発明の試薬系に使用できる非対称染料は一般に以下の特性値を有している：１．最大吸光度：４８８＋２０ｎｍ２．高い核酸結合親和性３．高い量子効率：０．１４．モル吸光係数：１０，０００５．ＲＮＡまたはＤＮＡに結合したときの蛍光の増強：２０６．膜透過速度：＜２分典型的には、本発明の水性試薬及び網状赤血球計数方法において使用される染料は水性環境で極めて不安定である。このクラスで試験した複数の染料の安定度データを図１０から図１４に示す。本発明の試薬系の１つの実施態様は、約０．０５μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌの濃度のＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によって販売されている染料、ヨウ化２ −ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムと、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのイミダゾールバッファと、約５ｍｇ／ｄｌ〜約２０ｍｇ／ｄｌのＮ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド（“ＢＩＧＣＨＡＰ” ）と、約０．０２％〜約０．０５５％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００（５ −クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン＋２−メチル−４− イソチアゾリン−３−オン）とから成る。ｐＨはＩＮのＨＣｌによって約６．８〜約７．２に調整され、オスモル濃度はＮａＣｌによって約２７０〜約３１９ｍＯｓｍ／リットルに調整されている。試薬系の第一の成分は染料である。このような染料の１つのクラスは、参照によって本発明に含まれる国際特許第ＷＯ９４／２４２１３号，「環置換された非対称染料（ＣＹＣＬＩＣ−ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤＵＮＳＹＭＭＥＴＲＩＣＤＹＥＳ）」に開示されたような非対称シアニン染料である。更に、本発明で使用される染料は、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合したときに増強された蛍光を示す。かかる有用な染料はまた、ＲＮＡ及びＤＮＡに対する高い結合親和性と高い量子効率とを有していなければならない。本文及び請求の範囲に記載の特徴を示す種々の非対称シアニン染料を使用できると予測される。このような染料のいくつかの非限定例としては、同じくＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）（“ＭＰＩ”）から得られるヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム、ヨウ化２− ジエチルアミノ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム、ヨウ化２− メチルチオ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムがある。同じくＭＰＩから供給される４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３− チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムトシレートのような他の非対称シアニン染料も本発明の実施に役立つ。４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）− メチリデン）−１−フェニルキノリニウムトシレートは、メチンブリッジを介してピリジン環系またはキノリン環系に結合した置換ベンザゾリウム環系を含む中性の非対称シアニン染料である。試薬の第二の成分は、約６．０〜約８．０のｐＫａを有し、（ＲＮＡまたはＤＮＡの染色に必要な）水溶液中のシアニン染料の所要濃度を長期間維持し得るバッファである。このようなバッファは、本発明を実施する際に使用されるシアニン染料または染料を安定化するために使用される非イオン性界面活性剤と反応してはならない。代表的なバッファは、イミダゾール、Ｈｅｐｅｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｓである。試薬系の第三の成分は非イオン性界面活性剤である。この界面活性剤の種類に従ってまたは使用される複数の非イオン性界面活性剤の組合せ次第で、濃度を約５ｍｇ／ｄｌ〜約１ｇ／ｄｌにすべきである。（１種または複数の）界面活性剤は、シアニン染料の細胞膜透過速度を促進すると考えられる（３０秒以内）。界面活性剤は更に、等張性水溶液中のシアニン染料の溶解度及び安定度を向上させる。しかしながら、（１種または複数の）このような界面活性剤は、たとえ低濃度であっても、シアニン染料と沈殿したり、反応したり、あるいはＲＢＣを溶解したりしてはならない。このような界面活性剤の非限定例は、ＢＩＧＣＨＡＰ、ｎ−ドデシル− Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー（“Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７”）、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マルトシド、デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシドである。試薬系の更に別の成分は、網状赤血球を含む赤血球または白血球の溶解を防止するために試薬の浸透性（オスモル濃度）を約２３０ｍＯｓｍ／リットル〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整する一価または二価のアルカリ塩である。このような塩は、溶液中でシアニン染料と反応したりまたは沈殿してはならない。このような塩の例としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂、ＺｎＣｌ₂などがある。任意成分としては、試薬中での微生物の増殖を防止する防腐剤がある。このような防腐剤は、細胞または被染色細胞の光散乱特性または蛍光発光特性を変化させてはならない。このような防腐剤の例としては、Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）１５０（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（１．０５−１．２５％）と２−メチル−４−イソチアゾリン− ３−オン（０．２５−０．４５％））、ナトリウムアジドなどがある。上記の試薬系を使用することによって、フローサイトメーターまたは他の全自動血液分析装置における網状赤血球の迅速な分析が可能である。１つの実施態様では、５μｌの全血サンプルを、本文及び請求の範囲に記載の１．０ｍｌの試薬系と混合し、サンプルと試薬との混合物を、混合後３０〜６０秒以内、最速では１０秒という短い時間内に市販のフローサイトメーターに導入する。図１ａから図１ｄは、実施例１に記載の手順で調製した正常血液のサンプルを用いて行ったこのような方法の結果を示す。本発明の別の実施態様は、全自動的な高処理能力のマルチパラメーター血液分析装置によって網状赤血球を迅速に定量分析し得る。参照によって本発明に含まれる１９９４年８月１日出願の「全自動分析の実施方法及び装置（ＭＥＴＨＯＤＡＮＤＡＰＰＡＲＡＴＵＳＦＯＲＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧＡＵＴＯＭＡＴＥＤＡＮＡＬＹＳＩＳ）」という表題の米国特許出願第０８／２８３，３７９号は、特に光散乱信号の軸方向光損失（“ＡＬＬ”）と中角散乱（“ＩＡＳ”）とを利用し、計器が全血サンプル中の細胞及び細胞サブクラスを全自動的に識別できるように種々の蛍光信号を検出する全自動血液分析装置を開示している。しかしながら一般には、本発明を実施する方法は、全血サンプルを、存在するいかなる網状赤血球のＲＮＡをも染色する試薬と混合し、ほぼ一度に１細胞が被照射光学フローセルを通過するように混合物を流動させ、細胞からの散乱光及び放出蛍光を検出し、サンプル／試薬混合物を別個のインキュベーション段階または期間で処理することなくサンプル中に存在する網状赤血球の量を決定する段階から成る。本発明の試薬の１つは、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．３μｇ／ｍｌの非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ、Ｂｉｓ− Ｔｒｉｓバッファ及びＴｒｉｓバッファから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファと、界面活性剤の種類または複数の界面活性剤の組合せに依存して約５ｍｇ／ｄｌ〜約１．０ｇ／ｄｌの濃度の非イオン性界面活性剤とから成り、試薬が約６．０〜約８．０のＰＨを有し、一価または二価のアルカリ塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有している。上記のマルチパラメータ一血液分析装置において全血サンプル中の網状赤血球のパーセンテージと絶対カウント数とを分析するために、約７８５６μｌの希釈／被覆（シース）溶液（等張性生理食塩水）を収容したＲＢＣカップにサンプル吸引プローブで約１８．７５μｌの全血サンプルを導入し、双方の流体を混合する。次いで、サンプル中のＲＢＣの絶対カウント数を電子的に測定するために希釈サンプルをシースドインピーダンスアパーチャー（ｓｈｅａｔｈｅｄｉｍｐｅｄａｎｃｅａｐｅｒｔｕｒｅ）に搬送する（参照によって本発明に含まれる１９９４年８月１日出願の“ＭＥＴＨＯＤＡＮＤＡＰＰＡＲＡＴＵＳＦＯＲＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧＡＵＴＯＭＡＴＥＤＡＮＡＬＹＳＩＳ”という表題の米国特許出願第０８／２８３，３７９号のＲＢＣ分析用計器校正の詳細な記載参照）。同時に、約２００μｌの希釈サンプルを６００μｌの本発明の試薬を収容した別の容器（“網状赤血球受容カップ”）に移送し、混合する。準備（混合）したサンプルを、シース付きの検出用光学フローセルに搬送する。希釈／被覆溶液によって包囲された層状サンプル流の形態で細胞がほぼ一度に１個ずつフローセルを通過するときに測定プロセスが開始される。被測定容積（ｖｏｌｕｍｅ）は光ビームによって照射されており、流動軸に垂直な２つの次元において流体力学的に収束した細胞流によって限定され、流動軸に平行な１つの次元において約１７ミクロンのレーザービームの垂直方向ビームウェストによって限定されている。この試験を実施するとき、サンプルの流速は約２．０μｌ／秒であり、ＲＢＣ及び網状赤血球のサンプル流の対応する被照射検出容積は約８０×５×１７ミクロンの寸法をもつ楕円筒である。１７ミクロンは円筒の軸に沿って測定された寸法である。この時点で、図４ａの細胞図のＩＡＳ及びＦＬ１の二次元特徴空間に示すように、細胞の存在は、３°〜１０°のコーン内の光を検出する中角散乱ホトダイオード及び青色蛍光ＦＬ１を検出する光電子増倍管（“ＰＭＴ”）によって検出される。細胞が上記被照射容積を通過するときにパルスが発生し、パルスはこれらの検出器によって測定される。次にこれらのパルスの振幅がフィルター化され、増幅され、デジタル化され、対応するＩＡＳ及びＦＬ１の二次元特徴空間にリストモードで記憶される。細胞は８秒間カウントされる。上記の流速及び希釈率を用いた場合、血液１マイクロリットルあたりＲＢＣカウント数が５百万個の正常被験サンプル中で生じるイベントカウントの割合は毎秒５９５０であろう。次に、上記のＩＡＳ及びＦＬ１の特徴空間のリストモードデータにアルゴリズムが応用され、２０秒以内の計算時間で以下のパラメーターが決定される。１．ＲＢＣゲート：網状赤血球を含むＲＢＣ集団をゲートするがＷＢＣ及び血小板を排除することによって、ＷＢＣ及び血小板を排除する。２．網状赤血球のパーセント：ゲートされたＲＢＣ集団をそれらのＦＬ１信号の大きさに従って再分析する。成熟ＲＢＣに属する領域を定義するために、対数適合度（ｌｏｇｆｉｔ）をＦＬ１ヒストグラムに適用し、この領域よりも上にあるＦＬ１信号を有する細胞を網状赤血球として標識する。網状赤血球のカウント数をＲＢＣカウント総数で除算することによって網状赤血球の％を計算する。３．網状赤血球の絶対カウント数：網状赤血球のパーセントにＣＢＣモードで得られたサンプル中のＲＢＣの絶対カウント数を乗算することによって得られる。４．網状赤血球成熟指数（“ＲＭＩ”）：ＲＭＩは、正常な網状赤血球集団の平均蛍光を１標準偏差（“Ｓ．Ｄ．”）以上上回るＦＬ１信号を有している網状赤血球のパーセントとして表す。上記は単なる便宜的な記載であり、本発明のＲＭＩの式が上記のアルゴリズムにのみ限定されることは全くない。以下の実施例は、光散乱及び蛍光によるフローサイトメトリーの技術を用いて網状赤血球を迅速に分析するための試薬組成物及び該組成物を組込んだ方法を示す。これらの実施例は単なる代表例であり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないことは理解されよう。実施例１５マイクロリットルの臨床サンプルを１．０ｍｌの試薬と混合した。試薬は、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０＋０．１に調整した５０ｍＭのイミダゾールバッファと、６．４ｇ／リットルのＮａＣｌと、０．１マイクログラム／ｍｌのヨウ化２ −ジエチルアミノ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３− チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７と、０．０３％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００とから成る。次いで、サンプルと試薬との混合物を３０〜６０秒以内にＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．）に導入し、試薬組成物中の染料による膜透過速度を測定した。図１ａは、前方散乱（ＦＳＣ）信号対緑色蛍光（ＦＬ１）信号の二次元表示である。図１ｂは、ゲートされた赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムであり、染色された網状赤血球集団が成熟ＲＢＣ集団の右側に示されている。図１ｃ及び図１ｄは夫々、第二の臨床サンプルの結果を示す図１ａ及び図１ｂと同様のグラフである。実施例２図２ａは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターで実施した経時試験の結果を長時間（３０秒〜３０分）にわたる網状赤血球の％として表すグラフであり、図２ｂは、網状赤血球の平均ＦＬ１として表すグラフである。双方の図から理解されるように、網状赤血球の％は３０秒以内に定常状態に到達し、染色濃度は３０秒以内にピークの約８０％に到達する。本発明によってこのように迅速な染色が得られるので、別個のインキュベーション装置または方法を要せずに本文中に開示した方法及び試薬を全自動血液分析装置及びフローサイトメーターに組込むことが可能である。実施例３約１５％の網状赤血球を含む５マイクロリットルの臨床サンプルを１．０ｍｌの本発明試薬と混合した。試薬は、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０＋０．１に調整した５０ｍＭのイミダゾールバッファと、６．４ｇ／リットルのＮａＣｌと、０．２マイクログラム／ｍｌのヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７と、０．０３％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００とから成る。次いで、サンプルと試薬との混合物を３０秒以内にＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターに導入し、サンプル中の網状赤血球の％を測定した。図３ａは、ＦＳＣ信号対ＦＬ１信号の二次元表示であり、図３ｂは、ゲートされた赤血球集団のＦＬ１ヒストグラムである。データが示すように、ＷＢＣ及び血小板はＲＢＣ及び網状赤血球の集団から十分に分離され、染色された網状赤血球のＦＬ１強度は、赤血球のＦＬ１ヒストグラム上で血液サンプル中の網状赤血球濃度の定量分析に用いる網状赤血球の領域を容易に定義できるような強度である。実施例４この実施例では、全自動的な高処理能力のマルチパラメーター血液分析装置( １９９４年８月１日出願の“ＭＥＴＨＯＤＡＮＤＡＰＰＡＲＡＴＵＳＦＯＲＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧＡＵＴＯＭＡＴＥＤＡＮＡＬＹＳＩＳ”という表題の米国特許出願第０８／２８３，３７９号)を使用した。正常被験者から採取した１８．７５μｌのＥＤＴＡ−抗凝固処理全血サンプルを、サンプル吸引プローブを用いて、約７８５６μｌの希釈／被覆溶液（等張性生理食塩水）を収容したＲＢＣカップに導入し、混合した。次いで、サンプルのＲＢＣ絶対カウント数を測定するために希釈サンプルをシースドインピーダンスアパーチャーに搬送した。同時に、約２００マイクロリットルの希釈全血サンプルを、６００マイクロリットルの本発明試薬を収容した網状赤血球のカップに移した。この試薬は、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０＋０．１に調整した５０ｍＭのイミダゾールバッファと、６．４ｇ／リットルのＮａＣｌと、０．２μｇ／ｍｌのヨウ化２−ブチル−４−（２，３ −ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムと、１０ｍｇ／ｍｌのＢＩＧＣＨＡＰと、０．０３％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００とを含んでいた。次いで、サンプル／試薬混合物を散乱及び蛍光を検出するシース付きの光学フローセルに搬送した。システム検出プロセスは前述の通りであり、１９９４年８月１日出願の“ＭＥＴＨＯＤＡＮＤＡＰＰＡＲＡＴＵＳＦＯＲＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧＡＵＴＯＭＡＴＥＤＡＮＡＬＹＳＩＳ”という表題の米国特許出願第０８／２８３，３７９号の記載内容全部が参照によって本明細書に含まれるものとする。サンプル／試薬混合物の搬送に要する処理停止時間は僅か１０秒に短縮される。ＩＡＳ対ＦＬ１細胞図上で網状赤血球を含むＲＢＣ集団がゲートされ（図４ａ）、ゲートされたＲＢＣ集団のＦＬ１ヒストグラム（図４ｂ）を利用して網状赤血球のカウント数及びＲＭＩの測定値が得られる。ＦＬ１ヒストグラムの１×表示はＲＢＣ集団ピークを示す目盛りであり、５×表示は網状赤血球集団を示す。これらの結果は、付加的なサンプルインキュベーション用装置もしくは方法またはオフラインのサンプル調製段階を要せずに、サンプル中の網状赤血球とＣＢＣとの同時分析が可能であることを示す。実施例５標準方法で測定して低濃度の網状赤血球及び増加濃度のＷＢＣを含むことが判明した臨床サンプルを、サンプル吸引プローブを用いて、約７８５６μｌの希釈／被覆溶液（等張性生理食塩水）を収容した米国特許出願第０８／２８３，３７９号に記載の装置のＲＢＣカップに導入する。次いで、希釈したサンプルをシースドインピーダンスアパーチャーに搬送し、サンプルのＲＢＣ絶対カウント数を測定する。同時に、約２００マイクロリットルの希釈サンプルを、６００マイクロリットルの本発明試薬を収容した網状赤血球のカップに移送し、混合した。この試薬は、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０＋０．１に調整した５０ｍＭのイミダゾールバッファと、６．４ｇ／リットルのＮａＣｌと、１．０ｍｌあたり０．２μｇのヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３ −チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムと、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７と、２．５ｍｇ／ｄｌのｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシドと、０．０３％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００とを含んでいた。次に、サンプル／試薬混合物をシース付きの検出用光学フローセル１００に搬送した。システム検出プロセスについては前述した。ＩＡＳ対ＦＬ１細胞図では網状赤血球を含むＲＢＣ集団がゲートされ（図５ａ）、ゲートされたＲＢＣ集団のＦＬ１ヒストグラム（図５ｂ）を使用して網状赤血球のカウント数及びＲＭＩの測定値を得る（このサンプルの網状赤血球のカウント数はＲＭＩの計算には少なすぎた）。図５ｂのＦＬ１ヒストグラムは、ＲＢＣ集団ピーク（１×表示）及び網状赤血球集団（５×表示）の双方を示す目盛りを有している。このサンプルでは、検出可能な網状赤血球集団は観察できない。実施例６この実施例では、増加濃度の網状赤血球（標準方法で測定して２０％）及び増加濃度のＷＢＣ（９６ｋ／リットル）を含む臨床サンプルを使用した。サンプルを実施例４に記載の手順で処理した。結果を図６ａ及び６ｂに示す。データが示すように、本発明は、ＷＢＣ及び血小板を正確に排除し、暗い網状赤血球と明るい網状赤血球との双方を同定及びカウントし得る。上記のアルゴリズムを使用するとこのサンプルは６９．２％という高いＲＭＩ値を示した。実施例７実施例４に記載の高処理能力のマルチパラメーター血液分析装置及び実施例１に記載のＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターにおいて、室温で３０分のインキュベーションを要するチアゾールオレンジ（ＴＯ）法（米国特許第４，８８３，８６７号）を用いて７７の臨床サンプルを分析した。各サンプルに対してＮＣＣＬＳ標準方法（詳細に関しては従来技術の項参照）による処理も実施した。次に、本発明の非インキュベーション方法の結果を、ＴＯ法及びＮＣＣＬＳ法の結果に比較した。線形回帰プロットを図７及び図８に示す。データが示すように、本発明の結果は、ＮＣＣＬＳ鏡検法（Ｒ＝０．９８２、勾配＝１．０５、Ｙ軸切片＝０．００２）及びＴＯ法（Ｒ＝０．９８６、勾配＝０．９６４、Ｙ軸切片＝０．００５）の結果と十分な相関関係を有している。実施例８一方は正常ウサギ（サンプル♯１）及び他方は網状赤血球増加症のウサギ（サンプル♯２）から２つのＥＤＴＡ−抗凝固処理ウサギ血液サンプルを作製した。サンプル♯１は１．９％の網状赤血球を含み、サンプル♯２は９０％を上回る濃度の網状赤血球を含んでいた。以下のプロトコルに従って線形性サンプルを調製した。１．双方のサンプルのＲＢＣ濃度を３．５＋０．０５Ｍ／リットルに調整した。２．以下の表に示す割合で２つのサンプルを混合することによって６レベルの線形性サンプルを調製した。３．米国特許第０８／２８３，３７９号の血液分析装置でサンプルを分析した。４．全血サンプル１μｌあたりの網状赤血球の％及び絶対数の理論値を以下の式に従って計算した：サンプルの網状赤血球の理論的％＝〔（ｎ／１．５）×Ａ％〕＋〔（ｍ／１．５）×Ｂ％〕×１００但し、ｎ＝線形性サンプル中のサンプル♯１の容量ｍ＝線形性サンプル中のサンプル♯２の容量１．５＝線形性サンプルの総容量Ａ％＝非希釈サンプル♯１中の網状赤血球の％Ｂ％＝非希釈サンプル♯２中の網状赤血球の％、及び、網状赤血球の理論的絶対数＝〔（ｎ×Ａ♯）＋（ｍ×Ｂ♯）〕／１．５×サンプルの網状赤血球の理論的％但し、ｎ＝線形性サンプル中のサンプル♯１の容量ｍ＝線形性サンプル中のサンプル♯２の容量１．５＝線形性サンプルの総容量Ａ♯＝非希釈サンプル♯１中の網状赤血球の♯ Ｂ♯＝非希釈サンプル♯２中の網状赤血球の♯。５．理論値を横座標、マルチパラメーター血液計測装置から得られた値を縦座標として線形性曲線をプロットした。結果を図９に示す。データが示すように、本発明の方法及び試薬は、網状赤血球濃度９０％まで線形応答を示す。実施例９種々の界面活性剤を評価するために本発明に従って調製した数種類の試薬の安定度を図１０〜１４に示す。安定度試験は、ＨＩＴＡＣＨＩＦ４５００（登録商標）計器（励起波長４８８ｎｍ）を用い、以下のプロトコルに従って試薬にＲＮＡを添加し、ＲＮＡに結合したシアニン核酸染色の発光スペクトルを走査することによって行った。１．脱イオン水中のＲＮＡ（仔ウシ肝臓ＲＮＡ、ＳｉｇｍａＣａｔ．Ｎｏ．Ｒ７２５０）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。２．各ＲＮＡの１００μｌの原液を１．６ｍｌの本発明の試験試薬に添加し、混合した。３．次いで、ＨＩＴＡＣＨＩＦ４５００（登録商標）計器（励起波長４８８ｎｍ）を用い、ＲＮＡ結合シアニン核酸染色の発光スペクトルを４５０ｎｍから６５０ｎｍまで走査した。全部の試験試薬でＲＮＡ結合シアニン染料の全目盛りを２，０００に設定する。実施例１０図１０は、水溶液中のシアニン染料、ヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン） −１−フェニルキノリニウムを安定化させる効果を異なる５種類の界面活性剤について試験した以外は、実施例４に記載の手順で調製した５０ｍＭのイミダゾールバッファ中のＲＮＡ結合したヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３ −メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム染料（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の発光スペクトルである。全部の試薬を室温で３．５ヵ月間保存した。ピークの高い順に：Ａ＝ＢＩＧＣＨＡＰ（１０ｍｇ％）；Ｂ＝マルトシド（５ｍｇ％）；Ｃ＝Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（０．２％）；Ｄ＝コール酸、ナトリウム塩（１０ｍｇ％）；Ｅ＝界面活性剤非添加；Ｆ＝カプリル酸、ナトリウム塩（１０ｍｇ％）を示す。データが示すように、ＢＩＧＣＨＡＰ、マルトシド及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７は水性緩衝溶液中で染料を極めて有効に維持することができたが、コール酸のナトリウム塩及びカプリル酸のナトリウム塩は有効でなかった。実際、試薬にカプリル酸を添加すると染料の保存寿命が短縮された。実施例１１図１１は、ＢＩＧＣＨＡＰまたはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を界面活性剤として用いて実施例４に記載の手順で調製し４℃で４ヵ月間保存したＲＮＡ結合シアニン染料、ヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムの発光スペクトルである。ピークの高い順に：Ａ＝新しく調製した対照試薬；Ｂ＝ＢＩＧＣＨＡＰ（１０ｍｇ％）；Ｃ＝Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（０．２％）；Ｄ＝Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（１．０％）；Ｅ＝界面活性剤非添加を示す。図から判るように、４ヵ月の試験期間中に本発明の染料の有意な劣化は生じない。実施例１２図１２は、ＲＮＡ結合シアニン染料、ヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン） −１−フェニルキノリニウムの発光スペクトルであり、５ｍｇ％のＢＩＧＣＨＡＰを含む本発明試薬中の３週間の高い温度での安定度を証明する。実施例４に記載の手順で試験試薬を調製し、実施例９のプロトコルに従ってＲＮＡを添加した。ピークの高い順に：Ａ＝４℃；Ｂ＝２５℃；Ｃ＝３７℃；Ｄ＝４５℃ を示す。データが証明するように、適当な水性緩衝溶液に非イオン性界面活性剤ＢＩＧＣＨＡＰを添加すると、シアニン染料の高温に対する感受性が低下し、従ってより安定になる。実施例１３図１３は、１．０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加するかまたは非添加のＢｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ中のＲＮＡ結合したヨウ化２−メチルチオ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２ −イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムの発光スペクトルである。イミダゾールバッファをＢｉｓ−Ｔｒｉｓバッファによって置換し、ヨウ化２− ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール −２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムをヨウ化２−メチルチオ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２ −イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム染料（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によって置換し、室温で６．５ヵ月間保存した以外は、実施例４に記載の手順で試薬を調製した。ピークの高い順に：Ａ＝１．０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加したヨウ化２−メチルチオ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム試薬；Ｂ＝界面活性剤を全く添加しないＢｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ中のヨウ化２−メチルチオ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール −２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム；Ｃ＝界面活性剤を全く添加しないイミダゾールバッファ中のヨウ化２−メチルチオ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２ −イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム；Ｄ＝１．０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加したグリシル−グリシンバッファ中のヨウ化２−メチルチオ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムを示す。結果は、このシアニン染料の安定化にはバッファと界面活性剤との適正な組合せが必要であることを示す。実施例１４図１４は、バッファと共に０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を含む種々のバッファ中のＲＮＡ結合したシアニン染料、ヨウ化２−ブチル−４−(２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン)−１−フェニルキノリニウムの発光スペクトルである。全部の試薬を室温で６週間保存した。ピークの高い順に：Ａ＝Ｔｒｉｓバッファ；Ｂ＝Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ；Ｃ＝イミダゾ−ル；Ｄ＝Ｈｅｐｅｓバッファ；Ｅ＝グリシル−グリシンバッファ；Ｆ＝リン酸バッファを示す。このデータが示すように、Ｔｒｉｓバッファ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ及びイミダゾールバッファは染料を十分に維持するが、グリシル−グリシンバッファ及びリン酸バッファは維持しない。実施例１５約２．３％の網状赤血球を含む５マイクロリットルの正常サンプルを、１．０ｍｌの本発明試薬と混合した。試薬は、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０＋０．１に調整し、ＮａＣｌで２９０ｍＯｓｍ／リットルのオスモル濃度に調整した５０ｍＭのＴｒｉｓバッファと、０．２μｇ／ｍｌの４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムトシレート（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７と、０．０３％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００とを含んでいた。次いで、サンプル中の網状赤血球の％を測定するために、１５秒以内にサンプル／試薬混合物をＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターに導入した。図１５ａは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）サイトメーターのＦＳＣ信号対ＦＬ１信号の二次元表示であり、図１５ｂは、ゲートされた赤血球集団のＦＬ１ヒトスグラムを示す。図１５ｃは、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターで行った経時試験の結果を、１５秒から４．０分までの網状赤血球の％として表す。図から判るように、ＲＢＣ＋網状赤血球のゲートは網状赤血球を血小板及びＷＢＣから明確に分離する。また、網状赤血球が極めて迅速に染色されるので網状赤血球の％が１５秒以内に定常状態に到達する。このような迅速な染色性が得られたので、全自動血液分析装置及びフローサイトメーターに検出方法を組込むことが可能になる。請求の範囲１．網状赤血球染色量の非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ及びＴｒｉｓバッファから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファ溶液と、Ｎ，Ｎ−ビス〔３ −Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マルトシド、デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル− Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシドから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とから成る水性核酸染色用試薬であって、前記試薬が、ｐＨ約６．０〜約８．０を有しており、水性試薬溶液中でシアニン染料と干渉しないかまたは沈殿しない一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整された浸透性を有していることを特徴とする試薬。２．非対称シアニン染料が環置換されていることを特徴とする請求項１に記載の試薬。３．前記非対称シアニン染料が、ヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ− ３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１− フェニルキノリニウム、ヨウ化２−ジエチルアミノ−４−（２，３−ジヒドロ− ３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１− フェニルキノリニウム、ヨウ化２−メチルチオ−４−（２，３−ジヒドロ−３− メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウム、及び、４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムトシレートから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の試薬。４．非対称シアニン染料が、ヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３− メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムであることを特徴とする請求項１に記載の試薬。５．非対称シアニン染料の網状赤血球染色量が約０．１μｌ／ｍｌ〜約０．３μ ｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項３に記載の試薬。６．バッファがイミダゾールであることを特徴とする請求項５に記載の試薬。７．非イオン性界面活性剤が約０．１ｇ／ｄｌ〜約１．０ｇ／ｄｌの量で存在することを特徴とする請求項５に記載の試薬。８．非イオン性界面活性剤がポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーであることを特徴とする請求項７に記載の試薬。９．非イオン性界面活性剤が約５ｍｇ／ｄｌ〜約２０ｍｇ／ｄｌの量で存在することを特徴とする請求項５に記載の試薬。１０．非イオン性界面活性剤がＮ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミドであることを特徴とする請求項９に記載の試薬。１１．更に、有効量の微生物増殖阻害用防腐剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の試薬。１２．防腐剤が、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（２．０−２．５％）と２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（０．７−０．９％）、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（１．０５− １．２５％）と２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（０．２５−０．４５％）、及び、ナトリウムアジドから成るグルーブから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の試薬。１３．全血サンプル中の網状赤血球の計数を、全血球分析を得るためのサンプルの別のアリコートとの区別と同時進行的に行う方法であって、（ａ）サンプルの１つ以上のアリコートを分析及び微分すべく全自動分析装置内部の夫々異なる場所に案内し、（ｂ）網状赤血球染色量の非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ及びＴｒｉｓバッファからなるグループから選択した約２０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファ溶液と、Ｎ，Ｎ−ビス〔３ −Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マルトシド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ドデシル−Ｄ −グルコピラノシド及びｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシドから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とを含み、ｐＨ約６．０〜約８．０を有しており、該水性試薬溶液中でシアニン染料と干渉しないかまたは沈殿しない一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整された浸透性を有している試薬とサンプルの網状赤血球アリコートとを混合し、同時に、混合した試薬／網状赤血球アリコートを全自動分析装置の光学的検出ゾーンに案内する段階と、（ｃ）細胞が前記検出ゾーンをほぼ一度に１個ずつ通過するように、混合した試薬／網状赤血球アリコートを移動させる段階と、（ｄ）前記光学的検出ゾーンにおいて被染色サンプルを入射光ビームによって照射して蛍光イベントを惹起する段階と、（ｅ）被染色網状赤血球が前記光学的検出ゾーンを通過中に前記サンプル溶液中の網状赤血球の蛍光イベントを測定し、（ｆ）被染色網状赤血球の測定された蛍光イベントをカウントすることによって前記サンプル中に存在する網状赤血球の数を決定する段階とから成る方法。１４．環置換されたシアニン染料が、ヨウ化２−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）− １−フェニルキノリニウムと、ヨウ化２−ジエチルアミノ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムと、ヨウ化２−メチルチオ−４−（２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ −１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン）−１−フェニルキノリニウムとから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。１５．全血サンプル中の網状赤血球を計数する方法であって、（ａ）網状赤血球染色量の非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ及びＴｒｉｓバッファから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファ溶液と、Ｎ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マルトシド、デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル −Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシドから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とを含み、ｐＨ約６．０〜約８．０を有しており、該水性試薬溶液中でシアニン染料と干渉しないかまたは沈殿しない一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整された浸透性を有している試薬とサンプルのアリコートとを混合し、同時に、混合した試薬／網状赤血球アリコートを全自動分析装置の光学的検出ゾーンに案内する段階と、（ｂ）細胞が前記検出ゾーンをほぼ一度に１個ずつ通過するように、試薬／網状赤血球アリコートを移動させる段階と、（ｃ）前記光学的検出ゾーンにおいて被染色サンプルを入射光ビームによって照射して蛍光イベントを惹起する段階と、（ｄ）被染色網状赤血球が前記光学的検出ゾーンを通過中に前記サンプル溶液中の網状赤血球の蛍光イベントを測定する段階と、（ｅ）被染色網状赤血球の測定された蛍光イベントをカウントすることによって前記サンプル中に存在する網状赤血球の数を決定する段階とから成る方法。

Claims

【特許請求の範囲】１．網状赤血球染色量の非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ及びＴｒｉｓバッファから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファ溶液と、Ｎ，Ｎ−ビス〔３ −Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マルトシド、デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル− Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシドから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とから成る水性核酸染色用試薬であって、前記試薬が、ｐＨ約６．０〜約８．０を有しており、水性試薬溶液中でシアニン染料と干渉しないかまたは沈殿しない一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有していることを特徴とする試薬。２．非対称シアニン染料が環置換されていることを特徴とする請求項１に記載の試薬。３．前記非対称シアニン染料が、Ｓｙｂｒ１１、Ｓｙｂｒ１４、Ｓｙｂｒ１６及びＳｙｔｏ１２から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の試薬。４．非対称シアニン染料がＳｙｂｒ１１であることを特徴とする請求項１に記載の試薬。５．非対称シアニン染料の網状赤血球染色量が約０．１μｌ／ｍｌ〜約０．３μ ｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項３に記載の試薬。６．バッファがイミダゾールであることを特徴とする請求項５に記載の試薬。７．非イオン性界面活性剤が約０．１ｇ／ｄｌ〜約１．０ｇ／ｄｌの量で存在することを特徴とする請求項５に記載の試薬。８．非イオン性界面活性剤がポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーであることを特徴とする請求項７に記載の試薬。９．非イオン性界面活性剤が約５ｍｇ／ｄｌ〜約２０ｍｇ／ｄｌの量で存在することを特徴とする請求項５に記載の試薬。１０．非イオン性界面活性剤がＮ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミドであることを特徴とする請求項９に記載の試薬。１１．更に、有効量の微生物増殖阻害用防腐剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の試薬。１２．防腐剤が、Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）１５０及びナトリウムアジドから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の試薬。１３．全血サンプル中の網状赤血球の計数を、全血球分析を得るためのサンプルの別のアリコートの区別と同時進行的に行う方法であって、（ａ）サンプルの１つ以上のアリコートを分析及び区別すべく全自動分析装置内部の夫々異なる場所に案内し、（ｂ）環置換された非対称シアニン染料から成るグループから選択された約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．３μｇ／ｍｌの染料と、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭのイミダゾールバッファと、Ｎ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド及びポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とを含み、ｐＨ約６．８〜約７．２を有しており、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２及びＺｎＣｌ２から成るグループから選択された一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２８０〜約３１０ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有している試薬とサンプルの網状赤血球アリコートとを混合し、同時に、混合した試薬／網状赤血球アリコートを全自動分析装置の光学的検出ゾーンに案内する段階と、（ｃ）細胞が前記検出ゾーンをほぼ一度に１個ずつ通過するように、混合した試薬／網状赤血球アリコートを移動させる段階と、（ｄ）前記光学的検出ゾーンにおいて被染色サンプルを入射光ビームによって照射して蛍光イベントを惹起する段階と、（ｅ）被染色網状赤血球が前記光学的検出ゾーンを通過中に前記サンプル溶液中の網状赤血球の蛍光イベントを測定し、（ｆ）被染色網状赤血球の測定された蛍光イベントをカウントすることによって前記サンプル中に存在する網状赤血球の数を決定する段階とから成る方法。１４．環置換されたシアニン染料が、Ｓｙｂｒ１１、Ｓｙｂｒ１４及びＳｙｂｒ１６から成るグループから選択されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。１５．全血サンプル中の網状赤血球を計数する方法であって、（ａ）網状赤血球染色量の非対称シアニン染料と、イミダゾールバッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファ及びＴｒｉｓバッファから成るグループから選択された約２０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファ溶液と、Ｎ，Ｎ−ビス〔３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル〕コラミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マルトシド、デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル −Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシドから成るグループから選択された染料安定化量の非イオン性界面活性剤とを含み、ｐＨ約６．０〜約８．０を有しており、水性試薬溶液中でシアニン染料と干渉しないかまたは沈殿しない一価もしくは二価のアルカリ塩によって約２３０〜約３４０ｍＯｓｍ／リットルに調整されたオスモル濃度を有している試薬とサンプルのアリコートとを混合し、同時に、混合した試薬／網状赤血球アリコートを全自動分析装置の光学的検出ゾーンに案内する段階と、（ｂ）細胞が前記検出ゾーンをほぼ一度に１個ずつ通過するように、試薬／網状赤血球アリコートを移動させる段階と、（ｃ）前記光学的検出ゾーンにおいて被染色サンプルを入射光ビームによって照射して蛍光イベントを惹起する段階と、（ｄ）被染色網状赤血球が前記光学的検出ゾーンを通過中に前記サンプル溶液中の網状赤血球の蛍光イベントを測定する段階と、（ｅ）被染色網状赤血球の測定された蛍光イベントをカウントすることによって前記サンプル中に存在する網状赤血球の数を決定する段階とから成る方法。