JP2014520253A - 好塩基球分析システムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書で提供されるのは、血液試料を分析するシステムおよび方法であり、さらに具体的には、好塩基球分析を行うためのシステムおよび方法である。一実施形態では、システムおよび方法は、（ａ）血液試料を専用の細胞膜透過性蛍光染料で染色すること；および、次に（ｂ）光散乱および蛍光発光の測定を使って、好塩基球を他のＷＢＣ亜集団から識別することを含む。一実施形態では、システムおよび方法は、光散乱および蛍光測定値の組み合わせに基づいて、血液試料の好塩基球クラスター分析を行うことを含む。
【選択図】図８
【選択図】図８
Description
関連出願への相互参照
本出願は、３５合衆国法典．§１１９（ｅ）に基づき、２０１１年５月４日出願の「好塩基球の検出および分析方法（Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）」と題する米国特許仮出願第６１／４８２，５４９号の利益を主張する。この特許の全開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、３５合衆国法典．§１１９（ｅ）に基づき、２０１１年５月４日出願の「好塩基球の検出および分析方法（Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）」と題する米国特許仮出願第６１／４８２，５４９号の利益を主張する。この特許の全開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
また、本出願は、２０１２年４月２６日に出願の「白血球分析システムおよび方法（ＷＨＩＴＥ ＢＬＯＯＤ ＣＥＬＬ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ）」と題する出願番号第ｘｘ／ｘｘｘ、ｘｘｘ号（Ａｔｔｙ Ｄｋｔ Ｎｏ：ＡＤＤＶ−０１６（１１０４０ＵＳＯ１））；および２０１２年４月２６日出願の「有核赤血球の分析システムおよび方法（ＮＵＣＬＥＡＴＥＤ ＲＥＤ ＢＬＯＯＤ ＣＥＬＬ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ）」と題する出願番号第ｘｘ／ｘｘｘ、ｘｘｘ号（Ａｔｔｙ Ｄｋｔ Ｎｏ：ＡＤＤＶ−０１７（１１０４１ＵＳＯ１））に関する。これらの特許の全開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、血液検査システムおよび方法に関する。さらに具体的には、本発明は、血液試料を分析し、血液試料中の好塩基球を同定、分類、および／または定量するシステムおよび方法に関する。
好塩基球は、白血球（ＷＢＣ）亜集団で、正常な血液試料の全ＷＢＣ数の１％以下である。好塩基球は、極めて希なＷＢＣの亜集団である。臨床的には、好塩基球は、主に特定の炎症性およびアレルギー反応に関与する。好塩基球は、ヒスタミン、セロトニン、およびヘパリン等の免疫系メディエーターを放出し、血液の流れを助け、血液凝固を防ぐ。
従来は、好塩基球は、血液試料標本を含む顕微鏡スライドの検査により、手作業での確認および計数されている。しかし、好塩基球が、他のＷＢＣ亜集団に比べて上述のように低い濃度であるため、手作業のスライド検査の精密さと正確さは疑わしい。さらに、よく訓練された衛生検査技師の必要性、および、その労働関連コストにより、スライド手作業の検査がさらに商業的に成り立ちにくくなっている。
好塩基球検出の代替技術には、フローサイトメトリー分析システムでの抗体の使用が含まれる。多くの抗体、例えば、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ６３およびＦＣεＲ１が、好塩基球表面抗原に感受性があり、特異的であることがわかった。しかし、好塩基球抗体アッセイ、長い試料調製および測定プロセスのコスト、およびフローサイトメトリーの経験を有する認定された衛生検査技師の必要性、によって、フローサイトメトリーアッセイ方法は、ほとんどの病院および研究室で、採用されていない。
代わりに、好塩基球は、通常、自動化５分類識別血液分析器による「一番良い推量（ｂｅｓｔ ｇｕｅｓｓ）」見積もりとして報告される。実際に、正確で効率的な好塩基球アッセイの開発努力は続けられており、その理由は、以下による：（１）、試料吸引、試料−試薬相互作用およびインキュベーション、ならびに試料測定を含め、各血液試料は、１分未満の時間で分析されるが、これは好塩基球同定の時間としては不十分である；（２）大抵の血液試料中で１％未満の好塩基球イベント数である；（３）好塩基球およびリンパ球が類似の光学散乱特性を共有し、この結果、誤同定の可能性が増加する；および（４）好塩基球特異的設計のアッセイが、システムの複雑さとコストを大きく増やすことになる。
本明細書で提供されるのは、血液試料を分析するシステムおよび方法、さらに具体的には、好塩基球分析を行うシステムおよび方法である。一実施形態では、システムおよび方法は、（ａ）血液試料を専用の細胞膜透過性蛍光染料で染色すること；およびその後（ｂ）光散乱および蛍光発光の測定を使って、他のＷＢＣ亜集団から好塩基球を識別すること、を含む。一実施形態では、システムおよび方法は、光散乱および蛍光測定値の組み合わせに基づいて、血液試料の好塩基球クラスター分析を行うことを含む。
本明細書に組み込まれる付随する図は、明細書の一部を構成する。この記述された説明と一緒に、図は、提示されたシステムおよび方法の原理を説明しており、当業者がこのシステムと方法を作成、使用できるようにするためにさらに有用である。図中、類似の参照番号は、同じか、または機能的に類似の要素を示している。
発明の詳細な説明
本明細書で提供されるのは、血液試料を分析するシステムおよび方法、さらに具体的には、好塩基球分析を行い、血液試料中の好塩基球を同定、分類、および計数するシステムおよび方法である。一実施形態では、システムおよび方法は、一般的には、（ａ）血液試料を専用の細胞膜透過性蛍光染料で染色すること；およびその後、（ｂ）光散乱および蛍光発光の測定を使って、他の白血球（ＷＢＣ）亜集団から好塩基球を識別することを含む。さらに具体的には、例示実施形態は、血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源；光散乱および蛍光発光を測定するように配置された複数の検出器；ならびに（ａ）光散乱および蛍光発光の測定値を受けるように、および（ｂ）受けた測定値に基づいて、血液試料の好塩基球クラスター分析を行うように構成されたプロセッサ、を有する血液分析器を含む。好塩基球クラスター分析は、受けた測定値の「粗（ｃｏａｒｓｅ）」クラスタリング、続けて、受けた測定値の「密（ｆｉｎｅ）」クラスタリングを含むことができる。密クラスタリングは、類似のクラスターを組み合わせるための決定要因として多次元確率距離尺度を利用できる。
本明細書で提供されるのは、血液試料を分析するシステムおよび方法、さらに具体的には、好塩基球分析を行い、血液試料中の好塩基球を同定、分類、および計数するシステムおよび方法である。一実施形態では、システムおよび方法は、一般的には、（ａ）血液試料を専用の細胞膜透過性蛍光染料で染色すること；およびその後、（ｂ）光散乱および蛍光発光の測定を使って、他の白血球（ＷＢＣ）亜集団から好塩基球を識別することを含む。さらに具体的には、例示実施形態は、血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源；光散乱および蛍光発光を測定するように配置された複数の検出器；ならびに（ａ）光散乱および蛍光発光の測定値を受けるように、および（ｂ）受けた測定値に基づいて、血液試料の好塩基球クラスター分析を行うように構成されたプロセッサ、を有する血液分析器を含む。好塩基球クラスター分析は、受けた測定値の「粗（ｃｏａｒｓｅ）」クラスタリング、続けて、受けた測定値の「密（ｆｉｎｅ）」クラスタリングを含むことができる。密クラスタリングは、類似のクラスターを組み合わせるための決定要因として多次元確率距離尺度を利用できる。
一実施形態では、システムおよび方法は、蛍光染色および蛍光トリガー戦略を使った核含有イベント対．非核含有イベントの選別を含む。従って、不溶解の赤血球（ＲＢＣ）、例えば、溶解抵抗性赤血球（ｒｓｔＲＢＣ）、およびＲＢＣ断片、からの干渉は、その後の分析の前に、実質的に除去される。換言すれば、本明細書記載のシステムおよび方法は、少なくとも１つの蛍光染料および蛍光トリガーシステムを利用して核含有イベントを選別し、それにより、正確に、信頼性高く、ＷＢＣ（およびＷＢＣ亜集団）を同定し、定量する。次に、光散乱情報および蛍光情報の組み合わせを使用して、ＷＢＣ亜集団、および好塩基球をさらに厳密に分離する。開示システムおよび方法は、それにより、好塩基球の正確な計数および識別を確実にする。
（１）分析のために複数の光学チャネルおよび少なくとも１つの蛍光チャネルの使用
一実施形態では、血液試料分析は、蛍光情報を強化した多角偏光散乱分離技術（ＭＡＰＳＳ）を使って行われる。フローセルを通過する各血液細胞による光散乱を検出するには、少なくとも１つのフォトダイオード、または少なくとも１つの光電子増倍管、または少なくとも１つのフォトダイオードおよび少なくとも１つの光電子増倍管の両方が、必要である。２つ以上のフォトダイオードを使って、約０°散乱を測定する軸方向光損失（ＡＬＬ）シグナル、および、低角（例えば、約３°〜約１５°）散乱を測定する中間角散乱（ＩＡＳ）シグナルを測定する。２つ以上の光電子増倍管を使って、９０°偏光側方散乱（ＰＳＳ）シグナルおよび９０°偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）シグナルを検出する。適切な波長範囲内の蛍光（ＦＬ１）測定のためには、光源の波長の選択に応じて、追加の光電子増倍管が必要である。システムで捕捉された各イベントは、このように、複数の特性情報、例えば、ＡＬＬ、ＩＡＳ（１つまたは複数のチャネル）、ＰＳＳ、ＤＳＳ、および蛍光（１つまたは複数のチャネル）を示す。これらの検出チャネル由来の情報を使って、さらなる血液細胞の分析を行う。
一実施形態では、血液試料分析は、蛍光情報を強化した多角偏光散乱分離技術（ＭＡＰＳＳ）を使って行われる。フローセルを通過する各血液細胞による光散乱を検出するには、少なくとも１つのフォトダイオード、または少なくとも１つの光電子増倍管、または少なくとも１つのフォトダイオードおよび少なくとも１つの光電子増倍管の両方が、必要である。２つ以上のフォトダイオードを使って、約０°散乱を測定する軸方向光損失（ＡＬＬ）シグナル、および、低角（例えば、約３°〜約１５°）散乱を測定する中間角散乱（ＩＡＳ）シグナルを測定する。２つ以上の光電子増倍管を使って、９０°偏光側方散乱（ＰＳＳ）シグナルおよび９０°偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）シグナルを検出する。適切な波長範囲内の蛍光（ＦＬ１）測定のためには、光源の波長の選択に応じて、追加の光電子増倍管が必要である。システムで捕捉された各イベントは、このように、複数の特性情報、例えば、ＡＬＬ、ＩＡＳ（１つまたは複数のチャネル）、ＰＳＳ、ＤＳＳ、および蛍光（１つまたは複数のチャネル）を示す。これらの検出チャネル由来の情報を使って、さらなる血液細胞の分析を行う。
図１は、血液分析に適する装置（フローサイトメトリーを含む）の照射および検出光学系を模式図で示す。図１を参照すると、装置１０は、光源１２、ビームを曲げるための前面ミラー１４および背面ミラー１６、第１の円柱状レンズ２０および第２の円柱状レンズ２２を含むビーム拡大器モジュール１８、焦点レンズ２４、ビーム微調整器２６、フローセル２８、前方散乱レンズ３０、ブルズアイ検出器３２、第１の光電子増倍管３４、第２の光電子増倍管３６、および第３の光電子増倍管３８、を含む。ブルズアイ検出器３２は、０°光散乱用内側検出器３２ａおよび７°光散乱用外側検出器３２ｂを持つ。
以下の考察では、光源は、好ましくは、レーザーである。別の実施形態では、約３５０ｎｍ〜約７００ｎｍの間の波長で発光するレーザーが選択される；例えば、一実施形態では、約４８８ｎｍで発光するレーザーが使われる。光源１２は、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡから市販されている垂直偏光空冷Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｕｂｅ ｌａｓｅｒ、であってもよい。３５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長のレーザーを使用できる。レーザー用操作条件は、「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」自動化血液分析器で現在使っているものと実質的に類似である。しかし、他の光源、例えば、ランプ（例えば、水銀、キセノン）も使用可能である。
フローセル、レンズ、焦点レンズ、ビーム微調整機構およびレーザー焦点レンズに関する追加の詳細は、米国特許第５，６３１，１６５号で見つけることができる。この特許は参照により、特に、カラム４１、行３２からカラム４３、行１１までが、本明細書に組み込まれる。図１の前方光路システムは、球形平凸レンズ３０およびレンズの後焦点面に位置する２素子フォトダイオード検出器３２を含む。この構成では、２素子フォトダイオード検出器３２内の各点は、フローセル２８を通過する細胞由来の特定の光収集角度に位置づけられる。検出器３２は、軸方向光損失（ＡＬＬ）および中間角前方散乱（ＩＡＳ）を検出できるブルズアイ検出器であってもよい。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４３、行１２〜５２に、この検出器の種々の代替装置について記載している。
第１の光電子増倍管３４（ＰＭＴ１）は、偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）を測定する。第２の光電子増倍管３６（ＰＭＴ２）は、偏光側方散乱（ＰＳＳ）を測定し、第３の光電子増倍管３８（ＰＭＴ３）は、選択蛍光染料および採用光源に応じて、約３６０ｎｍ〜約７５０ｎｍの蛍光発光を測定する。一実施形態では、ＰＭＴ３は、約４４０ｎｍ〜約６８０ｎｍ、さらに厳密には、約５００ｎｍ〜約５５０ｎｍからの蛍光発光を測定する。光電子増倍管は、広い範囲の波長の蛍光シグナルを集め、シグナル強度を強くする。側方散乱および蛍光発光は、効率的に必要な波長で伝達および反射し効率的な検出を可能とする二色性ビームスプリッター４０および４２により、これらの光電子増倍管の方に向けられる。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４３、行５３からカラム４４、行４に、光電子増倍管に関して種々の追加の詳細について記載している。
液浸集光（ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）システムを使って蛍光を測定する場合、感度は、光電子増倍管３４、３６、および３８で高められる。液浸集光システムは、第１のレンズ３０を、屈折率整合層を使ってフローセル２８に光学的に結合させ、広い角度にわたって光の収集を可能とするものである。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４４、行５〜３１で、この光学系の種々の追加の詳細について記載している。
集光レンズ４４は、高解像度顕微鏡で使われる回折限界画像処理に対し充分な収差補正を有する光学的レンズシステムである。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４４、行３２〜６０で、この光学系の種々の追加の詳細について記載している。
図１の他の部品、すなわち、スリット４６、視野レンズ４８、および第２のスリット５０の機能は、米国特許第５，６３１，１６５号のカラム４４、行６３〜カラム４５、行２６に記載されている。光電子増倍管の光路中に挿入され、検出光の波長もしくは偏光または波長と偏光の両方を変える光学フィルター５２または５６および偏光子５２または５６についても、米国特許第５，６３１，１６５号のカラム４４、行６３〜カラム４５、行２６に記載されている。本明細書での使用に適する光学的フィルターには、帯域フィルターおよびロングパスフィルターが含まれる。
光電子増倍管３４、３６、および３８は、側方散乱（軸が入射レーザービームにおよそ直角である円錐体中で散乱された光）または蛍光（入射レーザービームの波長とは違う波長での細胞からの光発光）を検出する。
米国特許第５，６３１，１６５号の選択された部分は、上記で参照しているが、米国特許第５，６３１，１６５号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（２）蛍光染料の使用
ＷＢＣは、それらの核中に比較的高い濃度のＤＮＡを含む。適切に設計されれば、蛍光染料は、異なるＷＢＣの亜集団の間で識別するために使用できる。例えば、リンパ球および好塩基球は、類似の光散乱特性を有するにも関わらず、異なる蛍光の特色を有する。さらに、成熟ＲＢＣは、ＤＮＡを含んでいない。従って、蛍光染料は、血液細胞集団の間で識別するように選択できる。染料の目的は、生細胞中に容易に侵入し、高親和性でＤＮＡと結合し、染料が適切な光源により励起される時、適切なストークスシフトを有する強力な蛍光を発光することである。可視バンド中の染料のピーク吸収は、染料を正確に励起し、最適な結果を得るために、実質的に光源の波長に一致させうる（光源の波長の５０ｎｍ以内、より好ましくは、光源の波長の２５ｎｍ以内で）。
ＷＢＣは、それらの核中に比較的高い濃度のＤＮＡを含む。適切に設計されれば、蛍光染料は、異なるＷＢＣの亜集団の間で識別するために使用できる。例えば、リンパ球および好塩基球は、類似の光散乱特性を有するにも関わらず、異なる蛍光の特色を有する。さらに、成熟ＲＢＣは、ＤＮＡを含んでいない。従って、蛍光染料は、血液細胞集団の間で識別するように選択できる。染料の目的は、生細胞中に容易に侵入し、高親和性でＤＮＡと結合し、染料が適切な光源により励起される時、適切なストークスシフトを有する強力な蛍光を発光することである。可視バンド中の染料のピーク吸収は、染料を正確に励起し、最適な結果を得るために、実質的に光源の波長に一致させうる（光源の波長の５０ｎｍ以内、より好ましくは、光源の波長の２５ｎｍ以内で）。
選択蛍光染料は、好ましくは、１）核酸に結合できる、２）ＷＢＣおよびｎＲＢＣの細胞膜に侵入できる、３）光源にさらした場合、選択波長で励起可能である、４）光源による励起時、蛍光を発光する、および、５）生体安定性で、体液に可溶である。染料は、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＲ１１、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎシリーズ染料、ヨウ化ヘキシジウム、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１４、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ ＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔ、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２５およびこれらのいずれかの等価物、からなる群から選択できる。染料を使って、ＷＢＣおよびｎＲＢＣを「活性化（ａｃｔｉｖａｔｅ）」し、血液分析器中で形成された蛍光トリガーに基づいて、非溶解ＲＢＣおよびＲＢＣの断片を「選別除去する（ｓｃｒｅｅｎ ｏｕｔ）」そしてWBCの亜集団間を識別する。染料は、典型的な例では、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。種々の染料が利用可能であるが、選択染料は、通常、血液分析器の励起源と対になり、ただ１つの専用の染料を使って、同定、定量、および／または分析する対象のｎＲＢＣおよび全ＷＢＣ亜集団の染色および蛍光発光の励起を行う。従って、ただ１つの（すなわち、専用の）染料を使って、他のすべてのＷＢＣ亜集団の中でも特に好塩基球を瞬時に同定、定量、および分析できる。
一実施形態では、蛍光染料は、１，０００ｘ１０３細胞／μｌまで染色および活性化を実行できるのに十分な量の、１）少なくとも１つの界面活性剤、２）少なくとも１つの緩衝液、３）少なくとも１つの塩、および／または４）少なくとも１つの抗菌剤と組み合わせた試薬で提供される。少なくとも１つの界面活性剤、例えば、「トリトン」Ｘ−１００またはサポニンを使って、ＲＢＣの膜を破壊し、ＲＢＣの断片の寸法を小さくする。少なくとも１つの界面活性剤は、典型的な例では、約０．００１％〜約５％の濃度で存在する。少なくとも１つの抗菌剤、例えば、「ＴＲＩＡＤＩＮＥ」または「ＰＲＯＣＬＩＮ」ファミリー由来のもの、を使って、試薬の微生物による汚染を防ぐ。少なくとも１つの抗菌剤の濃度は、必要な保存可能期間の間、試薬を保存するのに充分な濃度である。少なくとも１つの緩衝液、例えば、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）または４−（２−ヒドロキシエチル）−ｌ−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を使って、ＲＢＣおよび貯蔵ＷＢＣの溶解を制御するために、反応混合物のｐＨを調節する。少なくとも１つの緩衝液は、典型的な例では、約０．０１％〜約３％の濃度で存在する。ｐＨは、典型的な例では、約３〜約１２の範囲である。少なくとも１つの塩、例えば、ＮａＣｌまたはＮａ２ＳＯ４を使って、浸透圧を調節し、溶解の効果を高める、および／またはＷＢＣ残存を最適化する。少なくとも１つの塩は、約０．０１％〜約３％の濃度で存在してもよい。ある場合では、少なくとも１つの緩衝液は、少なくとも１つの塩としての役割を果たすことができ、または少なくとも１つの塩は、少なくとも１つの緩衝液としての役割を果たすことができる。
一般的に、より低い浸透圧、または低張性を使って、ＲＢＣの溶解を加速する。浸透圧は、典型的な例では、浸透圧は、典型的な例では、約２０〜約２５０ｍＯｓｍの範囲である。ＲＢＣの溶解は、血液試料および試薬を約３５容量部の試薬に対し、約１容量部の試料の比率で混合後、室温を超える温度（例えば、約３０℃〜約５０℃の間、例えば、約４０℃）で、比較的短い時間で（例えば、約２５秒未満で、約１７秒未満で、または約９秒未満ででも）起こさせることができる。
上記のように、通常、分析用散乱および蛍光データは、複数の光学チャネルおよび少なくとも１つの蛍光チャネルで集められる。
（３）蛍光トリガーの使用
血液細胞は、光源による蛍光染料の励起時に異なる大きさの蛍光シグナルを発光する。蛍光シグナルの大きさの差異は、細胞内の核酸、すなわち、ＤＮＡの量から生じる。ＤＮＡの量が大きくなればなるほど、高い蛍光シグナルの可能性が大きくなる。また、細胞膜の浸透、染料の寸法、染料およびＤＮＡの間の結合動力学、染料およびＤＮＡの間の親和性、ならびに他の因子の効力は、蛍光シグナルに影響する。成熟ＲＢＣは、最小の蛍光シグナルを発光する。理由は、成熟ＲＢＣ内にはＤＮＡがないからである。非溶解ＲＢＣまたはＲＢＣ断片は、蛍光を発光しないが、非常に弱い自己蛍光を発光できる。また、好塩基球は、リンパ球とは違った蛍光発光特性を有することが示された。
血液細胞は、光源による蛍光染料の励起時に異なる大きさの蛍光シグナルを発光する。蛍光シグナルの大きさの差異は、細胞内の核酸、すなわち、ＤＮＡの量から生じる。ＤＮＡの量が大きくなればなるほど、高い蛍光シグナルの可能性が大きくなる。また、細胞膜の浸透、染料の寸法、染料およびＤＮＡの間の結合動力学、染料およびＤＮＡの間の親和性、ならびに他の因子の効力は、蛍光シグナルに影響する。成熟ＲＢＣは、最小の蛍光シグナルを発光する。理由は、成熟ＲＢＣ内にはＤＮＡがないからである。非溶解ＲＢＣまたはＲＢＣ断片は、蛍光を発光しないが、非常に弱い自己蛍光を発光できる。また、好塩基球は、リンパ球とは違った蛍光発光特性を有することが示された。
従って、本明細書に提示のシステムおよび方法は、ＷＢＣおよびＷＢＣ亜集団を集め分析するための蛍光トリガーを使用する。一実施形態では、好塩基球／リンパ球識別に先立ち、蛍光トリガーは、ＲＢＣからのシグナルおよびＷＢＣ（および、存在する場合は、ｎＲＢＣ）からのシグナルの間に設定される。次に、集められた光学および蛍光情報を使って、ＷＢＣ亜集団を識別（または鑑別）できる。例えば、２次元サイトグラムを使って、粒子を同定および識別できる。
本明細書で使われる表現の「蛍光情報」は、血液分析器の蛍光チャネルから集められたデータを意味する。本明細書で使われる表現の「蛍光チャネル」は、試料から発光された蛍光の量の測定のために適切な波長バンド用に設定された検出装置、例えば、光電子増倍管を意味する。
図２Ａは、約１．６％好塩基球を含む第１の血液試料（試料１）の９０°偏光側方散乱（ＰＳＳ）対．中間角散乱（ＩＡＳ）のサイトグラムである。図２Ｂは、試料１の軸方向光損失（ＡＬＬ）対．ＩＡＳのサイトグラムである。好塩基球１００は、残りのＷＢＣ亜集団から手作業のゲーティングにより分離された。図３Ａは、約０．２％好塩基球を含む第２の血液試料（試料２）のＰＳＳ対．ＩＡＳのサイトグラムである。図３Ｂは、試料２のＡＬＬ対．ＩＡＳのサイトグラムである。好塩基球１００は、残りのＷＢＣ亜集団から手作業のゲーティングにより分離された。図２Ａ、２Ｂ、３Ａ、および３Ｂは、小角側方散乱（すなわち、ＩＡＳ、３°〜１５°）および前方散乱（すなわち、ＡＬＬ、０°〜２°）を使って分離できることを示す。
図４は、試料１の蛍光（ＦＬ１）対．ＩＡＳのサイトグラムである。リンパ球２００、好塩基球１００、および残渣単球３００のみが、サイトグラム中で示されている。図５は、試料２のＦＬ１対．ＩＡＳのサイトグラムである。リンパ球２００、好塩基球１００、および残渣単球３００のみがサイトグラム中で示されている。図４および５は、蛍光染料染色が、１つまたは複数の蛍光特性により、ＷＢＣ亜集団（例えば、リンパ球）からの好塩基球のさらなる分離を可能とすることを示す。このような分離は、異なるＷＢＣ亜集団の中での膜、ＤＮＡ含量、および予想される染色効率の効力の差異の結果である。例えば、アクリジンオレンジ（３μｇ／ｍＬ）を含むＷＢＣ試薬を使って、４０℃の温度で、２５秒間のＷＢＣの処理は、一般的に、より高いリンパ球のＦＬ１シグナル、およびより低い好塩基球のＦＬ１シグナルを生ずる。従って、好塩基球の同定および定量化は、このようなＷＢＣ試薬を使ってさらに促進できる。換言すれば、ＷＢＣ試薬が、好塩基球に、リンパ球（または他のＷＢＣ亜集団）により発光される蛍光とは異なる大きさで蛍光を発光させる場合、好塩基球は、蛍光発光シグナルを使ってリンパ球から分離されうる。
図６Ａ〜６Ｃおよび７Ａ〜７Ｃを参照して、さらなる結果を示す。例えば、図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、は、試料１に対し複数の特性（すなわち、２つ以上の特性（例えば、５つの特性））を使った好塩基球の分離を示す。さらに具体的には、図６Ａは、試料１のＰＳＳ対．ＩＡＳのサイトグラムである。図６Ｂは、試料１のＡＬＬ対．ＩＡＳのサイトグラムである。図６Ｃは、試料１のＦＬ１対．ＩＡＳのサイトグラムである。好塩基球１００は、クラスタリング分析により、残りのＷＢＣから分離された。図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、試料２に対し、複数の特性（すなわち、３つ以上の特性（例えば、５つの特性））を使った、好塩基球の分離を示す。さらに具体的には、図７Ａは、試料２のＰＳＳ対．ＩＡＳのサイトグラムである。図７Ｂは、試料２のＡＬＬ対．ＩＡＳのサイトグラムである。図７Ｃは、試料２のＦＬ１対．ＩＡＳのサイトグラムである。好塩基球１００は、クラスタリング分析により、残りのＷＢＣから分離された。
また、好塩基球の総合的な調査を行って、本明細書記載のシステムおよび方法を評価した。０〜約５％の範囲の好塩基球の割合の合計５６の血液試料を本明細書記載の方法に従って操作したプロトタイプアナライザーで測定した。好塩基球の濃度、すなわち、好塩基球のパーセンテージ（あるいは、本明細書で「％ＢＡ」と呼ぶ）を得るために、試料を手作業のゲーティングおよびクラスタリング分析アルゴリズムの両方で分析した。操作中、クラスタリング分析アルゴリズムを、最初に「粗」クラスタリングに適用する。これにより、多数のクラスターが生成する。次に、類似のクラスターを組み合わせるための決定要因として多次元確率距離尺度を利用して、アルゴリズムを、第２の「密」クラスタリングステップに適用する。結果として、この第２ステップで、クラスター中の細胞の数は、決定要因としては使用されず、それにより、低濃度の細胞、例えば、好塩基球、を含むクラスターが維持される。ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、ＤＳＳおよびＦＬ１を含む全ての光学および蛍光特性を利用して、好塩基球クラスターが決定される。
参照値は、同じセットの試料を、二重抗体好塩基球パネル（ＣＤ４５およびＦＣεＲ１）を備えたＡｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーターを使って測定することにより得た。ＣＤ４５は、ＦＬ３チャネルで測定され、ＦＣεＲ１は、ＦＬ４チャネルで測定された。この調査の結果を図８および９に示す。さらに具体的には、図８は、手作業のゲーティングで分析した好塩基球のパーセンテージ対．参照フローサイトメーターで測定した好塩基球パーセンテージの相関を示すプロットである。合計５６試料を測定し、相関プロットに含めた。図９は、クラスタリングで分析した好塩基球パーセンテージ対．参照フローサイトメーターで測定した好塩基球パーセンテージの相関を示すプロットである。合計５６試料を測定し、相関プロットに含めた。相関は下記の通り：
Ｙ＝０．９３７５Ｘ−０．０４３５；Ｒ２＝０．９１５１
（図８：手作業のゲーティング対．参照）
Ｙ＝１．０７２１Ｘ＋０．０３４８；Ｒ２＝０．９１４４
（図９：ランダムクラスタリング対．参照）
Ｙ＝０．９３７５Ｘ−０．０４３５；Ｒ２＝０．９１５１
（図８：手作業のゲーティング対．参照）
Ｙ＝１．０７２１Ｘ＋０．０３４８；Ｒ２＝０．９１４４
（図９：ランダムクラスタリング対．参照）
このように、本明細書記載の方法および参照方法（すなわち、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーターを使った方法）との間に、優れた相関が得られた。好塩基球およびリンパ球の間の分離は、バッタチャリャ距離によりさらに定量的に評価された。好塩基球およびリンパ球の間の平均バッタチャリャ距離は、５６試料に対し、４．２±２．０であった。これは、全体的に見て、信頼できる好塩基球分析であることを示す。より小さい最適分離を示すのは７試料（１２．５％）のみであった（バッタチャリャ距離＜３．０、かつ、全て＞２．５）。
表１は、参照（すなわち、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーターを使った方法）、手作業のゲーティング分析、クラスタリング分析、およびバッタチャリャ距離の結果の比較である。
好塩基球およびリンパ球に対し異なる光学的散乱シグナルを生成するようにＷＢＣ試薬を最適化し、異なるレベルの蛍光シグナルを発光するようにＷＢＣを染色する蛍光染料を利用することにより、好塩基球のリンパ球からの充分な分離を実現した。正確な好塩基球の定量化は、本明細書記載の方法により実現できる。さらに、本明細書記載の方法は、速く、簡単で、また、対費用効果が高い。好塩基球は、１分未満で、典型的な例では、３０秒未満で、わずか１個のＷＢＣ試薬を使って、同定および定量できる。ＷＢＣ試薬の配合は、複数の光学特性および少なくとも１つの蛍光特性で、好塩基球を別の集団として認められるようにする。さらに、好塩基球の同定および定量化を、全ＷＢＣ亜集団の同定および定量化と同時に、１回のアッセイで行うことができる。
追加の実施形態
一実施形態では、システムおよび方法は、（ａ）界面活性剤、界面活性剤の濃度、ＷＢＣ安定化薬剤、ＷＢＣ安定化薬剤の濃度、反応混合物の最終ｐＨ、および浸透圧の適切な選択によるＷＢＣ試薬の最適化；（ｂ）ＷＢＣを染色するためのＷＢＣ試薬中に核染色用染料を含めること；および（ｃ）生データファイルの処理後現れる好塩基球を、自動クラスタリングアルゴリズムを使って分析すること、を含む。生データファイルは、時間タグおよび他の関連情報と共に、少なくとも５つの情報の特性；すなわち、ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、ＤＳＳおよびＦＬ１を有するイベントを含んでもよい。成分の最適化により、少なくとも１つの光学的特性で、リンパ球からの好塩基球の識別が可能となる。
一実施形態では、システムおよび方法は、（ａ）界面活性剤、界面活性剤の濃度、ＷＢＣ安定化薬剤、ＷＢＣ安定化薬剤の濃度、反応混合物の最終ｐＨ、および浸透圧の適切な選択によるＷＢＣ試薬の最適化；（ｂ）ＷＢＣを染色するためのＷＢＣ試薬中に核染色用染料を含めること；および（ｃ）生データファイルの処理後現れる好塩基球を、自動クラスタリングアルゴリズムを使って分析すること、を含む。生データファイルは、時間タグおよび他の関連情報と共に、少なくとも５つの情報の特性；すなわち、ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、ＤＳＳおよびＦＬ１を有するイベントを含んでもよい。成分の最適化により、少なくとも１つの光学的特性で、リンパ球からの好塩基球の識別が可能となる。
別の実施形態では、蛍光染料で染色されている血液試料の好塩基球分析を行うための血液分析器が提供され、蛍光染料は、細胞膜透過性および核酸結合性である。分析器は、血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源を含む。
別の実施形態では、自動化血液分析器を使って好塩基球を検出する方法が提供される。この方法は、（ａ）全血試料を少なくとも１つの白血球試薬で希釈すること；（ｂ）ステップ（ａ）の希釈試料を、充分な時間、選択温度範囲内で、インキュベートして、赤血球を溶解し、白血球を残し、少なくとも１つの蛍光染料で白血球の染色を可能にすること；（ｃ）ステップ（ｂ）のインキュベートした混合物を、連続的にフローセルに送ること；（ｄ）試料がフローセルを通過する間に、光源を使って試料を励起すること；（ｅ）複数の光学散乱シグナルおよび少なくとも１つの蛍光発光シグナルを同時に集めること；および（ｆ）ステップ（ｅ）で集めた光学散乱シグナルおよび蛍光発光シグナルを使って、好塩基球を同定し、定量すること、を行うステップを含む。少なくとも１つの白血球試薬は、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩または少なくとも１つの緩衝液および少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）少なくとも１つの蛍光染料を含んでもよく、この場合、少なくとも１つの白血球試薬の配合が、複数の光学特性および少なくとも１つの蛍光特性によって、好塩基球を別の集団として認識されるようにする。好塩基球の検出および分析のみのために選ばれた試薬を使わずに、好塩基球を白血球識別分析の間に検出および分析できる。好塩基球は、小角側方散乱および前方散乱を使って、リンパ球から分離できる。好塩基球がリンパ球から発光される蛍光とは異なる強さの蛍光を発光する場合は、好塩基球は、蛍光発光シグナルを使ってリンパ球から分離できる。好塩基球は、光学的情報および蛍光情報を使って分析できる。好塩基球は、複数の光学的情報の特性および少なくとも１つの蛍光情報の特性の使用し、ランダムクラスタリングを使って識別できる。光源は、約３５０ｎｍ〜約７００ｎｍの波長であってよい。蛍光発光は、帯域フィルターまたはロングパスフィルターを使って、約３６０ｎｍ〜約７００ｎｍで収集できる。好塩基球の同定および定量、および残りの白血球の同定および定量を、１回のアッセイで同時に行うことができる。
別の実施形態では、自動化血液分析器を使った好塩基球の検出方法が提供され、この方法は、（ａ）全血試料を少なくとも１つの白血球試薬で希釈すること；（ｂ）ステップ（ａ）の希釈試料を、充分な時間、選択温度範囲内で、インキュベートして、赤血球を溶解し、白血球を残し、少なくとも１つの蛍光染料で白血球の染色を可能にすること：（ｃ）ステップ（ｂ）のインキュベートした混合物を、連続的にフローセルに送ること；（ｄ）試料がフローセルを通過する間に、光源を使って試料を励起すること；（ｅ）複数の光学散乱シグナルおよび少なくとも１つの蛍光発光シグナルを同時に集めること；および（ｆ）ステップ（ｅ）で集めた光学散乱シグナルおよび蛍光発光シグナルを使って、好塩基球を同定し、定量すること、を行うステップを含む。
本明細書記載のシステムおよび方法の特徴は、多角偏光散乱分離技術を使って、好中球、単球および好酸球から好塩基球を分離することを含む。好塩基球および他の３つの白血球亜集団は、０°散乱を測定する軸方向光損失チャネル（ＡＬＬ）、３°〜１５°散乱を測定する中間角散乱チャネル（ＩＡＳ）、９０°偏光側方散乱チャネル（ＰＳＳ）、および９０°偏光解消側方散乱チャネル（ＤＳＳ）、に対し実質的に異なるシグナルを示す。この方法の別の特徴は、光学的散乱情報（例えば、ＩＡＳ情報、ＡＬＬ情報、およびＰＳＳ情報）および蛍光情報により、リンパ球から好塩基球を分離することを含む。
別の実施形態では、蛍光染料で染色されている血液試料の好塩基球分析を行う血液分析器が提供され、蛍光染料は、細胞膜透過性および核酸結合性である。分析器は、血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源を含む。励起源は、レーザーであってもよい。分析器は、（１）励起血液試料から軸方向光損失を測定するように配置された軸方向光損失検出器、（２）励起血液試料から中間角散乱を測定するように配置された中間角散乱検出器、（３）励起血液試料から９０°側方散乱を測定するように配置された側方散乱検出器、および（４）励起血液試料から発光された蛍光を測定するように配置された蛍光検出器を含む複数の検出器をさらに含む。軸方向光損失検出器は、０°散乱で軸方向光損失を測定できる。中間角散乱検出器は、約３°〜約１５°で光角度散乱を測定できる。複数の検出器は、１つまたは複数の光電子増倍管を含むことができる。分析器は、（ａ）複数の検出器からの（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°側方散乱、および（４）蛍光の測定値を受け、（ｂ）４つ全ての測定値に基づき、血液試料の好塩基球クラスター分析を行うように構成されたプロセッサをさらに含む。好塩基球クラスター分析は、受けた測定値の粗クラスタリングを含んでもよい。好塩基球クラスター分析は、類似クラスターを組み合わせるための決定要因として、多次元確率距離尺度を利用して、受けた測定値の密クラスタリングをさらに含んでもよい。
側方散乱検出器は、励起血液試料からの９０°偏光側方散乱を測定するように配置された偏光側方散乱検出器であってもよい。従って、プロセッサは、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、および（４）蛍光の測定値に基づいて、血液試料内のリンパ球から血液試料内の好塩基球を識別するようにさらに構成されてもよい。分析器は、また、励起血液試料からの９０°偏光解消側方散乱を測定するように配置された偏光解消側方散乱検出器を含んでもよい。プロセッサは、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、および（３）９０°側方散乱の測定値に基づいて、血液試料内の好中球、単球、および好酸球から血液試料内の好塩基球を識別するようにさらに構成されてもよい。プロセッサは、受けた測定値を予備選別して、蛍光閾値に適合しないいずれの粒子も検討対象から外すようにさらに構成されてもよい。
血液分析器は、血液試料を試薬で希釈するためのインキュベーションサブシステムをさらに含んでもよい。試薬には、蛍光染料および溶解薬剤を含むことができる。試薬は、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）蛍光染料を含んでもよい。インキュベーションサブシステムを形成して、約３０秒未満の時間、試薬と共に血液試料をインキュベートしてもよい。インキュベーションサブシステムを形成して、約３０℃〜約５０℃の範囲の温度で、血液試料を試薬と共に、インキュベートしてもよい。インキュベーションサブシステムを形成して、約４０℃の温度で、血液試料を試薬と共に、インキュベートしてもよい。
別の実施形態では、好塩基球分析を、自動化血液分析器を使って行う方法が提供される。方法は、（ａ）全血試料を、赤血球（ＲＢＣ）溶解薬剤および細胞膜透過性、核酸結合蛍光染料を含む試薬での希釈；（ｂ）ステップ（ａ）の希釈血液試料を、約３０秒未満のインキュベーション時間、約３０℃〜約５０℃の範囲の温度でのインキュベーション；（ｃ）ステップ（ｂ）でインキュベートした試料を、血液分析器のフローセルに送り出すこと；（ｄ）インキュベートした試料がフローセルを通過する間に、ステップ（ｃ）でインキュベートした試料の励起源による励起；（ｅ）励起試料からの複数の光散乱シグナルおよび蛍光発光シグナルの収集；および（ｆ）ステップ（ｅ）で集めた全シグナルに基づいて好塩基球クラスター分析の実行、のステップを含む。好塩基球クラスター分析は、集めたシグナルの粗クラスタリングを含んでもよい。好塩基球クラスター分析は、類似クラスターを組み合わせるための決定要因として、多次元確率距離尺度を利用した、集めたシグナルの密クラスタリングをさらに含んでもよい。試薬は、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）少なくとも１つの蛍光染料を含んでもよい。励起源は、約３５０ｎｍ〜約７００ｎｍの波長であってもよい。励起源は、約４８８ｎｍの波長であってよい。複数の光散乱シグナルは、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、および（３）９０°側方散乱を含んでもよい。あるいは、複数の光散乱シグナルは、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、および（４）９０°偏光解消側方散乱を含んでもよい。
一実施形態では、本発明は、本明細書記載の機能性を実行できる１つまたは複数のコンピュータシステムに関する。例えば、本明細書で考察の方法／分析ステップのいずれかは、１つまたは複数のプロセッサ、データ通信インフラ（例えば、コミュニケーションバス、クロスオーバ・バー（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒｂａｒ）、またはネットワーク）、ディスプレイインターフェイス、および／または保存またはメモリユニットを有するコンピュータシステムに実装可能である。保存またはメモリユニットは、実行時、プロセッサに１つまたは複数の本明細書記載の機能を実行させる命令（例えば、制御ロジックまたはソフトウェア）を含むコンピュータ可読保存メディアを含んでもよい。用語の「コンピュータ可読保存メディア」、「コンピュータプログラムメディア」、および「コンピュータ使用可能メディア」は、通常、メディア、例えば、リムーバブル保存ドライブ、リムーバブル保存ユニット、コミュニケーションインターフェイスを介して送信されたデータ、および／またはハードディスクドライブに組み込まれたハードディスクの意味に使われる。このようなコンピュータプログラム製品は、コンピュータソフトウェア、インストラクション、および／またはデータをコンピュータシステムに提供し、これが、さらに、コンピュータシステムを、一般目的コンピュータから本明細書記載の特定の機能を実行するようにプログラムされた特殊目的コンピュータに変換する役割をする。必要に応じ、プロセッサ、関連部品、ならびに等価システムおよびサブシステムは、選択操作および機能を実行する「ための手段（ｍｅａｎｓ ｆｏｒ）」の例としての機能を果たす。このような選択操作および機能を実行する「ための手段」もまた、一般目的コンピュータを、前記選択操作および機能を実行するようにプログラムされた特殊目的コンピュータに変換する機能を果たす。
システムおよび方法は、このように、自動化血液分析器による、速く、単純で、低コストな好塩基球の検出および分析方法を提供する。アッセイは、試料インキュベーションのわずか３０秒、および試料測定のわずか１０秒を含め、１分以内に行うことができる。１つの白血球試薬を使って、極めて少ない白血球の亜集団、すなわち、好塩基球を含む、赤血球溶解および白血球識別を行うことができる。
結語
前出の本発明の説明は、例示および説明のために提示されている。網羅的とする、または本発明を開示された正確な形態に限定する意図はない。上記教示を考慮すると、他の修正および変更が可能であろう。実施形態は、本発明の原理および実際の適用を最良に説明するために、また、それにより他の当業者が種々の実施形態で、および意図された特定の用途に適合するように種々の修正形態で、本発明を最良に利用できるようにするために、選択され、説明された。添付の請求項は、等価構造、成分、方法、および手段を含む他の代替の本発明の実施形態を含むように解釈されるべきであることが意図されている。
前出の本発明の説明は、例示および説明のために提示されている。網羅的とする、または本発明を開示された正確な形態に限定する意図はない。上記教示を考慮すると、他の修正および変更が可能であろう。実施形態は、本発明の原理および実際の適用を最良に説明するために、また、それにより他の当業者が種々の実施形態で、および意図された特定の用途に適合するように種々の修正形態で、本発明を最良に利用できるようにするために、選択され、説明された。添付の請求項は、等価構造、成分、方法、および手段を含む他の代替の本発明の実施形態を含むように解釈されるべきであることが意図されている。
上記詳細説明は、１つまたは複数の代表的実施形態を説明する付随する図を参照する。
他の実施形態が可能である。本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、記載された実施形態に対し修正を行うことができる。従って、詳細説明は、制限を意味しない。さらに、発明の概要および要約セクションは、発明者に意図された１つまたは複数の本発明の、全てではない、代表的実施形態を説明するものであり、従って、本発明および添付請求項を何ら制限する意図はない。
他の実施形態が可能である。本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、記載された実施形態に対し修正を行うことができる。従って、詳細説明は、制限を意味しない。さらに、発明の概要および要約セクションは、発明者に意図された１つまたは複数の本発明の、全てではない、代表的実施形態を説明するものであり、従って、本発明および添付請求項を何ら制限する意図はない。
Claims (28)
- 蛍光染料で染色されている血液試料の好塩基球分析を行うための血液分析器であって、前記蛍光染料が、細胞膜透過性および核酸結合性であり、
前記血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源；（１）前記励起血液試料からの軸方向光損失を測定するように配置された軸方向光損失検出器、（２）前記励起血液試料からの中間角散乱を測定するように配置された中間角散乱検出器、（３）前記励起血液試料からの９０°側方散乱を測定するように配置された側方散乱検出器、および（４）前記励起血液試料から発光した蛍光を測定するように配置された蛍光検出器、を含む複数の検出器；ならびに
（ａ）前記複数の検出器から（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°側方散乱、および（４）蛍光の測定値を受け、
（ｂ）４つ全ての測定値に基づいて、前記血液試料の好塩基球クラスター分析を行うように構成されたプロセッサ；
を含む血液分析器。 - 前記好塩基球クラスター分析が、前記受けた測定値の粗クラスタリングを含む、請求項１に記載の血液分析器。
- 前記好塩基球クラスター分析が、類似クラスターを組み合わせるための決定要因として、多次元確率距離尺度を利用した、前記受けた測定値の密クラスタリングを含む、請求項２に記載の血液分析器。
- 前記側方散乱検出器が、前記励起血液試料からの９０°偏光側方散乱を測定するように配置された偏光側方散乱検出器である、請求項１に記載の血液分析器。
- 前記プロセッサが、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、および（４）蛍光の測定値に基づいて、前記血液試料内のリンパ球から血液試料内の好塩基球を識別するようにさらに構成される、請求項４に記載の血液分析器。
- 前記励起血液試料からの９０°偏光解消側方散乱を測定するように配置された偏光解消側方散乱検出器をさらに含む、請求項４に記載の血液分析器。
- 前記プロセッサが、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、および（３）９０°側方散乱の測定値に基づいて、前記血液試料内の好中球、単球、および好酸球から前記血液試料内の好塩基球を識別するようにさらに構成される、請求項１に記載の血液分析器。
- 前記プロセッサが、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、および（４）蛍光の測定値に基づいて、前記血液試料内の好中球、単球、および好酸球から前記血液試料内の好塩基球を識別するようにさらに構成される、請求項１に記載の血液分析器。
- 前記プロセッサが、前記受けた測定値を予備選別して、前記蛍光閾値に適合しないいずれの粒子も検討対象から外すようにさらに構成される、請求項１に記載の血液分析器。
- 前記軸方向光損失検出器が、０°散乱で軸方向光損失を測定する、請求項１に記載の血液分析器。
- 前記中間角散乱検出器が、約３°〜約１５°で光角度散乱を測定する、請求項１に記載の血液分析器。
- 前記複数の検出器が、１つまたは複数の光電子増倍管を含む、請求項１に記載の血液分析器。
- 前記励起源が、レーザーである、請求項１に記載の血液分析器。
- 前記血液試料を試薬で希釈するためのインキュベーションサブシステムをさらに含む、請求項１に記載の血液分析器。
- 前記試薬が、蛍光染料および溶解薬剤を含む、請求項１４に記載の血液分析器。
- 前記試薬が、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）前記蛍光染料を含む、請求項１４に記載の血液分析器。
- 前記インキュベーションサブシステムが、前記血液試料を試薬と共に、約３０秒未満の時間、インキュベートするように構成される、請求項１４に記載の血液分析器。
- 前記インキュベーションサブシステムが、前記血液試料を試薬と共に、約３０℃〜約５０℃の温度範囲でインキュベートするように構成される、請求項１４に記載の血液分析器。
- 前記インキュベーションサブシステムが、前記血液試料を試薬と共に、約４０℃の温度でインキュベートするように構成される、請求項１４に記載の血液分析器。
- 自動化血液分析器で好塩基球分析を行う方法であって、
（ａ）全血試料を、赤血球（ＲＢＣ）溶解薬剤および細胞膜透過性核酸結合蛍光染料を含む試薬で希釈すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の希釈血液試料を、約３０秒未満のインキュベーション時間、約３０℃〜約５０℃の範囲の温度でインキュベートすること；
（ｃ）ステップ（ｂ）でインキュベートした試料を、前記血液分析器のフローセルに送り出すこと；
（ｄ）前記インキュベートした試料が前記フローセルを通過する間に、ステップ（ｃ）でインキュベートした試料を励前記起源で励起すること；
（ｅ）励起試料からの複数の光散乱シグナルおよび蛍光発光シグナルを収集すること；および
（ｆ）ステップ（ｅ）で集めた全シグナルに基づいて好塩基球クラスター分析を行うこと、
を含む方法。 - 前記好塩基球クラスター分析が、前記収集したシグナルの粗クラスタリングを含む、請求項２０に記載の方法。
- 前記好塩基球クラスター分析が、類似のクラスターを組み合わせるための決定要因として多次元確率距離尺度を利用した、前記収集したシグナルの密クラスタリングをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記試薬が、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）少なくとも１つの蛍光染料を含む、請求項２０に記載の方法。
- 前記励起源が、約３５０ｎｍ〜約７００ｎｍの波長である、請求項２０に記載の方法。
- 励前記起源が、約４８８ｎｍの波長である、請求項２０に記載の方法。
- 前記複数の光散乱シグナルが、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、および（３）９０°側方散乱を含む、請求項２０に記載の方法。
- 前記複数の光散乱シグナルが、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、および（４）９０°偏光解消側方散乱を含む、請求項２０に記載の方法。
- 蛍光染料で染色されている血液試料の好塩基球分析を行うための血液分析器であって、前記蛍光染料が細胞膜透過性および核酸結合性であり、
前記血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源；
前記励起血液試料からの光散乱および前記励起血液試料から発光される蛍光を測定するように配置された複数の検出器；および
（ａ）前記複数の検出器からの光散乱および蛍光の測定値を受け、さらに
（ｂ）前記血液試料の多次元好塩基球クラスター分析を行う
ように構成されたプロセッサ；
を含む、血液分析器。
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