JPH0273157A - 流体内細胞成分の分析法 - Google Patents
流体内細胞成分の分析法Info
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Abstract
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Description
関し、より詳細には、フローサイトメトリーを用いた5
種類のパラメーター分析による血液または骨髄吸引物中
の細胞成分の識別および定量に関する。
血細胞数の計測および白血球の分画である。全血細胞数
の計測および白血球の分画には血液中のさまざまな細胞
成分を識別し、さらにその数を計測することが含まれる
。任意の1@のサンプルに見い出されるさまざまな血液
成分には赤血球(RBC)、血小板および有核細胞が含
まれる。
存在し、その中にはリンパ球[B細胞、T細胞、ナチュ
ラルキラー(N K )!胞およびそれらのさまざまな
サブセット]、単球、ならびに顆粒球(すべての成熟段
階における好中球、好酸球および好塩基球を含む)が含
まれる。細胞の型が多種類存在し、かつ任意の1種頭の
細胞型にも多岐にわたる成熟段階が存在する故、全血細
胞数の計測および白血球の分画を行なうためには正常個
体においてさえも時には困難かつ複雑な平原が必要とさ
れ、異常個体においてはより困難かつ複雑な手順が必要
とされる。このような複雑さは、骨髄サンプルの分析を
試みる場合により強請される。
当りの細胞数)および白血球の分画(即ち、標準単位容
量当りの所定の型の細胞数)は光学顕微鏡を用いて少容
量の細胞数を計測すること、さらにそうした後計測した
数に単位容量にするための係数を掛けることによって手
作業で行なわれてきた。測定したサンプル容量および細
胞の型の識別に必要とされる技術水準の両方が原因とな
って、このような方法では、得られる計測値は非常に変
化しやすく時として容認しがたい水準に達するであろう
。
細胞数の計測および白血球の分画を行なう手段が考案さ
れた。現在利用可能な装置は、開口インピーダンスによ
る電気的手段[例えばコールタ−カウンター(商(5)
(CoulLerCounter” ) 、コールタ−
(Coulter)ブロクナツト エレクトロニクス・
コンフ(Nroe、 Nat。
034(1956)に記載]または光散乱および光吸収
による光学的手段[例えば、テクニコン(T echn
1con) 、 H−600” ](商標)、ブリー
ケル(Breakall)ら、ブロードセル(B fo
od Ce1ls)、11,257(1985)に記載
]のどちらかによって細胞を検出する。このような装置
では、赤血球細胞画分を白血球から分離する必要があり
、また各々の測定は他のものとは独立して行なわれる。
個体で少なくとも1000:1)ので行なわなければな
らない、正常でない患者(例えば、白血球減少症の患者
)では、この比率は実質上高くなるだろう。
61,913号5第4,284.412号および第3.
826,364号明細書ならびにヘルゼンベルグ(He
rzenberg)ら、サイエンティフィックアメリカ
(Sci、 Am、 )翻土、108(1976)の論
文に記載されており、これは検出領域を通過する個々の
細胞の複数の独立パラメーターを検出すること(こよっ
て異成分からなるサンプル内に存在する異なる白血球集
団を同定するために使用されている0代表的には、これ
らのパラメーターには前方散乱光(F L S 。
散乱光(OL S 、これは相対的な顆粒炭(gran
ularity)の測定である)、および蛍光が含まれ
る。蛍光は核酸染色を行なった細胞より測定されるであ
ろう、または、例えば米国特許第4,520゜110号
明m1に記載されているように、蛍光色素に直接または
間接的に結きしたモノクローナル抗体(M A b>で
標識された表面抗原をもつ細胞から測定されるであろう
、フローサイトメーター内の別々のチャンネルによって
いるいろな細胞の各々の測定値が感知され記録される。
ことによって、いろいろな白血球成分が識別されるであ
ろう。
ターを血液から白血球の各分画を得るための手段として
用いる方法についての一例を提供している。しかしなが
ら、この方法は白血球の分画、しがち血液から得られた
サンプルのそれのみに限られている。
、単一の血液または骨髄のサンプルを分析して血液およ
び骨髄に存在するいろいろな細胞型をすべて識別し、さ
らに計数するような単一で標準的かつ正確な装置または
方法論は現在のところ得られていない。
析する方法であり、上記体液は脊髄、腹膜あるいは脳内
の流体、尿、または全血のいづれかよりなり、さらには
生体組織検査といったようなものから得られる骨髄吸引
液、リンパ節、F!臓または肝臓の細胞からなる組織の
細胞懸濁液からなる可能性もあり:かつ上記パラメータ
ーは検査した各細胞の光散乱能の少なくとも二種類を測
定すること、および検査した各細胞から検出される蛍光
発光(エミッション)または活性の少なくとも三種類を
測定することからなる0本方法は個体から流体サンプル
を採取する段階、ならびに流体サンプルと少なくとも二
種類の色素および少なくとも一種類の細胞表面マーカー
と混合させる段階からなり、上記色素はそれぞれ別々に
サンプル内の細胞の異った特徴を評価し、かつ上記マー
カーは異なる系統の細胞に別様に発現する抗原を認識し
、標識した溶液を形成する。それぞれの色素および標識
は蛍光を発し、かつ互いに識別可能な放出スペクトルの
ピークを持つ、さらに標識した溶液は検出器を通過させ
、その中で溶液中の各細胞は一度に実質上1個づつ試験
され、蛍光強度および散乱光の測定が試験しようとする
それぞれの細胞について行なわれた。それぞれの細胞に
ついて調べられた測定値(またはパラメーター)は、デ
ータ貯蔵・分析システムに保存され、即時にまたは後程
、再結会され分析されるであろう、これら数種類のパラ
メーターを分析することによって、血液および骨髄のサ
ンプルを構成する細胞の型および系統が識別され同定さ
れるであろう。
する段階;流体サンプルをRNA染料DNA染料のよう
な核酸染色用染料、および異なる系統の細胞に別様に発
現する細胞表面抗原を認識する標識したモノクローナル
抗体(M A b)と混合し標識溶液を形成させる段階
:標識溶液がフローサイトメーターを通過する段階;蛍
光強度OLSおよびFLSを測定する段階;ならびに分
析のために記録されたデータを貯蔵する段階からなる。
同一波長で励起され、かつ互いに識別可能な放出(エミ
ッション)スペクトルのピークを持つ。
ーのキットもまた、本発明の範囲に含まれる。
て分析する方法であって;前記体液は脊髄、腹膜あるい
は脳内の流体、尿、または全血のいづれかよりなり、さ
らには生体組織検査といったようなものから得られる骨
髄吸引液5肝臓、脾臓あるいはリンパ節から調製した組
織の細胞懸濁液をも含む可能性があり:前記パラメータ
ーは試験する各々の細胞からの散乱光を一以上の方向に
おいて少なくとも二種項測定することおよび試験する各
々の細胞の蛍光活性を少なくとも三種類測定することか
らなる0本方法は、個体から体液サンプルを採取する段
階、ならびに体液サンプルを少なくとも三種類の染料お
よび少なくとも一種類の標識した細胞表面マーカーと混
合させる段階からなり、前記染料のそれぞれはサンプル
内に存在する細胞の異なる特徴を別々に評価し、かつ前
記マーカーは異なる系統の細胞に別様に発現する抗原を
認識して標識溶液を形成する。各々の染料および標識は
蛍光を発し、かつ互いに識別可能な放出スペクトルのピ
ークを持つ、さらに標識した溶液は検出器を通過させ、
その内で溶液中の各々の細胞は一度に実質的にINづつ
試験され、蛍光強度および散乱光の測定が試験しようと
する個々の細胞について行なわれる0個々の細胞につい
て調べられた測定値(またはパラメーター)はデータ保
存手段に保存され、即時にまたは後程再結合され再分析
されるであろう。
ラメーターで分析することによって識別し同定すること
を可能にするであろう、望ましくは1本発明の方法は、
1) 個体から得られた体液サンプルに含まれる細胞を
分離する段階であり、還択的には、体液が全血または骨
髄吸引液のいづれかよりなる上記の分離段階; 2)二
種類の核酸蛍光染料を前記サンプルに添加してそれぞれ
の細胞内のDNAおよびRNAを差別的に標識する段階
であり、それぞれの染料が互いに異なる蛍光放出スペク
トルのピークを持つ上記の蛍光核酸染料添加段階; 3
)蛍光凛諸した細胞表面マーカーを前記サンプルに加え
る段階であり、前記マーカーが前記液体中の前記細胞に
別様に発現する抗原を認識し、かつ前記蛍光免疫標識が
前記蛍光染料とは異なる放出スペクトルのピークを持つ
前記の段1@; 4)前記サンプル内に存在する前記
細胞を、放出スペクトルのピークまたはその寸近での個
々の細胞の蛍光ならびに個々の細胞のOLSおよびFL
Sの両方を検出しかつ記録する能力を持つ自動装置で分
析する段階;からなる。
商5BDIS)のようなフローサイトメーターを含む、
好適には、フローサイトメーターは前記蛍光5本細胞を
励起するためにアルゴンイオンレーザ−のような単一の
レーザーを備えており、その波長は488nmまたはそ
の11近である。それ故、蛍光核酸染料および蛍光標識
は488nmで励起され得なければならない、好適には
、LDS−751[エキシトン(E xciLon)]
がDNA染料として使用され、チアゾールオレンジ(T
biazole −Orange)(BDIS)がR
NA染料として使用される。
を持ち、チアゾールオレンジは530nnに放出スペク
トルのピークをもつ0本発明の実施にあたって適切な池
の蛍光核酸色素には、米I]持許第4,544゜546
号明細書に記載の色素が含まれる。
ーを備えている場合には蛍光染料および/または蛍光標
識が異なる波長で励起されることを理解するであろう、
そのような実施態様において必要とされるのは、唯一、
染料および免疫蛍光標識のすべての放出スペクトルのピ
ークが異なることのみである。ヘリウム/ネオンおよび
アルゴンイオンレーザ−(波長はそれぞれ633naお
よび488nmである)を備えたフローサイトメーター
にはFASStar Plus” (商f5[)(B
DTS)が含まれる。
血細胞の表面に別様に発現する細胞表面抗原に運択的に
付着するモノクローナル抗体である。抗原は有核細胞の
いろいろな型および成熟段階で発現量が異なることが望
ましい、そのような抗原の一つにCD45がある。CD
45抗原はおよそ180〜2ZOKDの分子量を持ち、
すべてのリンパ球、単球および顆粒球に異なるレベルで
発現するが、成熟した血小板またはRBCには存在しな
い、CD45抗原と特異的に反応するモノクローナル抗
体(即ちCD45 MAb)にはHLe−1(または
抗日血球とも呼ばれる、BDIS)およびL CA (
D ako Corp)が含まれる。好適にはHLe−
1が用いられる。
接付加する。直接的な方法では、MAbは当業者に既知
の手段によって蛍光標識に直接結合させる。米国特許第
4,520,110号明細書は蛍光標識をMAbに結合
させるための一つの方法を提供している。
(PE)のようなフィコビリ蛋白質であり、この色素は
488nmで励起され、575n+*に放出ピークをも
つ、HLe−1およびPEの複合物は一般的にHLe−
1(PE)と呼ばれる。
あろう、蛍光色素としての必要条件は、アルゴンレーザ
ーが使用される場合には488nm、または二種類のレ
ーザー源を用いる場合には488nm以外のある波長(
例えば、He/Neレーザーでは633nm)で蛍光色
素が励起されること、および蛍光色素が核酸染料と重複
しない放出スペクトルピークをもつことのみである。
したデータを記録分析する手段と連結させることが望ま
しい、データを記録分析する手段には適切なソフトウェ
アを備えたパーソナルコンピューターが含まれるであろ
う、ソフトウェアは各細胞それぞれについて少なくとも
二種類のパラメーターを分析する能力、五次元空間で類
似した細胞集団分識別または同定する能力、および二次
元に少なくとも二種類のパラメーターを表示する能力を
もたねばならない、さらに、ソフトウェアは一種票以上
のパラメーターのゲートを設定し、かつ他のパラメータ
ーと組み合わせて二次元に表示する能力をもたねばなら
ない。
″(商標)ソフトウェア(BDIS)をコンソルト(C
onsort) 30デ一タ保存分析システム(BDI
S)に連結させて用いる。ソフトウェアは米国特許第0
46,619号明細書(1987年5月7日出Ni)に
そのすべてが記載されており、本願と同様に、本発明の
譲受人に譲渡されている。
細胞の複数のパラメーター分析のためのキットをも含む
。このキットは各々の細胞のDNAおよびRNAを標識
するための核酸染料であって、他のものから識別可能な
放出スペクトルピークをもつ染料を少なくとも二種類収
納する第一容器、および蛍光標識した細胞表面マーカー
であって、サンプルに含まれる異種細胞において別様に
発現するオJ胞表面抗原と特異的に反応する細胞表面マ
ーカーを蛍光5識した上記物質を収納する第二容器から
なる。染料はDNAおよびRNAを差別的に標識する核
酸染料が望ましい。好適な実施り様において、核酸染料
はLDS−751およびチアゾールオレンジであり、か
つ蛍光標識した細胞表面マーカーはHLe−1(PE)
である。
は細胞表面マーカーの組み合わせ以外の組み合わせもキ
ットに含みうることを理解するであろう。同様に、核酸
染料および/または細胞表面マーカーを容器内に分けて
入れることも理解されるであろう。
るLDS−751およびチアゾールオレンジならびにH
Le−1(PE)のようなCD45MAbre議した体
液サンプルより得られたおよそ22,000個の細胞を
含むドツトプロントを示している。標識した細胞は波長
488nmの単一アルゴンレーザーを装備したF A
CS can”7nmサイトメーター[ベクトン ディ
キンソン イムノサイトメトリーシステムズ(Bect
on D 1ckins。
s)(またはBDIS)]で分析し、OLCおよびFL
Sならびに蛍光強度の測定を各々の細胞について行なっ
た。デジタル化しりストモードに保存した二種類のパラ
メーターのデータの獲得はコンソルト(Consort
) 30コンピユーター(BDIS)を用いて行なった
。データの分析およびプリントアウトはPa1nt−A
−Gate” (商標)ソフトウェア(BDIS)を用
いて行なった。
せによって分析した正常な末梢血液サンプルから得られ
た細胞のいろいろなドツトプロットからなり、図中、(
○)で示した細胞は赤血球7(・)で示した細胞は白血
球、(■)で示した細胞は網状赤血球、(△)で示した
粒子は血小板である。
アゾールオレンジ蛍光(第LIMB)にゲートが設定さ
れた、血液サンプル内に存在する有核細胞のみについて
行なったいろいろなドツトプロットからなり、図中、(
△)で示した細胞はリンパ球、(■)で示した細胞は単
球、(×)で示した細胞は好中球、(拳)で示した細胞
は好酸球である。
によって分析した正常な骨髄吸引液から得られた細胞の
さまざまなドツトプロットからなり、図中、細胞の型は
第1図と同様のマークで示した。
びチアゾールオレンジ蛍光にゲートが設定された、骨髄
サンプル内に存在する有核細胞についてのみ行なったさ
まざまなドツトプロットからなり、図中、細胞の型は第
2図と同様のマークで示し、さらに有核の赤芽球は(ロ
)、未成熟白血球(芽球〉はく区)で示した。
せによって分析した血小板減少症BCLL、徴者から得
られた末梢血液細胞のさまざまなドツトプロットであり
、図中、細胞は第1図と同様のマークで示した。
チアゾールオレンジ蛍光にゲートが設定された、血液サ
ンプル中に存在する有核細胞についてのみ行なったさま
ざまなドツトプロット分析からなり、図中、細胞は第4
図と同様のマークで示した。
D T A (K 3)を抗凝血物質として含んだバ
クテナー チューブ(Vactainre tube
)[ベクトン ディキンソン(B eeton D
1ckinson)]に集めた。血液はまたB細胞慢性
リンパ性白血病(B−CLL)の第■期の患者からもR
AIに従って集めた。血液細胞の計数は自動血液細胞ア
ナライザー[Hl、テクニコン(Teehnieon)
]によって行なった(RB C3,3x10”/m1;
リンパ球81.9×10’7ml ;および血小板は手
操作で35x 10’/dと計数の後、20×10’/
mlと訂正された)、骨髄吸引液は正常なボランティア
より得た。4Aめな吸引液をバクテナチューブに移し、
RPM I 1640(G I BCO)を加えて1:
1に希釈した。
いた。サンプルは10μβのLDS751溶液(0,1
+*y15+*NPBS) 、10 μmチアゾールオ
レンジ溶液(0,1my/1st’PBS) 、および
10tzNHLe1(PE)と共に30分間インキュベ
ーションした。サンプルは測定前に1論!リンU綬祈生
理食塩溶液(PBS)で希釈した。
にはいるPE放出(エミッション)(5%削減)、PE
チャンネルにはいるLDS751(11%削減)、チア
ゾールオレンジチャンネルにはいるPE(23%削減)
、およびPE経路にはいるチアゾールオレンジ(0,4
$削減)を補償した。チアゾールオレンジとLDS−7
51チヤンネルとの間の補正は必要でなかった。
ーザ−を備えたF A CS can”フローサイトメ
ーターで行なった。デジタル化し、リストモードに保存
した三種類のパラメーターのデータの獲得は、コンソル
ト(Consort) 30 ”コンピューターを用い
F A CS can” 研究用ソフトウェアで行な
った。各々のサンプルについて22.000個の細胞を
分析した。有核細胞を識別するために、データの獲得は
LDS−751およびチアゾールオレンジの蛍光強度に
ゲートを設定して行なった。データの分析は多数のパラ
メーターデータを目に見えるようにするP aint
−A −Gate””ソフトウェアプログラムを用いて
行なった。
を理解するであろう、最初に体液サンプルを分割し、こ
の分割サンプルのうちの1個以上を上述のように希釈し
、もう1個は希釈せずにおくかまたはより少ない希釈倍
率で希釈する0次いで上記の方法を行なった後、1個の
分割サンプルを用い、有核細胞にゲートを設定するがそ
の数は計測せずにRBC,血小板および網状赤血球を同
定し識別した。また、上記の方法を行なった後、無・核
細胞にゲートを設定するがその数は計測せずに有核細胞
を同定しかつ識別した。サンプルを分割して有核細胞を
より少ない希釈倍率で希釈して試験すると、サンプル内
の比較的少ない有核細胞がより早く計測できるであろう
。
ゴンレーザーを用いた三種類の蛍光信号および三種類の
散乱光信号を検出するために調整されたFAC3440
”で行なった。細胞は10%ウシ胎児血清(Fe2)を
含trRPM11640内に介意した0分類した細胞は
5分間200Gで遠心分層し、再び105’ざFC3含
有のRPMI100μrに懸濁した0票微鏡用スライド
調製物はシャントン サイトセントリフユージ(S h
anclonCytoeentrifuge)[サザン
プロダクト(S outhern P rodue
t L td) 、英国]を用いて作製した。スライ
ドはライト スティン(WriFihtS tain)
で染色し、光学顕微鏡で調べた。網状赤血球を同定する
ためには、100μlの1%ニューメチレンブルー溶液
を再懸濁した分類細胞に加えた。細胞はス、ライド上に
移し、お−いをかぶせ、光学顕微鏡で調べた。
5色を多次元空間のドントのクラスターの同定に利用す
るコンピュータープログラムで行なった。二種類のパラ
メーターのうちの異なる組み合わせが一度に画面に表示
された。パラメーターの1つの組み合わせによって同定
された細胞クラスターを色付けして、さらにデータの他
の投影も同時に現わした。
小な血小板(1〜4μ+*)、赤血球(6〜8μ蹟)お
よびより大きい白血球(60〜20μm)が存在する結
果として得られた。全範囲の散乱光信号を評価するため
に、前方および直角方向散乱光信号は104対数増幅器
を用いて検知した。このような条件下では二種類の主要
細胞集団が全血内に同定された。第1図Aを参照された
い、細胞集団とさらに繁別するためにはさらなるパラメ
ーターが必要である。
い親和性または選択性をもち、結合すると蛍光が強くな
る。結合染料の放出(エミッション)ピークは530n
++である。これに対して、LDS−751はRNAと
比較してDNAにより高い親和性または選択性をもつ、
この染料ら結合すると蛍光が強くなるが、その最大放出
ピークは670nmである。血小板は核をもたないこと
が認められているにもか−わらず、LDS−751はそ
のような細胞をも選択的に染色する。従って、LDS−
751以外の染料もまた血小板および他の有核細胞と選
択的に結合して血小板を無核のRBCがら識別するであ
ろうと予想される。
は、RNAおよびDNAを両方共もたない赤血球と、両
方の核酸をもつ有核の白血球とを大別する。第1図Bに
示すように、赤血球および白血球((・)、右上方角)
が分離され、それらの蛍光信号ははf3桁の大きさで異
なる。これらの染料間の重大な干渉は、有核細胞には認
めらなかった。
網状赤血球および血小板の間の識別にも用いうるが、血
小板および網状赤血球の両方において、これらの染料間
の相互作用が認められた。
えた。LDS−751をチアゾールオレンジより先にま
たは一緒に加えると、チアゾールオレンジによる血小板
の染色が阻害された。血小板はチアゾールオレンジを単
独に加えた場合、またはLDS−751の添加に先立っ
て加えた場合にのみ、チアゾールオレンジで染色された
。ll1I状赤血球では、チアゾールオレンジによる蛍
光強度がLDS−751存在下でわずかに小さくなった
。
てサンプルをインキュベーションすることによって、血
小板と網状赤血球との間には最も効果的な分離が認めら
れ、同時に、赤血球とこれら二種類の集団との間にも良
好な分離が保たれた。
ペクトルの分陰は、PE複合MAbの結合状態の同時評
価を可能にする。CD45が遷ばれた理由は、この抗体
によって認識される抗原が異なる系統の細胞では異なる
密度で発生することが明らかにされているためである。
せは、以下の項に記載するように有核細胞の広範な分画
分析を可能にする。
HLe−1(PE)と共にインキュベージョンした。血
液調製物は測定前にPBSで1=100に希釈した。
て記載した。関連する細胞並集団の同一性は、選別した
細胞の閉微鏡試験によって確かめられた0選別細胞画分
の純度は9096以上であり、主な混入細胞は赤血球で
あった。そのような閾値を設定した結果として白血球集
団を選別する間に、赤血球は非常にしばしばゲートを設
定したその細胞集団と件にfIJ向する傾向がある。
なる。RBCは、前方および直角方向の散乱光信号が相
対的に大きいこと(第1図A、(0))I、DS−75
1およびチアゾールオレンジによる蛍光3発しないこと
く第1図B)、ならびに抗CD45と結合しないこと(
第1図C,D)から同定した。
ンジとの反応性に基づいて成熟型赤血球から識別された
(第1図B)、#!I状赤血球は赤血球に比べてLDS
−751による蛍光強度もわずかに強い、RBCおよび
網状赤血球は両方共、CD45によって認諾される表面
抗原を発現しない(第1図CおよびD)、網状赤血球を
その散乱光特徴に基づいて白血球およびRBCから識別
することはできない(第1図A)。
後はど骨髄の分析の項で議論する。
こと(第1図A、(△))に加えて、LDS751によ
る染色が比較的少ないこと(第1図B)によって特徴付
けられる。血小板はこれら三¥1′Mのパラメーターを
用いることによってRBC(0)、網状赤血球(■)、
白血球(・)から明確に分離されたく第1図B〉、赤血
球細胞と同様に、血小板はCD45によって認識される
抗原を発現しなかった(第1図CおよびD)、多数のパ
ラメーター分析を用いることによって、“正常な”血小
板は散乱光信号が比較的低く、LDS−751による蛍
光強度がRBCのそれより大きく、チアゾールオレンジ
との反応性を示さず、且つCD45結合物の存在しない
粒子として特徴付けられた。
ことによって特徴付けられたく第1図A(・))、白血
球と赤血球系細胞の散乱光の特徴はよく似ているが、白
血球はLDS−751およびチアゾールオレンジの両方
から生じる蛍光信号がより大きいこと(第1図B)によ
って赤血球系細胞(0)から明確に分離された。このよ
うな分離によってRBCが圧倒的に多数存在する中で白
血球の数を正確に測定する手段が提供された。白血球と
血小板、RBCおよび網状赤血球とのさらなる区別はC
D45との反応性によって得られた(第1図CおよびD
)。
ようにゲートをチアゾールオレンジおよびLDS−75
1に設定した。白血球の分画は有核細胞の散乱光特性と
CD45による蛍光強度との相間々係によって得られた
く第2図Aを参照されたい)、リンパ球(△)は最も明
るいCD45抗原の発現、および最も低い直角方向散乱
光信号によって特徴付けられた。単球(■)はCD45
による結合がリンパ球よりわずかに少ないこと、および
より大きい前方および直角方向の散乱光信号を示すこと
に基づいて同定された。好中球顆粒細胞(×)はCD4
5抗原をかすかに発現し、かつ散乱光信号は大きかった
。好酸球顆粒細胞(・)は単球と同程度量のCD45を
もつが、より大きい直角方向散乱光信号およびより低い
前方散乱光信号によって他の有核細胞から識別しうる。
。骨髄吸引物は、末梢血液のために用いたのと同様に、
LDS−751,チアゾールオレンジおよびHLe−1
(PE)と共にインキュベーションした。データの獲得
は末梢血液の分析のために用いたのと同じ様に計器を設
定して行なった。
の分析に用いたのと同一のものを用いた)を第3区に示
した。RBC(○)、11状赤血球(■)、血小板(Δ
)、および有核細胞(・)は五次元空間において末梢血
液細胞対応物と同じような位置を占めたく第1図および
第3図を比較されたい)。
る。血小板の分析において、これらの細胞粒子を代表す
る散乱光領域は、血液サンプルの分析の場合(第1図)
と同様、第3図も(Δ)で示した。末梢血液とは対照的
に、骨髄からの血小板の大部分はLDS−751で染色
されなかった(第3図Bでは(0)と重なって(・)ド
ツトとして同定された)。それ故、これらのものは正常
な血小板として同定されなかった。この細胞集団を選別
した結果、これらの細胞集団は主に破片からなり、同定
されなかった骨髄の小韓および細胞粒子を含んでいるこ
とがわかった。
S−751による蛍光信号が大きいことによって同定し
た(第3図B)、第3図Bに示すように、ゲートをLD
S−751およびチアゾールオレンジに設定して有核細
胞を収集した。W!、乱光特性および有核細胞に存在す
るCD45による免疫蛍光信号との相間々係を第4図に
示した。末梢血液の研究から同定したのと同様にリンパ
球、単球および顆粒球の典型的な位置をそれぞれ(Δ)
(■)および(×)で示した。
よびCD45の発現によって選別された有核細胞の数を
形R学的相違に基づいて計測した。
ある。結果は第1表に示し、その値は三種預の実験から
得られた有核細胞の百分率の平均として示した。
トの正常な骨髄の有核細胞の形態学側計数ゝ(△)98
1 0 10(■)57916
00 (X) 0 7 91
2 0(ロ)0001000 (区) 56寡 3’ 30
” 38 8マークは第4[
21Bに例示した領域を表わす、データは有核細胞の百
分率で示す。
これらの細胞の系統分類が確認されたが、(Δ)、(■
)および(×)の領域内の細胞のすべてが成熟型という
わけではなかった。〈×)で示した集団内には、成熟型
好中球に加えて、杆状球(bind)および後骨髄球も
見い出された。(Δ)で示した細胞(リンパ球)のおよ
そ5%がリンパ芽球であり、(■)で示した細胞(単球
)の20%が未成熟型のモノミニロイド細胞であった。
かすかに発現したCD45抗原をもつ二つの集団が骨髄
細胞から同定され、これらの細胞集団は第4図Bでそれ
ぞれ(ロ)および(区)で示した。この図から、(区)
で示した細胞集団と他のマークで示した集団との間は明
確に分かれていないことが明白である。Mも低レベルの
CD45抗原を発現している細胞集団(ロ)の光学顕m
鏡試験は、その集団が正常芽細胞および赤芽球のみから
なることを示した(第1表)、わずかに高い量のCD4
5抗原を発現する集団(区)はモノミニロイドおよびリ
ンパ球前駆体を含む最も未成熟な細胞ならびに少数の赤
芽球を含んでいた。
分析においても証明された。RAIB−CLLの第4期
の患者を選んだ理由は、細胞数の異常がすべての血液細
胞系統に見い出されることによる。リンパ球数が10〜
100倍に増加するため、残りの正常な白血球および網
状赤血球からリンパ球細胞を区別することはより困難に
なる。さらにこれらの患者では血小板の数が少ないため
、血小板の計数の信頼性がより低くなる。
ったのと同様に、LDS−751、チアゾールオレンジ
およびHLe−1(PE)と共にインキュベーションし
た。データは正常末梢血液(第1図)および骨髄(第3
図)について選択したのと同じ方法で表示した+RBC
は(○)で示し;網状赤血球は(■)で示し、血小板は
くΔ)、および有核細胞は(・)で示した(第5図A、
B、CおよびD)。
な末梢血液と比較して低い(第1図A、Bおよび第5図
A、Bの(Δ)マークを比較されたい)。
ドツトのうちの数個のみが第5図Bにおいて血小板を代
表するLDS−751による蛍光強度を示し、正常な血
小板であると考えうる。12I状赤血球(■)から血小
板を識別することにはすぐれている(第5図B)。
1およびチアゾールオレンジから得られる白血球と網状
赤血球(0)との分離は余り明確ではない、しかしなが
ら、白血球はCD45抗原の発現量に基づいて網状赤血
球とは明確に分離されうる(第5図CおよびD)。
図Bにおけるゲート設定)を第6図AおよびBに示す。
未成熟型リンパ球の特徴である低い前方および直角方向
の散乱光信号(区)を示した。少数の白血球のみが正常
なリンパ球くΔ)。
分離は圧倒的多数の未成熟型リンパ球が存在するために
明確ではなかった。CD45抗原を発現せず、かつ低い
直角方向散乱光信号をもつ少数の細胞(ロ)に注目され
たい(第6図Bを参照されたい)、これらの細胞は、こ
の患者における網状赤血球の著しい増加を裏付ける、有
核の赤芽球であると同定された。
入物質として吸引液内に持込まれる。このため、血液混
入物質についての補正を行なわずにサンプルを分析する
と、白血球の分画に誤りが生ずる。
、血液内に存在する白血球細胞の百分率が計算されるで
あろう、−度、骨髄サンプルを実施例■に記載の方法に
従って分析した後血液サンプルに存在する白血球細胞の
予想百分率を骨髄サンプルから減すると血液混入物質の
影響を除去したより正確な値が得られるであろう(事実
上混入物質のすべてが血液に起源を有するものと仮定し
た)。
細胞のそれぞれ1.0.1.0および0.2$からなり
、残り97.8$の細胞は本質的にRBCである。
そ1のリンパ球および顆粒球ならびに0.2の単球が存
在することになる。骨髄サンプルに存在するリンパ球、
顆粒球および単球の絶対数は20.000個の細胞サン
プル中にそれぞれ800,490および165個であり
、残りの細胞は本質的にRBC(叩ち、18,5451
[1)である、従って、例示のみの目的のために、骨髄
サンプルに混入すると予想されるリンパ球、顆粒球およ
び単球の数は185個のリンパ球(即ち1$x 18,
545)、185個の顆粒球(即ち、1zX18,54
5)t−5J:び37(I!gの単球(即ち0.21X
18,545)であろう、それ故、訂正した数は615
個のリンパ球、305個の顆粒球および128個の単球
であろう、このような方法を用いることによって、より
正確な細胞数が得られるであろう。
明に関係する当業者の技術水準で表示されている。それ
ぞれ個々の文献あるいは特許出願を特別かつ個別的に参
照として合体させる必要があるのと同程度に、すべての
文献および特許出願を参照としてこ)に自体させる。
特許請求の範囲の精神および観点から離れることなく本
発明内で実行しうろことは明らかであろう。
み会わせによって分析した正常な末梢血液細胞のドツト
プロットである。 第2図AおよびBは、正常末梢血液の有核細胞のドツト
プロットである。 第3図A〜Dは、五種所のパラメーターのさまざまな組
み合わせによって分析した正常な骨髄吸引[i胞のドツ
トプロットである。 第4図AおよびBは、正常骨髄吸引液の有核細胞につい
てのみ行なったドツトプロットである。 第5図A〜Dは、血小板減少症B−CLL患者から得ら
れた末梢血液細胞のドツトプロットであ第6図A〜Bは
、第5図中の有核細胞についてのみ行なったドツトプロ
ットである。 (外4名) 黍!(21 弄72 舵方敵占り光 CD45(PEン 前;方敢白−元 〕 CD45(PEン 尾32 A 千アソ1−ルスレンゾ CD45(PE) L5図 宿4 図 覇25敞乱光 CD45 (PE ) 丞乙図 ばi+75¥Jl犬 CD45 (PE)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、体液中の細胞を多数のパラメーターで分析する方法
であつて; 1)流体サンプルを個体から採取する段階;2)二種類
の蛍光核酸染料を前記サンプルに添加して個々の細胞内
のDNAおよびRNAを差別的に標識する段階であり、
それぞれの染料がその他のものと異なる蛍光放出(エミ
ッション)スペクトルピークをもつ前記の添加段階; 3)蛍光標識した細胞表面マーカーを前記サンプルに加
える段階であり、前記マーカーが前記流体サンプル内の
前記細胞表面に別様に発現する抗原を認識し、かつ前記
蛍光標識が前記蛍光染料とは異なる放出スペクトルピー
クをもつ、前記の段階; 4)前記サンプル中の個々の細胞についての三チャンネ
ルの蛍光および二チャンネルの散乱光を検出かつ記録で
きる装置で、前記サンプル中の前記細胞を分析する段階
; の各段階からなる上記の方法。 2、体液が腹膜、脊髄あるいは脳内の流体、尿、全血ま
たは骨髄、リンパ節、肝臓あるいは脾臓の細胞懸濁液か
らなる、請求項1記載の方法。 3、体液が全血である、請求項2記載の方法。 4、体液が骨髄である、請求項2記載の方法。 5、核酸染料のうちの1つがLDS−751である、請
求項1記載の方法。 6、核酸染料のうちの1つがチアゾールオレンジである
、請求項1記載の方法。 7、細胞表面マーカーが蛍光色素に結合したモノクロー
ナル抗体(MAb)である、請求項1記載の方法。 8、MAbがCD45MAbである、請求項7記載の方
法。 9、CD45MAbがHLe−1である、請求項8記載
の方法。 10、蛍光色素がフィコエリトリン(PE)である、請
求項7記載の方法。 11、装置がフローサイトメーターである、請求項1記
載の方法。 12、血液サンプル内に存在する細胞を5種類のパラメ
ーターで分析する方法であって、1)血液サンプルを個
体から採取する段階;2)LDS−751およびチアゾ
ールオレンジを前記サンプルに添加する段階; 3)HLe−1(PE)を前記サンプルに添加する段階
; 4)前記サンプルを、波長488nmに調整された単一
レーザー源を備えかつ前記サンプル内の個々の細胞につ
いてのOLSおよびFLS散乱光の測定値ならびにLD
S−751、チアゾールオレンジおよびPE蛍光放出の
測定値を記録かつ保存する能力をもつフローサイトメー
ター内を通過させる段階; の各段階からなる上記の分析方法。 13、骨髄サンプル内に存在する細胞を5種類のパラメ
ーターで分析する方法であって、1)骨髄サンプルを個
体より採取する段階;2)LDS−751およびチアゾ
ールオレンジを前記サンプルに添加する段階; 3)HLe−1(PE)を前記サンプルに添加する段階
; 4)前記サンプルを波長488nmに調整された単一レ
ーザー源を備え且つ前記サンプル内の個々の細胞のOL
SおよびFLS散乱光の測定値、ならびにLDS−75
1、チアゾールオレンジおよびPE蛍光放出の測定値を
記録しかつ保存する能力をもつフローサイトメーター内
を通過させる段階; の各段階からなる上記分析方法。 14、体液サンプル内に存在する細胞の複数パラメータ
ー分析のためのキットであって;個々の細胞内のDNA
およびRNAを標識するための少なくとも二種類の核酸
染料であって、その他のものと異なる蛍光放出スペクト
ルピークをもつそれぞれの核酸染料を含む第一容器;お
よび少なくとも一種類の蛍光標識した細胞表面マーカー
であり、前記マーカーが前記流体サンプル内に存在する
前記細胞に別様に発現する抗原を認識し、かつ前記蛍光
標識が前記蛍光染料とは異なる放出スペクトルピークを
もつ、上記マーカーを含む第二容器;からなる上記の分
析用キット。 15、前記核酸染料がLDS−751およびチアゾール
オレンジからなる、請求項14記載のキット。 16、蛍光標識した細胞表面マーカーが HLe−1(PE)からなる、請求項14記載のキット
。 17、骨髄サンプルへの血液の混入による白血球細胞レ
ベルの上昇を調整するために骨髄サンプルの複数パラメ
ーター分析を補正するための方法であり、 1)全血について請求項1記載の方法の各段階を行なう
段階; 2)血液中に存在する種々の白血球細胞成分の百分率を
定量する段階; 3)請求項1記載の方法の各段階を行なう段階; 4)骨髄に存在する種々の白血球細胞成分の絶対数を定
量する段階; 5)段階2)で得られた各々の百分率に骨髄サンプル中
の全細胞数を掛け、そうして得られた数を段階4)で得
られたそれぞれの細胞の絶対数からひき算する段階; の各段階からなる上記の補正方法。
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