FI94180B - Menetelmä solukomponenttien analysoimiseksi nesteestä - Google Patents

Menetelmä solukomponenttien analysoimiseksi nesteestä Download PDF

Info

Publication number
FI94180B
FI94180B FI892926A FI892926A FI94180B FI 94180 B FI94180 B FI 94180B FI 892926 A FI892926 A FI 892926A FI 892926 A FI892926 A FI 892926A FI 94180 B FI94180 B FI 94180B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
sample
cells
blood
cell
bone marrow
Prior art date
Application number
FI892926A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI892926A (fi
FI94180C (fi
FI892926A0 (fi
Inventor
Michael R Loken
Leon W M M Terstappen
Original Assignee
Becton Dickinson Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Becton Dickinson Co filed Critical Becton Dickinson Co
Publication of FI892926A0 publication Critical patent/FI892926A0/fi
Publication of FI892926A publication Critical patent/FI892926A/fi
Publication of FI94180B publication Critical patent/FI94180B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI94180C publication Critical patent/FI94180C/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1456—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56977—HLA or MHC typing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1402—Data analysis by thresholding or gating operations performed on the acquired signals or stored data
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/973—Simultaneous determination of more than one analyte
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805—Optical property
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Description

94180
Menetelmä solukomponenttien analysoimiseksi nesteestä
Keksintö kohdistuu ruumiinnesteessä läsnäolevien solukomponenttien moniparametriseen analyysiin, ja se kohdistuu erityisemmin veri- tai luuydinnäytteessä läsnäolevien solukomponenttien erottamiseen ja määrän määrittämiseen analysoimalla viisi parametriä virtaussytometrisesti.
Yksilön hematologisen tilan kaksi tärkeintä mittaa ovat verisolujen kokonaislukumäärä veressä ja valkosoluerotus. Verisolujen kokonaislukumäärän ja valkosoluerotuksen määrittäminen käsittää veren eri solukomponenttien erottamisen ja sitten niiden laskemisen. Kaikissa verinäytteissä läsnäolevista eri komponenteista voidaan mainita punaiset verisolut (PVS), verihiutaleet ja tumalliset solut. Viimeiseen ryhmään kuuluu lukuisia erityyppisiä leukosyyttejä (valkosoluja), joista voidaan mainita lymfosyytit [sekä B- että T-solut, luonnolliset tappajasolut (LT-solut) ja niiden eri alaryhmät], monosyytit ja granulosyytit (mukaan lukien neutrofiilit, eosinofiilit ja basofiilit kaikissa kehitysvaiheissaan). Solutyyppien laajasta mahdollisesta alueesta ja kunkin solutyypin erilaisista mahdollisista kehitysvaiheista johtuen veressä läsnäolevien verisolujen kokonaislukumäärän ja valkosoluerotuksen määrittäminen on usein hankalaa ja monimutkaista normaalin yksilön tapauk-: sessa ja vieläkin vaikeampaa ja monimutkaisempaa epänormaalin yksilön tapauksessa. Lisäksi tämä monimutkaisuus korostuu, kun tavoitteena on luuydinnäytteiden analyysi.
Verisolujen kokonaislukumäärä veressä (eli solujen lukumäärä tavanomaista tilavuusyksikköä kohden) ja valkosoluerotus (eli tietyn tyyppisten solujen lukumäärä tavanomaista tilavuusyksikköä kohden) määritetään perinteisesti käsin laskemalla solut pienestä näytetilavuudesta valomikroskoopin avulla ja kertomalla sitten laskettu lukumäärä koko tilavuutta vastaavalla tekijällä. Sekä lasketusta näytekoosta että siitä asiantuntemuksesta, joka tarvitaan eri solutyyppien erottamiseen, joh- 2 94180 tuen tähän menetelmään liittyy suurta vaihtelua, jota ei useinkaan voida hyväksyä.
Alalla ollaan viime aikoina saatu aikaan instrumentteja, joilla verisolujen kokonaislukumäärä veressä tai valkosoluerotus saadaan määritetyksi turvautumatta näytteen tarkasteluun käsin mikroskoopin avulla. Nykyään saatavilla olevat instrumentit ilmaisevat solut joko elektronisesti aukon impedanssin perusteella [esim. Coulter Counter''", kuvattu julkaisussa Coulter, Proc. Nat. Electronics Conf. 12:1034 (1956)] tai optisesti valon siroamisen ja absorption perusteella [esim. Technicon H-6000“, kuvattu julkaisussa Breakell et el.. Blood cells.
11:257 (1985)]. Näissä instrumenteissa punaisten verisolujen fraktio on erotettava valkosoluista ja kumpikin mittaus on tehtävä toisistaan riippumatta. Näin on tehtävä, koska normaalissa potilaassa punaisia verisoluja on huomattavasti, vähintään suhteessa 1000:1, enemmän kuin valkosoluja. Epänormaalissa potilaassa (esim. valkosolukadosta kärsivässä potilaassa) tämä suhde voi olla olennaisesti suurempi.
Olemassa on myös muita keinoja valkosoluerotuksen määrittämiseksi. Virtaussytometrejä, jotka on kuvattu yleisesti US-pa-tenttijulkaisuissa 4 661 913, 4 284 412 ja 3 826 364 sekä artikkelissa Herzenberg, et ai., Sei. Am.. 234:108 (1976), on käytetty erilaisten valkosolupopulaatioiden tunnistamiseen heterogeenisesta näytteestä ilmaisemalla monia toisistaan riippumattomia parametrejä erillisistä soluista, jotka kulkevat tunnistusalueen läpi. Näihin parametreihin kuuluvat tyypillisesti valon etusironta (FLS, joka on mitta hiukkasen suhteellisesta koosta), valon suorakulmainen sironta (OLS, joka on suhteellisen rakeisuuden mitta) sekä fluoresenssi. Fluo-• resenssi voidaan mitata nukleiinihappoväriä sisältävistä soluista tai se voidaan mitata soluista, joiden pinnalla olevat merkitsimet on leimattu fluorokromeihin suoraan tai epäsuoraan konjugoiduilla monoklonaalisilla vasta-aineilla (MAb), kuten esimerkiksi patenttijulkaisussa US 4 520 110 kuvataan. Vir-taussytometrin erilliset kanavat havaitsevat ja tallentavat kunkin erilaisen solumittauksen. Erilaiset valkosolukomponen- 3 941 80 tit voidaan erottaa toisistaan yhdistämällä ja vertaamalla näitä parametrejä. US-patenttijulkaisussa 4 727 020 on esitetty eräs esimerkki siitä, miten virtaussytometriä voidaan käyttää tässä menetelmässä valkosoluerotusten määrittämiseksi verestä. Tämä lähestymistapa rajoittuu kuitenkin valkosoluero-tuksiin ja vain veren valkosoluerotuksiin.
Näin ollen alalla ei ole tällä hetkellä käytettävissä yhtään ainoata tarkkaa standardi-instrumenttia tai -menetelmää, jolla vain yksi veri- tai luuydinnäyte voitaisiin analysoida siten, että kaikki erilaiset, veressä ja luuytimessä läsnäolevat solutyypit saadaan erotetuiksi toisistaan ja sitten lasketuiksi.
Tämä keksintö käsittää menetelmän ruumiinnesteessä läsnäolevien solujen samanaikaiseksi, moneen parametriin perustuvaksi analysoimiseksi, mainitun nesteen ollessa selkäydin-, vatsaontelo- tai aivonestettä, virtsaa tai kokoverta. Lisäksi tämä neste voi olla kudossolususpensiota, jossa kudos on luuydintä, imusolmukesoluja, perna- tai maksasoluja. Tässä menetelmässä parametreinä on vähintään kaksi mittaa kunkin tutkitun solun kyvystä sirottaa valoa ja vähintään kolme mittaa kunkin tutkitun solun aiheuttamasta fluoresenssiemissiosta tai -aktiivisuudesta. Tämän menetelmän käsittämissä vaiheissa yksilön ruumiinnestenäyte yhdistetään vähintään kahteen väriaineeseen ja vähintään yhteen solupinnan leimattuun merkitsimeen leima-: tun liuoksen muodostamiseksi, joiden mainittujen värien avulla voidaan määrittää toisistaan riippumatta näytteessä olevien solujen erilaisia ominaisuuksia, mainitun merkitsimen tunnistaessa antigeenin, joka on ilmentynyt erilaisena sukuperältään erilaisissa soluissa. Kukin väreistä ja leima-aineista on fluoresoiva ja niiden kunkin emissiospektrin huippu voidaan *1 erottaa muista huipuista. Sitten tämä leimattu liuos johdetaan ilmaisevan instrumentin läpi, jossa instrumentissa kutakin liuoksessa läsnäolevaa solua tarkastellaan olennaisesti yksi kerrallaan ja jossa fluoresenssin intensiteetti ja valon siroaminen mitataan kunkin tarkastellun solun tapauksessa. Kunkin solun tapauksessa suoritetut mittaukset (parametrit) * voidaan tallentaa muistiin ja analyysijärjesteinään ja niitä 4 94180 voidaan yhdistellä ja analysoida reaaliajassa tai myöhempänä ajankohtana. Veri- ja luuydinnäytteiden käsittämät solutyypit ja sukuperät voidaan erottaa ja tunnistaa analysoimalla nämä useat parametrit.
Erityisemmin tämän menetelmän käsittämissä vaiheissa leimatun liuoksen muodostamiseksi ruumiinnestenäytteeseen lisätään nuk-leiinihappovärejä, kuten RNA-väriä tai DNA-väriä sekä leimattua monoklonaalista vasta-ainetta (MAb), joka tunnistaa suku-perältään erilaisissa soluissa erilaisena ilmentyneen solupin-nan antigeenin, leimattu liuos johdetaan virtaussytometrin läpi, fluoresenssin intensiteetti, OLS ja FLS mitataan ja saadut tiedot tallennetaan analyysiä varten. Kukin nukleiinihap-poväreistä ja immuunileima-aineista on fluoresoiva, ne kaikki voidaan virittää samalla aallonpituudella ja niiden emissios-pektrien huiput voidaan erottaa muista huipuista.
Keksintö kattaa myös reagenssipakkauksen, joka sisältää ohessa käyttökelpoisia nukleiinihappovärejä sekä solupinnan leimattuja merkitsimiä.
Kaikki kuusi kuviota esittävät logaritmiasteikolla noin 22000 solulla saatuja värillisiä pistekuvioita. Solut olivat peräisin nestenäytteestä, joka oli leimattu nukleiinihappoväreillä LDS-751 ja tiatsolioranssi sekä monoklonaalisella vasta-aineella CD4 MAb kuten HLe-l(PE). Leimatut solut analysoitiin FACScan^-virtaussytometrillä, joka käsitti yhden ainoan, aallonpituuteen 488 nm viritetyn argonlaserin [Becton Dickinson Immunocytometry Systems (eli BDIS)], ja kunkin solun tapauksessa mitattiin OLS, FLS ja fluoresenssin intensiteetti. Digitaalimuotoon saatettuun ja luettelona tallennettuun viiteen parametriin liittyvä tiedonkeruu tapahtui Consort 30 -tieto-jenkäsittelylaitteella (BDIS). Tietojen analysointi ja tulostus toteutettiin käyttäen ohjelmistoa Paint-A-Gatetm (BDIS) .
Kuvio 1 käsittää lukuisia pistekuvioita, jotka on saatu normaalin ääreisverinäytteen soluilla näiden viiden parametrin • erilaisina yhdistelminä analysoiden. Näissä kuvioissa keltai-
Il It l Hl· I ! I sl I
5 941 80 seksi värjäytyneet solut ovat punasoluja (erytrosyyttejä), mustiksi värjäytyneet solut ovat valkosoluja (leukosyyttejä), punaisiksi värjäytyneet solut ovat retikulosyyttejä ja tumman sinisiksi värjäytyneet hiukkaset ovat verihiutaleita; kuvio 2 käsittää lukuisia pistekuvioita, jotka on saatu ainoastaan kuvion 1 yhteydessä analysoidun verinäytteen tumallisilla soluilla. Nämä solut on rajattu kuvion Ib LDS-75l/tiat-solioranssi-fluoresenssikuviossa, jossa tumman sinisiksi värjäytyneet solut ovat lymfosyyttejä, punaisiksi värjäytyneet solut ovat monosyyttejä, vihreiksi värjäytyneet solut ovat neutrofiilejä ja mustiksi värjäytyneet solut ovat eosinofiile-jä; kuvio 3 käsittää lukuisia pistekuvioita, jotka on saatu normaalin luuytimen soluilla näiden viiden parametrin erilaisina yhdistelminä analysoiden ja tässä kuviossa solutyypit värjäytyivät samoin kuin kuviossa 1; kuvio 4 käsittää lukuisia pistekuvioita, jotka on saatu ainoastaan kuvion 3 yhteydessä analysoidun luuydinnäytteen tumallisilla soluilla, jotka on rajattu LDS-75l/tiatsolioranssi-fluoresenssikuviossa. Solutyypit värjäytyivät samoin kuin kuviossa 2, ja tumalliset erytroidisolut värjäytyivät purppuranpunaisiksi ja epäkypsät leukosyytit (emosolut) värjäytyivät * vaalean sinisiksi; kuvio 5 käsittää lukuisia pistekuvioita, jotka on saatu trom-bosytopeenisen B-CLL-potilaan ääreisveren soluilla näiden viiden parametrin erilaisina yhdistelminä analysoiden. Solut värjäytyivät samoin kuin kuviossa 1; ja f « kuvio 6 käsittää lukuisia pistekuvioita, jotka on saatu ainoastaan kuvion 5 yhteydessä analysoidun verinäytteen tumallisilla soluilla, jotka on rajattu sen LDS-751/tiatsolioranssi-fluoresenssikuviossa. Solut värjäytyivät samoin kuin kuviossa 4.
« 6 94180
Keksintö käsittää menetelmän ruumiinnesteessä läsnäolevien solujen samanaikaiseksi, moneen parametriin perustuvaksi analysoimiseksi, mainitun nesteen ollessa selkäydin-, vatsaontelo- tai aivonestettä, virtsaa tai kokoverta. Lisäksi tämä neste voi olla kudossolususpensiota, joka solususpensio on valmistettu luuytimestä tai esimerkiksi maksa-, perna- tai imu-solmukesoluista. Tässä menetelmässä parametreinä on vähintään kaksi mittaa kunkin tutkitun solun kyvystä sirottaa valoa useammassa kuin yhdessä suunnassa ja vähintään kolme mittaa kunkin tutkitun solun aiheuttamasta fluoresenssiaktiivisuudes-ta. Tämän menetelmän käsittämissä vaiheissa leimatun liuoksen muodostamiseksi ruumiinnestenäyte yhdistetään vähintään kahteen väriaineeseen ja vähintään yhteen solupinnan leimattuun merkitsimeen, joiden mainittujen värien avulla voidaan määrittää toisistaan riippumatta näytteessä olevien solujen erilaisia ominaisuuksia, mainitun merkitsimen tunnistaessa antigeenin, joka on ilmentynyt erilaisena sukuperältään erilaisissa soluissa. Kukin väreistä ja leima-aineista on fluoresoiva ja niiden kunkin emissiospektrin huippu voidaan erottaa muista huipuista. Sitten tämä leimattu liuos johdetaan ilmaisevan instrumentin läpi, jossa instrumentissa kutakin liuoksessa läsnäolevaa solua tarkastellaan olennaisesti yksi kerrallaan 7a jossa fluoresenssin intensiteetti ja valon siroaminen mitataan kunkin tarkastellun solun tapauksessa. Kunkin solun takauksessa suoritetut mittaukset (parametrit) voidaan tallentaa muistiin ja niitä voidaan yhdistellä ja analysoida reaaliajassa tai myöhempänä ajankohtana.
Keksintö tekee mahdolliseksi nestenäytteessä läsnäolevien solujen erottamisen ja tunnistamisen analysoimalla vähintään viisi parametria. Keksinnön mukainen menetelmä käsittää edullisesti vaiheet, joissa: 1) otetaan soluja sisältävä ruumiinnestenäyte, joka on edullisesti kokoverta tai luuydinnestettä; 2) tähän näytteeseen lisätään kaksi fluoresoivaa nukleiinihappoväriä kunkin solun DNA:n ja RNA:n leimaamiseksi eri tavalla, kummankin värin fluoresenssie-missiospektrin huippujen erottuessa toisistaan; 3) näyttee- 7 94180 seen lisätään fluoresoivasti leimattua solupinnan merkitsintä, joka merkitsin tunnistaa nesteessä läsnäolevien solujen pinnalla eri tavalla ilmentyneen antigeenin, ja jonka mainitun fluoresoivan immuunileiman emissiospektrihuippu erottuu mainittujen fluoresoivien värien huipuista; ja 4) näytteessä olevat solut analysoidaan automaattisella instrumentilla, joka kykenee ilmaisemaan ja taltioimaan sekä erillisten solujen fluoresenssin emissiospektrin huipun kohdalla tai sen läheisyydessä että erillisten solujen OLS- ja FLS-sironnat.
Edullisessa suoritusmuodossa ilmaiseva instrumentti on vir-taussytometri, esimerkiksi FACScantal (BDIS). Mainittujen fluoresoivasti leimattujen solujen virittämiseksi tämä sytometri on varustettu edullisesti yhdellä laserilla kuten argonioni-laserilla, joka on viritetty aallonpituuteen 488 nm tai sen läheisyyyteen. Näin ollen nämä fluoresoivat nukleiinihappovä-rit ja fluoresoiva leima on voitava virittää aallonpituudella 488 nm. DNA-värinä käytetään edullisesti LDS-751-väriä (Exciton) ja RNA-värinä käytetään edullisesti tiatsolioranssia (BDIS). LDS-751:n emissiospektrin huippu saadaan aallonpituudella 670 nm ja tiatsolioranssin emissiospektrin huippu saadaan aallonpituudella 530 nm. Muita fluoresoivia nukleiinihap-povärejä, joita voidaan käyttää oheista keksintöä toteutettaessa, ovat esimerkiksi ne, jotka on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 544 546.
Alan asiantuntijalle on selvää, että mikäli virtaussytometri on varustettu useammalla kuin yhdellä laserilla, niin fluoresoivat värit ja/tai fluoresoiva leima voidaan virittää eri aallonpituuksilla. Tällaisessa suoritusmuodossa ainoana vaatimuksena on se, että värien ja immuunifluoresoivan leiman kaikki emissio-; spektrien huiput erottuvat toisistaan. Sellaisista virtaussyto-metreistä, jotka on varustettu vastaavasti aallonpituuteen 633 nm ja 488 nm viritetyillä helium/neon- ja argonionilasereilla, voidaan mainita esimerkiksi FACStar Plus*” (BDIS) .
Samoin edullisessa suoritusmuodossa solupinnan merkitsin on monoklonaalinen vasta-aine, joka kiinnittyy selektiivisesti 8 94180 hematopoieettisten solujen pinnalla erilaisena ilmentyneeseen solupinnan antigeeniin. On toivottavaa, että antigeeniä ilmentyy eri määrinä erityyppisten ja erilaisessa kehitysvaiheissa olevien tumallisten solujen pinnalla. Eräs tällainen antigeeni on CD45. Tämän antigeenin molekyylipaino on noin 1BO - 220 kD ja sitä ilmentyy eri määrinä kaikkien lymfosyyttien, monosyyt-tien ja granulosyyttien pinnalla, mutta se puuttuu täysin kehittyneistä verihiutaleista ja punaisista vesisoluista. Spesifisesti CD45-antigeenin kanssa reagoivista monoklonaalisistä vasta—aineista (CD4S Mab) voidaan mainita HLe—1 (jota kutsutaan myös anti-leukosyytiksi, BDIS) sekä LCA (Dako Corp.). Edullisesti käytetään tuotetta HLe—1.
CD45 MAb kiinnitetään suoraan fluoresoivaan leimaan kuten fluori kromi in. Suorassa menetelmässä MAb konjugoidaan suoraan fluoresoivaan leimaan alan asiantuntijalle tutuilla tavoilla. US—patenttijulkaisussa 4 520 110 kuvataan eräs menetelmä fluoresoivan leiman konjugoimiseksi MAbsiin.
Edullisessa suoritusmuodossa fluori kromi on fykobi1iproteiini kuten fykoerytriini (PE), joka voidaan virittää aallonpituudella 488 nm ja jonka emissiohuippu saadaan aallonpituudella 575 nm. Hle-lsn ja PE:n yhdistelmästä käytetään yleensä mer— kintää HLe-1(PE).
. Tässä keksinnössä voidaan myös käyttää muita f 1uorikromeja.
Ainoina vaatimuksina on, että nämä fluori kromit virittyvät aallonpituudella 488 nm argonlaseria käytettäessä tai jollakin muulla aallonpituudella kahta 1aserlähdettä käytettäessä (esim. aallonpituudella 633 nm He/Ne—1aserin tapauksessa), ja että fluorikromin emissiospektrin huippu ei peitä nukleiinihappo-värejä.
Edelleen on toivottavaa, että virtaussytometri on kytketty .· laitteeseen, joka taltioi ja analysoi kustakin erillisestä solusta saadut tiedot. Tietoja taltioiva ja analysoiva laite voi olla sopivalla ohjelmistolla varustettu mikrotietokone. Ohjelmiston tulisi kyetä analysoimaan vähintään viisi paramet- 94180 9 riä kunkin solun tapauksessa, erottamaan toisistaan tai tunnistamaan samanlaisten solujen populaatiot viisiulotteisessa avaruudessa sekä esittämään kaksiulotteisesti vähintään kaksi näistä parametreista. Lisäksi ohjelmiston tulisi kyetä rajaamaan yksi tai useampi parametri ja esittämään kaksiulotteisesti muiden parametrien yhdistelmä.
Edullisessa suoritusmuodossa käytetään Paint-A—Gatetm—ohjelmistoa (BDIS) yhdistettynä tietoja tallentavaan ja analysoivaan Consort 30-järjestelmään (BDIS). Tämä ohjelmisto on kuvattu täydellisesti 7. toukokuuta 1987 jätetyssä US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 046 619, ja jolla on sama hakija kuin oheisella hakemuksella.
Ohessa kuvatun menetelmän lisäksi keksinnössä saadaan myös aikaan reagenssipakkaus ruumiinnesteessä läsnäolevien solujen analysoimiseksi monen parametrin avulla. Tämä reagenssipakkaus voi käsittää ensimmäisen astian, joka sisältää vähintään kaksi nukleiinihappoväriä kussakin solussa olevan DNA:n ja RNA:n leimaamiseksi, joiden värien emissiospektrien huiput erottuvat toisistaan, sekä toisen astian, joka sisältää fluoresoivasti leimattua solupinnan merkitsintä, joka solupinnan merkitsin reagoi spesifisesti näytteessä olevien erilaisten solujen pinnalla eri tavalla ilmentyneen solupinnan antigeenin kanssa.
Nämä värit ovat edullisesti nukleiinihappovärejä, jotka lei— ,* maavat DNA:n ja RNA:n eri tavalla. Edullisessa suoritusmuodossa nukleiinihappovärit ovat LDS-751 ja tiatsolioranssi ja fluoresoi vasti leimattu solupinnan merkitsin on HLe-1(PE). Alan asiantuntijalle on selvää, että reagenssipakkaus voi myös käsittää muita kuin ohessa kuvattuja nukleiinihappovärin ja/tai solupinnan merkitsimen yhdistelmiä. Samoin on selvää, että . ! nukleiinihappovärit ja/tai solupinnan merkitsimet on voitu täyttää erillisiin astioihin.
Esi merki t
Normaalien vapaaehtoisten ääreisverta kerättiin 1askimopiston avulla Vacutainer—putkiin, jotka sisälsivät hyytymistä estävänä ·· aineena EDTA<k3)—liuosta (Becton Dickinson). Verta otettiin 10 94180 myös potilaasta, jonka B-solujen krooninen lymfosyyttinen leukemia (B-CLL) arvioitiin RAI-määrityksellä IV tilan leukemiaksi. Automaattisella verisolujen analysaattorilla (Hl, Techni-con) määritetyt verisolujen 1ukukuumäärät olivat: punaisia verisoluja 3,3 x 10^/ml; leukosyyttejä 81,9 κ lO^/ml; ja verihiutaleita 35 x 10^/ml, joka korjattiin käsin toteutetun laskemisen perusteella arvoksi 20 x 10Ä/ml. Imemällä otettuja luu— ydinnäytteitä saatiin normaaleista vapaaehtoisista. Imetyt näytteet siirrettiin Vacutainer—putkiin, ja ne laimennettiin suhteessa 1:1 RPMI 1640—1iuoksella (6IBC0).
Kussakin kokeessa käytettiin 10 μΐ veri— tai luuydinnäytettä. Näytteissä inkuboitiin 30 minuuttia 10 μΐ LDS-751-1iuosta (0,1 mg 5 ml:ssa PBS-1iuosta), 10 μΐ tiatsolioranssiliuosta (0,1 mg 1 ml:ssa PBS—liuosta) ja 10 μΐ HLe-1(PE)-1iuosta. Näyte laimennettiin 1 ml:lla -fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS) ennen mittaamista.
Spektri kompensaatiota käytettiin LDS-751-kanavaan tunkeutuvan PE-emission korjaamiseksi (5 V.:n vähennys), PE-kanavaan tunkeutuvan LDS-751-emission kor jaami seksi (11 n vähennys), tiat-solioranssi kanavaan tunkeutuvan PE—emission korjaamiseksi (23 %:n vähennys) sekä PE-kanavaan tunkeutuvan tiatsolioranssi-emi 55i on kor jaami seksi (0,4 V.zn vähennys). Ti atsol i oransseja LDS-751-kanavien välillä ei tarvittu kompensaatiota.
Virtaussytometriset mittaukset toteutettiin FACScantm-virtaus-sytometri11ä, joka oli varustettu yhdellä argonionilaseri 1la. Digitaalimuotoon saatettuun ja luettelona tallennettuun viiteen parametriin liittyvä tiedonkeruu toteutettiin FACScantm-tutki-musohjelmistol la käyttäen Consort SO^-tietojenkäsi ttelylaatetta. Kunkin näytteen tapauksessa analysoitiin 22000 solua. Tumallisten solujen erottamiseksi tietojenkeruu toteutettiin rajoittuen LDS-751:n ja tiatsolioranssin fluoresenssin intensiteettiin. Tiedot analysoitiin Paint-A-Gateiim-ohjelmistol 1 a, jolla voidaan esittää useaan parametriin liittyviä tietoja.
Il IM I Mil t * I M I
94180 11
Alan asiantuntijalle on selvää, että näyte voidaan analysoida kahdella erillisellä toimenpiteellä. Ruumiinnesteestä otetaan ensin osiin jaettu näyte, jonka osista yksi tai useampi laimennetaan edellä kuvatulla tavalla ja yhtä osaa ei laimenneta lainkaan tai sitä laimennetaan vähemmän. Tämän jälkeen noudatetaan edellä kuvattua menetelmää käyttäen yhtä näyteosaa punaisten verisolujen, verihiutaleiden ja retikulosyyttien tunnistamiseksi ja erottamiseksi tumallisiin soluihin rajoittuen, niitä kuitenkaan laskematta. Tätä menetelmää noudatetaan samoin tumallisten solujen tunnistamiseksi ja erottamiseksi tumattomiin soluihin rajoittuen, mutta niitä kuitenkaan laskematta. Näytteessä läsnäolevat, suhteellisesti harvinaisemmat tumalliset solut saadaan lasketuksi nopeammin jakamalla näyte osiin ja tarkastelemal1 a tumallisia soluja vähemmän laimennetusta näyteosasta.
Solut lajiteltiin FACS 440*m—laitteel1 a, joka kykeni ilmaisemaan kaksi valon siroamisen tuottamaa signaalia sekä kolme fluoresenssisignaalia käytettäessä yhtä, aallonpituuteen 488 nm viritettyä argonionilaseria. Solut lajiteltiin RPMI 1640— liuokseen, joka sisälsi 10 7. siki öasteisen vasikan seerumia (FCS). Lajiteltuja soluja sentrifugoiti in 5 minuuttia nopeudella 200 Ά g ja ne suspendoitiin uudestaan 100 μΐ:aan RPMI-liuosta, joka sisälsi 10 % FCS:ta. Mikroskooppilevyi1le tehdyt preparaatit saatiin käyttäen Shandon Cytosentri-fuge-1 aitetta (Southern Product Ltd., England). Levyt värjättiin Wright Stain-väri11ä ja niitä tarkasteltiin valomikroskoopi11 a. Reti — kulosyyttien tunnistamiseksi uudestaan suspendoituihin lajiteltuihin soluihin lisättiin 100 μΐ juuri valmistettua 1 7. mety-leenisini sen liuosta. Solut siirrettiin mikroskooppilevyile, ne peitettiin ja niitä tarkasteltiin vai omikroskoopi1la.
Viiden parametrin luettelomuotoiset tiedostot analysoitiin tietokoneohjelmalla, jossa käytetään hyväksi väriä pisteryhmien moniulotteiseksi tunnistamiseksi. Viiden parametrin eri yhdistelmät voitiin esittää samanaikaisesti. Parametrien yhden yhdistelmän perusteella tunnistettujen solujen ryhmät värjättiin värillä, joka saatiin sitten samanaikaisesti näkyviin tietojen 12 94180 muissa esityksissä.
Hajottamattornista verinäytteistä saadaan lukuisia erilaisia valon sironnan signaaleja pienten verihiukkasten (1—4 μ), eryt— rosyyttien (6-8 μ) Ja suurempien leukosyyttien (6-20 μ) läsnäolon seurauksena. Jotta valon sironnan tuottamien signal ien koko alue saataisiin määritetyksi, valon etusironnan Ja suorakulmaisen sironnan aiheuttamat signaalit määritettiin käyttäen neljää kymmenlogaritmista vahvistinta. Näissä olosuhteissa kokoverestä tunnistettiin kaksi suurta solupopulaatiota. Katso kuvio la. Näiden solupopulaatioiden erottaminen edelleen edellytti muiden parametrien käyttöä.
Tiatsolioranssilla on suurempi affiniteetti tai mieltymys RNA:han kuin DNA:hän ja sen fluoresenssi voimistuu sitoutumisen seurauksena. Sitoutuneen värin emissiohuippu saadaan aallonpituudella 530 nm. Sitävastoin LDS—751:llä on suurempi affiniteetti tai mieltymys DNA:han kuin RNA:han. Myös tämän värin fluoresenssi voimistuu sitoutumisen seurauksena, mutta sen suurin emissio saadaan aallonpituudella 670 nm. Vaikka todetaankin, ettei verihiutaleilla ole tumaa, LDS—751 värjää selektiivisesti tällaiset solut. Täten on odotettavaa, että muut värit kuin LDS-751 sitoutuvat selektiivisesti verihiutaleisiin ja muihin tumallisiin soluihin, jolloin verihiutaleet erottuvat tumattomista punaisista verisoluista.
Tiatsolioranssin ja LD-751:n yhdistelmällä päästään suureen erottumiseen erytrosyyttien, joista puuttuu sekä RNA että DNA, ja tumallisten, nämä molemmat nukleiinihapot käsittävien leukosyyttien välillä. Kuviossa Ib erytrosyytit ja leukosyytit (mustia, oikeassa yläkulmassa) ovat erottuneet lähes kolmen suuruusluokan verran fluoresenssisignaaliensa suhteen. Näiden värien ei todettu häiritsevän merkittävästi toisiaan tumallisten solujen tapauksessa.
Vaikka tiatsolioranssi a ja LDS-751:tä voidaankin käyttää erytrosyyttien, retikulosyyttien ja verihiutaleiden erottamiseen toisistaan, niin näiden värien välillä todettiin vuorovaiku- 94180 13 tusta sekä vesihiutaleissa että retikulosyyteissä. Verihiutaleiden tapauksessa se järjestys, jossa nämä värit lisättiin, vaikutti -fluoresenssin intensiteettiin. LDS-751:n lisääminen ennen tiatsolioranssia tai samanaikaisesti sen kanssa esti verihiutaleiden värjäämisen tiatsolioranssi 1la. Verihiutaleet värjäytyivät tiatsolioranssi11a vain siinä tapauksessa, että väri lisättiin yksinään tai jos se lisättiin ennen LDS-751:tä. Retikulosyyttien tapauksessa -fluoresenssin intensiteetti tiat— solioranssia käytettäessä oli hieman pienempi LDS-751:n läsnäollessa. Kun näytteitä inkuboitiin samanaikaisesti tiatsoli— oranssin ja LDS—751 s n kanssa, niin tällöin päästiin verihiutaleiden ja retikulosyyttien mahdollisimman suureen erottumiseen näiden populaatioiden erottuessa samalla hyvin erytrosyyteistä.
Tiatsolioranssin ja LDS-751:n emissiospektrien erottuminen toisistaan teki mahdolliseksi sen, että samanaikaisesti voitiin määrittää PE:hen konjugoituneen MAb:n sitoutuminen. CD45 valittiin, koska tämän vasta-aineen tunnistaman antigeenin on todettu esiintyvän erilaisina tiheyksinä sukuperältään erilaisten solujen pinnalla. Immuunitluoresenssin intensiteetin yhdistäminen valon etusirontaan ja suorakulmaiseen sirontaan teki mahdolliseksi tumallisten solujen tehokkaan erottavan analysoimisen, kuten seuraavissa kappaleissa esitetään.
Esimerkki I
. Normaalien verisolujen erotusanalyysi Ääreisveressä inkuboitiin LDS-751:tä, tiatsolioranssia ja HLe— l(PE):tä. Veri preparaatti laimennettiin suhteessa 1:100 PBS— liuoksella ennen mittaamista.
: Tulosten mutkikkuudesta johtuen veren erilaisten solupopulaa tioiden tunnistaminen kuvataan toisistaan erillään. Kuvatut soiualipopulaatiot varmistettiin tarkastelemalla lajiteltuja soluja mikroskooppisesti. Lajiteltujen solutraktioiden puhtaus □li yli 90 %, jolloin suurin osa kontaminoivista soluista oli erytrosyyttejä. Erytrosyyttien suuri esiintymistiheys teki mahdolliseksi niiden ohjaamisen sivuun yhdessä rajatun solu- 14 941 80 populaation kanssa asettamalla kynnys sopivaksi leukosyytti -populaatioiden lajittelun aikana.
Veren hallitseva solupopulaatio muodostuu täysin kehittyneistä erytrosyyteistä (punaisista verisoluista). Punaiset verisolut tunnistettiin valon etusironnan ja valon suorakulmaisen sironnan tuottamasta suhteellisen suuresta signaalista (kuvio la, keltainen), fluoresenssin puuttumisesta LDS-751:tä ja tiatsoli-oranssia käytettäessä (kuvio Ib) sekä anti-CD45—sitoutumisen puuttumisesta (kuviot le, d).
Retikulosyytit (punaisia kuviossa 1) voitiin erottaa täysin kehittyneistä erytrosyyteistä pääasiallisesti sen perusteella, miten ne reagoivat tiatsolioranssin kanssa (kuvio Ib). Reti — kulosyyttien tuottama fluoresenssi LÖS-751:tä käytettäessä on hieman parempi erytrosyytteihin verrattuna. Punaiset verisolut samoin kuin retikulosyytit eivät ilmennä CD45:n tunnistamia pinnan antigeenejä (kuvio le, d). Retikulosyyttejä ei voitu erottaa leukosyyteistä eikä punaisista verisoluista niiden valoa sirottavien ominaisuuksien perusteella (kuvio la).
Tumallisia punasoluja, joita ei tavallisesti esiinny ääreis— veressä, tarkastellaan myöhemmin luuytimen analyysin osana.
Verihiutaleiden tunnusomaisena piirteenä oli niiden suhteellisen pieni valon etusironta ja suorakulmainen sironta (kuvio la, sininen) sekä niiden värjäytyminen LDS-751:tä käytettäessä (kuvio Ib). Verihiutaleet erottuivat selvästi punaisista verisoluista (keltaisia), retikulosyyteistä (punaisia) sekä leuko-syyyteistä (mustia) (kuvio Ib) näitä kolmea parametriä käytettäessä. Erytroidisolujen tavoin verihiutaleet eivät ilmentäneet : CD45:n tunnistamia antigeenejä (kuvio le, d). Moneen paramet riin perustuvaa analyysiä käyttäen "normaalit" verihiutaleet voidaan luonnehtia hiukkasiksi, joiden tapauksessa valon sirontasi gnaal i t ovat suhteellisen heikkoja, fluoresenssin intensiteetti LDS-751stä käytettäessä on suurempi punaisiin verisoluihin verrattuna, reaktiivisuus tiatsolioranssin kanssa puuttuu ja CD45—sitoutumista ei esiinny.
94180 15
Leukosyyttien tunnusomaisena piirteenä ovat valon suorakulmaisen sironnan ja etusironnan suhteellisen suuret signaalit (kuvio la, musta). Vaikka leukosyyttien ja erytroidisolujen (keltaisia) valoa sirottavat ominaisuudet olivatkin samankaltaiset, niin leukosyytit erottuivat kuitenkin selvästi erytroidi soi uis-ta sen ansiosta, että niiden sekä LDS-751:llä että tiatsoli-oranssilla tuotetut -fluoresenssisignaalit olivat suuria (kuvio Ib). Tämän erotuskyvyn perusteella saadaan aikaan täsmällinen menetelmä valkoisten verisolujen laskemiseksi sillain, kun läsnä on huomattavasti enemmän punaisia verisoluja. Edelleen, leukosyytit voitiin erottaa verihiutaleista, punaisista verisoluista ja retikulosyyteistä sen perusteella, miten ne reagoivat CD45:n kanssa (kuvio le, d) .
Jotta tumalliset solut saatiin analysoiduiksi yksityiskohtaisemmin, rajaus toteutettiin tiatsolioranssi 11a ja LDb—751:11ä, kuten kuviossa Ib esitetään. Leukosyyttierotus saatiin saattamalla tumallisten solujen valoa sirottavat ominaisuudet ja CD45:n -fluoresenssin intensiteetti keskenään vastaavuussuhteeseen. Katso kuvio 2a. Lymfosyyttien (sinisiä) tunnusomaisena piirteenä oli CD45-antigeenin selvin ilmentyminen sekä valon suorakulmaisen sironnan pienimmät signaalit. Monosyytit (punaisia) tunnistettiin sen perusteella, että ne sitoivat hieman vähemmän CD45:tä kuin lymfosyytit, valon etusironnan ja suorakulmaisen sironnan signaalien ollessa kuitenkin suurempia.
·; Neutr of i i 1 i set granulosyytit (vihreitä) ilmentivät heikosti CD45-antigeenia ja ne tuottivat suuria valon sirontasignaaleja. Eosinofii1iset granulosyytit (mustia) sitoivat saman määrän CD45:tä kuin monosyytit, mutta ne voitiin erottaa näistä soluista sen perusteella, että valon suorakulmaisen sironnan signaali oli suurempi ja valon etusironnan signaali oli pie— . v nempi.
Esimerkki II
Normaalien 1uuydinsolujen erotusanalyysi
Verinäytteen yhteydessä käytettyä viisiulotteista analyysiä sovellettiin myös luuytimen kvantitatiivisten ominaisuuksien 16 94180 selvittämiseen. Imemällä saadussa luuytimessä inkuboitiin LDS-751:tä, tiatsolioranssi a ja HLe-l(PE):tä samoin kuin ääreis-verenkin tapauksessa. Tiedot kerättiin instrumentin niillä samoilla asetusarvoi11 a, joita käytettiin ääreisverta analysoitaessa. Tyypillinen koe on esitetty kuviossa 3 (käyttäen samaa esitystapaa ja samoja värivalintoja kuin ääreisveren analyysissa). Punaiset verisolut (keltaisia), retikulosyytit (punaisia), verihiutaleet (tumman sinisiä) ja tumalliset solut (mustia) ovat sijoittuneet samoihin kohtiin viisiulotteisessa avaruudessa kuin niiden vastineet ääreisveressä (vertaa toisiinsa kuvia 1 ja 3).
Verisolu- ja luuydinsolupopulastioiden välillä voidaan todeta mielenkiintoisia eroja. Verihiutaleiden analyysissä näille soluhiukkasillle tyypillinen valon sironta-alue värjäytyi siniseksi kuviossa 3 samoin kuin verinäytteen analyysissä (kuvio 1). Toisin kuin ääreisveren tapauksessa, suurin osa näistä luuytimen hiukkasista ei värjäytynyt LDS-751:llä (ne voidaan tunnistaa mustina pisteinä keltaisella taustalla kuviossa 3b). Tästä syystä näitä hiukkasia ei tunnistettu normaaleiksi veri-hiukkasiksi. Tämän populaation solulajittelu tuotti lähinnä jätettä, joka käsitti luuytimen luupiikkejä sekä tunnistamattomia soiuhiukkasia.
Tumalliset luuydinsolut tunnistettiin niiden suurista, LDS-751: llä sekä ti at soi i oranssi 11 a saaduista -Fluoresenssi si qnaa— leista (kuvio 3b). Rajana käytettiin LDS-751:n ja tiatsoli-oranssin intensiteettiä, kuten kuviosta 3b nähdään, jotta saataisiin enemmän tumallisia soiutapahtumia. Kuviossa 4 esitetään näiden tumallisten solujen valoa sirottavat ominaisuudet sekä niiden ja CD45:llä saatujen immuunitluoresenssisignaalien välinen vastaavuus. Lymfosyyttien, monosyyttien ja granulosyyttien tyypilliset sijaintikohdat, jotka tunnistettiin ääreisverel1ä suoritettujen tutkimusten perusteella, olivat värjäytyneet tumman siniseksi, punaiseksi ja vihreäksi, vastaavasti.
Kolmen erilaisen, imemällä saadun 1uuydinnäytteen tapauksessa morfologinen erotuslaskeminen toteutettiin valon suorakulmaisen l| »H I 111' t i l Hl 1 94180 17 sironnan ja CD45—i1 mentyrni sen perusteella 1 ajitel1 ui 11 a tumallisilla soluilla. Lajitellut alueet on esitetty kuviossa 4b eri värein. Tulokset esitetään taulukossa I tumallisten solujen kolmesta kokeesta saatuna keskimääräisenä prosentuaalisena osuutena.
Taulukko I
Ihmisen normaalien, tumallisten, valon suorakulmaisen sironnan ja CD45—iImentyrnisen perusteella lajiteltujen, luuydinsolujen morfologinen erotusl askemi nen*
Erilaistu-
Lymfo- Mono- Branulo- Eryt— mattomat syytit svvtit syytit_roidi t_emosolut tumman sininen 98 1 .0 1 0 punainen 5 79 16 O 0
vihreä O 7 91 2 O
purppura 00 0 100 0 vaalean sininen 56* 3# 30# 3# 8 Värit viittaavat kuviossa 4b esitettyihin alueisiin. Tulokset on esitetty tumallisten solujen prosentuaalisena osuutena.
— n = 3; # emosolu
Lajiteltujen populaatioiden tarkastelu valomikroskoopi11 a vahvisti näiden solujen sukuperäluokituksen, mutta kaikki tumman ·* sinisessä, punaisessa ja vihreässä alueessa sijainneet solut eivät olleet kuitenkaan täysin kehittyneitä. Vihreäksi värjäytyneestä populaatiosta löydettiin täysin kehittyneiden neutro-fiilien lisäksi vyöhykkeitä ja metamyelosyyttejä. Arviolta 5 V. tumman sinisiksi värjäytyneistä soluista (lymfosyyttejä) oli 1 ymfoblasteja ja 20 V. punaisiksi värjäytyneistä soluista « (monosyyttejä) oli epätäydel1isesti kehittyneitä monomyeloi di -soluja.
Toisin kuin ääreisveren tapauksessa 1uuydinsoluista tunnistettiin kaksi populaatiota, joiden aiheuttama valon suorakulmainen sironta oli heikkoa, jotka ilmentivät heikosti CD45-anti geeniä « * 94180
IB
_ia jotka värjäytyivät purppuranpunaiseksi ja vaalean siniseksi, vastaavasti, kuviossa 4b. Tämän kuvion perusteella on ilmeistä, ettei selvää erottumista tapahtunut vaalean siniseksi värjäytyneen solupopulaation ja muiden värjäytyneiden populaatioiden välillä. CD45-antigeenia heikoimmin ilmentäneen solupopulaation (purppuranpunainen) tarkastelu valomikroskoopi11 a osoitti, että se käsitti yksinomaan normoblasteja ja erytroblasteja (taulukko I). Hieman suurempia määriä CD45—antigeeniä ilmentänyt populaatio (vaalean sininen) sisälsi epätäydellisimmin kehittyneitä soluja kuten esimerkiksi monomyeloidi— ja lymfoi— diesiasteita sekä joitakin erytroblasteja (taulukko I).
Esimerkki III
Verisolujen erotusanalyysi trombosytopeenista, kroonista, lymfosyytti stä B-soluieukemiaa sairastavan potilaan tapauksessa Tämän tekniikan hyödyllisyys voidaan osoittaa B-CLL—potilaasta saadun veren analyysissä. RAI—määrityksen perusteella vaiheen IV B-CLL—poti 1 as valittiin, koska kaikkien veri soiusukuperi en tapauksessa todetaan tavallisesti epänormaaleja laskettuja määriä. Lymfosyyttien lukumäärän kasvu 10-100-kertaiseksi vaikeuttaa näiden solujen erottamista jäljellä olevista normaaleista leukosyyteistä ja retikulosyyteistä. Lisäksi verihiutaleiden pieni lukumäärä näissä potilaissa tekee verihiutaleiden 1askentatuloksen epäluotettavammaksi.
B-Cl1-poti 1 aan veressä inkuboitiin LDS-751:tä, tiatsolioranssia ja HLe-l(PE):tä samoin kuin normaaliveressä. Tulokset esitetään samalla tavalla kuin normaalin ääreisveren (kuvio 1) ja luuytimen (kuvio 3) tapauksessa; punaiset verisolut värjäytyivät keltaisiksi; retikulosyytit nähtiin punaisina; verihiutaleet olivat värjäytyneet sinisiksi ja tumalliset, solut olivat vär— jäytyneet mustiksi (kuviot 5a, b, c, d).
Veri hiutalei1le tyypillisessä valon sironta-alueessa esiintyvien solujen esiintymistiheys (kuvio 5a) oli pieni normaaliin ääreisvereen verrattuna (vertaa keskenään sinisiä pisteitä kuvioissa la,b ja kuvioissa 5a,b). Vain muutama piste, jotka
Il UH 1 i I II * I I Hl . i 94180 19 tunnistettiin verihiutaleiksi valon siroamisen perusteella kuviossa 5a (sinisiä), tuotti LDS-751:llä verihiutaleille tyypillisen -fluoresenssin intensiteetin kuviossa 5b ja voidaan näin ollen katsoa normaaliksi verihiutaleeksi. Verihiutaleiden erottuminen retikulosyyteistä (punaisia) on edelleen erinomaista (kuvio 5b).
Tumallisten solujen (mustia) esiintymistiheyden huomattavan suurenemisen seurauksena leukosyyttien ja retikulosyyttien (punaisia) erottuminen LDS-751:llä ja tiatsolioranssilla on vähemmän selvää. Leukosyytit voidaan kuitenkin erottaa selvästi retikulosyyteistä sen perusteella, miten ne ilmentävät CD45-antigeenia (kuviot 5c,d).
Tumallisten solujen (rajattu kuviossa 5b) valoa sirottavat ominaisuudet ja CD45-antigeenin ilmentäminen on esitetty kuvioissa 6a,b. Suurin osa soluista ilmentää heikosti CD45-anti— geeniä ja tuottaa epätäydel1isesti kehittyneille lymfosyyteille tunnusomaisesta pieniä valon etusironnan ja suorakulmaisen sironnan signaaleja (vaalean sinisiä). Vain jokunen leukosyytti havaittiin normaaliksi lymfosyytiksi (tumman sininen), granulo-syytiksi (vihreä) ja monosyytiksi (punainen), vaikka erottuminen ei ollutkaan selvää epätäydel1isesti kehittyneiden lymfoi-disolujen ylivoimaisesta lukumäärästä johtuen. Huomaa vain muutamat solut (purppuranpunaisia), jotka eivät ilmentäneet CD45-antigeenia, ja jotka tuottivat valon suorakulmaisen sironnan pienen signaalin. Katso kuvio 6b. Nämä solut tunnistettiin tumallisiksi erytroidisoluiksi, mikä Dn yhtäpitävää sen kanssa, että retikulosyyttien lukumäärä on suurentunut huomattavasti tällaisessa potilaassa.
, ·; Esimerkki IV
Kokoveri luuytimen kontaminanttina
Kun luuydintä otetaan imemällä, verta joutuu usein kontaminant-tina näytteeseen. Täten, mikäli näyte analysoitaisiin korjaamatta tuloksia kontaminoivan veren suhteen, niin leukosyytti-erotukset voisivat olla virheellisiä.
20 94180
Valkoisten veri solutyyppi en prosentuaalinen osuus veressä voidaan laskea ajamalla verinäyte edellä esimerkissä I kuvatulla tavalla. Sen jälkeen, kun luuydinnäyte on ajettu esimerkissä II kuvatulla tavalla, valkoisten verisolujen odotettu prosentuaalinen osuus verinäytteessä voidaan vähentää luuydinnäyt-teestä täsmäl1isemmän tuloksen saamiseksi, josta tuloksesta verikontaminaatio on eliminoitu (olettaen, että kaikki konta-minantit ovat todellakin peräisin verestä).
Täten, esimerkiksi, lymfosyytit, granulosyytit ja monosyytit muodostavat 1,0, 1,0 ja 0,2 prosenttia kaikista verinäytteen soluista, vastaavasti, jäljellä olevien solujen <97,8 V.) ollessa olennaisesti punaisia verisoluja. Näin ollen verinäytteessä on arviolta yksi lymfosyytti sekä granulosyytti ja 0,2 monosyyttiä 100 punaista verisolua kohden. Näiden samojen solujen absoluuttiset lukumäärät luuydinnäytteessä ovat vastaavasti 800, 490 ja 1ό5 20000 solua käsittävässä näytteessä, jäljellä olevien solujen <18545 kpl.) ollessa olennaisesti punaisia verisoluja. Täten esimerkin vuoksi esitettäköön, että lymfosyyttien, granulosyyttien ja monosyyttien, joiden odotetaan kontaminoivan 1uuydinnäytettä, lukumäärät olisivat 185 lymfosyyttiä (eli 1 % x 18545), 185 granul osyytti ä (eli 1 '/. x 18545) ja 37 monosyyttiä (eli 0,2 V. x 18545). Näin ollen korjatut lukumäärät olisivat 615 lymfosyyttiä, 305 granulosyyttiä ja 12B monosyyttiä. Tällä menetelmällä voidaan saada täsmällisem-: piä laskentatuloksia.
Kaikki tässä kuvauksessa mainitut julkaisut ja patenttihakemukset kuvastavat tekniikan nykytilaa alalla, johon oheinen keksintö liittyy. Kaikki julkaisut ja patenttihakemukset liitetään oheen viittauksella, ikäänkuin kunkin erillisen julkaisun tai patenttihakemuksen yhteydessä se olisi erityisesti esitetty liitettäväksi oheen viittauksella.
Alan asiantuntijalle on selvää, että keksintöön voidaan tehdä muutoksia ja sitä voidaan muokata liitteenä olevien patenttivaatimusten hengestä ja tavoitteista kuitenkaan poikkeamatta.

Claims (17)

  1. 94180
  2. 1. Menetelmä ruumiinnesteessä läsnäolevien solujen analysoimiseksi monen parametrin avulla, tunnettu siitä, että sen käsittämissä vaiheissa: 1. otetaan nestenäyte; 2. näytteeseen lisätään kaksi fluoresoivaa nukleiinihappovä-riä kunkin solun DNA:n ja RNA:n leimaamiseksi eri tavalla, joiden värien fluoresenssiemissiospektrin huiput erottuvat toisistaan; 3. näytteeseen lisätään fluoresoivasti leimattua solupinnan merkitsintä, joka merkitsin tunnistaa nestenäytteessä läsnäolevien solujen pinnalla eri tavoin ilmentyneen antigeenin ja jonka fluoresoivan leiman emissiospektrin huippu on erilainen kuin mainituilla fluoresoivilla väreillä; ja 4. mainitussa näytteessä olevat solut analysoidaan instrumentilla, joka kykenee ilmaisemaan ja taltioimaan kolme fluoresenssikanavaa ja kaksi valon sirontakanavaa kunkin mainitussa näytteessä läsnäolevan solun tapauksessa.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ruumiinneste on vatsaontelo-, selkäydin- tai aivonestettä, virtsaa, kokoverta tai solususpensiota, joka on saatu luuytimestä, imusolmukkeesta, maksasta tai pernasta. «
  4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ruumiinneste on kokoverta.
  5. 4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ruumiinneste on luuydintä.
  6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksi nukleiinihappoväreistä on LDS-751.
  7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksi nukleiinihappoväreistä on tiatsolioranssi. 94180
  8. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solupinnan merkitsin on fluorikromiin konjugoitu mono-klonaalinen vasta-aine.
  9. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on CD45-antigeenin kanssa reagoiva monoklonaalinen vasta-aine.
  10. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CD45-antigeenin kanssa reagoiva monoklonaalinen vasta-aine on HLe-1.
  11. 10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fluorikromi on fykoerytriini (PE).
  12. 11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että instrumentti on virtaussytometri.
  13. 12. Menetelmä verinäytteessä läsnäolevien solujen analysoimiseksi viiden parametrin avulla, tunnettu siitä, että sen kä-sittämissä vaiheissa: 1. otetaan verinäyte; 2. näytteeseen lisätään LDS-751:tä ja tiatsolioranssia; 3. näytteeseen lisätään HLe-1(PE)-konjugaattia; 4. näyte johdetaan virtaussytometrin läpi, joka virtaussytometri käsittää yhden, aallonpituuteen 488 nm viritetyn laserlähteen ja joka kykenee esittämään ja taltioimaan valon suorakulmaisen sironnan ja etusironnan sekä LDS-751:n, tiatsolioranssin ja fykoerytriinin tuottaman fluoresenssin mittaukset kunkin näytteessä läsnäolevan solun tapauksessa.
  14. 13. Menetelmä luuydinnäytteessä läsnäolevien solujen analysoimiseksi viiden parametrin avulla, tunnettu siitä, että sen käsittämissä vaiheissa: 1. otetaan luuydinnäyte; 2. näytteeseen lisätään LDS-751:tä ja tiatsolioranssia; 3. näytteeseen lisätään HLe-1(PE)-konjugaattia; 941 80 4. näyte johdetaan virtaussytometrin läpi, joka virtaussyto-metri käsittää yhden, aallonpituuteen 488 nm viritetyn laserlähteen ja joka kykenee esittämään ja taltioimaan valon suorakulmaisen sironnan ja etusironnan sekä LDS-751:n, tiatsolioranssin ja fykoerytriinin tuottaman fluoresenssin mittaukset kunkin näytteessä läsnäolevan solun tapauksessa.
  15. 14. Reagenssipakkaus ruumiinnestenäytteessä läsnäolevien solujen analysoimiseksi usean parametrin avulla, tunnettu siitä, että reagenssipakkaus käsittää ensimmäisen astian, joka sisältää vähintään kaksi nukleiinihappoväriä kussakin solussa olevan DNA:n ja RNA:n leimaamiseksi, joiden värien fluoresenssiemissiospektrien huiput erottuvat toisistaan, sekä toisen astian, joka sisältää vähintään yhtä fluore-soivasti leimattua solupinnan merkitsintä, joka merkitsin tunnistaa nestenäytteessä olevien solujen pinnalla eri tavalla ilmentyneen solupinnan antigeenin, ja jonka fluoresoivan leiman emissiospektrin huippu eroaa fluoresoivien värien vastaavista huipuista.
  16. 15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että mainitut nukleiinihappovärit ovat LDS-751 ja tiatsolioranssi. ·; 16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen reagenssipakkaus, tunnet tu siitä, että fluoresoivasti leimattu solupinnan merkitsin on HLe-i(PE).
  17. 17. Menetelmä luuydinnäytteen moneen parametriin perustuvan analyysin parantamiseksi korjaamalla valkoisiin verisoluihin ... liittyvät, luuydinnäytettä kontaminoivasta verestä johtuvat liian suuret tulokset, tunnettu siitä, että sen käsittämissä vaiheissa: 1. patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän vaiheet toteutetaan kokoverellä; 2. veressä läsnäolevien erilaisten valkoisten verisolukompo-nenttien prosentuaaliset osuudet määritetään; 941 80 3. toteutetaan seuraavat menetelmävaiheet; (i) otetaan luuydinnäyte (ii) näytteeseen lisätään kaksi fluoresoivaa nukleiini-happoväriä kunkin solun DNA:n ja RNA:n leimaamiseksi eri tavalla, joiden värien fluoresenssiemissio-spektrin huiput erottuvat toisistaan; (iii) lisätään monoklonaalinen vasta-aine fluorikromiin konjugoituun CD45:een, jonka fluorikromin emissio-spektrin huippu erottuu mainituista fluoresoivista väreistä; ja (iv) mainitussa näytteessä olevat solut analysoidaan instrumentilla, joka kykenee ilmaisemaan ja taltioimaan kolme fluoresenssikanavaa ja kaksi valon sirontakanavaa kunkin mainitussa näytteessä läsnäolevan solun tapauksessa; 4. luuytimessä läsnäolevien erilaisten valkoisten verisolu-komponenttien absoluuttiset lukumäärät määritetään; ja 5. kukin vaiheessa 2) saatu prosentuaalinen osuus kerrotaan luuydinnäytteessä läsnäolevien solujen kokonaislukumäärällä ja tämä lukumäärä vähennetään vaiheessa 4) saaduista vastaavista absoluuttisista lukumääristä.
FI892926A 1988-06-15 1989-06-14 Menetelmä solukomponenttien analysoimiseksi nesteestä FI94180C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/207,099 US5047321A (en) 1988-06-15 1988-06-15 Method for analysis of cellular components of a fluid
US20709988 1988-06-15

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI892926A0 FI892926A0 (fi) 1989-06-14
FI892926A FI892926A (fi) 1989-12-16
FI94180B true FI94180B (fi) 1995-04-13
FI94180C FI94180C (fi) 1995-07-25

Family

ID=22769201

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI892926A FI94180C (fi) 1988-06-15 1989-06-14 Menetelmä solukomponenttien analysoimiseksi nesteestä

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5047321A (fi)
EP (1) EP0347210B1 (fi)
JP (1) JPH0726954B2 (fi)
AT (1) ATE111227T1 (fi)
AU (1) AU613197B2 (fi)
CA (1) CA1340170C (fi)
DE (1) DE68918004T2 (fi)
DK (1) DK296889A (fi)
ES (1) ES2063820T3 (fi)
FI (1) FI94180C (fi)
NO (1) NO175506C (fi)

Families Citing this family (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO164622C (no) * 1988-05-11 1990-10-24 Tore Lindmo Binaer immunometrisk partikkelbasert metode for maaling av spesifikke serum-antigener ved hjelp av vaeskestroemsmikrofotometri og et ferdigpreparert maaloppsett derav.
US4963478A (en) * 1988-07-05 1990-10-16 Immucor, Inc. Article for preforming immunological assays utilizing organic dyes and method for producing and utilizing same
FR2638848B1 (fr) * 1988-11-04 1993-01-22 Chemunex Sa Procede de detection et/ou de dosage dans un milieu liquide ou semi-liquide d'au moins une substance organique, biologique ou medicamenteuse soluble, par une methode d'agglutination
FR2653447B1 (fr) * 1989-10-20 1991-12-27 Bio Merieux Procede et reactifs pour la detection de micro-organismes.
EP0448931B1 (en) * 1990-01-26 1996-04-03 Canon Kabushiki Kaisha Method for measuring a specimen by the use of fluorescence light
US5229265A (en) * 1990-03-13 1993-07-20 Litron Laboratories Process for analyzing clastogenic agents
US5401847A (en) * 1990-03-14 1995-03-28 Regents Of The University Of California DNA complexes with dyes designed for energy transfer as fluorescent markers
US5622853A (en) * 1990-05-01 1997-04-22 Becton Dickinson And Company T lymphocyte precursor
US5641629A (en) * 1990-06-11 1997-06-24 Nexstar Pharmacueticals Inc Spectroscopically detectable nucleic acid ligands
US5650275A (en) * 1990-06-11 1997-07-22 Nexstar Pharmacueticals Inc Target detection method using spectroscopically detectable nucleic acid ligands
IE76732B1 (en) * 1990-08-07 1997-11-05 Becton Dickinson Co One step test for absolute counts
DE69132843T2 (de) * 1990-12-06 2002-09-12 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben
JP2927979B2 (ja) * 1991-02-22 1999-07-28 シスメックス株式会社 フローサイトメトリーによる赤芽球の分類方法
US5776709A (en) * 1991-08-28 1998-07-07 Becton Dickinson And Company Method for preparation and analysis of leukocytes in whole blood
CA2087086A1 (en) * 1992-01-22 1993-07-23 Leon Wmm Terstappen Multidimensional cell differential analysis
DE69326731T2 (de) * 1992-09-04 2000-05-18 Becton Dickinson Co Kontroll-Teilchen für die Zellzählung und Instrumentenlinearität
DE69428552T2 (de) * 1993-01-26 2002-04-11 Becton Dickinson Co Verfahren zum Nachweis von seltenen Ereignissen
US5294799A (en) * 1993-02-01 1994-03-15 Aslund Nils R D Apparatus for quantitative imaging of multiple fluorophores
CA2156752C (en) * 1993-02-25 1999-01-05 Young Ran Kim Multipurpose reagent system for rapid lysis of whole blood samples
WO1995013540A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 Becton Dickinson And Company Method for absolute counting of rare cells
GB9326238D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Sinvent As Method of assay
DE69533660T2 (de) * 1994-04-29 2005-11-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Homogenes Verfahren zum Nachweis von Doppelstrang-Nukleinsäuren mittels fluoreszierender Farbstoffe und dafür nützliche Kits
US5631165A (en) * 1994-08-01 1997-05-20 Abbott Laboratories Method for performing automated hematology and cytometry analysis
US5891734A (en) * 1994-08-01 1999-04-06 Abbott Laboratories Method for performing automated analysis
US5656499A (en) * 1994-08-01 1997-08-12 Abbott Laboratories Method for performing automated hematology and cytometry analysis
US5879900A (en) * 1994-12-15 1999-03-09 Abbott Laboratories Method for simultaneous analysis of cell viability, nucleated red blood cells and white blood cell differentials
US5559037A (en) * 1994-12-15 1996-09-24 Abbott Laboratories Method for rapid and simultaneous analysis of nucleated red blood cells
US6329158B1 (en) * 1995-09-15 2001-12-11 Becton Dickinson And Company Use of dimly fluorescing nucleic acid dyes in the identification of nucleated cells
ATE472725T1 (de) * 1995-12-15 2010-07-15 Abbott Lab Verfahren für gleichzeitige analyse von zelllebensfähigkeit, nukleierten roten blutkörperchen und leukozytendifferential
TW438973B (en) * 1995-12-19 2001-06-07 Sysmex Corp Apparatus and method for analyzing solid components in urine
JP3308441B2 (ja) * 1995-12-19 2002-07-29 シスメックス株式会社 尿中有形成分分析装置
JP3783808B2 (ja) * 1997-05-19 2006-06-07 シスメックス株式会社 白血球分類計数用試薬
DE19756782A1 (de) * 1997-12-19 1999-06-24 Dade Behring Marburg Gmbh Nachweis und Bestimmung festphasenassoziierter Faktoren
US6911313B2 (en) * 1998-02-06 2005-06-28 Sysmex Corporation Process for discriminating and counting erythroblasts
DE19857692C1 (de) 1998-12-14 2000-08-24 Evotec Biosystems Ag Verfahren und Vorrichtung zur zellspurbasierten Zelluntersuchung
JP3817091B2 (ja) * 1999-07-02 2006-08-30 テルモ株式会社 細胞数測定装置
JP3929283B2 (ja) * 2000-11-08 2007-06-13 シスメックス株式会社 骨髄有核細胞の分類計数方法
US6403378B1 (en) * 2001-04-26 2002-06-11 Guava Technologies, Inc. Cell viability assay reagent
GB0118995D0 (en) * 2001-08-03 2001-09-26 Univ Wales Medicine Detection of mutations in nucleic acids
US20030134305A1 (en) * 2001-08-16 2003-07-17 Dertinger Stephen D. Method for the enumeration of mammalian micronucleated erythrocyte populations with a single-laser flow cytometer
ATE314650T1 (de) * 2002-05-14 2006-01-15 Univ Salamanca Multidimensionale analyse von leukozyten
JP4299597B2 (ja) * 2002-07-29 2009-07-22 シスメックス株式会社 血液分析装置及び方法
US7507548B2 (en) 2003-03-04 2009-03-24 University Of Salamanca Multidimensional detection of aberrant phenotypes in neoplastic cells to be used to monitor minimal disease levels using flow cytometry measurements
US7674598B2 (en) * 2004-05-21 2010-03-09 Beckman Coulter, Inc. Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential
US7625712B2 (en) * 2004-05-21 2009-12-01 Beckman Coulter, Inc. Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential
US7321843B2 (en) * 2005-09-30 2008-01-22 Universidad De Salamanca Method for generating new flow cytometry data files containing an infinite number of dimensions based on data estimation
US8958990B2 (en) * 2005-10-03 2015-02-17 Sysmex Corporation Sample analyzer and sample analyzing method
WO2008018905A2 (en) * 2006-01-17 2008-02-14 Cellumen, Inc. Method for predicting biological systems responses
US8114615B2 (en) 2006-05-17 2012-02-14 Cernostics, Inc. Method for automated tissue analysis
WO2008060483A2 (en) * 2006-11-10 2008-05-22 Cellumen, Inc. Protein-protein interaction biosensors and methods of use thereof
WO2009058876A1 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 Beckman Coulter, Inc. Method for a rapid antibody-based analysis of platelet populations
US8159670B2 (en) * 2007-11-05 2012-04-17 Abbott Laboratories Method and apparatus for rapidly counting and identifying biological particles in a flow stream
DE102008030515A1 (de) * 2008-06-27 2009-12-31 Christian Seliger Durchflusszytometrisches Verfahren zur Bestimmung von Gesamtleukozytenzahl und Thrombozytenzahl sowie zur Leukozytendifferenzierung in Blutproben von Vögeln
WO2010056732A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Marv Enterprises Llc Utilization of stents for the treatment of blood borne carcinomas
WO2010068812A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-17 Abqmr, Inc. Nuclear magnetic resonance apparatus, methods and associated technology
US9216386B2 (en) 2009-03-17 2015-12-22 Marv Enterprises, LLC Sequential extracorporeal treatment of bodily fluids
JP5452058B2 (ja) * 2009-03-31 2014-03-26 シスメックス株式会社 血液分析装置
EP2259065A1 (en) 2009-06-03 2010-12-08 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods, reagents and kits for flow cytometric immunophenotyping
JP2011092104A (ja) * 2009-10-30 2011-05-12 Hitachi Engineering & Services Co Ltd 微生物などの検査方法及び検査装置
SG174650A1 (en) * 2010-03-31 2011-10-28 Agency Science Tech & Res A method of monitoring parasite development in blood
US9476812B2 (en) 2010-04-21 2016-10-25 Dna Electronics, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US9428547B2 (en) 2010-04-21 2016-08-30 Dna Electronics, Inc. Compositions for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US20110262989A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Nanomr, Inc. Isolating a target analyte from a body fluid
US8841104B2 (en) 2010-04-21 2014-09-23 Nanomr, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
CA2830501C (en) 2011-03-17 2023-10-17 Cernostics, Inc. Systems and compositions for diagnosing barrett's esophagus and methods of using the same
CN103917868B (zh) * 2011-05-04 2016-08-24 雅培制药有限公司 嗜碱性粒细胞分析系统和方法
US20150027950A1 (en) * 2012-03-27 2015-01-29 Marv Enterprises, LLC Treatment for atherosclerosis
WO2013177099A1 (en) * 2012-05-21 2013-11-28 Felder Mitchell S Method for treating infectious diseases using emissive energy
US10000557B2 (en) 2012-12-19 2018-06-19 Dnae Group Holdings Limited Methods for raising antibodies
US9804069B2 (en) 2012-12-19 2017-10-31 Dnae Group Holdings Limited Methods for degrading nucleic acid
US9434940B2 (en) 2012-12-19 2016-09-06 Dna Electronics, Inc. Methods for universal target capture
US9551704B2 (en) 2012-12-19 2017-01-24 Dna Electronics, Inc. Target detection
US9599610B2 (en) 2012-12-19 2017-03-21 Dnae Group Holdings Limited Target capture system
US9995742B2 (en) 2012-12-19 2018-06-12 Dnae Group Holdings Limited Sample entry
WO2016089521A1 (en) 2014-12-04 2016-06-09 Becton, Dickinson And Company Flow cytometry cell sorting systems and methods of using the same
WO2016093970A1 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Becton, Dickinson And Company Methods for optically aligning light collection components and optically aligned light collection systems thereof
WO2016100954A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Captl Llc Flow cytometry using hydrodynamically planar flow
WO2016099538A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Captl Llc Flow cytometry using hydrodynamically planar flow
JP6937697B2 (ja) 2015-02-18 2021-09-22 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 光検出システム及びその使用方法
ES2965719T3 (es) 2015-06-17 2024-04-16 Becton Dickinson Co Unidad de tapón de dispersión de detector óptico que tiene una barra de dispersión desmontable y métodos para usar la misma
GB201601073D0 (en) * 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
AU2016339956B2 (en) 2015-10-13 2021-07-01 Omega Biosystems Incorporated Multi-modal fluorescence imaging flow cytometry system
CA3002401A1 (en) * 2015-10-23 2017-04-27 Geosyntec Consultants, Inc. Use of visibly detectable compounds as performance reference compounds in passive sampling devices
US20190086319A1 (en) 2016-03-10 2019-03-21 Becton, Dickinson And Company Methods of evaluating a cellular sample for her-2/neu expression and compositions for practicing the same
KR20180129832A (ko) 2016-03-17 2018-12-05 비디 바이오사이언시스 고효율 형광 유세포분석기를 사용하는 세포 선별
WO2017184776A1 (en) 2016-04-22 2017-10-26 Becton, Dickinson And Company High density deposition for array production
CN109477785B (zh) 2016-09-13 2022-09-27 贝克顿·迪金森公司 具有光学均衡的流式细胞仪
WO2018067210A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 Becton, Dickinson And Company Methods and systems for determining a drop delay of a flow stream in a flow cytometer
ES2950436T3 (es) 2016-12-14 2023-10-10 Becton Dickinson Co Métodos y composiciones para obtener una valoración de tuberculosis en un sujeto
WO2018148098A2 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Becton, Dickinson And Company Dried dye reagent devices and methods for making and using the same
US10585031B2 (en) 2017-02-27 2020-03-10 Becton, Dickinson And Company Light detection systems and methods for using thereof
US11346762B2 (en) 2018-01-23 2022-05-31 Becton, Dickinson And Company Systems for dynamic light detection obscuration and methods for using thereof
US10844228B2 (en) 2018-03-30 2020-11-24 Becton, Dickinson And Company Water-soluble polymeric dyes having pendant chromophores
EP3785017A4 (en) 2018-04-27 2022-01-26 Becton, Dickinson and Company COLLECTION SYSTEMS FOR STREAM CYTOMETRICALLY SORTED SAMPLES AND METHODS OF USE THEREOF
JP7416729B2 (ja) 2018-06-19 2024-01-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 検出器アレイのための可変多重化スイッチ、システム、およびその使用方法
WO2020197787A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 Becton, Dickinson And Company Spectral unmixing of fluorescence imaging using radiofrequency-multiplexed excitation data

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3826364A (en) * 1972-05-22 1974-07-30 Univ Leland Stanford Junior Particle sorting method and apparatus
US4284412A (en) * 1979-07-13 1981-08-18 Ortho Diagnostics, Inc. Method and apparatus for automated identification and enumeration of specified blood cell subclasses
US4544546A (en) * 1980-04-21 1985-10-01 Abbott Laboratories Fluorescent nucleic acid stains
US4520110A (en) * 1981-10-06 1985-05-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing a phycobiliprotein labeled ligand or receptor
CA1254134A (en) * 1984-03-28 1989-05-16 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Specific binding flow cytometry method
US4661913A (en) * 1984-09-11 1987-04-28 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for the detection and classification of articles using flow cytometry techniques
US4727020A (en) * 1985-02-25 1988-02-23 Becton, Dickinson And Company Method for analysis of subpopulations of blood cells
ZA867698B (en) * 1985-10-11 1987-07-29 Smithkline Beckman Corp Methods and reagents for performing subset analysis
CA1279008C (en) * 1985-10-11 1991-01-15 Smith Kline & French Canada Ltd. Methods and reagents for performing subset analysis
US4883867A (en) * 1985-11-01 1989-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes, RNA or DNA
US5016283A (en) * 1985-11-04 1991-05-14 Cell Analysis Systems, Inc. Methods and apparatus for immunoploidy analysis

Also Published As

Publication number Publication date
NO892302D0 (no) 1989-06-05
NO175506C (no) 1994-10-19
JPH0273157A (ja) 1990-03-13
CA1340170C (en) 1998-12-08
FI892926A (fi) 1989-12-16
AU3596189A (en) 1989-12-21
DK296889D0 (da) 1989-06-15
AU613197B2 (en) 1991-07-25
NO175506B (no) 1994-07-11
NO892302L (no) 1989-12-18
FI94180C (fi) 1995-07-25
DE68918004D1 (de) 1994-10-13
EP0347210B1 (en) 1994-09-07
JPH0726954B2 (ja) 1995-03-29
DE68918004T2 (de) 1995-01-05
ATE111227T1 (de) 1994-09-15
ES2063820T3 (es) 1995-01-16
DK296889A (da) 1989-12-16
EP0347210A2 (en) 1989-12-20
EP0347210A3 (en) 1990-10-17
US5047321A (en) 1991-09-10
FI892926A0 (fi) 1989-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI94180B (fi) Menetelmä solukomponenttien analysoimiseksi nesteestä
EP0552707B1 (en) Multidimensional cell differential analysis
EP0882983B1 (en) Reagent and method for classification and counting of leukocytes
US5879900A (en) Method for simultaneous analysis of cell viability, nucleated red blood cells and white blood cell differentials
US5175109A (en) Reagent for classifying leukocytes by flow cytometry
US7625712B2 (en) Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential
EP1250585B1 (en) Method and apparatus for analyzing cells in a whole blood sample
EP0347039B1 (en) Method for discriminating between intact and damaged cells in a sample
US7674598B2 (en) Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential
US6900023B1 (en) Method for classifying and counting leukocytes
WO1996018878A1 (en) Method for rapid and simultaneous analysis of nucleated red blood cells
US20040241770A1 (en) Process for discriminating and counting erythroblasts
JP4567082B2 (ja) 赤芽球の分類計数方法
EP0586183B1 (en) Control particles for cell counting and instrument linearity
EP0866960B1 (en) Method for simultaneous analysis of cell viability, nucleated red blood cells and white blood cell differential
EP0259833B1 (en) Reagent and method for classifying leukocytes by flow cytometry
WO1997021994A9 (en) Method for simultaneous analysis of cell viability, nucleated red blood cells and white blood cell differential
Sakata Reagent characteristics in the XE-2100 NRBC channel

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
MM Patent lapsed

Owner name: BECTON, DICKINSON AND COMPANY