JPH0273157A - 流体内細胞成分の分析法 - Google Patents
流体内細胞成分の分析法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は体液中の細胞成分の多角的パラメーター分析に
関し、より詳細には、フローサイトメトリーを用いた５
種類のパラメーター分析による血液または骨髄吸引物中
の細胞成分の識別および定量に関する。
関し、より詳細には、フローサイトメトリーを用いた５
種類のパラメーター分析による血液または骨髄吸引物中
の細胞成分の識別および定量に関する。
（従来の技術）
一体の血液状態を知る上で最も重要な二種雇の測定は全
血細胞数の計測および白血球の分画である。全血細胞数
の計測および白血球の分画には血液中のさまざまな細胞
成分を識別し、さらにその数を計測することが含まれる
。任意の１＠のサンプルに見い出されるさまざまな血液
成分には赤血球（ＲＢＣ）、血小板および有核細胞が含
まれる。
血細胞数の計測および白血球の分画である。全血細胞数
の計測および白血球の分画には血液中のさまざまな細胞
成分を識別し、さらにその数を計測することが含まれる
。任意の１＠のサンプルに見い出されるさまざまな血液
成分には赤血球（ＲＢＣ）、血小板および有核細胞が含
まれる。
有核細胞の範囁において、白血球には多数の異なる型が
存在し、その中にはリンパ球［Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュ
ラルキラー（Ｎ Ｋ ）！胞およびそれらのさまざまな
サブセット］、単球、ならびに顆粒球（すべての成熟段
階における好中球、好酸球および好塩基球を含む）が含
まれる。細胞の型が多種類存在し、かつ任意の１種頭の
細胞型にも多岐にわたる成熟段階が存在する故、全血細
胞数の計測および白血球の分画を行なうためには正常個
体においてさえも時には困難かつ複雑な平原が必要とさ
れ、異常個体においてはより困難かつ複雑な手順が必要
とされる。このような複雑さは、骨髄サンプルの分析を
試みる場合により強請される。
存在し、その中にはリンパ球［Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュ
ラルキラー（Ｎ Ｋ ）！胞およびそれらのさまざまな
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まれる。細胞の型が多種類存在し、かつ任意の１種頭の
細胞型にも多岐にわたる成熟段階が存在する故、全血細
胞数の計測および白血球の分画を行なうためには正常個
体においてさえも時には困難かつ複雑な平原が必要とさ
れ、異常個体においてはより困難かつ複雑な手順が必要
とされる。このような複雑さは、骨髄サンプルの分析を
試みる場合により強請される。
伝統的には、全血細胞総数の計測（即ち、標準単位容量
当りの細胞数）および白血球の分画（即ち、標準単位容
量当りの所定の型の細胞数）は光学顕微鏡を用いて少容
量の細胞数を計測すること、さらにそうした後計測した
数に単位容量にするための係数を掛けることによって手
作業で行なわれてきた。測定したサンプル容量および細
胞の型の識別に必要とされる技術水準の両方が原因とな
って、このような方法では、得られる計測値は非常に変
化しやすく時として容認しがたい水準に達するであろう
。
当りの細胞数）および白血球の分画（即ち、標準単位容
量当りの所定の型の細胞数）は光学顕微鏡を用いて少容
量の細胞数を計測すること、さらにそうした後計測した
数に単位容量にするための係数を掛けることによって手
作業で行なわれてきた。測定したサンプル容量および細
胞の型の識別に必要とされる技術水準の両方が原因とな
って、このような方法では、得られる計測値は非常に変
化しやすく時として容認しがたい水準に達するであろう
。
最近になって、手動で票微鏡試験を行なうことなく全血
細胞数の計測および白血球の分画を行なう手段が考案さ
れた。現在利用可能な装置は、開口インピーダンスによ
る電気的手段［例えばコールタ−カウンター（商（５）
（ＣｏｕｌＬｅｒＣｏｕｎｔｅｒ” ） 、コールタ−
（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ブロクナツト エレクトロニクス・
コンフ（Ｎｒｏｅ、 Ｎａｔ。
細胞数の計測および白血球の分画を行なう手段が考案さ
れた。現在利用可能な装置は、開口インピーダンスによ
る電気的手段［例えばコールタ−カウンター（商（５）
（ＣｏｕｌＬｅｒＣｏｕｎｔｅｒ” ） 、コールタ−
（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ブロクナツト エレクトロニクス・
コンフ（Ｎｒｏｅ、 Ｎａｔ。
Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏｎｆ）、 、１２．１
０３４（１９５６）に記載］または光散乱および光吸収
による光学的手段［例えば、テクニコン（Ｔ ｅｃｈｎ
１ｃｏｎ） 、 Ｈ−６００” ］（商標）、ブリー
ケル（Ｂｒｅａｋａｌｌ）ら、ブロードセル（Ｂ ｆｏ
ｏｄ Ｃｅ１ｌｓ）、１１，２５７（１９８５）に記載
］のどちらかによって細胞を検出する。このような装置
では、赤血球細胞画分を白血球から分離する必要があり
、また各々の測定は他のものとは独立して行なわれる。
０３４（１９５６）に記載］または光散乱および光吸収
による光学的手段［例えば、テクニコン（Ｔ ｅｃｈｎ
１ｃｏｎ） 、 Ｈ−６００” ］（商標）、ブリー
ケル（Ｂｒｅａｋａｌｌ）ら、ブロードセル（Ｂ ｆｏ
ｏｄ Ｃｅ１ｌｓ）、１１，２５７（１９８５）に記載
］のどちらかによって細胞を検出する。このような装置
では、赤血球細胞画分を白血球から分離する必要があり
、また各々の測定は他のものとは独立して行なわれる。
これは、一般的には赤血球が白血球より数が多い（正常
個体で少なくとも１０００：１）ので行なわなければな
らない、正常でない患者（例えば、白血球減少症の患者
）では、この比率は実質上高くなるだろう。
個体で少なくとも１０００：１）ので行なわなければな
らない、正常でない患者（例えば、白血球減少症の患者
）では、この比率は実質上高くなるだろう。
また、白血球を分画するための手段は他にも存在する。
フローサイトメーターは、−ａ的には米国特許第４，６
６１，９１３号５第４，２８４．４１２号および第３．
８２６，３６４号明細書ならびにヘルゼンベルグ（Ｈｅ
ｒｚｅｎｂｅｒｇ）ら、サイエンティフィックアメリカ
（Ｓｃｉ、 Ａｍ、 ）翻土、１０８（１９７６）の論
文に記載されており、これは検出領域を通過する個々の
細胞の複数の独立パラメーターを検出すること（こよっ
て異成分からなるサンプル内に存在する異なる白血球集
団を同定するために使用されている０代表的には、これ
らのパラメーターには前方散乱光（Ｆ Ｌ Ｓ 。
６１，９１３号５第４，２８４．４１２号および第３．
８２６，３６４号明細書ならびにヘルゼンベルグ（Ｈｅ
ｒｚｅｎｂｅｒｇ）ら、サイエンティフィックアメリカ
（Ｓｃｉ、 Ａｍ、 ）翻土、１０８（１９７６）の論
文に記載されており、これは検出領域を通過する個々の
細胞の複数の独立パラメーターを検出すること（こよっ
て異成分からなるサンプル内に存在する異なる白血球集
団を同定するために使用されている０代表的には、これ
らのパラメーターには前方散乱光（Ｆ Ｌ Ｓ 。
これは相対的な粒子の大きさの測定である）、直角方向
散乱光（ＯＬ Ｓ 、これは相対的な顆粒炭（ｇｒａｎ
ｕｌａｒｉｔｙ）の測定である）、および蛍光が含まれ
る。蛍光は核酸染色を行なった細胞より測定されるであ
ろう、または、例えば米国特許第４，５２０゜１１０号
明ｍ１に記載されているように、蛍光色素に直接または
間接的に結きしたモノクローナル抗体（Ｍ Ａ ｂ＞で
標識された表面抗原をもつ細胞から測定されるであろう
、フローサイトメーター内の別々のチャンネルによって
いるいろな細胞の各々の測定値が感知され記録される。
散乱光（ＯＬ Ｓ 、これは相対的な顆粒炭（ｇｒａｎ
ｕｌａｒｉｔｙ）の測定である）、および蛍光が含まれ
る。蛍光は核酸染色を行なった細胞より測定されるであ
ろう、または、例えば米国特許第４，５２０゜１１０号
明ｍ１に記載されているように、蛍光色素に直接または
間接的に結きしたモノクローナル抗体（Ｍ Ａ ｂ＞で
標識された表面抗原をもつ細胞から測定されるであろう
、フローサイトメーター内の別々のチャンネルによって
いるいろな細胞の各々の測定値が感知され記録される。
これらのパラメーターを組み合わせたり比較したりする
ことによって、いろいろな白血球成分が識別されるであ
ろう。
ことによって、いろいろな白血球成分が識別されるであ
ろう。
米国特許第４，７２７，０２０号は、フローサイトメー
ターを血液から白血球の各分画を得るための手段として
用いる方法についての一例を提供している。しかしなが
ら、この方法は白血球の分画、しがち血液から得られた
サンプルのそれのみに限られている。
ターを血液から白血球の各分画を得るための手段として
用いる方法についての一例を提供している。しかしなが
ら、この方法は白血球の分画、しがち血液から得られた
サンプルのそれのみに限られている。
今までに得られた方法をすべてまとめて考えたとしても
、単一の血液または骨髄のサンプルを分析して血液およ
び骨髄に存在するいろいろな細胞型をすべて識別し、さ
らに計数するような単一で標準的かつ正確な装置または
方法論は現在のところ得られていない。
、単一の血液または骨髄のサンプルを分析して血液およ
び骨髄に存在するいろいろな細胞型をすべて識別し、さ
らに計数するような単一で標準的かつ正確な装置または
方法論は現在のところ得られていない。
（発明の構成）
本発明は体液中の細胞の多数のパラメーターを同時に分
析する方法であり、上記体液は脊髄、腹膜あるいは脳内
の流体、尿、または全血のいづれかよりなり、さらには
生体組織検査といったようなものから得られる骨髄吸引
液、リンパ節、Ｆ！臓または肝臓の細胞からなる組織の
細胞懸濁液からなる可能性もあり：かつ上記パラメータ
ーは検査した各細胞の光散乱能の少なくとも二種類を測
定すること、および検査した各細胞から検出される蛍光
発光（エミッション）または活性の少なくとも三種類を
測定することからなる０本方法は個体から流体サンプル
を採取する段階、ならびに流体サンプルと少なくとも二
種類の色素および少なくとも一種類の細胞表面マーカー
と混合させる段階からなり、上記色素はそれぞれ別々に
サンプル内の細胞の異った特徴を評価し、かつ上記マー
カーは異なる系統の細胞に別様に発現する抗原を認識し
、標識した溶液を形成する。それぞれの色素および標識
は蛍光を発し、かつ互いに識別可能な放出スペクトルの
ピークを持つ、さらに標識した溶液は検出器を通過させ
、その中で溶液中の各細胞は一度に実質上１個づつ試験
され、蛍光強度および散乱光の測定が試験しようとする
それぞれの細胞について行なわれた。それぞれの細胞に
ついて調べられた測定値（またはパラメーター）は、デ
ータ貯蔵・分析システムに保存され、即時にまたは後程
、再結会され分析されるであろう、これら数種類のパラ
メーターを分析することによって、血液および骨髄のサ
ンプルを構成する細胞の型および系統が識別され同定さ
れるであろう。
析する方法であり、上記体液は脊髄、腹膜あるいは脳内
の流体、尿、または全血のいづれかよりなり、さらには
生体組織検査といったようなものから得られる骨髄吸引
液、リンパ節、Ｆ！臓または肝臓の細胞からなる組織の
細胞懸濁液からなる可能性もあり：かつ上記パラメータ
ーは検査した各細胞の光散乱能の少なくとも二種類を測
定すること、および検査した各細胞から検出される蛍光
発光（エミッション）または活性の少なくとも三種類を
測定することからなる０本方法は個体から流体サンプル
を採取する段階、ならびに流体サンプルと少なくとも二
種類の色素および少なくとも一種類の細胞表面マーカー
と混合させる段階からなり、上記色素はそれぞれ別々に
サンプル内の細胞の異った特徴を評価し、かつ上記マー
カーは異なる系統の細胞に別様に発現する抗原を認識し
、標識した溶液を形成する。それぞれの色素および標識
は蛍光を発し、かつ互いに識別可能な放出スペクトルの
ピークを持つ、さらに標識した溶液は検出器を通過させ
、その中で溶液中の各細胞は一度に実質上１個づつ試験
され、蛍光強度および散乱光の測定が試験しようとする
それぞれの細胞について行なわれた。それぞれの細胞に
ついて調べられた測定値（またはパラメーター）は、デ
ータ貯蔵・分析システムに保存され、即時にまたは後程
、再結会され分析されるであろう、これら数種類のパラ
メーターを分析することによって、血液および骨髄のサ
ンプルを構成する細胞の型および系統が識別され同定さ
れるであろう。
より詳細には、本方法は、個体から体液サンプルを採取
する段階；流体サンプルをＲＮＡ染料ＤＮＡ染料のよう
な核酸染色用染料、および異なる系統の細胞に別様に発
現する細胞表面抗原を認識する標識したモノクローナル
抗体（Ｍ Ａ ｂ）と混合し標識溶液を形成させる段階
：標識溶液がフローサイトメーターを通過する段階；蛍
光強度ＯＬＳおよびＦＬＳを測定する段階；ならびに分
析のために記録されたデータを貯蔵する段階からなる。
する段階；流体サンプルをＲＮＡ染料ＤＮＡ染料のよう
な核酸染色用染料、および異なる系統の細胞に別様に発
現する細胞表面抗原を認識する標識したモノクローナル
抗体（Ｍ Ａ ｂ）と混合し標識溶液を形成させる段階
：標識溶液がフローサイトメーターを通過する段階；蛍
光強度ＯＬＳおよびＦＬＳを測定する段階；ならびに分
析のために記録されたデータを貯蔵する段階からなる。
各々の核酸染料および免疫標識は蛍光であり、これらは
同一波長で励起され、かつ互いに識別可能な放出（エミ
ッション）スペクトルのピークを持つ。
同一波長で励起され、かつ互いに識別可能な放出（エミ
ッション）スペクトルのピークを持つ。
本発明に有用な核酸染料および標識した細胞表面マーカ
ーのキットもまた、本発明の範囲に含まれる。
ーのキットもまた、本発明の範囲に含まれる。
本発明は体液的細胞を同時に多数のパラメーターについ
て分析する方法であって；前記体液は脊髄、腹膜あるい
は脳内の流体、尿、または全血のいづれかよりなり、さ
らには生体組織検査といったようなものから得られる骨
髄吸引液５肝臓、脾臓あるいはリンパ節から調製した組
織の細胞懸濁液をも含む可能性があり：前記パラメータ
ーは試験する各々の細胞からの散乱光を一以上の方向に
おいて少なくとも二種項測定することおよび試験する各
々の細胞の蛍光活性を少なくとも三種類測定することか
らなる０本方法は、個体から体液サンプルを採取する段
階、ならびに体液サンプルを少なくとも三種類の染料お
よび少なくとも一種類の標識した細胞表面マーカーと混
合させる段階からなり、前記染料のそれぞれはサンプル
内に存在する細胞の異なる特徴を別々に評価し、かつ前
記マーカーは異なる系統の細胞に別様に発現する抗原を
認識して標識溶液を形成する。各々の染料および標識は
蛍光を発し、かつ互いに識別可能な放出スペクトルのピ
ークを持つ、さらに標識した溶液は検出器を通過させ、
その内で溶液中の各々の細胞は一度に実質的にＩＮづつ
試験され、蛍光強度および散乱光の測定が試験しようと
する個々の細胞について行なわれる０個々の細胞につい
て調べられた測定値（またはパラメーター）はデータ保
存手段に保存され、即時にまたは後程再結合され再分析
されるであろう。
て分析する方法であって；前記体液は脊髄、腹膜あるい
は脳内の流体、尿、または全血のいづれかよりなり、さ
らには生体組織検査といったようなものから得られる骨
髄吸引液５肝臓、脾臓あるいはリンパ節から調製した組
織の細胞懸濁液をも含む可能性があり：前記パラメータ
ーは試験する各々の細胞からの散乱光を一以上の方向に
おいて少なくとも二種項測定することおよび試験する各
々の細胞の蛍光活性を少なくとも三種類測定することか
らなる０本方法は、個体から体液サンプルを採取する段
階、ならびに体液サンプルを少なくとも三種類の染料お
よび少なくとも一種類の標識した細胞表面マーカーと混
合させる段階からなり、前記染料のそれぞれはサンプル
内に存在する細胞の異なる特徴を別々に評価し、かつ前
記マーカーは異なる系統の細胞に別様に発現する抗原を
認識して標識溶液を形成する。各々の染料および標識は
蛍光を発し、かつ互いに識別可能な放出スペクトルのピ
ークを持つ、さらに標識した溶液は検出器を通過させ、
その内で溶液中の各々の細胞は一度に実質的にＩＮづつ
試験され、蛍光強度および散乱光の測定が試験しようと
する個々の細胞について行なわれる０個々の細胞につい
て調べられた測定値（またはパラメーター）はデータ保
存手段に保存され、即時にまたは後程再結合され再分析
されるであろう。
本発明は体液サンプル内の細胞を少なくとも三種類のパ
ラメーターで分析することによって識別し同定すること
を可能にするであろう、望ましくは１本発明の方法は、
１） 個体から得られた体液サンプルに含まれる細胞を
分離する段階であり、還択的には、体液が全血または骨
髄吸引液のいづれかよりなる上記の分離段階； ２）二
種類の核酸蛍光染料を前記サンプルに添加してそれぞれ
の細胞内のＤＮＡおよびＲＮＡを差別的に標識する段階
であり、それぞれの染料が互いに異なる蛍光放出スペク
トルのピークを持つ上記の蛍光核酸染料添加段階； ３
）蛍光凛諸した細胞表面マーカーを前記サンプルに加え
る段階であり、前記マーカーが前記液体中の前記細胞に
別様に発現する抗原を認識し、かつ前記蛍光免疫標識が
前記蛍光染料とは異なる放出スペクトルのピークを持つ
前記の段１＠； ４）前記サンプル内に存在する前記
細胞を、放出スペクトルのピークまたはその寸近での個
々の細胞の蛍光ならびに個々の細胞のＯＬＳおよびＦＬ
Ｓの両方を検出しかつ記録する能力を持つ自動装置で分
析する段階；からなる。
ラメーターで分析することによって識別し同定すること
を可能にするであろう、望ましくは１本発明の方法は、
１） 個体から得られた体液サンプルに含まれる細胞を
分離する段階であり、還択的には、体液が全血または骨
髄吸引液のいづれかよりなる上記の分離段階； ２）二
種類の核酸蛍光染料を前記サンプルに添加してそれぞれ
の細胞内のＤＮＡおよびＲＮＡを差別的に標識する段階
であり、それぞれの染料が互いに異なる蛍光放出スペク
トルのピークを持つ上記の蛍光核酸染料添加段階； ３
）蛍光凛諸した細胞表面マーカーを前記サンプルに加え
る段階であり、前記マーカーが前記液体中の前記細胞に
別様に発現する抗原を認識し、かつ前記蛍光免疫標識が
前記蛍光染料とは異なる放出スペクトルのピークを持つ
前記の段１＠； ４）前記サンプル内に存在する前記
細胞を、放出スペクトルのピークまたはその寸近での個
々の細胞の蛍光ならびに個々の細胞のＯＬＳおよびＦＬ
Ｓの両方を検出しかつ記録する能力を持つ自動装置で分
析する段階；からなる。
好適な実施態様において、検出器はＦＡＣ３ｃａｎ”（
商５ＢＤＩＳ）のようなフローサイトメーターを含む、
好適には、フローサイトメーターは前記蛍光５本細胞を
励起するためにアルゴンイオンレーザ−のような単一の
レーザーを備えており、その波長は４８８ｎｍまたはそ
の１１近である。それ故、蛍光核酸染料および蛍光標識
は４８８ｎｍで励起され得なければならない、好適には
、ＬＤＳ−７５１［エキシトン（Ｅ ｘｃｉＬｏｎ）］
がＤＮＡ染料として使用され、チアゾールオレンジ（Ｔ
ｂｉａｚｏｌｅ −Ｏｒａｎｇｅ）（ＢＤＩＳ）がＲ
ＮＡ染料として使用される。
商５ＢＤＩＳ）のようなフローサイトメーターを含む、
好適には、フローサイトメーターは前記蛍光５本細胞を
励起するためにアルゴンイオンレーザ−のような単一の
レーザーを備えており、その波長は４８８ｎｍまたはそ
の１１近である。それ故、蛍光核酸染料および蛍光標識
は４８８ｎｍで励起され得なければならない、好適には
、ＬＤＳ−７５１［エキシトン（Ｅ ｘｃｉＬｏｎ）］
がＤＮＡ染料として使用され、チアゾールオレンジ（Ｔ
ｂｉａｚｏｌｅ −Ｏｒａｎｇｅ）（ＢＤＩＳ）がＲ
ＮＡ染料として使用される。
ＬＤＳ−７５１は６フＯｎ＋ｓに放出スペクトルピーク
を持ち、チアゾールオレンジは５３０ｎｎに放出スペク
トルのピークをもつ０本発明の実施にあたって適切な池
の蛍光核酸色素には、米Ｉ］持許第４，５４４゜５４６
号明細書に記載の色素が含まれる。
を持ち、チアゾールオレンジは５３０ｎｎに放出スペク
トルのピークをもつ０本発明の実施にあたって適切な池
の蛍光核酸色素には、米Ｉ］持許第４，５４４゜５４６
号明細書に記載の色素が含まれる。
当業者は、フローサイトメーターが一種顕以上のレーザ
ーを備えている場合には蛍光染料および／または蛍光標
識が異なる波長で励起されることを理解するであろう、
そのような実施態様において必要とされるのは、唯一、
染料および免疫蛍光標識のすべての放出スペクトルのピ
ークが異なることのみである。ヘリウム／ネオンおよび
アルゴンイオンレーザ−（波長はそれぞれ６３３ｎａお
よび４８８ｎｍである）を備えたフローサイトメーター
にはＦＡＳＳｔａｒ Ｐｌｕｓ” （商ｆ５［）（Ｂ
ＤＴＳ）が含まれる。
ーを備えている場合には蛍光染料および／または蛍光標
識が異なる波長で励起されることを理解するであろう、
そのような実施態様において必要とされるのは、唯一、
染料および免疫蛍光標識のすべての放出スペクトルのピ
ークが異なることのみである。ヘリウム／ネオンおよび
アルゴンイオンレーザ−（波長はそれぞれ６３３ｎａお
よび４８８ｎｍである）を備えたフローサイトメーター
にはＦＡＳＳｔａｒ Ｐｌｕｓ” （商ｆ５［）（Ｂ
ＤＴＳ）が含まれる。
また、好適な実施態様において、細胞表面マーカーは造
血細胞の表面に別様に発現する細胞表面抗原に運択的に
付着するモノクローナル抗体である。抗原は有核細胞の
いろいろな型および成熟段階で発現量が異なることが望
ましい、そのような抗原の一つにＣＤ４５がある。ＣＤ
４５抗原はおよそ１８０〜２ＺＯＫＤの分子量を持ち、
すべてのリンパ球、単球および顆粒球に異なるレベルで
発現するが、成熟した血小板またはＲＢＣには存在しな
い、ＣＤ４５抗原と特異的に反応するモノクローナル抗
体（即ちＣＤ４５ ＭＡｂ）にはＨＬｅ−１（または
抗日血球とも呼ばれる、ＢＤＩＳ）およびＬ ＣＡ （
Ｄ ａｋｏ Ｃｏｒｐ）が含まれる。好適にはＨＬｅ−
１が用いられる。
血細胞の表面に別様に発現する細胞表面抗原に運択的に
付着するモノクローナル抗体である。抗原は有核細胞の
いろいろな型および成熟段階で発現量が異なることが望
ましい、そのような抗原の一つにＣＤ４５がある。ＣＤ
４５抗原はおよそ１８０〜２ＺＯＫＤの分子量を持ち、
すべてのリンパ球、単球および顆粒球に異なるレベルで
発現するが、成熟した血小板またはＲＢＣには存在しな
い、ＣＤ４５抗原と特異的に反応するモノクローナル抗
体（即ちＣＤ４５ ＭＡｂ）にはＨＬｅ−１（または
抗日血球とも呼ばれる、ＢＤＩＳ）およびＬ ＣＡ （
Ｄ ａｋｏ Ｃｏｒｐ）が含まれる。好適にはＨＬｅ−
１が用いられる。
ＣＤ４５ ＭＡｂには蛍光色素のような蛍光標識を直
接付加する。直接的な方法では、ＭＡｂは当業者に既知
の手段によって蛍光標識に直接結合させる。米国特許第
４，５２０，１１０号明細書は蛍光標識をＭＡｂに結合
させるための一つの方法を提供している。
接付加する。直接的な方法では、ＭＡｂは当業者に既知
の手段によって蛍光標識に直接結合させる。米国特許第
４，５２０，１１０号明細書は蛍光標識をＭＡｂに結合
させるための一つの方法を提供している。
好適な実施態様において、蛍光色素はフィコエリトリン
（ＰＥ）のようなフィコビリ蛋白質であり、この色素は
４８８ｎｍで励起され、５７５ｎ＋＊に放出ピークをも
つ、ＨＬｅ−１およびＰＥの複合物は一般的にＨＬｅ−
１（ＰＥ）と呼ばれる。
（ＰＥ）のようなフィコビリ蛋白質であり、この色素は
４８８ｎｍで励起され、５７５ｎ＋＊に放出ピークをも
つ、ＨＬｅ−１およびＰＥの複合物は一般的にＨＬｅ−
１（ＰＥ）と呼ばれる。
これ以外の蛍光色素もまた本発明において使用されるで
あろう、蛍光色素としての必要条件は、アルゴンレーザ
ーが使用される場合には４８８ｎｍ、または二種類のレ
ーザー源を用いる場合には４８８ｎｍ以外のある波長（
例えば、Ｈｅ／Ｎｅレーザーでは６３３ｎｍ）で蛍光色
素が励起されること、および蛍光色素が核酸染料と重複
しない放出スペクトルピークをもつことのみである。
あろう、蛍光色素としての必要条件は、アルゴンレーザ
ーが使用される場合には４８８ｎｍ、または二種類のレ
ーザー源を用いる場合には４８８ｎｍ以外のある波長（
例えば、Ｈｅ／Ｎｅレーザーでは６３３ｎｍ）で蛍光色
素が励起されること、および蛍光色素が核酸染料と重複
しない放出スペクトルピークをもつことのみである。
さらに、フローサイトメーターは個々の細胞毎から収集
したデータを記録分析する手段と連結させることが望ま
しい、データを記録分析する手段には適切なソフトウェ
アを備えたパーソナルコンピューターが含まれるであろ
う、ソフトウェアは各細胞それぞれについて少なくとも
二種類のパラメーターを分析する能力、五次元空間で類
似した細胞集団分識別または同定する能力、および二次
元に少なくとも二種類のパラメーターを表示する能力を
もたねばならない、さらに、ソフトウェアは一種票以上
のパラメーターのゲートを設定し、かつ他のパラメータ
ーと組み合わせて二次元に表示する能力をもたねばなら
ない。
したデータを記録分析する手段と連結させることが望ま
しい、データを記録分析する手段には適切なソフトウェ
アを備えたパーソナルコンピューターが含まれるであろ
う、ソフトウェアは各細胞それぞれについて少なくとも
二種類のパラメーターを分析する能力、五次元空間で類
似した細胞集団分識別または同定する能力、および二次
元に少なくとも二種類のパラメーターを表示する能力を
もたねばならない、さらに、ソフトウェアは一種票以上
のパラメーターのゲートを設定し、かつ他のパラメータ
ーと組み合わせて二次元に表示する能力をもたねばなら
ない。
好適な実施懇探においては、Ｐａ１ｎｔ−ＡＧａｔｅＴ
″（商標）ソフトウェア（ＢＤＩＳ）をコンソルト（Ｃ
ｏｎｓｏｒｔ） ３０デ一タ保存分析システム（ＢＤＩ
Ｓ）に連結させて用いる。ソフトウェアは米国特許第０
４６，６１９号明細書（１９８７年５月７日出Ｎｉ）に
そのすべてが記載されており、本願と同様に、本発明の
譲受人に譲渡されている。
″（商標）ソフトウェア（ＢＤＩＳ）をコンソルト（Ｃ
ｏｎｓｏｒｔ） ３０デ一タ保存分析システム（ＢＤＩ
Ｓ）に連結させて用いる。ソフトウェアは米国特許第０
４６，６１９号明細書（１９８７年５月７日出Ｎｉ）に
そのすべてが記載されており、本願と同様に、本発明の
譲受人に譲渡されている。
本明細書に記載した方法に加えて、本発明はまた体液的
細胞の複数のパラメーター分析のためのキットをも含む
。このキットは各々の細胞のＤＮＡおよびＲＮＡを標識
するための核酸染料であって、他のものから識別可能な
放出スペクトルピークをもつ染料を少なくとも二種類収
納する第一容器、および蛍光標識した細胞表面マーカー
であって、サンプルに含まれる異種細胞において別様に
発現するオＪ胞表面抗原と特異的に反応する細胞表面マ
ーカーを蛍光５識した上記物質を収納する第二容器から
なる。染料はＤＮＡおよびＲＮＡを差別的に標識する核
酸染料が望ましい。好適な実施り様において、核酸染料
はＬＤＳ−７５１およびチアゾールオレンジであり、か
つ蛍光標識した細胞表面マーカーはＨＬｅ−１（ＰＥ）
である。
細胞の複数のパラメーター分析のためのキットをも含む
。このキットは各々の細胞のＤＮＡおよびＲＮＡを標識
するための核酸染料であって、他のものから識別可能な
放出スペクトルピークをもつ染料を少なくとも二種類収
納する第一容器、および蛍光標識した細胞表面マーカー
であって、サンプルに含まれる異種細胞において別様に
発現するオＪ胞表面抗原と特異的に反応する細胞表面マ
ーカーを蛍光５識した上記物質を収納する第二容器から
なる。染料はＤＮＡおよびＲＮＡを差別的に標識する核
酸染料が望ましい。好適な実施り様において、核酸染料
はＬＤＳ−７５１およびチアゾールオレンジであり、か
つ蛍光標識した細胞表面マーカーはＨＬｅ−１（ＰＥ）
である。
当業者は、本明細書に開示した核酸染料および７／また
は細胞表面マーカーの組み合わせ以外の組み合わせもキ
ットに含みうることを理解するであろう。同様に、核酸
染料および／または細胞表面マーカーを容器内に分けて
入れることも理解されるであろう。
は細胞表面マーカーの組み合わせ以外の組み合わせもキ
ットに含みうることを理解するであろう。同様に、核酸
染料および／または細胞表面マーカーを容器内に分けて
入れることも理解されるであろう。
以下に図面について簡単に説明する。
６種頭の図面はすべて対数目盛りであり、核酸染料であ
るＬＤＳ−７５１およびチアゾールオレンジならびにＨ
Ｌｅ−１（ＰＥ）のようなＣＤ４５ＭＡｂｒｅ議した体
液サンプルより得られたおよそ２２，０００個の細胞を
含むドツトプロントを示している。標識した細胞は波長
４８８ｎｍの単一アルゴンレーザーを装備したＦ Ａ
ＣＳ ｃａｎ”７ｎｍサイトメーター［ベクトン ディ
キンソン イムノサイトメトリーシステムズ（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄ １ｃｋｉｎｓ。
るＬＤＳ−７５１およびチアゾールオレンジならびにＨ
Ｌｅ−１（ＰＥ）のようなＣＤ４５ＭＡｂｒｅ議した体
液サンプルより得られたおよそ２２，０００個の細胞を
含むドツトプロントを示している。標識した細胞は波長
４８８ｎｍの単一アルゴンレーザーを装備したＦ Ａ
ＣＳ ｃａｎ”７ｎｍサイトメーター［ベクトン ディ
キンソン イムノサイトメトリーシステムズ（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄ １ｃｋｉｎｓ。
Ｉ ｍｍｕｎｏｅｙＬｏｍｅｔｒｙ Ｓ ｙｓｔｅｍ
ｓ）（またはＢＤＩＳ）］で分析し、ＯＬＣおよびＦＬ
Ｓならびに蛍光強度の測定を各々の細胞について行なっ
た。デジタル化しりストモードに保存した二種類のパラ
メーターのデータの獲得はコンソルト（Ｃｏｎｓｏｒｔ
） ３０コンピユーター（ＢＤＩＳ）を用いて行なった
。データの分析およびプリントアウトはＰａ１ｎｔ−Ａ
−Ｇａｔｅ” （商標）ソフトウェア（ＢＤＩＳ）を用
いて行なった。
ｓ）（またはＢＤＩＳ）］で分析し、ＯＬＣおよびＦＬ
Ｓならびに蛍光強度の測定を各々の細胞について行なっ
た。デジタル化しりストモードに保存した二種類のパラ
メーターのデータの獲得はコンソルト（Ｃｏｎｓｏｒｔ
） ３０コンピユーター（ＢＤＩＳ）を用いて行なった
。データの分析およびプリントアウトはＰａ１ｎｔ−Ａ
−Ｇａｔｅ” （商標）ソフトウェア（ＢＤＩＳ）を用
いて行なった。
第１図は、二種類のパラメーターのさまざまな組み合わ
せによって分析した正常な末梢血液サンプルから得られ
た細胞のいろいろなドツトプロットからなり、図中、（
○）で示した細胞は赤血球７（・）で示した細胞は白血
球、（■）で示した細胞は網状赤血球、（△）で示した
粒子は血小板である。
せによって分析した正常な末梢血液サンプルから得られ
た細胞のいろいろなドツトプロットからなり、図中、（
○）で示した細胞は赤血球７（・）で示した細胞は白血
球、（■）で示した細胞は網状赤血球、（△）で示した
粒子は血小板である。
第２図は第１図で分析され、かつＬＤＳ７５１およびチ
アゾールオレンジ蛍光（第ＬＩＭＢ）にゲートが設定さ
れた、血液サンプル内に存在する有核細胞のみについて
行なったいろいろなドツトプロットからなり、図中、（
△）で示した細胞はリンパ球、（■）で示した細胞は単
球、（×）で示した細胞は好中球、（拳）で示した細胞
は好酸球である。
アゾールオレンジ蛍光（第ＬＩＭＢ）にゲートが設定さ
れた、血液サンプル内に存在する有核細胞のみについて
行なったいろいろなドツトプロットからなり、図中、（
△）で示した細胞はリンパ球、（■）で示した細胞は単
球、（×）で示した細胞は好中球、（拳）で示した細胞
は好酸球である。
第３図は五種想のパラメーターのいろいろな組み合わせ
によって分析した正常な骨髄吸引液から得られた細胞の
さまざまなドツトプロットからなり、図中、細胞の型は
第１図と同様のマークで示した。
によって分析した正常な骨髄吸引液から得られた細胞の
さまざまなドツトプロットからなり、図中、細胞の型は
第１図と同様のマークで示した。
第４図は、第３図で分析され、かつＬＤＳ−７５１およ
びチアゾールオレンジ蛍光にゲートが設定された、骨髄
サンプル内に存在する有核細胞についてのみ行なったさ
まざまなドツトプロットからなり、図中、細胞の型は第
２図と同様のマークで示し、さらに有核の赤芽球は（ロ
）、未成熟白血球（芽球〉はく区）で示した。
びチアゾールオレンジ蛍光にゲートが設定された、骨髄
サンプル内に存在する有核細胞についてのみ行なったさ
まざまなドツトプロットからなり、図中、細胞の型は第
２図と同様のマークで示し、さらに有核の赤芽球は（ロ
）、未成熟白血球（芽球〉はく区）で示した。
第５図は五Ｐｌ顕のパラメーターのいろいろな組み合わ
せによって分析した血小板減少症ＢＣＬＬ、徴者から得
られた末梢血液細胞のさまざまなドツトプロットであり
、図中、細胞は第１図と同様のマークで示した。
せによって分析した血小板減少症ＢＣＬＬ、徴者から得
られた末梢血液細胞のさまざまなドツトプロットであり
、図中、細胞は第１図と同様のマークで示した。
第６図は第５図で分析され、かつＬＤＳ−７５１および
チアゾールオレンジ蛍光にゲートが設定された、血液サ
ンプル中に存在する有核細胞についてのみ行なったさま
ざまなドツトプロット分析からなり、図中、細胞は第４
図と同様のマークで示した。
チアゾールオレンジ蛍光にゲートが設定された、血液サ
ンプル中に存在する有核細胞についてのみ行なったさま
ざまなドツトプロット分析からなり、図中、細胞は第４
図と同様のマークで示した。
夫芝且
正常なボランティアからの末梢血液を静脈穿刺によりＥ
Ｄ Ｔ Ａ （Ｋ ３）を抗凝血物質として含んだバ
クテナー チューブ（Ｖａｃｔａｉｎｒｅ ｔｕｂｅ
）［ベクトン ディキンソン（Ｂ ｅｅｔｏｎ Ｄ
１ｃｋｉｎｓｏｎ）］に集めた。血液はまたＢ細胞慢性
リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の第■期の患者からもＲ
ＡＩに従って集めた。血液細胞の計数は自動血液細胞ア
ナライザー［Ｈｌ、テクニコン（Ｔｅｅｈｎｉｅｏｎ）
］によって行なった（ＲＢ Ｃ３，３ｘ１０”／ｍ１；
リンパ球８１．９×１０’７ｍｌ ；および血小板は手
操作で３５ｘ １０’／ｄと計数の後、２０×１０’／
ｍｌと訂正された）、骨髄吸引液は正常なボランティア
より得た。４Ａめな吸引液をバクテナチューブに移し、
ＲＰＭ Ｉ １６４０（Ｇ Ｉ ＢＣＯ）を加えて１：
１に希釈した。
Ｄ Ｔ Ａ （Ｋ ３）を抗凝血物質として含んだバ
クテナー チューブ（Ｖａｃｔａｉｎｒｅ ｔｕｂｅ
）［ベクトン ディキンソン（Ｂ ｅｅｔｏｎ Ｄ
１ｃｋｉｎｓｏｎ）］に集めた。血液はまたＢ細胞慢性
リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の第■期の患者からもＲ
ＡＩに従って集めた。血液細胞の計数は自動血液細胞ア
ナライザー［Ｈｌ、テクニコン（Ｔｅｅｈｎｉｅｏｎ）
］によって行なった（ＲＢ Ｃ３，３ｘ１０”／ｍ１；
リンパ球８１．９×１０’７ｍｌ ；および血小板は手
操作で３５ｘ １０’／ｄと計数の後、２０×１０’／
ｍｌと訂正された）、骨髄吸引液は正常なボランティア
より得た。４Ａめな吸引液をバクテナチューブに移し、
ＲＰＭ Ｉ １６４０（Ｇ Ｉ ＢＣＯ）を加えて１：
１に希釈した。
各々の試験には１０μｌの血液または骨髄サンプルを用
いた。サンプルは１０μβのＬＤＳ７５１溶液（０，１
＋＊ｙ１５＋＊ＮＰＢＳ） 、１０ μｍチアゾールオ
レンジ溶液（０，１ｍｙ／１ｓｔ’ＰＢＳ） 、および
１０ｔｚＮＨＬｅ１（ＰＥ）と共に３０分間インキュベ
ーションした。サンプルは測定前に１論！リンＵ綬祈生
理食塩溶液（ＰＢＳ）で希釈した。
いた。サンプルは１０μβのＬＤＳ７５１溶液（０，１
＋＊ｙ１５＋＊ＮＰＢＳ） 、１０ μｍチアゾールオ
レンジ溶液（０，１ｍｙ／１ｓｔ’ＰＢＳ） 、および
１０ｔｚＮＨＬｅ１（ＰＥ）と共に３０分間インキュベ
ーションした。サンプルは測定前に１論！リンＵ綬祈生
理食塩溶液（ＰＢＳ）で希釈した。
スペクトルの補正を行なってＬＤＳ−７５１チヤンネル
にはいるＰＥ放出（エミッション）（５％削減）、ＰＥ
チャンネルにはいるＬＤＳ７５１（１１％削減）、チア
ゾールオレンジチャンネルにはいるＰＥ（２３％削減）
、およびＰＥ経路にはいるチアゾールオレンジ（０，４
＄削減）を補償した。チアゾールオレンジとＬＤＳ−７
５１チヤンネルとの間の補正は必要でなかった。
にはいるＰＥ放出（エミッション）（５％削減）、ＰＥ
チャンネルにはいるＬＤＳ７５１（１１％削減）、チア
ゾールオレンジチャンネルにはいるＰＥ（２３％削減）
、およびＰＥ経路にはいるチアゾールオレンジ（０，４
＄削減）を補償した。チアゾールオレンジとＬＤＳ−７
５１チヤンネルとの間の補正は必要でなかった。
フローサイトメーターの測定は単一のアルゴンイオンレ
ーザ−を備えたＦ Ａ ＣＳ ｃａｎ”フローサイトメ
ーターで行なった。デジタル化し、リストモードに保存
した三種類のパラメーターのデータの獲得は、コンソル
ト（Ｃｏｎｓｏｒｔ） ３０ ”コンピューターを用い
Ｆ Ａ ＣＳ ｃａｎ” 研究用ソフトウェアで行な
った。各々のサンプルについて２２．０００個の細胞を
分析した。有核細胞を識別するために、データの獲得は
ＬＤＳ−７５１およびチアゾールオレンジの蛍光強度に
ゲートを設定して行なった。データの分析は多数のパラ
メーターデータを目に見えるようにするＰ ａｉｎｔ
−Ａ −Ｇａｔｅ””ソフトウェアプログラムを用いて
行なった。
ーザ−を備えたＦ Ａ ＣＳ ｃａｎ”フローサイトメ
ーターで行なった。デジタル化し、リストモードに保存
した三種類のパラメーターのデータの獲得は、コンソル
ト（Ｃｏｎｓｏｒｔ） ３０ ”コンピューターを用い
Ｆ Ａ ＣＳ ｃａｎ” 研究用ソフトウェアで行な
った。各々のサンプルについて２２．０００個の細胞を
分析した。有核細胞を識別するために、データの獲得は
ＬＤＳ−７５１およびチアゾールオレンジの蛍光強度に
ゲートを設定して行なった。データの分析は多数のパラ
メーターデータを目に見えるようにするＰ ａｉｎｔ
−Ａ −Ｇａｔｅ””ソフトウェアプログラムを用いて
行なった。
当業者は、サンプルの分析が二分割法で行なわれること
を理解するであろう、最初に体液サンプルを分割し、こ
の分割サンプルのうちの１個以上を上述のように希釈し
、もう１個は希釈せずにおくかまたはより少ない希釈倍
率で希釈する０次いで上記の方法を行なった後、１個の
分割サンプルを用い、有核細胞にゲートを設定するがそ
の数は計測せずにＲＢＣ，血小板および網状赤血球を同
定し識別した。また、上記の方法を行なった後、無・核
細胞にゲートを設定するがその数は計測せずに有核細胞
を同定しかつ識別した。サンプルを分割して有核細胞を
より少ない希釈倍率で希釈して試験すると、サンプル内
の比較的少ない有核細胞がより早く計測できるであろう
。
を理解するであろう、最初に体液サンプルを分割し、こ
の分割サンプルのうちの１個以上を上述のように希釈し
、もう１個は希釈せずにおくかまたはより少ない希釈倍
率で希釈する０次いで上記の方法を行なった後、１個の
分割サンプルを用い、有核細胞にゲートを設定するがそ
の数は計測せずにＲＢＣ，血小板および網状赤血球を同
定し識別した。また、上記の方法を行なった後、無・核
細胞にゲートを設定するがその数は計測せずに有核細胞
を同定しかつ識別した。サンプルを分割して有核細胞を
より少ない希釈倍率で希釈して試験すると、サンプル内
の比較的少ない有核細胞がより早く計測できるであろう
。
細胞の分類は、波長４８８ｎｍにｙＪ整された単一アル
ゴンレーザーを用いた三種類の蛍光信号および三種類の
散乱光信号を検出するために調整されたＦＡＣ３４４０
”で行なった。細胞は１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を
含ｔｒＲＰＭ１１６４０内に介意した０分類した細胞は
５分間２００Ｇで遠心分層し、再び１０５’ざＦＣ３含
有のＲＰＭＩ１００μｒに懸濁した０票微鏡用スライド
調製物はシャントン サイトセントリフユージ（Ｓ ｈ
ａｎｃｌｏｎＣｙｔｏｅｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）［サザン
プロダクト（Ｓ ｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ ｒｏｄｕｅ
ｔ Ｌ ｔｄ） 、英国］を用いて作製した。スライ
ドはライト スティン（ＷｒｉＦｉｈｔＳ ｔａｉｎ）
で染色し、光学顕微鏡で調べた。網状赤血球を同定する
ためには、１００μｌの１％ニューメチレンブルー溶液
を再懸濁した分類細胞に加えた。細胞はス、ライド上に
移し、お−いをかぶせ、光学顕微鏡で調べた。
ゴンレーザーを用いた三種類の蛍光信号および三種類の
散乱光信号を検出するために調整されたＦＡＣ３４４０
”で行なった。細胞は１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を
含ｔｒＲＰＭ１１６４０内に介意した０分類した細胞は
５分間２００Ｇで遠心分層し、再び１０５’ざＦＣ３含
有のＲＰＭＩ１００μｒに懸濁した０票微鏡用スライド
調製物はシャントン サイトセントリフユージ（Ｓ ｈ
ａｎｃｌｏｎＣｙｔｏｅｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）［サザン
プロダクト（Ｓ ｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ ｒｏｄｕｅ
ｔ Ｌ ｔｄ） 、英国］を用いて作製した。スライ
ドはライト スティン（ＷｒｉＦｉｈｔＳ ｔａｉｎ）
で染色し、光学顕微鏡で調べた。網状赤血球を同定する
ためには、１００μｌの１％ニューメチレンブルー溶液
を再懸濁した分類細胞に加えた。細胞はス、ライド上に
移し、お−いをかぶせ、光学顕微鏡で調べた。
二種類のパラメーターのりストモードファイルの分析は
５色を多次元空間のドントのクラスターの同定に利用す
るコンピュータープログラムで行なった。二種類のパラ
メーターのうちの異なる組み合わせが一度に画面に表示
された。パラメーターの１つの組み合わせによって同定
された細胞クラスターを色付けして、さらにデータの他
の投影も同時に現わした。
５色を多次元空間のドントのクラスターの同定に利用す
るコンピュータープログラムで行なった。二種類のパラ
メーターのうちの異なる組み合わせが一度に画面に表示
された。パラメーターの１つの組み合わせによって同定
された細胞クラスターを色付けして、さらにデータの他
の投影も同時に現わした。
広い範囲の散乱光信号が未溶解の血液サンプルから、微
小な血小板（１〜４μ＋＊）、赤血球（６〜８μ蹟）お
よびより大きい白血球（６０〜２０μｍ）が存在する結
果として得られた。全範囲の散乱光信号を評価するため
に、前方および直角方向散乱光信号は１０４対数増幅器
を用いて検知した。このような条件下では二種類の主要
細胞集団が全血内に同定された。第１図Ａを参照された
い、細胞集団とさらに繁別するためにはさらなるパラメ
ーターが必要である。
小な血小板（１〜４μ＋＊）、赤血球（６〜８μ蹟）お
よびより大きい白血球（６０〜２０μｍ）が存在する結
果として得られた。全範囲の散乱光信号を評価するため
に、前方および直角方向散乱光信号は１０４対数増幅器
を用いて検知した。このような条件下では二種類の主要
細胞集団が全血内に同定された。第１図Ａを参照された
い、細胞集団とさらに繁別するためにはさらなるパラメ
ーターが必要である。
チアゾールオレンジはＤＮＡと比較してＲＮＡにより高
い親和性または選択性をもち、結合すると蛍光が強くな
る。結合染料の放出（エミッション）ピークは５３０ｎ
＋＋である。これに対して、ＬＤＳ−７５１はＲＮＡと
比較してＤＮＡにより高い親和性または選択性をもつ、
この染料ら結合すると蛍光が強くなるが、その最大放出
ピークは６７０ｎｍである。血小板は核をもたないこと
が認められているにもか−わらず、ＬＤＳ−７５１はそ
のような細胞をも選択的に染色する。従って、ＬＤＳ−
７５１以外の染料もまた血小板および他の有核細胞と選
択的に結合して血小板を無核のＲＢＣがら識別するであ
ろうと予想される。
い親和性または選択性をもち、結合すると蛍光が強くな
る。結合染料の放出（エミッション）ピークは５３０ｎ
＋＋である。これに対して、ＬＤＳ−７５１はＲＮＡと
比較してＤＮＡにより高い親和性または選択性をもつ、
この染料ら結合すると蛍光が強くなるが、その最大放出
ピークは６７０ｎｍである。血小板は核をもたないこと
が認められているにもか−わらず、ＬＤＳ−７５１はそ
のような細胞をも選択的に染色する。従って、ＬＤＳ−
７５１以外の染料もまた血小板および他の有核細胞と選
択的に結合して血小板を無核のＲＢＣがら識別するであ
ろうと予想される。
チアゾールオレンジおよびＬＤＳ−７５１の組み会わせ
は、ＲＮＡおよびＤＮＡを両方共もたない赤血球と、両
方の核酸をもつ有核の白血球とを大別する。第１図Ｂに
示すように、赤血球および白血球（（・）、右上方角）
が分離され、それらの蛍光信号ははｆ３桁の大きさで異
なる。これらの染料間の重大な干渉は、有核細胞には認
めらなかった。
は、ＲＮＡおよびＤＮＡを両方共もたない赤血球と、両
方の核酸をもつ有核の白血球とを大別する。第１図Ｂに
示すように、赤血球および白血球（（・）、右上方角）
が分離され、それらの蛍光信号ははｆ３桁の大きさで異
なる。これらの染料間の重大な干渉は、有核細胞には認
めらなかった。
チアゾールオレンジおよびＬＤＳ−７５１は、赤血球、
網状赤血球および血小板の間の識別にも用いうるが、血
小板および網状赤血球の両方において、これらの染料間
の相互作用が認められた。
網状赤血球および血小板の間の識別にも用いうるが、血
小板および網状赤血球の両方において、これらの染料間
の相互作用が認められた。
血小板では、両染料を加える順序が蛍光強度に影響を与
えた。ＬＤＳ−７５１をチアゾールオレンジより先にま
たは一緒に加えると、チアゾールオレンジによる血小板
の染色が阻害された。血小板はチアゾールオレンジを単
独に加えた場合、またはＬＤＳ−７５１の添加に先立っ
て加えた場合にのみ、チアゾールオレンジで染色された
。ｌｌ１Ｉ状赤血球では、チアゾールオレンジによる蛍
光強度がＬＤＳ−７５１存在下でわずかに小さくなった
。
えた。ＬＤＳ−７５１をチアゾールオレンジより先にま
たは一緒に加えると、チアゾールオレンジによる血小板
の染色が阻害された。血小板はチアゾールオレンジを単
独に加えた場合、またはＬＤＳ−７５１の添加に先立っ
て加えた場合にのみ、チアゾールオレンジで染色された
。ｌｌ１Ｉ状赤血球では、チアゾールオレンジによる蛍
光強度がＬＤＳ−７５１存在下でわずかに小さくなった
。
チアゾールオレンジおよびＬＤＳ−７５１を同時に加え
てサンプルをインキュベーションすることによって、血
小板と網状赤血球との間には最も効果的な分離が認めら
れ、同時に、赤血球とこれら二種類の集団との間にも良
好な分離が保たれた。
てサンプルをインキュベーションすることによって、血
小板と網状赤血球との間には最も効果的な分離が認めら
れ、同時に、赤血球とこれら二種類の集団との間にも良
好な分離が保たれた。
チアゾールオレンジおよびＬＤＳ−７５１の間の放出ス
ペクトルの分陰は、ＰＥ複合ＭＡｂの結合状態の同時評
価を可能にする。ＣＤ４５が遷ばれた理由は、この抗体
によって認識される抗原が異なる系統の細胞では異なる
密度で発生することが明らかにされているためである。
ペクトルの分陰は、ＰＥ複合ＭＡｂの結合状態の同時評
価を可能にする。ＣＤ４５が遷ばれた理由は、この抗体
によって認識される抗原が異なる系統の細胞では異なる
密度で発生することが明らかにされているためである。
免疫蛍光強度と前方および直角方向散乱光との組み合わ
せは、以下の項に記載するように有核細胞の広範な分画
分析を可能にする。
せは、以下の項に記載するように有核細胞の広範な分画
分析を可能にする。
の
末梢血液をＬＤＳ−７５１，チアゾールオレンジおよび
ＨＬｅ−１（ＰＥ）と共にインキュベージョンした。血
液調製物は測定前にＰＢＳで１＝１００に希釈した。
ＨＬｅ−１（ＰＥ）と共にインキュベージョンした。血
液調製物は測定前にＰＢＳで１＝１００に希釈した。
データが複雑なため、異なる血液細胞集団の同定は分け
て記載した。関連する細胞並集団の同一性は、選別した
細胞の閉微鏡試験によって確かめられた０選別細胞画分
の純度は９０９６以上であり、主な混入細胞は赤血球で
あった。そのような閾値を設定した結果として白血球集
団を選別する間に、赤血球は非常にしばしばゲートを設
定したその細胞集団と件にｆＩＪ向する傾向がある。
て記載した。関連する細胞並集団の同一性は、選別した
細胞の閉微鏡試験によって確かめられた０選別細胞画分
の純度は９０９６以上であり、主な混入細胞は赤血球で
あった。そのような閾値を設定した結果として白血球集
団を選別する間に、赤血球は非常にしばしばゲートを設
定したその細胞集団と件にｆＩＪ向する傾向がある。
血液中の主な細胞集団は成熟型赤血球（ＲＢ Ｃ）から
なる。ＲＢＣは、前方および直角方向の散乱光信号が相
対的に大きいこと（第１図Ａ、（０））Ｉ、ＤＳ−７５
１およびチアゾールオレンジによる蛍光３発しないこと
く第１図Ｂ）、ならびに抗ＣＤ４５と結合しないこと（
第１図Ｃ，Ｄ）から同定した。
なる。ＲＢＣは、前方および直角方向の散乱光信号が相
対的に大きいこと（第１図Ａ、（０））Ｉ、ＤＳ−７５
１およびチアゾールオレンジによる蛍光３発しないこと
く第１図Ｂ）、ならびに抗ＣＤ４５と結合しないこと（
第１図Ｃ，Ｄ）から同定した。
網状赤血球（第１図、（■））は、主にチアゾールオレ
ンジとの反応性に基づいて成熟型赤血球から識別された
（第１図Ｂ）、＃！Ｉ状赤血球は赤血球に比べてＬＤＳ
−７５１による蛍光強度もわずかに強い、ＲＢＣおよび
網状赤血球は両方共、ＣＤ４５によって認諾される表面
抗原を発現しない（第１図ＣおよびＤ）、網状赤血球を
その散乱光特徴に基づいて白血球およびＲＢＣから識別
することはできない（第１図Ａ）。
ンジとの反応性に基づいて成熟型赤血球から識別された
（第１図Ｂ）、＃！Ｉ状赤血球は赤血球に比べてＬＤＳ
−７５１による蛍光強度もわずかに強い、ＲＢＣおよび
網状赤血球は両方共、ＣＤ４５によって認諾される表面
抗原を発現しない（第１図ＣおよびＤ）、網状赤血球を
その散乱光特徴に基づいて白血球およびＲＢＣから識別
することはできない（第１図Ａ）。
有核赤血球は普通末梢血液中には見い出されないので、
後はど骨髄の分析の項で議論する。
後はど骨髄の分析の項で議論する。
血小板は、前方および直角方向の散乱光が比敦的小さい
こと（第１図Ａ、（△））に加えて、ＬＤＳ７５１によ
る染色が比較的少ないこと（第１図Ｂ）によって特徴付
けられる。血小板はこれら三￥１′Ｍのパラメーターを
用いることによってＲＢＣ（０）、網状赤血球（■）、
白血球（・）から明確に分離されたく第１図Ｂ〉、赤血
球細胞と同様に、血小板はＣＤ４５によって認識される
抗原を発現しなかった（第１図ＣおよびＤ）、多数のパ
ラメーター分析を用いることによって、“正常な”血小
板は散乱光信号が比較的低く、ＬＤＳ−７５１による蛍
光強度がＲＢＣのそれより大きく、チアゾールオレンジ
との反応性を示さず、且つＣＤ４５結合物の存在しない
粒子として特徴付けられた。
こと（第１図Ａ、（△））に加えて、ＬＤＳ７５１によ
る染色が比較的少ないこと（第１図Ｂ）によって特徴付
けられる。血小板はこれら三￥１′Ｍのパラメーターを
用いることによってＲＢＣ（０）、網状赤血球（■）、
白血球（・）から明確に分離されたく第１図Ｂ〉、赤血
球細胞と同様に、血小板はＣＤ４５によって認識される
抗原を発現しなかった（第１図ＣおよびＤ）、多数のパ
ラメーター分析を用いることによって、“正常な”血小
板は散乱光信号が比較的低く、ＬＤＳ−７５１による蛍
光強度がＲＢＣのそれより大きく、チアゾールオレンジ
との反応性を示さず、且つＣＤ４５結合物の存在しない
粒子として特徴付けられた。
白血球は直角方向および前方散乱光信号が比較的大きい
ことによって特徴付けられたく第１図Ａ（・））、白血
球と赤血球系細胞の散乱光の特徴はよく似ているが、白
血球はＬＤＳ−７５１およびチアゾールオレンジの両方
から生じる蛍光信号がより大きいこと（第１図Ｂ）によ
って赤血球系細胞（０）から明確に分離された。このよ
うな分離によってＲＢＣが圧倒的に多数存在する中で白
血球の数を正確に測定する手段が提供された。白血球と
血小板、ＲＢＣおよび網状赤血球とのさらなる区別はＣ
Ｄ４５との反応性によって得られた（第１図ＣおよびＤ
）。
ことによって特徴付けられたく第１図Ａ（・））、白血
球と赤血球系細胞の散乱光の特徴はよく似ているが、白
血球はＬＤＳ−７５１およびチアゾールオレンジの両方
から生じる蛍光信号がより大きいこと（第１図Ｂ）によ
って赤血球系細胞（０）から明確に分離された。このよ
うな分離によってＲＢＣが圧倒的に多数存在する中で白
血球の数を正確に測定する手段が提供された。白血球と
血小板、ＲＢＣおよび網状赤血球とのさらなる区別はＣ
Ｄ４５との反応性によって得られた（第１図ＣおよびＤ
）。
有核細胞をより詳細に分析するために、第１図Ｂに示す
ようにゲートをチアゾールオレンジおよびＬＤＳ−７５
１に設定した。白血球の分画は有核細胞の散乱光特性と
ＣＤ４５による蛍光強度との相間々係によって得られた
く第２図Ａを参照されたい）、リンパ球（△）は最も明
るいＣＤ４５抗原の発現、および最も低い直角方向散乱
光信号によって特徴付けられた。単球（■）はＣＤ４５
による結合がリンパ球よりわずかに少ないこと、および
より大きい前方および直角方向の散乱光信号を示すこと
に基づいて同定された。好中球顆粒細胞（×）はＣＤ４
５抗原をかすかに発現し、かつ散乱光信号は大きかった
。好酸球顆粒細胞（・）は単球と同程度量のＣＤ４５を
もつが、より大きい直角方向散乱光信号およびより低い
前方散乱光信号によって他の有核細胞から識別しうる。
ようにゲートをチアゾールオレンジおよびＬＤＳ−７５
１に設定した。白血球の分画は有核細胞の散乱光特性と
ＣＤ４５による蛍光強度との相間々係によって得られた
く第２図Ａを参照されたい）、リンパ球（△）は最も明
るいＣＤ４５抗原の発現、および最も低い直角方向散乱
光信号によって特徴付けられた。単球（■）はＣＤ４５
による結合がリンパ球よりわずかに少ないこと、および
より大きい前方および直角方向の散乱光信号を示すこと
に基づいて同定された。好中球顆粒細胞（×）はＣＤ４
５抗原をかすかに発現し、かつ散乱光信号は大きかった
。好酸球顆粒細胞（・）は単球と同程度量のＣＤ４５を
もつが、より大きい直角方向散乱光信号およびより低い
前方散乱光信号によって他の有核細胞から識別しうる。
の
血液で用いた三次元分析を骨髄の量的分析にも応用した
。骨髄吸引物は、末梢血液のために用いたのと同様に、
ＬＤＳ−７５１，チアゾールオレンジおよびＨＬｅ−１
（ＰＥ）と共にインキュベーションした。データの獲得
は末梢血液の分析のために用いたのと同じ様に計器を設
定して行なった。
。骨髄吸引物は、末梢血液のために用いたのと同様に、
ＬＤＳ−７５１，チアゾールオレンジおよびＨＬｅ−１
（ＰＥ）と共にインキュベーションした。データの獲得
は末梢血液の分析のために用いたのと同じ様に計器を設
定して行なった。
典型的な実験例（表示および色（マーク）付は末梢血液
の分析に用いたのと同一のものを用いた）を第３区に示
した。ＲＢＣ（○）、１１状赤血球（■）、血小板（Δ
）、および有核細胞（・）は五次元空間において末梢血
液細胞対応物と同じような位置を占めたく第１図および
第３図を比較されたい）。
の分析に用いたのと同一のものを用いた）を第３区に示
した。ＲＢＣ（○）、１１状赤血球（■）、血小板（Δ
）、および有核細胞（・）は五次元空間において末梢血
液細胞対応物と同じような位置を占めたく第１図および
第３図を比較されたい）。
血液集団と骨髄集団との間には興味ある相違点が存在す
る。血小板の分析において、これらの細胞粒子を代表す
る散乱光領域は、血液サンプルの分析の場合（第１図）
と同様、第３図も（Δ）で示した。末梢血液とは対照的
に、骨髄からの血小板の大部分はＬＤＳ−７５１で染色
されなかった（第３図Ｂでは（０）と重なって（・）ド
ツトとして同定された）。それ故、これらのものは正常
な血小板として同定されなかった。この細胞集団を選別
した結果、これらの細胞集団は主に破片からなり、同定
されなかった骨髄の小韓および細胞粒子を含んでいるこ
とがわかった。
る。血小板の分析において、これらの細胞粒子を代表す
る散乱光領域は、血液サンプルの分析の場合（第１図）
と同様、第３図も（Δ）で示した。末梢血液とは対照的
に、骨髄からの血小板の大部分はＬＤＳ−７５１で染色
されなかった（第３図Ｂでは（０）と重なって（・）ド
ツトとして同定された）。それ故、これらのものは正常
な血小板として同定されなかった。この細胞集団を選別
した結果、これらの細胞集団は主に破片からなり、同定
されなかった骨髄の小韓および細胞粒子を含んでいるこ
とがわかった。
有核骨髄細胞は、チアゾールオレンジと同様にしてＬＤ
Ｓ−７５１による蛍光信号が大きいことによって同定し
た（第３図Ｂ）、第３図Ｂに示すように、ゲートをＬＤ
Ｓ−７５１およびチアゾールオレンジに設定して有核細
胞を収集した。Ｗ！、乱光特性および有核細胞に存在す
るＣＤ４５による免疫蛍光信号との相間々係を第４図に
示した。末梢血液の研究から同定したのと同様にリンパ
球、単球および顆粒球の典型的な位置をそれぞれ（Δ）
（■）および（×）で示した。
Ｓ−７５１による蛍光信号が大きいことによって同定し
た（第３図Ｂ）、第３図Ｂに示すように、ゲートをＬＤ
Ｓ−７５１およびチアゾールオレンジに設定して有核細
胞を収集した。Ｗ！、乱光特性および有核細胞に存在す
るＣＤ４５による免疫蛍光信号との相間々係を第４図に
示した。末梢血液の研究から同定したのと同様にリンパ
球、単球および顆粒球の典型的な位置をそれぞれ（Δ）
（■）および（×）で示した。
三種項の異なる骨髄吸引液について、直角方向散乱光お
よびＣＤ４５の発現によって選別された有核細胞の数を
形Ｒ学的相違に基づいて計測した。
よびＣＤ４５の発現によって選別された有核細胞の数を
形Ｒ学的相違に基づいて計測した。
選別した領域は第４図Ｂに異なるマークで示した領域で
ある。結果は第１表に示し、その値は三種預の実験から
得られた有核細胞の百分率の平均として示した。
ある。結果は第１表に示し、その値は三種預の実験から
得られた有核細胞の百分率の平均として示した。
第」」！
直角方向散乱光およびＣＤ４５発現によって分類したヒ
トの正常な骨髄の有核細胞の形態学側計数ゝ（△）９８
１ ０ １０（■）５７９１６
００ （Ｘ） ０ ７ ９１
２ ０（ロ）０００１０００ （区） ５６寡 ３’ ３０
” ３８ ８マークは第４［
２１Ｂに例示した領域を表わす、データは有核細胞の百
分率で示す。
トの正常な骨髄の有核細胞の形態学側計数ゝ（△）９８
１ ０ １０（■）５７９１６
００ （Ｘ） ０ ７ ９１
２ ０（ロ）０００１０００ （区） ５６寡 ３’ ３０
” ３８ ８マークは第４［
２１Ｂに例示した領域を表わす、データは有核細胞の百
分率で示す。
一一３．′芽球
選択した集団の光学項微鏡試験を行なうことによって５
これらの細胞の系統分類が確認されたが、（Δ）、（■
）および（×）の領域内の細胞のすべてが成熟型という
わけではなかった。〈×）で示した集団内には、成熟型
好中球に加えて、杆状球（ｂｉｎｄ）および後骨髄球も
見い出された。（Δ）で示した細胞（リンパ球）のおよ
そ５％がリンパ芽球であり、（■）で示した細胞（単球
）の２０％が未成熟型のモノミニロイド細胞であった。
これらの細胞の系統分類が確認されたが、（Δ）、（■
）および（×）の領域内の細胞のすべてが成熟型という
わけではなかった。〈×）で示した集団内には、成熟型
好中球に加えて、杆状球（ｂｉｎｄ）および後骨髄球も
見い出された。（Δ）で示した細胞（リンパ球）のおよ
そ５％がリンパ芽球であり、（■）で示した細胞（単球
）の２０％が未成熟型のモノミニロイド細胞であった。
末梢血液とは対照的に、低い直角方向散乱光信号および
かすかに発現したＣＤ４５抗原をもつ二つの集団が骨髄
細胞から同定され、これらの細胞集団は第４図Ｂでそれ
ぞれ（ロ）および（区）で示した。この図から、（区）
で示した細胞集団と他のマークで示した集団との間は明
確に分かれていないことが明白である。Ｍも低レベルの
ＣＤ４５抗原を発現している細胞集団（ロ）の光学顕ｍ
鏡試験は、その集団が正常芽細胞および赤芽球のみから
なることを示した（第１表）、わずかに高い量のＣＤ４
５抗原を発現する集団（区）はモノミニロイドおよびリ
ンパ球前駆体を含む最も未成熟な細胞ならびに少数の赤
芽球を含んでいた。
かすかに発現したＣＤ４５抗原をもつ二つの集団が骨髄
細胞から同定され、これらの細胞集団は第４図Ｂでそれ
ぞれ（ロ）および（区）で示した。この図から、（区）
で示した細胞集団と他のマークで示した集団との間は明
確に分かれていないことが明白である。Ｍも低レベルの
ＣＤ４５抗原を発現している細胞集団（ロ）の光学顕ｍ
鏡試験は、その集団が正常芽細胞および赤芽球のみから
なることを示した（第１表）、わずかに高い量のＣＤ４
５抗原を発現する集団（区）はモノミニロイドおよびリ
ンパ球前駆体を含む最も未成熟な細胞ならびに少数の赤
芽球を含んでいた。
本発明の技術の有用性はＢ−ＣＬＬ患者から得た血液の
分析においても証明された。ＲＡＩＢ−ＣＬＬの第４期
の患者を選んだ理由は、細胞数の異常がすべての血液細
胞系統に見い出されることによる。リンパ球数が１０〜
１００倍に増加するため、残りの正常な白血球および網
状赤血球からリンパ球細胞を区別することはより困難に
なる。さらにこれらの患者では血小板の数が少ないため
、血小板の計数の信頼性がより低くなる。
分析においても証明された。ＲＡＩＢ−ＣＬＬの第４期
の患者を選んだ理由は、細胞数の異常がすべての血液細
胞系統に見い出されることによる。リンパ球数が１０〜
１００倍に増加するため、残りの正常な白血球および網
状赤血球からリンパ球細胞を区別することはより困難に
なる。さらにこれらの患者では血小板の数が少ないため
、血小板の計数の信頼性がより低くなる。
Ｂ−ＣＬＬ患者から得た血液は正常な血液について行な
ったのと同様に、ＬＤＳ−７５１、チアゾールオレンジ
およびＨＬｅ−１（ＰＥ）と共にインキュベーションし
た。データは正常末梢血液（第１図）および骨髄（第３
図）について選択したのと同じ方法で表示した＋ＲＢＣ
は（○）で示し；網状赤血球は（■）で示し、血小板は
くΔ）、および有核細胞は（・）で示した（第５図Ａ、
Ｂ、ＣおよびＤ）。
ったのと同様に、ＬＤＳ−７５１、チアゾールオレンジ
およびＨＬｅ−１（ＰＥ）と共にインキュベーションし
た。データは正常末梢血液（第１図）および骨髄（第３
図）について選択したのと同じ方法で表示した＋ＲＢＣ
は（○）で示し；網状赤血球は（■）で示し、血小板は
くΔ）、および有核細胞は（・）で示した（第５図Ａ、
Ｂ、ＣおよびＤ）。
血小板を代表する散乱光領域に存在する細胞頻度は正常
な末梢血液と比較して低い（第１図Ａ、Ｂおよび第５図
Ａ、Ｂの（Δ）マークを比較されたい）。
な末梢血液と比較して低い（第１図Ａ、Ｂおよび第５図
Ａ、Ｂの（Δ）マークを比較されたい）。
第５図Ａ（△）において散乱光から血小板と同定された
ドツトのうちの数個のみが第５図Ｂにおいて血小板を代
表するＬＤＳ−７５１による蛍光強度を示し、正常な血
小板であると考えうる。１２Ｉ状赤血球（■）から血小
板を識別することにはすぐれている（第５図Ｂ）。
ドツトのうちの数個のみが第５図Ｂにおいて血小板を代
表するＬＤＳ−７５１による蛍光強度を示し、正常な血
小板であると考えうる。１２Ｉ状赤血球（■）から血小
板を識別することにはすぐれている（第５図Ｂ）。
有核細胞（・）頻度の著しい増加のため、ＬＤＳ−７５
１およびチアゾールオレンジから得られる白血球と網状
赤血球（０）との分離は余り明確ではない、しかしなが
ら、白血球はＣＤ４５抗原の発現量に基づいて網状赤血
球とは明確に分離されうる（第５図ＣおよびＤ）。
１およびチアゾールオレンジから得られる白血球と網状
赤血球（０）との分離は余り明確ではない、しかしなが
ら、白血球はＣＤ４５抗原の発現量に基づいて網状赤血
球とは明確に分離されうる（第５図ＣおよびＤ）。
有核細胞の散乱光特性およびＣＤ４５抗原の発現（第５
図Ｂにおけるゲート設定）を第６図ＡおよびＢに示す。
図Ｂにおけるゲート設定）を第６図ＡおよびＢに示す。
細胞の大部分はＣＤ４５抗原をかすかに発現しており、
未成熟型リンパ球の特徴である低い前方および直角方向
の散乱光信号（区）を示した。少数の白血球のみが正常
なリンパ球くΔ）。
未成熟型リンパ球の特徴である低い前方および直角方向
の散乱光信号（区）を示した。少数の白血球のみが正常
なリンパ球くΔ）。
顆粒球（×）および単球（Ｏ）として検出されたがその
分離は圧倒的多数の未成熟型リンパ球が存在するために
明確ではなかった。ＣＤ４５抗原を発現せず、かつ低い
直角方向散乱光信号をもつ少数の細胞（ロ）に注目され
たい（第６図Ｂを参照されたい）、これらの細胞は、こ
の患者における網状赤血球の著しい増加を裏付ける、有
核の赤芽球であると同定された。
分離は圧倒的多数の未成熟型リンパ球が存在するために
明確ではなかった。ＣＤ４５抗原を発現せず、かつ低い
直角方向散乱光信号をもつ少数の細胞（ロ）に注目され
たい（第６図Ｂを参照されたい）、これらの細胞は、こ
の患者における網状赤血球の著しい増加を裏付ける、有
核の赤芽球であると同定された。
■、 ての
時として、骨髄吸引液を採取中に血液がサンプルへの混
入物質として吸引液内に持込まれる。このため、血液混
入物質についての補正を行なわずにサンプルを分析する
と、白血球の分画に誤りが生ずる。
入物質として吸引液内に持込まれる。このため、血液混
入物質についての補正を行なわずにサンプルを分析する
と、白血球の分画に誤りが生ずる。
前記実施例Ｉの方法に従って血液サンプルを分析すると
、血液内に存在する白血球細胞の百分率が計算されるで
あろう、−度、骨髄サンプルを実施例■に記載の方法に
従って分析した後血液サンプルに存在する白血球細胞の
予想百分率を骨髄サンプルから減すると血液混入物質の
影響を除去したより正確な値が得られるであろう（事実
上混入物質のすべてが血液に起源を有するものと仮定し
た）。
、血液内に存在する白血球細胞の百分率が計算されるで
あろう、−度、骨髄サンプルを実施例■に記載の方法に
従って分析した後血液サンプルに存在する白血球細胞の
予想百分率を骨髄サンプルから減すると血液混入物質の
影響を除去したより正確な値が得られるであろう（事実
上混入物質のすべてが血液に起源を有するものと仮定し
た）。
例えばリンパ球、顆粒球および単球は血液サンプルの全
細胞のそれぞれ１．０．１．０および０．２＄からなり
、残り９７．８＄の細胞は本質的にＲＢＣである。
細胞のそれぞれ１．０．１．０および０．２＄からなり
、残り９７．８＄の細胞は本質的にＲＢＣである。
結果として、血液サンプルには１００のＲＢＣ当りおよ
そ１のリンパ球および顆粒球ならびに０．２の単球が存
在することになる。骨髄サンプルに存在するリンパ球、
顆粒球および単球の絶対数は２０．０００個の細胞サン
プル中にそれぞれ８００，４９０および１６５個であり
、残りの細胞は本質的にＲＢＣ（叩ち、１８，５４５１
［１）である、従って、例示のみの目的のために、骨髄
サンプルに混入すると予想されるリンパ球、顆粒球およ
び単球の数は１８５個のリンパ球（即ち１＄ｘ １８，
５４５）、１８５個の顆粒球（即ち、１ｚＸ１８，５４
５）ｔ−５Ｊ：び３７（Ｉ！ｇの単球（即ち０．２１Ｘ
１８，５４５）であろう、それ故、訂正した数は６１５
個のリンパ球、３０５個の顆粒球および１２８個の単球
であろう、このような方法を用いることによって、より
正確な細胞数が得られるであろう。
そ１のリンパ球および顆粒球ならびに０．２の単球が存
在することになる。骨髄サンプルに存在するリンパ球、
顆粒球および単球の絶対数は２０．０００個の細胞サン
プル中にそれぞれ８００，４９０および１６５個であり
、残りの細胞は本質的にＲＢＣ（叩ち、１８，５４５１
［１）である、従って、例示のみの目的のために、骨髄
サンプルに混入すると予想されるリンパ球、顆粒球およ
び単球の数は１８５個のリンパ球（即ち１＄ｘ １８，
５４５）、１８５個の顆粒球（即ち、１ｚＸ１８，５４
５）ｔ−５Ｊ：び３７（Ｉ！ｇの単球（即ち０．２１Ｘ
１８，５４５）であろう、それ故、訂正した数は６１５
個のリンパ球、３０５個の顆粒球および１２８個の単球
であろう、このような方法を用いることによって、より
正確な細胞数が得られるであろう。
本明細書に列挙したすべての文献および特許出願は本発
明に関係する当業者の技術水準で表示されている。それ
ぞれ個々の文献あるいは特許出願を特別かつ個別的に参
照として合体させる必要があるのと同程度に、すべての
文献および特許出願を参照としてこ）に自体させる。
明に関係する当業者の技術水準で表示されている。それ
ぞれ個々の文献あるいは特許出願を特別かつ個別的に参
照として合体させる必要があるのと同程度に、すべての
文献および特許出願を参照としてこ）に自体させる。
普通の技術の熟練者にとって、多くの変更および修正が
特許請求の範囲の精神および観点から離れることなく本
発明内で実行しうろことは明らかであろう。
特許請求の範囲の精神および観点から離れることなく本
発明内で実行しうろことは明らかであろう。
第１図Ａ〜Ｄは、五種預のパラメーターのさまざまな組
み会わせによって分析した正常な末梢血液細胞のドツト
プロットである。 第２図ＡおよびＢは、正常末梢血液の有核細胞のドツト
プロットである。 第３図Ａ〜Ｄは、五種所のパラメーターのさまざまな組
み合わせによって分析した正常な骨髄吸引［ｉ胞のドツ
トプロットである。 第４図ＡおよびＢは、正常骨髄吸引液の有核細胞につい
てのみ行なったドツトプロットである。 第５図Ａ〜Ｄは、血小板減少症Ｂ−ＣＬＬ患者から得ら
れた末梢血液細胞のドツトプロットであ第６図Ａ〜Ｂは
、第５図中の有核細胞についてのみ行なったドツトプロ
ットである。 （外４名） 黍！（２１ 弄７２ 舵方敵占り光 ＣＤ４５（ＰＥン 前；方敢白−元 〕 ＣＤ４５（ＰＥン 尾３２ Ａ 千アソ１−ルスレンゾ ＣＤ４５（ＰＥ） Ｌ５図 宿４ 図 覇２５敞乱光 ＣＤ４５ （ＰＥ ） 丞乙図 ばｉ＋７５￥Ｊｌ犬 ＣＤ４５ （ＰＥ）
み会わせによって分析した正常な末梢血液細胞のドツト
プロットである。 第２図ＡおよびＢは、正常末梢血液の有核細胞のドツト
プロットである。 第３図Ａ〜Ｄは、五種所のパラメーターのさまざまな組
み合わせによって分析した正常な骨髄吸引［ｉ胞のドツ
トプロットである。 第４図ＡおよびＢは、正常骨髄吸引液の有核細胞につい
てのみ行なったドツトプロットである。 第５図Ａ〜Ｄは、血小板減少症Ｂ−ＣＬＬ患者から得ら
れた末梢血液細胞のドツトプロットであ第６図Ａ〜Ｂは
、第５図中の有核細胞についてのみ行なったドツトプロ
ットである。 （外４名） 黍！（２１ 弄７２ 舵方敵占り光 ＣＤ４５（ＰＥン 前；方敢白−元 〕 ＣＤ４５（ＰＥン 尾３２ Ａ 千アソ１−ルスレンゾ ＣＤ４５（ＰＥ） Ｌ５図 宿４ 図 覇２５敞乱光 ＣＤ４５ （ＰＥ ） 丞乙図 ばｉ＋７５￥Ｊｌ犬 ＣＤ４５ （ＰＥ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、体液中の細胞を多数のパラメーターで分析する方法
であつて； １）流体サンプルを個体から採取する段階；２）二種類
の蛍光核酸染料を前記サンプルに添加して個々の細胞内
のＤＮＡおよびＲＮＡを差別的に標識する段階であり、
それぞれの染料がその他のものと異なる蛍光放出（エミ
ッション）スペクトルピークをもつ前記の添加段階； ３）蛍光標識した細胞表面マーカーを前記サンプルに加
える段階であり、前記マーカーが前記流体サンプル内の
前記細胞表面に別様に発現する抗原を認識し、かつ前記
蛍光標識が前記蛍光染料とは異なる放出スペクトルピー
クをもつ、前記の段階； ４）前記サンプル中の個々の細胞についての三チャンネ
ルの蛍光および二チャンネルの散乱光を検出かつ記録で
きる装置で、前記サンプル中の前記細胞を分析する段階
； の各段階からなる上記の方法。 ２、体液が腹膜、脊髄あるいは脳内の流体、尿、全血ま
たは骨髄、リンパ節、肝臓あるいは脾臓の細胞懸濁液か
らなる、請求項１記載の方法。 ３、体液が全血である、請求項２記載の方法。 ４、体液が骨髄である、請求項２記載の方法。 ５、核酸染料のうちの１つがＬＤＳ−７５１である、請
求項１記載の方法。 ６、核酸染料のうちの１つがチアゾールオレンジである
、請求項１記載の方法。 ７、細胞表面マーカーが蛍光色素に結合したモノクロー
ナル抗体（ＭＡｂ）である、請求項１記載の方法。 ８、ＭＡｂがＣＤ４５ＭＡｂである、請求項７記載の方
法。 ９、ＣＤ４５ＭＡｂがＨＬｅ−１である、請求項８記載
の方法。 １０、蛍光色素がフィコエリトリン（ＰＥ）である、請
求項７記載の方法。 １１、装置がフローサイトメーターである、請求項１記
載の方法。 １２、血液サンプル内に存在する細胞を５種類のパラメ
ーターで分析する方法であって、１）血液サンプルを個
体から採取する段階；２）ＬＤＳ−７５１およびチアゾ
ールオレンジを前記サンプルに添加する段階； ３）ＨＬｅ−１（ＰＥ）を前記サンプルに添加する段階
； ４）前記サンプルを、波長４８８ｎｍに調整された単一
レーザー源を備えかつ前記サンプル内の個々の細胞につ
いてのＯＬＳおよびＦＬＳ散乱光の測定値ならびにＬＤ
Ｓ−７５１、チアゾールオレンジおよびＰＥ蛍光放出の
測定値を記録かつ保存する能力をもつフローサイトメー
ター内を通過させる段階； の各段階からなる上記の分析方法。 １３、骨髄サンプル内に存在する細胞を５種類のパラメ
ーターで分析する方法であって、１）骨髄サンプルを個
体より採取する段階；２）ＬＤＳ−７５１およびチアゾ
ールオレンジを前記サンプルに添加する段階； ３）ＨＬｅ−１（ＰＥ）を前記サンプルに添加する段階
； ４）前記サンプルを波長４８８ｎｍに調整された単一レ
ーザー源を備え且つ前記サンプル内の個々の細胞のＯＬ
ＳおよびＦＬＳ散乱光の測定値、ならびにＬＤＳ−７５
１、チアゾールオレンジおよびＰＥ蛍光放出の測定値を
記録しかつ保存する能力をもつフローサイトメーター内
を通過させる段階； の各段階からなる上記分析方法。 １４、体液サンプル内に存在する細胞の複数パラメータ
ー分析のためのキットであって；個々の細胞内のＤＮＡ
およびＲＮＡを標識するための少なくとも二種類の核酸
染料であって、その他のものと異なる蛍光放出スペクト
ルピークをもつそれぞれの核酸染料を含む第一容器；お
よび少なくとも一種類の蛍光標識した細胞表面マーカー
であり、前記マーカーが前記流体サンプル内に存在する
前記細胞に別様に発現する抗原を認識し、かつ前記蛍光
標識が前記蛍光染料とは異なる放出スペクトルピークを
もつ、上記マーカーを含む第二容器；からなる上記の分
析用キット。 １５、前記核酸染料がＬＤＳ−７５１およびチアゾール
オレンジからなる、請求項１４記載のキット。 １６、蛍光標識した細胞表面マーカーが ＨＬｅ−１（ＰＥ）からなる、請求項１４記載のキット
。 １７、骨髄サンプルへの血液の混入による白血球細胞レ
ベルの上昇を調整するために骨髄サンプルの複数パラメ
ーター分析を補正するための方法であり、 １）全血について請求項１記載の方法の各段階を行なう
段階； ２）血液中に存在する種々の白血球細胞成分の百分率を
定量する段階； ３）請求項１記載の方法の各段階を行なう段階； ４）骨髄に存在する種々の白血球細胞成分の絶対数を定
量する段階； ５）段階２）で得られた各々の百分率に骨髄サンプル中
の全細胞数を掛け、そうして得られた数を段階４）で得
られたそれぞれの細胞の絶対数からひき算する段階； の各段階からなる上記の補正方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US207099 | 1988-06-15 | ||
| US07/207,099 US5047321A (en) | 1988-06-15 | 1988-06-15 | Method for analysis of cellular components of a fluid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0273157A true JPH0273157A (ja) | 1990-03-13 |
| JPH0726954B2 JPH0726954B2 (ja) | 1995-03-29 |
Family
ID=22769201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1153564A Expired - Lifetime JPH0726954B2 (ja) | 1988-06-15 | 1989-06-15 | 流体内細胞成分の分析法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5047321A (ja) |
| EP (1) | EP0347210B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0726954B2 (ja) |
| AT (1) | ATE111227T1 (ja) |
| AU (1) | AU613197B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340170C (ja) |
| DE (1) | DE68918004T2 (ja) |
| DK (1) | DK296889A (ja) |
| ES (1) | ES2063820T3 (ja) |
| FI (1) | FI94180C (ja) |
| NO (1) | NO175506C (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04252957A (ja) * | 1990-08-07 | 1992-09-08 | Becton Dickinson & Co | 絶対カウントのための一段試験 |
| JPH0627017A (ja) * | 1992-01-22 | 1994-02-04 | Becton Dickinson & Co | 多元的細胞識別分析法 |
| JPH10319010A (ja) * | 1997-05-19 | 1998-12-04 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 白血球分類計数用試薬および分類計数方法 |
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