JP2001091513A - 白血球の分類計数方法 - Google Patents
白血球の分類計数方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】白血球の分類計数方法の提供。
【解決手段】 （１）血液学的試料に、白血球細胞に特
異的に結合する第一蛍光標識抗体（以下第一蛍光抗
体）、好中球系細胞と結合する第二蛍光抗体及び幼若顆
粒球系細胞と結合する第三蛍光抗体（互いに区別可能な
蛍光を発する蛍光色素で標識された蛍光抗体）を添加し
て白血球細胞を蛍光染色し、試料中の赤血球を除去、
(２)試料をフローサイトメータで少なくとも１散乱光と
３蛍光を測定、(３)散乱光強度と第一蛍光抗体からの蛍
光強度とに基づいて顆粒球系細胞集団を特定、(４)特定
された顆粒球系細胞集団につき、第一蛍光抗体からの蛍
光強度と、第二又は第三蛍光抗体からの蛍光強度とに基
づいて好中球系細胞集団を特定、(５)特定された好中球
系細胞集団につき、第二蛍光抗体からの蛍光強度と、第
三蛍光抗体からの蛍光強度とに基づいて成熟度の異なる
好中球系細胞集団の細胞を分類計数する。
異的に結合する第一蛍光標識抗体（以下第一蛍光抗
体）、好中球系細胞と結合する第二蛍光抗体及び幼若顆
粒球系細胞と結合する第三蛍光抗体（互いに区別可能な
蛍光を発する蛍光色素で標識された蛍光抗体）を添加し
て白血球細胞を蛍光染色し、試料中の赤血球を除去、
(２)試料をフローサイトメータで少なくとも１散乱光と
３蛍光を測定、(３)散乱光強度と第一蛍光抗体からの蛍
光強度とに基づいて顆粒球系細胞集団を特定、(４)特定
された顆粒球系細胞集団につき、第一蛍光抗体からの蛍
光強度と、第二又は第三蛍光抗体からの蛍光強度とに基
づいて好中球系細胞集団を特定、(５)特定された好中球
系細胞集団につき、第二蛍光抗体からの蛍光強度と、第
三蛍光抗体からの蛍光強度とに基づいて成熟度の異なる
好中球系細胞集団の細胞を分類計数する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、白血球の分類計数
方法に関し、より詳細には、フローサイトメトリーを用
いて成熟度の異なる幼若顆粒球(immature granulocyte)
を分類計数しうる白血球の分類計数方法に関する。
方法に関し、より詳細には、フローサイトメトリーを用
いて成熟度の異なる幼若顆粒球(immature granulocyte)
を分類計数しうる白血球の分類計数方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】臨床検
査の分野において、成熟度の異なる顆粒球を分類計数を
することは、疾患の診断及び疾患の経過の観察を行う上
で極めて有用な情報を得ることができるため有利であ
る。例えば、通常、幼若顆粒球は、骨髄中に存在し、末
梢血液中に存在しないため、末梢血中に幼若顆粒球が出
現すれば、その患者は、感染症、炎症性疾患、慢性又は
急性骨髄球性白血病、その他の悪性腫瘍等の疾患である
可能性を示している。従って、成熟度の異なる各顆粒球
を分類計数することは、これらの疾患の診断及び経過観
察の観察に非常に有用である。
査の分野において、成熟度の異なる顆粒球を分類計数を
することは、疾患の診断及び疾患の経過の観察を行う上
で極めて有用な情報を得ることができるため有利であ
る。例えば、通常、幼若顆粒球は、骨髄中に存在し、末
梢血液中に存在しないため、末梢血中に幼若顆粒球が出
現すれば、その患者は、感染症、炎症性疾患、慢性又は
急性骨髄球性白血病、その他の悪性腫瘍等の疾患である
可能性を示している。従って、成熟度の異なる各顆粒球
を分類計数することは、これらの疾患の診断及び経過観
察の観察に非常に有用である。
【０００３】従来、幼若顆粒球の分類計数を行うには血
液の塗抹標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡
で観察しながら、細胞を、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球
の各成熟度ごとに分類し、計数する方法が一般的であっ
た。しかし、この方法では、観察のための煩雑な前処理
が必要となるとともに、細胞計数数が少ないために精度
が悪く、さらに、正確な分類を行うためには観察技師の
かなりの熟練が必要となる。
液の塗抹標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡
で観察しながら、細胞を、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球
の各成熟度ごとに分類し、計数する方法が一般的であっ
た。しかし、この方法では、観察のための煩雑な前処理
が必要となるとともに、細胞計数数が少ないために精度
が悪く、さらに、正確な分類を行うためには観察技師の
かなりの熟練が必要となる。
【０００４】一方、様々な成熟段階の血液細胞が含まれ
ている骨髄液中の血液成分の分析については、フローサ
イトメトリの原理を応用した種々の方法が提案されてい
る。例えば、白血球を特定するための第一抗体と白血球
をサブポピュレーションに分けるための第二抗体とを使
用して、骨髄液細胞の異なる細胞系列と成熟段階を特定
する方法が提案されている（米国特許5,137,809号）。
しかし、この方法は、第二抗体というただひとつのパラ
メータにより成熟段階を特定するため、顕微鏡観察のよ
うに、幼若顆粒球を成熟度に応じて分類することができ
ないという問題があった。
ている骨髄液中の血液成分の分析については、フローサ
イトメトリの原理を応用した種々の方法が提案されてい
る。例えば、白血球を特定するための第一抗体と白血球
をサブポピュレーションに分けるための第二抗体とを使
用して、骨髄液細胞の異なる細胞系列と成熟段階を特定
する方法が提案されている（米国特許5,137,809号）。
しかし、この方法は、第二抗体というただひとつのパラ
メータにより成熟段階を特定するため、顕微鏡観察のよ
うに、幼若顆粒球を成熟度に応じて分類することができ
ないという問題があった。
【０００５】また、Bowenらは、骨髄中の顆粒球系細胞
の成熟度が、CD16とCD11bとの発現強度に反映されるこ
とを発表している（Abnormal patterns of expression
of CD16 (FcRgIII) and CD11b (CRIII) antigens by de
veloping neutrophils in thebone marrow of patients
with myelodysplastic syndrome（Laboratory Hematol
ogy.，Vol. 3，No. 4，292〜298，1997）。この方法に
よれば、まず、顆粒球系細胞をCD45とSSC（側方散乱
光：Side Scatter）とで特定し、その顆粒球系細胞にお
けるCD16とCD11bとの発現強度を調べることにより、成
熟段階を推定することができる。しかし、この方法で
は、成熟好酸球と幼若顆粒球とを区別することができ
ず、測定結果の信頼性は低くなる。つまり、成熟好酸球
は、幼若顆粒球と同様にCD16陰性、CD11b陰性のため、
両者を分離することができない。
の成熟度が、CD16とCD11bとの発現強度に反映されるこ
とを発表している（Abnormal patterns of expression
of CD16 (FcRgIII) and CD11b (CRIII) antigens by de
veloping neutrophils in thebone marrow of patients
with myelodysplastic syndrome（Laboratory Hematol
ogy.，Vol. 3，No. 4，292〜298，1997）。この方法に
よれば、まず、顆粒球系細胞をCD45とSSC（側方散乱
光：Side Scatter）とで特定し、その顆粒球系細胞にお
けるCD16とCD11bとの発現強度を調べることにより、成
熟段階を推定することができる。しかし、この方法で
は、成熟好酸球と幼若顆粒球とを区別することができ
ず、測定結果の信頼性は低くなる。つまり、成熟好酸球
は、幼若顆粒球と同様にCD16陰性、CD11b陰性のため、
両者を分離することができない。
【０００６】一方、末梢血サンプル中の白血球成分分析
に関しても種々の方法が提案されている。例えば、非イ
オン性界面活性剤とアミノ酸とを含む試薬により成熟し
た白血球を溶血させることによって、幼若顆粒球を測定
する方法が提案されている（米国特許5,413,938号）。
しかし、この方法では、幼若顆粒球以外の白血球は全て
溶血してしまうため、全体の白血球が特定できず、した
がって、この方法単独では、白血球に対する幼若顆粒球
の分類比率を算出することができない。
に関しても種々の方法が提案されている。例えば、非イ
オン性界面活性剤とアミノ酸とを含む試薬により成熟し
た白血球を溶血させることによって、幼若顆粒球を測定
する方法が提案されている（米国特許5,413,938号）。
しかし、この方法では、幼若顆粒球以外の白血球は全て
溶血してしまうため、全体の白血球が特定できず、した
がって、この方法単独では、白血球に対する幼若顆粒球
の分類比率を算出することができない。
【０００７】また、Hublらは、CD16の発現に基づいた幼
若な好中球の検出方法に関して報告している（Value of
neutrophil CD16 expression for detection of left
shift and acute-phase response（Am. J. Clin. Patho
l.， 107(2):187-196，Feb.1997)。しかし、この方法
も、幼若顆粒球を成熟度に応じて分類する方法について
は記載されていない。このような現状から、末梢血中の
幼若顆粒球を他の白血球細胞の影響を受けないように精
度よく計数し、かつ幼若顆粒球を成熟度によって分類す
るための方法が要求されている。
若な好中球の検出方法に関して報告している（Value of
neutrophil CD16 expression for detection of left
shift and acute-phase response（Am. J. Clin. Patho
l.， 107(2):187-196，Feb.1997)。しかし、この方法
も、幼若顆粒球を成熟度に応じて分類する方法について
は記載されていない。このような現状から、末梢血中の
幼若顆粒球を他の白血球細胞の影響を受けないように精
度よく計数し、かつ幼若顆粒球を成熟度によって分類す
るための方法が要求されている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、（１）
血液学的試料に、以下の、互いに区別可能な蛍光を発す
る蛍光色素で標識された蛍光標識抗体；(a)白血球細胞
に特異的に結合する第一の蛍光標識抗体、(b)好中球系
細胞と結合する第二の蛍光標識抗体及び(c)幼若顆粒球
系細胞と結合する第三の蛍光標識抗体、を添加して白血
球を蛍光染色し、血液学的試料中の赤血球を除去し、
(２)得られた血液学的試料をフローサイトメータに供し
て、少なくとも１つの散乱光と３つの蛍光を測定し、
(３)散乱光強度と第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度と
に基づいて顆粒球系細胞集団を特定し、(４)特定された
顆粒球系細胞集団について、第一の蛍光標識抗体からの
蛍光強度と、第二又は第三の蛍光標識抗体からの蛍光強
度とに基づいて好中球系細胞集団を特定し、(５)特定さ
れた好中球系細胞集団について、第二の蛍光標識抗体か
らの蛍光強度と、第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度と
に基づいて成熟度の異なる好中球系細胞集団の細胞を分
類計数することからなる白血球の分類計数方法が提供さ
れる。
血液学的試料に、以下の、互いに区別可能な蛍光を発す
る蛍光色素で標識された蛍光標識抗体；(a)白血球細胞
に特異的に結合する第一の蛍光標識抗体、(b)好中球系
細胞と結合する第二の蛍光標識抗体及び(c)幼若顆粒球
系細胞と結合する第三の蛍光標識抗体、を添加して白血
球を蛍光染色し、血液学的試料中の赤血球を除去し、
(２)得られた血液学的試料をフローサイトメータに供し
て、少なくとも１つの散乱光と３つの蛍光を測定し、
(３)散乱光強度と第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度と
に基づいて顆粒球系細胞集団を特定し、(４)特定された
顆粒球系細胞集団について、第一の蛍光標識抗体からの
蛍光強度と、第二又は第三の蛍光標識抗体からの蛍光強
度とに基づいて好中球系細胞集団を特定し、(５)特定さ
れた好中球系細胞集団について、第二の蛍光標識抗体か
らの蛍光強度と、第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度と
に基づいて成熟度の異なる好中球系細胞集団の細胞を分
類計数することからなる白血球の分類計数方法が提供さ
れる。
【０００９】
【発明実施の形態】本発明において、工程(1)で用いる
血液学的試料とは、哺乳動物、ことにヒトの末梢血液、
骨髄液、尿、アフェレーシス（apheresis)等で採取した
試料などの体液試料を意味する。これらの血液学的試料
は、採取した試料をそのまま本発明の工程に付してもよ
いし、例えば、適量のへパリンを添加したものを本発明
の工程に付してもよい。
血液学的試料とは、哺乳動物、ことにヒトの末梢血液、
骨髄液、尿、アフェレーシス（apheresis)等で採取した
試料などの体液試料を意味する。これらの血液学的試料
は、採取した試料をそのまま本発明の工程に付してもよ
いし、例えば、適量のへパリンを添加したものを本発明
の工程に付してもよい。
【００１０】白血球細胞に特異的に結合する第一の蛍光
標識抗体の抗体は、白血球を構成する各種細胞、つま
り、単球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球等に特
異的に結合する抗体であれば特に限定されるものではな
く、例えば、抗CD45抗体などが挙げられる。この抗体
は、一般に市販されているものを使用することができ
る。
標識抗体の抗体は、白血球を構成する各種細胞、つま
り、単球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球等に特
異的に結合する抗体であれば特に限定されるものではな
く、例えば、抗CD45抗体などが挙げられる。この抗体
は、一般に市販されているものを使用することができ
る。
【００１１】好中球系細胞と結合する第二の蛍光標識抗
体の抗体は、成熟段階に応じて細胞表面において密度が
変化する抗原を認識して、好中球系細胞と結合すること
ができる抗体であり、例えば、前骨髄球(promyelocyt
e)、骨髄球(myelocyte)、後骨髄球(metamyelocyte)、杆
状核球（band form）、分節核球（segmented form）等
の１種又は２種以上に結合する抗体であれば特に限定さ
れるものではない。具体的には、抗CD11b抗体、抗CD16
抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体等が挙げられる。ま
た、この抗体は、上記抗原に結合する限り、他の細胞、
例えば、単球、好酸球、リンパ球等に結合するものであ
ってもよい。これらの抗体は、一般に市販されているも
のを使用することができる。
体の抗体は、成熟段階に応じて細胞表面において密度が
変化する抗原を認識して、好中球系細胞と結合すること
ができる抗体であり、例えば、前骨髄球(promyelocyt
e)、骨髄球(myelocyte)、後骨髄球(metamyelocyte)、杆
状核球（band form）、分節核球（segmented form）等
の１種又は２種以上に結合する抗体であれば特に限定さ
れるものではない。具体的には、抗CD11b抗体、抗CD16
抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体等が挙げられる。ま
た、この抗体は、上記抗原に結合する限り、他の細胞、
例えば、単球、好酸球、リンパ球等に結合するものであ
ってもよい。これらの抗体は、一般に市販されているも
のを使用することができる。
【００１２】幼若顆粒球系細胞と結合する第三の蛍光標
識抗体は、成熟段階に応じて顆粒球の表面において密度
が変化する抗原を認識して、幼若顆粒球系細胞と結合す
ることができる抗体であり、例えば、前骨髄球、骨髄
球、後骨髄球等の１種又は２種以上に結合する抗体であ
れば特に限定されるものではない。具体的には、抗CD11
b抗体、抗CD16抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体等が挙
げられる。ただし、第二の蛍光標識抗体における抗体と
は異なる抗体であることを要する。また、この抗体は、
上記抗原に結合する限り、他の細胞、例えば、単球、好
酸球、リンパ球等に結合するものであってもよい。
識抗体は、成熟段階に応じて顆粒球の表面において密度
が変化する抗原を認識して、幼若顆粒球系細胞と結合す
ることができる抗体であり、例えば、前骨髄球、骨髄
球、後骨髄球等の１種又は２種以上に結合する抗体であ
れば特に限定されるものではない。具体的には、抗CD11
b抗体、抗CD16抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体等が挙
げられる。ただし、第二の蛍光標識抗体における抗体と
は異なる抗体であることを要する。また、この抗体は、
上記抗原に結合する限り、他の細胞、例えば、単球、好
酸球、リンパ球等に結合するものであってもよい。
【００１３】本発明においては、第二と第三の蛍光標識
抗体における抗体は、例えば、抗CD16抗体と抗CD11b抗
体、抗CD16抗体と抗CD66b抗体、抗CD16抗体と抗CD66c抗
体、抗CD11b抗体と抗CD66b抗体又は抗CD11b抗体と抗CD6
6c抗体のいずれかの組み合わせが挙げられる。なかで
も、抗CD16抗体と抗CD11b抗体の組み合わせが好まし
い。
抗体における抗体は、例えば、抗CD16抗体と抗CD11b抗
体、抗CD16抗体と抗CD66b抗体、抗CD16抗体と抗CD66c抗
体、抗CD11b抗体と抗CD66b抗体又は抗CD11b抗体と抗CD6
6c抗体のいずれかの組み合わせが挙げられる。なかで
も、抗CD16抗体と抗CD11b抗体の組み合わせが好まし
い。
【００１４】上記抗体を蛍光標識抗体とするための蛍光
標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネー
ト(fluorescein isothiocyanate:FITC)、フィコエリス
リン(phicoerythrin:PE)、アロフィコシアニン(allophi
cocyanin：APC)、テキサスレッド(Texas Red)、PE-CY
5、ペリジンクロロフィルプロテイン(Peridinin Chloro
phyll Protein :PerCP)などによる標識化合物が挙げら
れる。本発明で使用する3つの抗体に結合させる蛍光標
識化合物は、互いに異なるスペクトルを有していること
が必要である。例えば、FITC、PE及びPE-CY5の組み合わ
せ、FITC、PE及びPerCPの組み合わせなどが挙げられ
る。
標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネー
ト(fluorescein isothiocyanate:FITC)、フィコエリス
リン(phicoerythrin:PE)、アロフィコシアニン(allophi
cocyanin：APC)、テキサスレッド(Texas Red)、PE-CY
5、ペリジンクロロフィルプロテイン(Peridinin Chloro
phyll Protein :PerCP)などによる標識化合物が挙げら
れる。本発明で使用する3つの抗体に結合させる蛍光標
識化合物は、互いに異なるスペクトルを有していること
が必要である。例えば、FITC、PE及びPE-CY5の組み合わ
せ、FITC、PE及びPerCPの組み合わせなどが挙げられ
る。
【００１５】血液学的試料に蛍光標識抗体を添加する際
の混合比は、用いる血液学的試料の状態、蛍光標識抗体
の種類等により適宜調整することができるが、血液学的
試料と各蛍光標識抗体とが容量比で、例えば、20：1〜
2:1程度が挙げられる。この際の反応温度、反応時間
は、血液学的試料と各蛍光標識抗体との混合比などによ
り適宜調整することができるが、例えば、室温で15〜30
分間、０〜１０℃で30〜40分程度が好ましい。血液学的
試料に各蛍光標識抗体を添加する方法としては、血液学
的試料に、第一抗体、第二抗体、第三抗体を順次添加し
てもよいし、任意の順序で添加してもよい。また、各抗
体を別途混合し、この混合物を血液学的試料に添加して
もよい。
の混合比は、用いる血液学的試料の状態、蛍光標識抗体
の種類等により適宜調整することができるが、血液学的
試料と各蛍光標識抗体とが容量比で、例えば、20：1〜
2:1程度が挙げられる。この際の反応温度、反応時間
は、血液学的試料と各蛍光標識抗体との混合比などによ
り適宜調整することができるが、例えば、室温で15〜30
分間、０〜１０℃で30〜40分程度が好ましい。血液学的
試料に各蛍光標識抗体を添加する方法としては、血液学
的試料に、第一抗体、第二抗体、第三抗体を順次添加し
てもよいし、任意の順序で添加してもよい。また、各抗
体を別途混合し、この混合物を血液学的試料に添加して
もよい。
【００１６】また、血液学的試料において、赤血球を除
去する。赤血球の除去は、後工程のフローサイトメトリ
において、白血球の測定の障害となる赤血球の影響を排
除することを目的として行うものである。赤血球を除去
する方法としては、得られた血液学的試料をデキストラ
ン溶液により処理し、赤血球を沈降させる方法、Ficoll
-Hypaqueのような比重液により処理し、白血球と赤血球
を分離する方法、赤血球に傷害を与えるような試薬を用
いて処理し、赤血球を溶血する方法などが挙げられる。
なかでも、例えば、得られた血液学的試料を塩化アンモ
ニウムをベースとした溶血剤によって処理し、赤血球を
溶血する方法が、簡便性と白血球の流出が少ないことか
ら、好ましい。なお、本発明では、後述する工程（３）
〜工程（６）を行うために支障が生じない限り、工程
（１）において、血液学的試料の白血球を蛍光染色した
後に、赤血球を除去してもよいし、赤血球を除去した
後、白血球の蛍光染色をしてもよいし、第一から第三の
蛍光標識抗体を添加する各サブ工程の間に赤血球を除去
してもよい。
去する。赤血球の除去は、後工程のフローサイトメトリ
において、白血球の測定の障害となる赤血球の影響を排
除することを目的として行うものである。赤血球を除去
する方法としては、得られた血液学的試料をデキストラ
ン溶液により処理し、赤血球を沈降させる方法、Ficoll
-Hypaqueのような比重液により処理し、白血球と赤血球
を分離する方法、赤血球に傷害を与えるような試薬を用
いて処理し、赤血球を溶血する方法などが挙げられる。
なかでも、例えば、得られた血液学的試料を塩化アンモ
ニウムをベースとした溶血剤によって処理し、赤血球を
溶血する方法が、簡便性と白血球の流出が少ないことか
ら、好ましい。なお、本発明では、後述する工程（３）
〜工程（６）を行うために支障が生じない限り、工程
（１）において、血液学的試料の白血球を蛍光染色した
後に、赤血球を除去してもよいし、赤血球を除去した
後、白血球の蛍光染色をしてもよいし、第一から第三の
蛍光標識抗体を添加する各サブ工程の間に赤血球を除去
してもよい。
【００１７】工程(２)において使用するフローサイトメ
ータは、一般に市販されているものであれば、特に限定
されるものではなくどのようなものでも使用することが
できる。このようなフローサイトメータにより、上記で
得られた血液学的試料について、少なくとも1つの散乱
光信号と３つの蛍光信号を測定する。一般的にフローサ
イトメータで測定することのできる散乱光は前方散乱光
(Forward Scatter : FSC)、側方散乱光(Side Scatter:
SSC)が挙げられるが、本発明では、細胞の大きさと、細
胞中に存在する顆粒に応じて信号強度を増す側方散乱光
が好ましい。蛍光は、使用する蛍光標識抗体の標識化合
物の種類により異なるが、例えば、緑蛍光、オレンジ蛍
光、赤蛍光の組み合わせ等が挙げられる。
ータは、一般に市販されているものであれば、特に限定
されるものではなくどのようなものでも使用することが
できる。このようなフローサイトメータにより、上記で
得られた血液学的試料について、少なくとも1つの散乱
光信号と３つの蛍光信号を測定する。一般的にフローサ
イトメータで測定することのできる散乱光は前方散乱光
(Forward Scatter : FSC)、側方散乱光(Side Scatter:
SSC)が挙げられるが、本発明では、細胞の大きさと、細
胞中に存在する顆粒に応じて信号強度を増す側方散乱光
が好ましい。蛍光は、使用する蛍光標識抗体の標識化合
物の種類により異なるが、例えば、緑蛍光、オレンジ蛍
光、赤蛍光の組み合わせ等が挙げられる。
【００１８】工程(３)〜(５)において、少なくとも1つ
の散乱光信号と3つの蛍光信号から、成熟度の異なる幼
若顆粒球を分類計数することができる。まず、工程(３)
において、散乱光強度と第一の蛍光標識抗体からの蛍光
強度とに基づいて顆粒球系細胞集団（幼若顆粒球、成熟
好中球及び好酸球）を特定する。具体的には、散乱光強
度と第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度とを測定し、両
強度を２軸とする２次元分布（例えば、スキャッタグラ
ム）を得る。これにより、幼若顆粒球を含む顆粒球集団
を、単球、リンパ球、好塩基球及び、試料中に残存する
赤血球又は溶血処理によって発生した赤血球破砕物（デ
ブリス）から分離することができる（図２参照）。な
お、この際得られる２次元分布においては、上述したよ
うに、幼若顆粒球を含む顆粒球集団のほかに、単球、リ
ンパ球、好塩基球及びデブリスをそれぞれ特定すること
ができるため、顆粒球集団、単球、リンパ球及び好塩基
球を含む集団を特定し、計数することにより、全白血球
数を計数することができる（図１参照）。
の散乱光信号と3つの蛍光信号から、成熟度の異なる幼
若顆粒球を分類計数することができる。まず、工程(３)
において、散乱光強度と第一の蛍光標識抗体からの蛍光
強度とに基づいて顆粒球系細胞集団（幼若顆粒球、成熟
好中球及び好酸球）を特定する。具体的には、散乱光強
度と第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度とを測定し、両
強度を２軸とする２次元分布（例えば、スキャッタグラ
ム）を得る。これにより、幼若顆粒球を含む顆粒球集団
を、単球、リンパ球、好塩基球及び、試料中に残存する
赤血球又は溶血処理によって発生した赤血球破砕物（デ
ブリス）から分離することができる（図２参照）。な
お、この際得られる２次元分布においては、上述したよ
うに、幼若顆粒球を含む顆粒球集団のほかに、単球、リ
ンパ球、好塩基球及びデブリスをそれぞれ特定すること
ができるため、顆粒球集団、単球、リンパ球及び好塩基
球を含む集団を特定し、計数することにより、全白血球
数を計数することができる（図１参照）。
【００１９】次いで、工程(４)において、特定された顆
粒球系細胞集団について、第一の蛍光標識抗体からの蛍
光強度と、第二又は第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度
とを測定することにより、好中球系細胞（成熟好中球及
び幼若顆粒球）を特定する。これには、好酸球の有する
抗原密度の特異性を利用することができる。例えば、第
一抗体に抗CD45抗体、第二又は第三抗体に抗CD16抗体を
用いた場合、成熟好中球は抗CD16抗体に陽性であり、好
酸球と幼若顆粒球とは抗CD16抗体に陰性であり、また、
好酸球の抗CD45抗体の抗原密度は幼若顆粒球よりも高
い。よって、第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度と、第
二又は第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度とを２軸とす
る２次元分布を得ることにより、好中球系細胞は好酸球
と容易に分離することができる（図３参照）。
粒球系細胞集団について、第一の蛍光標識抗体からの蛍
光強度と、第二又は第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度
とを測定することにより、好中球系細胞（成熟好中球及
び幼若顆粒球）を特定する。これには、好酸球の有する
抗原密度の特異性を利用することができる。例えば、第
一抗体に抗CD45抗体、第二又は第三抗体に抗CD16抗体を
用いた場合、成熟好中球は抗CD16抗体に陽性であり、好
酸球と幼若顆粒球とは抗CD16抗体に陰性であり、また、
好酸球の抗CD45抗体の抗原密度は幼若顆粒球よりも高
い。よって、第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度と、第
二又は第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度とを２軸とす
る２次元分布を得ることにより、好中球系細胞は好酸球
と容易に分離することができる（図３参照）。
【００２０】さらに、工程(５)において、特定された好
中球系細胞集団（成熟好中球及び幼若顆粒球）につい
て、第二及び第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度を測定
することにより、幼若顆粒球を特定し、さらに、この幼
若顆粒球を成熟度に応じて分類する。この目的に用いる
第二抗体と第三抗体は、対応する抗原の発現が、好中球
系細胞の成熟過程に応じて変化するものを選択すること
ができるが、成熟度による分類を効果的に行うために
は、両者の発現時期が異なっているものが好ましい。こ
のためには、例えば、第二及び第三抗体として、抗CD16
抗体と抗CD11b抗体との組み合わせが挙げられる。つま
り、好中球系細胞の成熟過程において、好中球系細胞の
表面の抗原CD11bとCD16とはともに成熟するに従って発
現するが、CD11bはCD16よりも発現時期が早い。よっ
て、第二抗体に抗CD16抗体、第三抗体に抗CD11b抗体を
用い、第二及び第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度を２
軸とする２次元分布を得ることにより、第二抗体の蛍光
強度の差から幼若顆粒球を成熟好中球と分離することが
でき（図４参照）、さらに、第三の蛍光標識抗体の蛍光
強度の差から成熟度の異なる幼若顆粒球に分類すること
ができる（図５参照）。
中球系細胞集団（成熟好中球及び幼若顆粒球）につい
て、第二及び第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度を測定
することにより、幼若顆粒球を特定し、さらに、この幼
若顆粒球を成熟度に応じて分類する。この目的に用いる
第二抗体と第三抗体は、対応する抗原の発現が、好中球
系細胞の成熟過程に応じて変化するものを選択すること
ができるが、成熟度による分類を効果的に行うために
は、両者の発現時期が異なっているものが好ましい。こ
のためには、例えば、第二及び第三抗体として、抗CD16
抗体と抗CD11b抗体との組み合わせが挙げられる。つま
り、好中球系細胞の成熟過程において、好中球系細胞の
表面の抗原CD11bとCD16とはともに成熟するに従って発
現するが、CD11bはCD16よりも発現時期が早い。よっ
て、第二抗体に抗CD16抗体、第三抗体に抗CD11b抗体を
用い、第二及び第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度を２
軸とする２次元分布を得ることにより、第二抗体の蛍光
強度の差から幼若顆粒球を成熟好中球と分離することが
でき（図４参照）、さらに、第三の蛍光標識抗体の蛍光
強度の差から成熟度の異なる幼若顆粒球に分類すること
ができる（図５参照）。
【００２１】なお、ここで成熟度の異なる幼若顆粒球に
分類するとは、たとえば、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球
等を少なくとも２つの幼若顆粒球グループに分類計数す
ることをいう。このように分類計数された全幼若顆粒球
及び成熟度の異なる各幼若顆粒球は、工程（３）におい
て得られる全白血球の細胞数で除算することにより、全
白血球に対する細胞比率を求めることができる。
分類するとは、たとえば、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球
等を少なくとも２つの幼若顆粒球グループに分類計数す
ることをいう。このように分類計数された全幼若顆粒球
及び成熟度の異なる各幼若顆粒球は、工程（３）におい
て得られる全白血球の細胞数で除算することにより、全
白血球に対する細胞比率を求めることができる。
【００２２】以下に本発明の幼若顆粒球の分類計数方法
の実施例を具体的に説明する。 実施例1 まず、以下の組成の試薬を調製した。 蛍光標識抗体 ・PerCP標識抗CD45抗体（Becton Dickinson社製、Anti
-Hle-1，赤蛍光を有する第一抗体） ・FITC蛍光標識抗CD16抗体（Becton Dickinson社製、L
eu-11b，緑蛍光を有する第一抗体） ・PE標識抗CD11b抗体（Becton Dickinson社製、Leu-1
5，オレンジ蛍光を有する第三抗体） 塩化アンモニウムをベースとした溶血剤 ・塩化アンモニウム(NH4Cl) 8.26g/L ・炭酸水素カリウム(KHCO3) 1.0g/L ・EDTA-4Na 0.037g/L ・精製水
の実施例を具体的に説明する。 実施例1 まず、以下の組成の試薬を調製した。 蛍光標識抗体 ・PerCP標識抗CD45抗体（Becton Dickinson社製、Anti
-Hle-1，赤蛍光を有する第一抗体） ・FITC蛍光標識抗CD16抗体（Becton Dickinson社製、L
eu-11b，緑蛍光を有する第一抗体） ・PE標識抗CD11b抗体（Becton Dickinson社製、Leu-1
5，オレンジ蛍光を有する第三抗体） 塩化アンモニウムをベースとした溶血剤 ・塩化アンモニウム(NH4Cl) 8.26g/L ・炭酸水素カリウム(KHCO3) 1.0g/L ・EDTA-4Na 0.037g/L ・精製水
【００２３】まず、ヘパリンを添加することにより抗凝
固剤処理した末梢血液100μLにFITC標識抗CD16抗体、PE
標識抗CD11b抗体、PerCP標識抗CD45抗体をそれぞれ10μ
L加え、室温で約３０分間インキュベーションし、白血
球を蛍光染色した。その後、塩化アンモニウムをベース
とした溶血剤を2mL加え、室温で５分間インキュベーシ
ョンすることにより、白血球の測定の障害となる赤血球
を除去するために、赤血球を溶血させた。
固剤処理した末梢血液100μLにFITC標識抗CD16抗体、PE
標識抗CD11b抗体、PerCP標識抗CD45抗体をそれぞれ10μ
L加え、室温で約３０分間インキュベーションし、白血
球を蛍光染色した。その後、塩化アンモニウムをベース
とした溶血剤を2mL加え、室温で５分間インキュベーシ
ョンすることにより、白血球の測定の障害となる赤血球
を除去するために、赤血球を溶血させた。
【００２４】得られた血液学的試料について、光源とし
て488nmのアルゴンイオンレーザを装備したフローサイ
トメータで、側方散乱光及び530nm（緑）、585nm（オレ
ンジ）、650nm（赤）の波長の蛍光を測定した。側方散
乱光強度及び赤蛍光強度を座標軸とする個々の細胞の分
布を描いたスキャッタグラムを図６に示す。図６では顆
粒球、単球、リンパ球、好塩基球、デブリスの５集団が
認められた。解析は、図７に示したように、白血球全体
をウィンドウ(W1)によって囲み、白血球全体の数を計数
した。さらに同一のスキャッタグラム中で顆粒球をウィ
ンドウ（W2）によって囲んだ（図７）。
て488nmのアルゴンイオンレーザを装備したフローサイ
トメータで、側方散乱光及び530nm（緑）、585nm（オレ
ンジ）、650nm（赤）の波長の蛍光を測定した。側方散
乱光強度及び赤蛍光強度を座標軸とする個々の細胞の分
布を描いたスキャッタグラムを図６に示す。図６では顆
粒球、単球、リンパ球、好塩基球、デブリスの５集団が
認められた。解析は、図７に示したように、白血球全体
をウィンドウ(W1)によって囲み、白血球全体の数を計数
した。さらに同一のスキャッタグラム中で顆粒球をウィ
ンドウ（W2）によって囲んだ（図７）。
【００２５】また、緑蛍光強度及び赤蛍光強度を座標軸
とし、ウィンドウ(W2)内の細胞のみの細胞分布を描いた
スキャッタグラムを図８に示す。図８には好酸球、幼若
顆粒球、成熟好中球の３集団が認められた。解析は、図
８に示したように、好中球系細胞（幼若顆粒球及び成熟
好中球）をウィンドウ（W3）によって囲んだ。さらに、
緑蛍光強度及びオレンジ蛍光強度を座標軸とし、ウィン
ドウ（W3）内の細胞のみの細胞分布を描いたスキャッタ
グラムを図９示す。図９には幼若顆粒球ステージI、幼
若顆粒球ステージII、成熟好中球の３集団が認められ
た。解析は図９に示したように、２つの幼若顆粒球をウ
ィンドウ（W4）で囲み、全幼若顆粒球数を計数した。
とし、ウィンドウ(W2)内の細胞のみの細胞分布を描いた
スキャッタグラムを図８に示す。図８には好酸球、幼若
顆粒球、成熟好中球の３集団が認められた。解析は、図
８に示したように、好中球系細胞（幼若顆粒球及び成熟
好中球）をウィンドウ（W3）によって囲んだ。さらに、
緑蛍光強度及びオレンジ蛍光強度を座標軸とし、ウィン
ドウ（W3）内の細胞のみの細胞分布を描いたスキャッタ
グラムを図９示す。図９には幼若顆粒球ステージI、幼
若顆粒球ステージII、成熟好中球の３集団が認められ
た。解析は図９に示したように、２つの幼若顆粒球をウ
ィンドウ（W4）で囲み、全幼若顆粒球数を計数した。
【００２６】次に、全幼若顆粒球数を、上記で求めた全
白血球で除算することにより、白血球数に対する幼若顆
粒球比率を求めた。なお、実施例1とは別に、実施例1と
同様の血液学的試料を用いて、用手法（メイグリュンワ
ルド-ギムザ染色、800カウント）により、幼若顆粒球を
分類計数した。本実施例１のフローサイトメータで測定
した幼若顆粒球比率と用手法で測定した幼若顆粒球比率
との相関図を図１０に示す。図１０に示すように、相関
係数ｒ2は0.87となり、実施例1の方法が幼若顆粒球の分
類計数について非常に精度が高いことが確認された。
白血球で除算することにより、白血球数に対する幼若顆
粒球比率を求めた。なお、実施例1とは別に、実施例1と
同様の血液学的試料を用いて、用手法（メイグリュンワ
ルド-ギムザ染色、800カウント）により、幼若顆粒球を
分類計数した。本実施例１のフローサイトメータで測定
した幼若顆粒球比率と用手法で測定した幼若顆粒球比率
との相関図を図１０に示す。図１０に示すように、相関
係数ｒ2は0.87となり、実施例1の方法が幼若顆粒球の分
類計数について非常に精度が高いことが確認された。
【００２７】実施例２ 実施例1と同様の方法により末梢血液を用い幼若顆粒球
の測定を行った。解析は図１１に示したように２つの幼
若顆粒球集団を個々のウィンドウ（W5,W6）で囲み、幼
若顆粒球ステージI及び幼若顆粒球ステージIIの細胞数
を計数して、白血球に対する細胞比率を求めた。また、
実施例２とは別に、実施例２と同様の血液学的試料を用
いて、用手法（メイグリュンワルド-ギムザ染色）によ
り各幼若顆粒球の測定を行った。なお、用手法における
幼若顆粒球ステージIは前骨髄球及び骨髄球、幼若顆粒
球ステージIIは後骨髄球に対応する。幼若顆粒球ステー
ジIでは図１２に示すように、相関係数r2は0.87となっ
た。また、幼若顆粒球ステージIIでは図１３に示すよう
に相関係数r2は0.80となった。これらのことから、実施
例２の方法が幼若顆粒球の各ステージにおける分類計数
について非常に精度が高いことが確認された。
の測定を行った。解析は図１１に示したように２つの幼
若顆粒球集団を個々のウィンドウ（W5,W6）で囲み、幼
若顆粒球ステージI及び幼若顆粒球ステージIIの細胞数
を計数して、白血球に対する細胞比率を求めた。また、
実施例２とは別に、実施例２と同様の血液学的試料を用
いて、用手法（メイグリュンワルド-ギムザ染色）によ
り各幼若顆粒球の測定を行った。なお、用手法における
幼若顆粒球ステージIは前骨髄球及び骨髄球、幼若顆粒
球ステージIIは後骨髄球に対応する。幼若顆粒球ステー
ジIでは図１２に示すように、相関係数r2は0.87となっ
た。また、幼若顆粒球ステージIIでは図１３に示すよう
に相関係数r2は0.80となった。これらのことから、実施
例２の方法が幼若顆粒球の各ステージにおける分類計数
について非常に精度が高いことが確認された。
【図１】本発明の白血球の分類計数方法における血液学
的試料の側方散乱光強度と第一抗体の蛍光強度とのスキ
ャッタグラムである。
的試料の側方散乱光強度と第一抗体の蛍光強度とのスキ
ャッタグラムである。
【図２】本発明の白血球の分類計数方法における血液学
的試料の側方散乱光強度と第一抗体の蛍光強度とのスキ
ャッタグラムである。
的試料の側方散乱光強度と第一抗体の蛍光強度とのスキ
ャッタグラムである。
【図３】本発明の白血球の分類計数方法における血液学
的試料の第一抗体の蛍光強度と第二抗体の蛍光強度との
スキャッタグラムである。
的試料の第一抗体の蛍光強度と第二抗体の蛍光強度との
スキャッタグラムである。
【図４】本発明の白血球の分類計数方法における血液学
的試料の第三抗体の蛍光強度と第一抗体の蛍光強度との
スキャッタグラムである。
的試料の第三抗体の蛍光強度と第一抗体の蛍光強度との
スキャッタグラムである。
【図５】本発明の白血球の分類計数方法における血液学
的試料の第三抗体の蛍光強度と第一抗体の蛍光強度との
スキャッタグラムである。
的試料の第三抗体の蛍光強度と第一抗体の蛍光強度との
スキャッタグラムである。
【図６】本発明の白血球の分類計数方法における実施例
１の血液学的試料の側方散乱光強度と赤蛍光強度とのス
キャッタグラムである。
１の血液学的試料の側方散乱光強度と赤蛍光強度とのス
キャッタグラムである。
【図７】本発明の白血球の分類計数方法における実施例
1の血液学的試料の側方散乱光強度と赤蛍光強度とのス
キャッタグラムである。
1の血液学的試料の側方散乱光強度と赤蛍光強度とのス
キャッタグラムである。
【図８】本発明の白血球の分類計数方法における実施例
１の血液学的試料の赤蛍光強度と緑蛍光強度とのスキャ
ッタグラムである。
１の血液学的試料の赤蛍光強度と緑蛍光強度とのスキャ
ッタグラムである。
【図９】本発明の白血球の分類計数方法における実施例
1の血液学的試料のオレンジ蛍光強度と緑蛍光強度との
スキャッタグラムである。
1の血液学的試料のオレンジ蛍光強度と緑蛍光強度との
スキャッタグラムである。
【図１０】本発明の白血球の分類計数方法と用手法とに
よる幼若顆粒球比率の相関関係を示す図である。
よる幼若顆粒球比率の相関関係を示す図である。
【図１１】本発明の白血球の分類計数方法における実施
例２の血液学的試料のオレンジ蛍光強度と緑蛍光強度と
のスキャッタグラムである。
例２の血液学的試料のオレンジ蛍光強度と緑蛍光強度と
のスキャッタグラムである。
【図１２】本発明の白血球の分類計数方法と用手法とに
よる幼若顆粒球比率（ステージI）の相関関係を示す図
である。
よる幼若顆粒球比率（ステージI）の相関関係を示す図
である。
【図１３】本発明の白血球の分類計数方法と用手法とに
よる幼若顆粒球比率（ステージII）の相関関係を示す図
である。
よる幼若顆粒球比率（ステージII）の相関関係を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 藤本 裕之 神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号 シスメックス株式会社内 (72)発明者 坂田 孝 神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号 シスメックス株式会社内 (72)発明者 浜口 行雄 神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号 シスメックス株式会社内
Claims (11)
- 【請求項１】 （１）血液学的試料に、以下の、互いに
区別可能な蛍光を発する蛍光色素で標識された蛍光標識
抗体； (a)白血球細胞に特異的に結合する第一の蛍光標識抗
体、 (b)好中球系細胞と結合する第二の蛍光標識抗体及び (c)幼若顆粒球系細胞と結合する第三の蛍光標識抗体、
を添加して白血球細胞を蛍光染色し、血液学的試料中の
赤血球を除去し、(２)得られた血液学的試料をフローサ
イトメータに供して、少なくとも１つの散乱光と３つの
蛍光を測定し、(３)散乱光強度と第一の蛍光標識抗体か
らの蛍光強度とに基づいて顆粒球系細胞集団を特定し、
(４)特定された顆粒球系細胞集団について、第一の蛍光
標識抗体からの蛍光強度と、第二又は第三の蛍光標識抗
体からの蛍光強度とに基づいて好中球系細胞集団を特定
し、(５)特定された好中球系細胞集団について、第二の
蛍光標識抗体からの蛍光強度と、第三の蛍光標識抗体か
らの蛍光強度とに基づいて成熟度の異なる好中球系細胞
集団の細胞を分類計数することからなる白血球の分類計
数方法。 - 【請求項２】 工程(３)において、散乱光強度と第一の
蛍光標識抗体からの蛍光強度とに基づいて顆粒球系細胞
集団に加えて全白血球集団を特定し、かつ計数し、工程
(５)で計数された成熟度の異なる各好中球系細胞の全白
血球に占める比率を算出することを特徴とする請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 第一の蛍光標識抗体が、抗CD45抗体であ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 第二の蛍光標識抗体が、抗CD11b抗体、
抗CD16抗体、抗CD66b抗体及び抗CD66c抗体からなるグル
ープから選ばれた抗体であり、第三の蛍光標識抗体が、
前記第二の蛍光標識抗体とは異なる前記グループから選
ばれた抗体である請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 第二と第三の蛍光標識抗体が、抗CD16抗
体と抗CD11b抗体、抗CD16抗体と抗CD66b抗体、抗CD16抗
体と抗CD66c抗体、抗CD11b抗体と抗CD66b抗体又は抗CD1
1b抗体と抗CD66c抗体のいずれかの組み合わせである請
求項１記載の方法。 - 【請求項６】 第二及び第三の蛍光標識抗体が、抗CD16
抗体及び抗CD11b抗体である請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 測定する散乱光が、側方散乱光である請
求項１記載の方法。 - 【請求項８】 蛍光色素が、フルオレセインイソチオシ
アネート(FITC)、フィコエリスリン(PE)、アロフィコシ
アニン(APC)、テキサスレッド、PE-CY5、ペリジンクロ
ロフィルプロテイン(PerCP)からなる群から選択される
色素である請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 第一蛍光標識抗体、第二の蛍光標識抗体
及び第三の蛍光標識抗体における区別可能な蛍光を発す
る蛍光色素が、FITC、PE及びPE-CY5の組み合わせ又はFI
TC、PE及びPerCPの組み合わせである請求項７記載の方
法。 - 【請求項１０】 血液学的試料が、哺乳動物の末梢血
液、骨髄液、尿又はアフェレーシス等で採取した試料の
いずれかである請求項１記載の方法。 - 【請求項１１】 工程（１）において、血液学的試料中
の赤血球を除去した後に、白血球を蛍光染色する請求項
１の方法。
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|---|---|
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| CN111812070A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-10-23 | 迈克医疗电子有限公司 | 核左移以及取值范围的确定方法、装置和细胞分析仪 |
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| CN101726579B (zh) * | 2008-10-17 | 2014-06-18 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 血液检测试剂和方法 |
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