JPH06300753A

JPH06300753A - マラリア感染細胞の検出方法及び試薬

Info

Publication number: JPH06300753A
Application number: JP6024023A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Matsumoto; 英彬松本; Takashi Sakata; 孝坂田
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1993-02-22
Filing date: 1994-02-22
Publication date: 1994-10-28
Anticipated expiration: 2018-06-30
Also published as: JP3421111B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】マラリア感染細胞を迅速にかつ特異的に染色
することができ、マラリア感染の有無を簡単に検査する
方法および試薬を提供する。【構成】被検細胞を含む液体試料を式Ｉのオーラミン
類似体の少なくとも１種からなる第１染料と、式IIの縮
合ベンゼン誘導体の少なくとも１種からなる第２染料と
を含有する染色液で処理し、蛍光染色したマラリア感染
細胞を光学的に検出することからなるマラリア感染細胞
の検出方法。（Ｒ_１からＲ_６は水素原子、メチル基またはエチル基。
Ｘはハロゲン原子。ＲはＣ_１−６アルキル基。Ｙは−Ｃ
Ｈ−又は−ＮＨ。ｎは０又は１。又は２つの低級アルコキシ基もしくは１つのジ低級アル
キルアミノ基（該低級アルキルはシアノ基で置換されて
いてもよい）で置換されたフェニル基である）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、マラリアに感染した細
胞（具体的には赤血球）を迅速かつ特異的に染色するこ
とができる、マラリア感染細胞検出方法及び試薬に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】マラリアに感染すると、マラリア原虫は
赤血球内に入り込み増殖していく。マラリア感染赤血球
を検出することはマラリア感染の有無を検査する上で有
効な方法である。

【０００３】マラリア感染赤血球を検出する技術とし
て、従来次のようなものがあった。

【０００４】血液塗抹標本をギムザ染色し、顕微鏡下で
観察し、マラリア感染赤血球を検出する方法があり、こ
れは例えば、「マラリア原虫の検査法」、中村敏夫他、
臨床検査、Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４：３３５−３４１，
１９７９に開示されている。また、血液塗抹標本を蛍光
色素で染色し、蛍光顕微鏡下で観察し、マラリア感染赤
血球を検出する方法が、「蛍光色素による各種原虫感染
症の迅速診断の試み」、川本文彦、臨床検査、Ｖｏｌ．
３２，Ｎｏ．７：８０３−８０６，１９８８に開示され
ている。

【０００５】しかしながら、これらの方法では、塗抹標
本の作成、乾燥、固定、染色の各工程を必要とし、繁雑
である。また、マラリア感染赤血球と非感染赤血球の弁
別に熟練した技術が必要である。さらに、顕微鏡下で観
察するのに多くの時間（通常１５分以上）を要すること
になる。

【０００６】これに対し、フローサイトメータを用いて
マラリア感染赤血球を測定する方法も開発されている。
これは、蛍光色素でマラリア感染赤血球を染色し、フロ
ーサイトメータを用いて検出するものである。原理的に
は、マラリア原虫が蛍光色素で染色され、アルゴンレー
ザ光を照射することにより蛍光を発する。この蛍光を発
する赤血球をマラリア感染赤血球として検出する。この
原理を用いる以下のような各種の方法が開示されてい
る。

【０００７】ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＭａｒａｒｉ
ａＰａｒａｓｉｔｅ−ＩｎｆｅｃｔｅｄＢｌｏｏｄ
ｂｙＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ（フローサイト
メータを用いたマラリア原虫感染血球の分析）、Ｊ．
Ｗ．Ｊａｃｏｂｂｅｒｇｅｒ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖ
ｏｌ．４：２２８−２３７，１９８３。

【０００８】この方法は蛍光色素として３，３’−ジメ
チルオキサカルボシアニン（３，３’−ｄｉｍｅｔｈｙ
ｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ：ＤｉＯＣ１
（３））を使用してフローサイトメータでマラリア感染
赤血球を検出する。この文献のＦｉｇ．７には網状赤血
球（ＩｍｍａｔｕｒｅＲＢＣ：ｉｍＲＢＣ）とマラリ
ア感染赤血球（ｐＲＢＣ，ｐｐＲＢＣ）がオーバーラッ
プして分布することが示されている。また、Ｆｉｇ．２
には、網状赤血球（ｉｍＲＢＣ）とマラリア感染赤血球
（ｐＲＢＣ，ｐｐＲＢＣ）がＤｉＯＣ１（３）染色で蛍
光を発している写真が掲載されている。

【０００９】ＴｈｉａｚｏｌｅＯｒａｎｇｅ：Ａ
ＮｅｗＤｙｅｆｏｒＰｌａｓｍｏｄｉｕｍＳｐ
ｅｃｉｅｓＡｎａｌｙｓｉｓ（チアゾールオレンジ：
熱帯熱マラリア分析の為の新色素）、Ｍ．Ｔ．Ｍａｋｌ
ｅｒｅｔａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ８：
５６８−５７０，１９８７。

【００１０】この方法は蛍光色素としてチアゾールオレ
ンジを使用して培養マラリア感染赤血球をフローサイト
メータで測定するものである。上記文献５６９頁左段中
程には網状赤血球がバックグランドとして染色されてい
る旨の記載がある。

【００１１】ＲａｐｉｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰａｒａｓｉ
ｔｉｚｅｄＨｕｍａｎＲｅｄＣｅｌｌｓｂｙ
ＡｕｔｏｍａｔｅｄＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ
（フローサイトメータを用いたヒト原虫感染赤血球の迅
速検出方法）、Ｊ．Ｍ．Ｗｈａｕｍｅｔａｌ．，Ｃ
ｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ．４：１１７−１２２，１９
８３。

【００１２】この方法は、蛍光色素としてアクリジンオ
レンジを使用してマラリア感染赤血球をフローサイトメ
ータで測定するものである。マラリア感染赤血球にはマ
ラリアのＤＮＡがあるので、緑蛍光を出し、網状赤血球
はそのＲＮＡのため赤蛍光を発生する。網状赤血球は赤
蛍光の強い赤血球として弁別する。

【００１３】ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃＴｗ
ｏ−ＣｏｌｏｒＳｔａｉｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｆｏｒＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＤｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＥｒｙｔｈｒｏｃｙ
ｔｅＭｅｍｂｒａｎｅＡｎｔｉｇｅｎａｎｄＩ
ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｌａｒｉａｌＤＮＡ
（フローサイトメータを使用したヒト赤血球膜抗原と赤
血球内マラリアＤＮＡの同時測定に関する２カラー染色
技術）、Ｋ．Ｐａｔｔａｎａｐａｎｙａｓａｔｅｔａ
ｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ．１３：１８２−１
８７，１９９２。

【００１４】この方法は、蛍光色素としてプロピジウム
アイオダイド（ＰＩ：赤蛍光を発する）を使用し、赤血
球膜にある抗原ＤＡＦ（ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａ
ｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）に対する抗体を使用して、赤
血球膜抗原量とマラリア感染赤血球を測定する。

【００１５】上記方法およびにおいては、網状赤血
球とマラリア感染赤血球とが同時に存在すると、正確に
マラリア感染赤血球が測定できない欠点がある。また、
上記方法およびにおいては、赤蛍光と緑蛍光の２つ
の蛍光を測定する必要がある。さらに、方法では、蛍
光色素としてアクリジンオレンジを使用するため、フロ
ーサイトメータの流路や測定セルに蛍光色素が付着し、
これらを著しく汚染する。方法では、モノクローナル
抗体を使用しているため、ＲＢＣと反応させるのに３０
分以上の時間が必要である等、上記方法はそれぞれ欠点
を有している。

【００１６】上記文献以外にもこれと関連する技術とし
て以下のものが挙げられる。

【００１７】特開昭６１−２８０５６５号（米国特許
第４，９８５，１７４号）特開昭６２−０３４０５８号これらの文献には蛍光色素としてオーラミンＯを含有し
た溶液と血液試料とを混合し、網状赤血球を蛍光染色す
ることが開示されている。には４つの、には１つの
実施例が紹介されている。これを一覧表として以下の表
１にまとめた。

【００１８】

【表１】しかし後述するように、これらの条件では網状赤血球も
マラリア感染赤血球も同じように染まってしまい、マラ
リア感染赤血球のみを検出することはできない。

【００１９】

【発明が解決しようとする課題】以上述べたように、従
来のマラリア感染赤血球を検出する方法はいずれも克服
すべき欠点を有している。本発明の目的は、マラリア感
染赤血球のみをごく短時間（数十秒）で染色し、この染
色されたマラリア感染赤血球をフローサイトメータで個
々に検出する方法及び試薬を提供することにある。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、オーラミンＯ類似体に加えて第２の染料を使用
することによって、マラリア感染赤血球を特異的に染色
し、これを網状赤血球と区別して検出できる方法を見い
だし、本発明を完成した。

【００２１】すなわち、本発明は、被検細胞を含む液体
試料を式（Ｉ）：

【化２３】［式中、Ｒ₁からＲ₆は水素原子、メチル基またはエチル
基であり、Ｘはハロゲン原子である］のオーラミン類似
体の少なくとも１種からなる第１染料と、式（II）：

【化２４】の縮合ベンゼン誘導体の少なくとも１種からなる第２染
料とを含有する染色液で処理し、蛍光染色したマラリア
感染細胞を光学的に検出することからなるマラリア感染
細胞の検出方法、ならびに該方法に使用する試薬を提供
する。

【００２２】式（Ｉ）のオーラミン類似体化合物におい
て、Ｒ₁からＲ₆はそれぞれ独立に水素原子、メチル基ま
たはエチル基である。またＸはハロゲン原子であり、こ
れにはヨウ素原子、臭素原子及び塩素原子が含まれる。

【００２３】式（II）の縮合ベンゼン誘導体化合物にお
いて、ＲのＣ_1-6アルキルとしては、直鎖状及び分枝状
のアルキルを含むが、直鎖状のものが好ましく、例え
ば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−
ペンチル及びｎ−ヘキシルなどが含まれる。Ｘのハロゲ
ン原子としては、ヨウ素原子、臭素原子及び塩素原子を
含む。また、Ｂにおける２つの低級アルコキシ基で置換
されたフェニル基とは、２つのＣ_1-3アルコキシ、好ま
しくはＣ_1-2アルコキシ、例えばメトキシ基、エトキシ
基で置換されたフェニル基をいう。例えば、２，６−ジ
メトキシフェニル基、２，６−ジエトキシフェニル基が
挙げられる。また、Ｂにおけるジ低級アルキルアミノ基
（該低級アルキルはシアノ基で置換されていてもよい）
で置換されたフェニル基とは、Ｃ_1-3アルキルアミノ
基、好ましくはＣ_1-2アルキルアミノ基で置換されたフ
ェニル基をいう。ここで該アルキル基はシアノ基で置換
されていてもよく、例えば、メチル、エチル、シアノメ
チル、シアノエチルなどを含む。好ましいジ低級アルキ
ルアミノ基（該低級アルキルはシアノ基で置換されてい
てもよい）で置換されたフェニル基としては、４−ジメ
チルアミノフェニル基、４−ジエチルアミノフェニル
基、４−（シアノエチルメチルアミノ）フェニル基など
が挙げられる。

【００２４】式（Ｉ）のオーラミン類似体の好ましい具
体例を挙げると、次の通りである。

【００２５】オーラミンＯ（ＣＩＮｏ．４１０００）

【化２５】ベーシックイェロー３７（ＣＩＮｏ．４１００１）

【化２６】ベーシックイェロー３（オーラミンＧ；ＣＩＮｏ．４
１００５）

【化２７】式（II）のベンゼン誘導体の具体例を挙げると、次の通
りである。ＮＫと記載したものについては、（株）日本
感光色素研究所から入手可能である。

【００２６】i）３，３’−ジエチル−２，２’−オキ
サカルボシアニンアイオダイド（ＮＫ−８５、ＤｉＯＣ
２（３））

【化２８】 ii）２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−３−エチル
ベンゾチアゾリウムアイオダイド（ＮＫ−９１）

【化２９】 iii）３，３’−ジメチル−２，２’−オキサカルボシ
アニンアイオダイド（ＮＫ−８６、ＤｉＯＣ１（３））

【化３０】 iv）３，３’−（ジ−ｎ−プロピル）−２，２’−オキ
サカルボシアニンアイオダイド（ＮＫ−２６０５、Ｄｉ
ＯＣ３（３））

【化３１】 v）３，３’−（ジ−ｎ−ペンチル）−２，２’−オキ
サカルボシアニンアイオダイド（ＮＫ−２４５３、Ｄｉ
ＯＣ５（３））

【化３２】 vi）３，３’−（ジ−ｎ−ヘキシル）−２，２’−オキ
サカルボシアニンアイオダイド（ＮＫ−２２８０、Ｄｉ
ＯＣ６（３））

【化３３】 vii）２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−３−メチ
ルベンゾオキサゾリウムアイオダイド（ＮＫ−５２８）

【化３４】 viii）２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１，３，
３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムアイオダイド（Ｎ
Ｋ−９７）

【化３５】 ix）ＢａｓｉｃＹｅｌｌｏｗ１１

【化３６】および x）ＢａｓｉｃＲｅｄ１４

【化３７】本発明のマラリア感染細胞の染色試薬は式（Ｉ）のオー
ラミン類似体の少なくとも１種からなる第１染料と、式
（II）の縮合ベンゼン誘導体の少なくとも１種からなる
第２染料と、これらを溶解しうる水または水溶性の有機
溶媒とからなる。本発明の染色試薬（以下、染色液とい
うこともある）は、第１染料と第２染料とを水に溶解し
て調製することができるが、水に可溶性の有機溶媒に溶
解して調製することもできる。このような溶媒を使用す
ると、染料（例えばオーラミンＯ）の加水分解を防止す
ることができる。使用する有機溶媒としては、低級アル
カノール、低級アルキレングリコールまたは低級アルキ
レングリコールモノ低級アルキルエーテルが好ましい。
例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、
エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチ
レングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテ
ル、エチレングリコールモノエチルエーテルなどを使用
することができる。なかでも、エチレングリコール、ジ
エチレングリコール及びトリエチレングリコールが好ま
しく、赤血球への影響や粘性などを考慮するとエチレン
グリコールが最も好ましい。

【００２７】染料を水または水溶性の有機溶媒に溶解し
た場合、染色液中の第１染料の濃度は０．００５〜０．
４ｗ／ｖ％であり、第２の染料の濃度は０．００５〜
０．５ｗ／ｖ％が好ましい。

【００２８】本発明のマラリア感染細胞の検出方法を実
施するには、上記染色液を液体試料および希釈液と混合
して測定液を調製してフローサイトメータによる測定に
供する。本発明において液体試料とは血液試料をいう。

【００２９】本発明の方法を実施するには測定液中の染
料濃度を適切に調整することが重要である。つまり、測
定液中に第１染料が好ましくは１〜８０ｐｐｍの範囲の
濃度、より好ましくは５−５０ｐｐｍの範囲の濃度で含
有されることが好ましい。これは、染料の濃度が薄すぎ
ても、濃すぎてもマラリア感染細胞の検出に不都合が生
じるためである。すなわち、反応時間が長くなったり、
フローサイトメータでの検出の際にマラリア感染細胞と
網状赤血球との信号強度の差異が不明確になる。測定液
中に含有される第１染料及び第２染料の濃度を上記の範
囲に調整する方法としては、液体試料を染色液で処理す
る前に、予め液体試料を希釈液で希釈する方法、または
予め染色液を希釈液で希釈する方法、あるいは液体試
料、染色液及び希釈液を同時に混合し、処理する方法が
ある。これは、液体試料と高濃度の染色液のみを混合し
て放置すると、とくに有機溶媒を用いて染色液を調製し
た場合には、染色液に含有されている有機溶媒が血球に
悪影響を及ぼし、場合によっては液体試料中の赤血球を
溶解させる可能性があるからである。液体試料に対する
希釈液による希釈倍率は４〜１０００倍が好ましい。ま
た、希釈液としては、ｐＨ４〜９のリン酸緩衝液、クエ
ン酸緩衝液やトリス緩衝液などの従来公知の緩衝液を使
用することができる。

【００３０】さらに、本発明のマラリア感染細胞の検出
方法においては、マラリア感染細胞を特異的に測定する
ために、被検細胞を含有する液体試料を２５−４０℃の
反応温度で、約２０〜６０秒間、好ましくは約３０〜４
０秒間の反応条件で、第１染料と第２染料を含有する染
色液で処理することが好ましい。

【００３１】次いで、本発明において使用するフローサ
イトメータについて説明する。これに使用する光源は励
起波長４８８ｎｍのアルゴンレーザであり、検出対象は
前方散乱光（ＦＳＣ）および波長５２５ｎｍ以上の蛍光
（ＦＬ）である。本発明の実施例では自動網赤血球測定
装置Ｒ−２０００（東亜医用電子株式会社）を用いて測
定した。

【００３２】本発明のメカニズムは以下のように考えら
れる。

【００３３】網状赤血球（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ）
は赤血球の幼若型であり（したがって、ｉｍｍａｔｕｒ
ｅｒｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌとも呼ばれる）、Ｒ
ＮＡを含む。網状赤血球はオーラミンＯによってＲＮＡ
が沈殿、凝集することにより染色される。染色されるた
めには、沈殿、凝集を要するので、染料濃度が薄い場合
には染色されるまでに長く時間が必要となる。一方、白
血球やマラリア感染赤血球の内部にはＤＮＡや封入体が
含まれているので、沈殿や凝集の必要がなく、薄い染料
でも短時間で染色される。しかしながら、オーラミンＯ
の濃度を薄くすると、成熟赤血球の膜の染色性が低下す
るので、十分な蛍光強度が得られなくなるという欠点が
あった。

【００３４】３，３’−ジエチル−２，２’−オキサカ
ルボシアニンアイオダイド（ＤｉＯＣ２（３）、商標名
ＮＫ−８５として（株）日本感光色素研究所より入手）
は血球膜を染める作用のあることが従来知られていた。
そこで、ＤｉＯＣ２（３）を添加してみると、全体的に
蛍光強度を上げることができ、かつ意外にもマラリア感
染赤血球からの蛍光強度と、網状赤血球からの蛍光強度
との間に良好な差異を生じることが判明した。本発明に
おいて、ＤｉＯＣ２（３）はマラリア原虫を染色するた
めに添加するのではなく、マラリア原虫を染めているの
はあくまでオーラミンＯである。

【００３５】以下に記載する参考例および実施例によっ
て本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれによ
ってなんら限定されるものではない。

【００３６】参考例まず、染料としてオーラミンＯだけを用いて、その濃度
を変えた染色液を数種類用意し、フローサイトメータに
て血液試料を測定した。

【００３７】使用した染色液と希釈液の組成は以下の通
りである。

【００３８】＜染色液＞・オーラミンＯ：３００−３０００ｍｇを・エチレングリコール１００ｍｌに溶解して作成した。

【００３９】染色液中のオーラミンＯ濃度は０．３−
３．０％である。

【００４０】＜希釈液＞・プロピオン酸ナトリウム：９．５ｇ／ｌ・トリスヒドロキシルメチルアミノメタン：６．０ｇ
／ｌ・トリシン：７．４ｇ／ｌ＜測定液＞・血液試料：１０μｌ・希釈液：１９５０μｌ・染色液：４０μｌを混合して２ｍｌの測定液を作成した（血液試料に対す
る希釈倍率は２００倍となる）。なお、希釈液は予め３
５℃に加温したもとを使用し、混合液（測定液）を３５
℃で３０秒間インキュベートした後、フローセルに導入
し、細胞個々に前方散乱光（ＦＳＣ）、蛍光（ＦＬ）を
測定した。

【００４１】図１−図３は、染色液中にオーラミンＯが
３．０％含まれているときの測定結果である（測定液の
オーラミンＯの濃度は６００ｐｐｍであり、また血液試
料１μｌに対するオーラミンＯの量は１２０μｇであ
る）。

【００４２】図１はヘモグロビンＨ症（網状赤血球が多
い）、図２は正常検体（網状赤血球は少しあり、マラリ
ア感染赤血球はない）、図３はマラリア感染検体（網状
赤血球もマラリア感染赤血球もある）の二次元スキャッ
タグラムによる測定結果である。図１−図３から、網状
赤血球（図中Ｒｅｔで示す）もマラリア感染赤血球（図
中ｐＲＢで示す）も同じ領域に出現していることがわか
る。すなわち、この条件では網状赤血球とマラリア感染
赤血球との弁別は不可能である。なお、図中のｍＲＢは
成熟赤血球を示す。

【００４３】次に、同じ検体をオーラミンＯが低濃度の
染色液を用いて測定した。図４−図６は、同じ検体をオ
ーラミンＯ低濃度の染色液（染色液中、オーラミンＯ濃
度が０．３％）を用いて測定した結果である（測定液の
オーラミンＯの濃度は６０ｐｐｍであり、血液検体１μ
ｌに対するオーラミンＯの量は１２μｇである）。図
４、５、６はそれぞれ図１、２、３に対応する。なお、
オーラミンＯ濃度が０．３−３．０％の間にある場合の
結果は図示しないが、両者の間の結果となった。

【００４４】ここで、図４−図６から、オーラミンＯを
低濃度にすることにより、網状赤血球からの蛍光強度と
マラリア感染赤血球からの蛍光強度に差が生じることが
判明した。すなわち、網状赤血球は蛍光染色されない
が、マラリア感染赤血球は蛍光染色されるような条件が
あるのではないか、と推測された。

【００４５】しかし、図４−図６からわかるように、単
にオーラミンＯの濃度を薄くするだけでは、蛍光強度は
弱く、また蛍光強度の差も必ずしも明確に生じない。そ
こで、測定感度やインキュベートの条件などの各種条件
を変えて検討した。例えば、インキュベート時間を２分
程度に延ばすと蛍光強度は増大する。また、温度を４０
℃に上げても蛍光強度が上がる。

【００４６】しかし、単にこのような条件を変えるだけ
では網状赤血球とマラリア感染赤血球との差異を迅速に
検出するには不十分であると思われた。

【００４７】本発明は測定の迅速化、すなわち３０秒程
度の短時間の染色工程で、かつ安定して網状赤血球とマ
ラリア感染赤血球の染料程度に明確な差異を生ぜしめる
条件について鋭意研究した結果、達成されたものであ
る。

【００４８】上記課題は、・オーラミンＯを低濃度にすること、および・さらに新しい染料を追加すること、により解決された。

【００４９】

【実施例１】以下のようにして測定液を調製した。

【００５０】＜染色液＞・オーラミンＯ：３００ｍｇ・３，３’−ジエチル−２，２’−オキサカルボシアニ
ンアイオダイド（ＤｉＯＣ２（３））：５０ｍｇをエチレングリコール１００ｍｌに溶解させて作製し
た。第２の染料として用いた３，３’−ジエチル−２，
２’−オキサカルボシアニンアイオダイド（ＤｉＯＣ２
（３））は、（株）日本感光色素研究所からＮＫ−８５
（商品名）として入手したものを用いた。

【００５１】染色液に第２の染料を含有させた以外は、
参考例と全く同じ組成の測定液、測定条件を用いた。

【００５２】図７、８はそれぞれ正常検体、マラリア感
染検体の測定結果であり、それぞれ図２、３に対応す
る。両者の比較から明らかなように、マラリア感染赤血
球ｐＲＢのみが良好に蛍光染色され、成熟赤血球ｍＲＢ
および網状赤血球Ｒｅｔから分かれて分布する。そこで
このマラリア感染赤血球ｐＲＢをクラス分けし計数する
ことができる。なお、図には表されていないが、白血球
は蛍光の強い領域に出現するので、これらと明確に区別
することができる。

【００５３】

【実施例２】実施例１の３，３’−ジエチル−２，２’
−オキサカルボシアニンアイオダイドに代えて、２−
（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−３−エチルベンゾチ
アゾリウムアイオダイド（ＮＫ−９１として入手）を第
２の染料として用いて同様の試験を行ったところ、同様
にマラリア感染赤血球を良好に区別、計数することがで
きた。

【００５４】また、これら２種の染料以外の、上記第２
の染料についても試験したところ、マラリア感染赤血球
の検出に使用可能なことが判明した。その実施可能条件
は上記３，３’−ジエチル−２，２’−オキサカルボシ
アニンアイオダイドの場合とほぼ同じであった。すなわ
ち、濃度については、測定液中における最終濃度で１−
１００ｐｐｍの範囲で実施可能であり、最適濃度は５−
５０ｐｐｍであった。

【００５５】

【実施例３】実施例１のオーラミンＯに代えて、ベーシ
ックイェロー３７を第１の染料として用いて同様の試験
を行ったところ、同様にマラリア感染赤血球を良好に区
別、計数することができた。また、ベーシックイェロー
３を第１の染料として用いた場合もマラリア感染細胞の
検出に使用可能であった。濃度については、測定液中に
おける最終濃度で１〜８０ｐｐｍの範囲で実施可能であ
り、最適濃度は５〜５０ｐｐｍであった。

【００５６】

【発明の効果】本発明の方法により、マラリア感染細胞
を迅速にかつ特異的に染色することができ、マラリア感
染の有無を簡単に検査することが可能になった。本発明
の医学診断分野における効果は極めて大きい。

【図面の簡単な説明】

【図１】染色液中にオーラミンＯを３．０％含む測定液
を用いて、ヘモグロビンＨ症の血液試料を測定した場合
の二次元スキャッタグラムを示す。

【図２】染色液中にオーラミンＯを３．０％含む測定液
を用いて、正常血液試料を測定した場合の二次元スキャ
ッタグラムを示す。

【図３】染色液中にオーラミンＯを３．０％含む測定液
を用いて、マラリア感染血液試料を測定した場合の二次
元スキャッタグラムを示す。

【図４】染色液中にオーラミンＯを０．３％含む測定液
を用いて、ヘモグロビンＨ症の血液試料を測定した場合
の二次元スキャッタグラムを示す。

【図５】染色液中にオーラミンＯを０．３％含む測定液
を用いて、正常血液試料を測定した場合の二次元スキャ
ッタグラムを示す。

【図６】染色液中にオーラミンＯを０．３％含む測定液
を用いて、マラリア感染血液試料を測定した場合の二次
元スキャッタグラムを示す。

【図７】実施例１に記載する本発明の測定液を用いて、
正常血液試料を測定した場合の二次元スキャッタグラム
を示す。

【図８】実施例１に記載する本発明の測定液を用いて、
マラリア感染血液試料を測定した場合の二次元スキャッ
タグラムを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検細胞を含む液体試料を式（Ｉ）：【化１】［式中、Ｒ₁からＲ₆は水素原子、メチル基またはエチル
基であり、Ｘはハロゲン原子である］のオーラミン類似体の少なく
とも１種からなる第１染料と、式（II）：【化２】の縮合ベンゼン誘導体の少なくとも１種からなる第２染
料とを含有する染色液で処理し、蛍光染色したマラリア
感染細胞を光学的に検出することからなるマラリア感染
細胞の検出方法。
【請求項２】前記第１染料がオーラミンＯである請求
項１に記載の方法。
【請求項３】前記第２染料が以下の群から選択される
少なくとも１種である請求項１に記載の方法： i）３，３’−ジエチル−２，２’−オキサカルボシア
ニンアイオダイド（ＮＫ−８５、ＤｉＯＣ２（３））【化３】 ii）２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−３−エチル
ベンゾチアゾリウムアイオダイド（ＮＫ−９１）【化４】 iii）３，３’−ジメチル−２，２’−オキサカルボシ
アニンアイオダイド（ＮＫ−８６、ＤｉＯＣ１（３））【化５】 iv）３，３’−（ジ−ｎ−プロピル）−２，２’−オキ
サカルボシアニンアイオダイド（ＮＫ−２６０５、Ｄｉ
ＯＣ３（３））【化６】 v）３，３’−（ジ−ｎ−ペンチル）−２，２’−オキ
サカルボシアニンアイオダイド（ＮＫ−２４５３、Ｄｉ
ＯＣ５（３））【化７】 vi）３，３’−（ジ−ｎ−ヘキシル）−２，２’−オキ
サカルボシアニンアイオダイド（ＮＫ−２２８０、Ｄｉ
ＯＣ６（３））【化８】 vii）２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−３−メチ
ルベンゾオキサゾリウムアイオダイド（ＮＫ−５２８）【化９】 viii）２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１，３，
３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムアイオダイド（Ｎ
Ｋ−９７）【化１０】 ix）ＢａｓｉｃＹｅｌｌｏｗ１１【化１１】および x）ＢａｓｉｃＲｅｄ１４【化１２】
【請求項４】染色液による処理時に、液体試料がｐＨ
４〜９の希釈液で希釈される請求項１に記載の方法。
【請求項５】液体試料の希釈液による希釈倍率が４〜
１０００倍である請求項１に記載の方法。
【請求項６】染色処理時における第１の染料と第２の
染料の濃度が、測定液中それぞれ１〜８０ｐｐｍ、１〜
１００ｐｐｍである請求項１に記載の方法。
【請求項７】染色処理時における温度が２５〜４０℃
である請求項１に記載の方法。
【請求項８】染色処理時間が約２０〜６０秒である請
求項１に記載の方法。
【請求項９】請求項１に記載の式（Ｉ）のオーラミン
類似体の少なくとも１種からなる第１染料と、請求項１
に記載の式（II）の縮合ベンゼン誘導体の少なくとも１
種からなる第２染料と、これらを溶解しうる水または水
溶性の有機溶媒とからなるマラリア感染細胞の染色試
薬。
【請求項１０】前記第１染料がオーラミンＯである請
求項９に記載の試薬。
【請求項１１】前記第２染料が以下の群から選択され
る少なくとも１種である請求項９に記載の試薬： i）３，３’−ジエチル−２，２’−オキサカルボシア
ニンアイオダイド（ＮＫ−８５、ＤｉＯＣ２（３））【化１３】 ii）２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−３−エチル
ベンゾチアゾリウムアイオダイド（ＮＫ−９１）【化１４】 iii）３，３’−ジメチル−２，２’−オキサカルボシ
アニンアイオダイド（ＮＫ−８６、ＤｉＯＣ１（３））【化１５】 iv）３，３’−（ジ−ｎ−プロピル）−２，２’−オキ
サカルボシアニンアイオダイド（ＮＫ−２６０５、Ｄｉ
ＯＣ３（３））【化１６】 v）３，３’−（ジ−ｎ−ペンチル）−２，２’−オキ
サカルボシアニンアイオダイド（ＮＫ−２４５３、Ｄｉ
ＯＣ５（３））【化１７】 vi）３，３’−（ジ−ｎ−ヘキシル）−２，２’−オキ
サカルボシアニンアイオダイド（ＮＫ−２２８０、Ｄｉ
ＯＣ６（３））【化１８】 vii）２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−３−メチ
ルベンゾオキサゾリウムアイオダイド（ＮＫ−５２８）【化１９】 viii）２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１，３，
３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムアイオダイド（Ｎ
Ｋ−９７）【化２０】 ix）ＢａｓｉｃＹｅｌｌｏｗ１１【化２１】および x）ＢａｓｉｃＲｅｄ１４【化２２】
【請求項１２】染色試薬中の第１染料と第２染料のそ
れぞれの濃度が、０．００５〜０．４ｗ／ｖ％、０．０
０５〜０．５ｗ／ｖ％である請求項９に記載の試薬。