JPH06105253B2 - 骨髄試料の組成の検出方法 - Google Patents
骨髄試料の組成の検出方法Info
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- JPH06105253B2 JPH06105253B2 JP63283547A JP28354788A JPH06105253B2 JP H06105253 B2 JPH06105253 B2 JP H06105253B2 JP 63283547 A JP63283547 A JP 63283547A JP 28354788 A JP28354788 A JP 28354788A JP H06105253 B2 JPH06105253 B2 JP H06105253B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は試料中の造血細胞の検出および分析に関し、よ
り詳細には標識モノクローナル抗体および細胞の光散乱
特性を用いて、骨髄試料中の異なる系統の未熟細胞およ
び成熟細胞を検出して分析する方法に関する。
り詳細には標識モノクローナル抗体および細胞の光散乱
特性を用いて、骨髄試料中の異なる系統の未熟細胞およ
び成熟細胞を検出して分析する方法に関する。
（従来の技術） 骨髄は複雑な組織である。主として、骨髄は造血細胞の
分化と成熟に関与する部位である。多能性幹細胞から、
多数の細胞系統が分化する。これらの系統のうちで主な
成分はリンパ系（B.TおよびNK細胞）、赤芽球系（赤血
球）および骨髄系（好塩基球、好中球、好酸球、巨核球
およびマクロフアージ）である。常時、これらの系統の
それぞれの細胞は一般に骨髄試料中に存在している。
分化と成熟に関与する部位である。多能性幹細胞から、
多数の細胞系統が分化する。これらの系統のうちで主な
成分はリンパ系（B.TおよびNK細胞）、赤芽球系（赤血
球）および骨髄系（好塩基球、好中球、好酸球、巨核球
およびマクロフアージ）である。常時、これらの系統の
それぞれの細胞は一般に骨髄試料中に存在している。
ひとたび分化すると、各種の細胞系統はいくつかの段階
を経て成熟する。成熟は骨髄および他の場所で起こる。
例えば、赤芽球系において、赤血球は一定の形態を有す
る芽細胞（幼若細胞）として骨髄中で発生し始める。そ
の段階から網状赤血球の段階まで、多くの段階を通して
形態学的変化が何度も起こり、結局核を放出して網状赤
血球となる。その後、網状赤血球は血液中に入り、そこ
で最終的な成熟変化を受けて赤血球になる。他の細胞系
統も同様の発生段階を経るが、発生段階の数および場所
は相違する（例えば、未熟Ｔ細胞は骨髄で発生し始める
が、成熟および分化の主な場所は胸腺である）。従つ
て、骨髄試料を調べることにより、試料に含まれる種々
の細胞系統ばかりでなく、各系統のいくつかの発生段階
をも同定することが可能である。
を経て成熟する。成熟は骨髄および他の場所で起こる。
例えば、赤芽球系において、赤血球は一定の形態を有す
る芽細胞（幼若細胞）として骨髄中で発生し始める。そ
の段階から網状赤血球の段階まで、多くの段階を通して
形態学的変化が何度も起こり、結局核を放出して網状赤
血球となる。その後、網状赤血球は血液中に入り、そこ
で最終的な成熟変化を受けて赤血球になる。他の細胞系
統も同様の発生段階を経るが、発生段階の数および場所
は相違する（例えば、未熟Ｔ細胞は骨髄で発生し始める
が、成熟および分化の主な場所は胸腺である）。従つ
て、骨髄試料を調べることにより、試料に含まれる種々
の細胞系統ばかりでなく、各系統のいくつかの発生段階
をも同定することが可能である。
試料中の細胞系統および／または発生段階を同定できる
ことは重要である。その結果は臨床的症状の指標を与え
ることができる。例えば、貧血患者において、その症状
の原因を治療するために、それが血液中での赤血球の破
壊の結果であるのか、あるいは芽細胞が成熟するのに失
敗した結果であるのか知る必要がある。骨髄を調べるこ
とにより、幹細胞、芽細胞および網状赤血球の正常量で
の存在は診断を不可能にし、それらの正常量での不在は
診断を確実なものにする。従つて、“正常”状態からの
変化を見分けることにより、異常な現象の診断を下すこ
とが可能である。
ことは重要である。その結果は臨床的症状の指標を与え
ることができる。例えば、貧血患者において、その症状
の原因を治療するために、それが血液中での赤血球の破
壊の結果であるのか、あるいは芽細胞が成熟するのに失
敗した結果であるのか知る必要がある。骨髄を調べるこ
とにより、幹細胞、芽細胞および網状赤血球の正常量で
の存在は診断を不可能にし、それらの正常量での不在は
診断を確実なものにする。従つて、“正常”状態からの
変化を見分けることにより、異常な現象の診断を下すこ
とが可能である。
種々の細胞系統および発生段階を同定するために、試料
は相当詳しく調べなければならない。それぞれの細胞系
統および１つの系統のそれぞれの段階がある一定の形態
学的特徴を有することは知られている。こうして、現在
一般に行われている手段は、吸引または生検法により骨
髄試料を採取し、それを染色し、その後光学顕微鏡でそ
れを観察することである。このような方法は主観的であ
り、時間がかかり、半定量的であり、そして肉眼で見え
る結果を得るために多数回の染色を必要とする。
は相当詳しく調べなければならない。それぞれの細胞系
統および１つの系統のそれぞれの段階がある一定の形態
学的特徴を有することは知られている。こうして、現在
一般に行われている手段は、吸引または生検法により骨
髄試料を採取し、それを染色し、その後光学顕微鏡でそ
れを観察することである。このような方法は主観的であ
り、時間がかかり、半定量的であり、そして肉眼で見え
る結果を得るために多数回の染色を必要とする。
成熟および分化に伴つて生じる肉眼で見える形態学的変
化のほかに、詳細な変化が遺伝子発現の面で起こる。多
くの研究は、成熟期間中に単一の系統（例えば正常な赤
血球）において種々のこのような細胞表面抗原が出現
（又は消失）することについて開示しており、またそれ
らの成熟過程で数種の系統に対して発現された単一の抗
原について開示している。例えば、ローケン（Loken）
ら、Flow Cytometric Analysis of Human Bone Marrow
（ヒト骨髄のフローサイトメトリー分析）:I.Normal Er
ythroid Development（正常赤芽球の発生）、Blood、6
9:255−263（1987）、およびシビン（Civin）ら、Antig
enic Analysis of Hematopoiesis（造血の抗原分析）。
VI.Flow Cytometric Characterization of MY−10−pos
itive Progenitor Cells in Normal Human Bone Marrow
（正常ヒト骨髄中のMY−10−陽性前駆細胞のフローサイ
トメトリー同定）、Exp.Hematol.,15:10−17（1987）を
それぞれ参照されたい。骨髄中の細胞の不均質性のため
に、細胞表面抗原を検出するマーカーの使用は系統間の
細胞を識別するのに十分というわけではない。
化のほかに、詳細な変化が遺伝子発現の面で起こる。多
くの研究は、成熟期間中に単一の系統（例えば正常な赤
血球）において種々のこのような細胞表面抗原が出現
（又は消失）することについて開示しており、またそれ
らの成熟過程で数種の系統に対して発現された単一の抗
原について開示している。例えば、ローケン（Loken）
ら、Flow Cytometric Analysis of Human Bone Marrow
（ヒト骨髄のフローサイトメトリー分析）:I.Normal Er
ythroid Development（正常赤芽球の発生）、Blood、6
9:255−263（1987）、およびシビン（Civin）ら、Antig
enic Analysis of Hematopoiesis（造血の抗原分析）。
VI.Flow Cytometric Characterization of MY−10−pos
itive Progenitor Cells in Normal Human Bone Marrow
（正常ヒト骨髄中のMY−10−陽性前駆細胞のフローサイ
トメトリー同定）、Exp.Hematol.,15:10−17（1987）を
それぞれ参照されたい。骨髄中の細胞の不均質性のため
に、細胞表面抗原を検出するマーカーの使用は系統間の
細胞を識別するのに十分というわけではない。
こうして、目下のところ、系統間の細胞および発生段階
を単一方法で同定し且つ識別する手段は全く知られてい
ない。このような手段は異常な造血疾患を診断するため
の迅速で特異な手法を提供するであろう。
を単一方法で同定し且つ識別する手段は全く知られてい
ない。このような手段は異常な造血疾患を診断するため
の迅速で特異な手法を提供するであろう。
（発明が解決しようとする課題） 本発明は、正常な造血細胞の系統および発生段階を同定
し、分析するための方法およびキツトに関する。本発明
の１つの実施態様である成熟段階によれば、骨髄試料が
個体から採取される。その試料は本質的に白血球のみか
ら成る第二試料を提供するように処理される。第一のモ
ノクローナル抗体を第一の螢光色素で標識する。第一の
モノクローナル抗体は、それが実質的にすべての白血球
と反応するように選ばれる。第二のモノクローナル抗体
も第二の螢光色素で標識する。第二のモノクローナル抗
体は、それが白血球のサブ集団（例えば単球および顆粒
球）と反応するように選ばれる。第一および第二の螢光
色素は、それぞれが類似した励起エネルギーレベルを有
するが、異なる発光スペクトルを示すように選択され
る。
し、分析するための方法およびキツトに関する。本発明
の１つの実施態様である成熟段階によれば、骨髄試料が
個体から採取される。その試料は本質的に白血球のみか
ら成る第二試料を提供するように処理される。第一のモ
ノクローナル抗体を第一の螢光色素で標識する。第一の
モノクローナル抗体は、それが実質的にすべての白血球
と反応するように選ばれる。第二のモノクローナル抗体
も第二の螢光色素で標識する。第二のモノクローナル抗
体は、それが白血球のサブ集団（例えば単球および顆粒
球）と反応するように選ばれる。第一および第二の螢光
色素は、それぞれが類似した励起エネルギーレベルを有
するが、異なる発光スペクトルを示すように選択され
る。
その後、第二試料、第一螢光色素で標識したモノクロー
ナル抗体および第二螢光色素で標識したモノクローナル
抗体の混合物を調製し、それにより第二混合物中の白血
球が第一のモノクローナル抗体で標識され、且つ白血球
のサブ集団が第二のモノクローナル抗体で標識されるよ
うにする。次に、この混合物をフローサイトメトリー
（流動細胞計測法）で分析して、細胞の大きさおよび顆
粒度（granularity）により系統を識別し、同時に細胞
に対する第一および第二抗体の結合分布を記録する。４
つのパラメーターのすべてを組み合わせると、各系統お
よびその系統の発生段階を識別するのに十分なデータが
得られる。そのデータはコンピュータのようなデータ収
集手段に貯えられる。
ナル抗体および第二螢光色素で標識したモノクローナル
抗体の混合物を調製し、それにより第二混合物中の白血
球が第一のモノクローナル抗体で標識され、且つ白血球
のサブ集団が第二のモノクローナル抗体で標識されるよ
うにする。次に、この混合物をフローサイトメトリー
（流動細胞計測法）で分析して、細胞の大きさおよび顆
粒度（granularity）により系統を識別し、同時に細胞
に対する第一および第二抗体の結合分布を記録する。４
つのパラメーターのすべてを組み合わせると、各系統お
よびその系統の発生段階を識別するのに十分なデータが
得られる。そのデータはコンピュータのようなデータ収
集手段に貯えられる。
（課題を解決するための手段） 骨髄吸引液を正常な成人から採取した。骨髄は以下の実
施例において造血細胞の供給原であつたが、当業者には
造血細胞を血液から分離し得ることが明らかであるだろ
う。この供給源からの細胞を同定するために、本発明方
法を変更する必要はない。
施例において造血細胞の供給原であつたが、当業者には
造血細胞を血液から分離し得ることが明らかであるだろ
う。この供給源からの細胞を同定するために、本発明方
法を変更する必要はない。
低密度白血球〔1,077/cm3、Ficoll−Hypaque（ニユージ
ヤージー州ビスカタウエイ、フアルマシア社）を用いた
密度勾配遠心法により得られたもの〕は10％ウシ胎児血
清を含むRPMI 1640（GIBCO）で洗い、免疫螢光染色のた
めに分取した。低密度白血球は第一の試料を作るために
使用した。しかしながら、当業者には全血液または骨髄
吸引液を使用できることが明らかであるだろう。このよ
うな場合には、第一試料を調製するために、例えば塩化
アンモニウムを用いる。
ヤージー州ビスカタウエイ、フアルマシア社）を用いた
密度勾配遠心法により得られたもの〕は10％ウシ胎児血
清を含むRPMI 1640（GIBCO）で洗い、免疫螢光染色のた
めに分取した。低密度白血球は第一の試料を作るために
使用した。しかしながら、当業者には全血液または骨髄
吸引液を使用できることが明らかであるだろう。このよ
うな場合には、第一試料を調製するために、例えば塩化
アンモニウムを用いる。
低密度骨髄白血球は107/mlの濃度で懸濁した。両方の抗
体が螢光色素に直接結合された実験において、第一の抗
体は最大螢光を与える抗体量を用いて106個の細胞に添
加した。細胞は氷上で20分間インキユベートした。その
後、細胞を遠心により沈殿させ、第二抗体を加える前に
RPMI 1640緩衝液（染色容量の少なくとも５倍）で洗つ
た。氷上で20分後、細胞を再度緩衝液で洗い、その後１
％パラホルムアルデヒド中で固定した。
体が螢光色素に直接結合された実験において、第一の抗
体は最大螢光を与える抗体量を用いて106個の細胞に添
加した。細胞は氷上で20分間インキユベートした。その
後、細胞を遠心により沈殿させ、第二抗体を加える前に
RPMI 1640緩衝液（染色容量の少なくとも５倍）で洗つ
た。氷上で20分後、細胞を再度緩衝液で洗い、その後１
％パラホルムアルデヒド中で固定した。
螢光色素に直接結合された１つの抗体を利用する実験で
は、４段階法が用いられた。初めに、細胞は未結合抗体
と反応させた。洗浄段階後、細胞をラツト抗マウスKapp
a（PE）と反応させ、氷上でインキユベートし、そして
洗浄した。次いで、細胞を10％正常マウス血清にさらし
て第二段階抗体の遊離結合部位をブロツクした。その
後、細胞は第二の（螢光色素に直接結合された）モノク
ローナル抗体で染色し、洗浄し、そして前のように固定
した。
は、４段階法が用いられた。初めに、細胞は未結合抗体
と反応させた。洗浄段階後、細胞をラツト抗マウスKapp
a（PE）と反応させ、氷上でインキユベートし、そして
洗浄した。次いで、細胞を10％正常マウス血清にさらし
て第二段階抗体の遊離結合部位をブロツクした。その
後、細胞は第二の（螢光色素に直接結合された）モノク
ローナル抗体で染色し、洗浄し、そして前のように固定
した。
３色分析のために、細胞は初めに未結合抗体と反応さ
せ、続いてラツト抗マウスKappa−APC第二段階抗体と反
応させた。細胞を洗い、10％正常マウス血清と反応さ
せ、続いてPE結合およびFITC結合抗体と20分間反応さ
せ、洗浄し、そして前のように固定した。
せ、続いてラツト抗マウスKappa−APC第二段階抗体と反
応させた。細胞を洗い、10％正常マウス血清と反応さ
せ、続いてPE結合およびFITC結合抗体と20分間反応さ
せ、洗浄し、そして前のように固定した。
フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）に結合し
たおよび／またはフイコエリトリン（PE）に直接又は間
接結合したCD3（Leu−４）,CD10（CALLA）,CD11b（Leu
−15）,CD14（Leu−M3）,CD15（Leu−11）,CD19（Leu−
12）,CD20（Leu−16）,CD45R（Leu−18），マウスIgG1,
マウスIgG2、ラツト抗マウスKappa、ラツト抗マウスKap
pa−アロフイコシアニン（APC）、および精製CD34（HPC
A−１）はカリフオルニア州マウンテンビユー、ベクト
ン・デイツキンソン・イムノサイトメトリー・システム
ズ社から入手した。抗グリコホリン（10F7）はカリフオ
ルニア州リバーモア、ラングロイス（R.Langlois）博士
から贈与された。
たおよび／またはフイコエリトリン（PE）に直接又は間
接結合したCD3（Leu−４）,CD10（CALLA）,CD11b（Leu
−15）,CD14（Leu−M3）,CD15（Leu−11）,CD19（Leu−
12）,CD20（Leu−16）,CD45R（Leu−18），マウスIgG1,
マウスIgG2、ラツト抗マウスKappa、ラツト抗マウスKap
pa−アロフイコシアニン（APC）、および精製CD34（HPC
A−１）はカリフオルニア州マウンテンビユー、ベクト
ン・デイツキンソン・イムノサイトメトリー・システム
ズ社から入手した。抗グリコホリン（10F7）はカリフオ
ルニア州リバーモア、ラングロイス（R.Langlois）博士
から贈与された。
未染色細胞、IgG1−FITC、IgG2−PEおよびラツト抗マウ
スKappa−APC標識細胞は対照として使用した。
スKappa−APC標識細胞は対照として使用した。
初めに、上記の通りに調製した骨髄吸引液はフローサイ
トメトリーにより分析した。現在利用されているフロー
サイトメーターは細胞の体積、前方の光散乱および／ま
たは側方の光散乱を測定するのに有用である。その後、
これらのパラメーターを用いて、細胞系統はそれらの光
学的および物理的特性に基づいて分類することができ
る。
トメトリーにより分析した。現在利用されているフロー
サイトメーターは細胞の体積、前方の光散乱および／ま
たは側方の光散乱を測定するのに有用である。その後、
これらのパラメーターを用いて、細胞系統はそれらの光
学的および物理的特性に基づいて分類することができ
る。
簡単に述べると、前方光散乱（FLS）は細胞の大きさの
測定をもたらす。（細胞の体積は同様に細胞の大きさを
表し、そのように装備された計測器も使用できる。）一
方、側方光散乱（SLS）は細胞の“顆粒度（granularit
y）”にほぼ等しい。SLSは細胞から反射された光を測定
するものであり、細胞中の核および／または顆粒のよう
な構造の存在（又は不在）の関数である。FLSおよびSLS
は、組み合わせると、異なる型の細胞を識別するのに役
立つ。
測定をもたらす。（細胞の体積は同様に細胞の大きさを
表し、そのように装備された計測器も使用できる。）一
方、側方光散乱（SLS）は細胞の“顆粒度（granularit
y）”にほぼ等しい。SLSは細胞から反射された光を測定
するものであり、細胞中の核および／または顆粒のよう
な構造の存在（又は不在）の関数である。FLSおよびSLS
は、組み合わせると、異なる型の細胞を識別するのに役
立つ。
FLSおよびSLSのほかに、フローサイトメーターは１つ以
上、通常２つの螢光流路を含む。これらの流路は励起さ
れた際に異なる波長の光を発することのできる螢光色素
で標識された細胞を識別するために使用される。別々の
螢光色素で標識された別々の抗体を用いて、異なる細胞
表面抗原の発現に基づいて細胞型を識別することができ
る。４つのパラメーター（すなわち、FLS、SLS、FL1お
よびFL2）をすべて組み合わせることにより、系統およ
びそれらの発生段階が四次元の空間で識別される。
上、通常２つの螢光流路を含む。これらの流路は励起さ
れた際に異なる波長の光を発することのできる螢光色素
で標識された細胞を識別するために使用される。別々の
螢光色素で標識された別々の抗体を用いて、異なる細胞
表面抗原の発現に基づいて細胞型を識別することができ
る。４つのパラメーター（すなわち、FLS、SLS、FL1お
よびFL2）をすべて組み合わせることにより、系統およ
びそれらの発生段階が四次元の空間で識別される。
フローサイトメトリー分析は、２色免疫螢光の場合にFA
CStarTMを、そして３色免疫螢光の場合にFACS400TMを用
いて行つた（カリフオルニア州マウンテンビユー、ベク
トン・デイツキンソン・イムノサイトメトリー・システ
ムズ社）。アルゴンイオンレーザーは200mWの電力を用
いて488nmで操作した。FITC発光は530/30BPフイルター
を用いて集められ、一方PE発光は585/42BPフイルターを
通して集められた。３色免疫螢光は上記のようなアルゴ
ンレーザーと共に633nm、40mWのHeNeレーザーを用いて
実施した。APC発光は660/20BPフイルターを用いて集め
られた。Consort 30 Data Management System（ベクト
ン・デイツキンソン社）に50,000の事例を一覧表形式で
収集した。これによりデータを再分析して、前方および
直角の光散乱により固定した細胞集団の免疫螢光の異な
る色同士の相関関係を立証することが可能になつた。す
べての等高線プロツトにおいて、最低レベルは３つの事
例であり、等高線は4,6,8,10,16,32,64,128のところに
引いた。
CStarTMを、そして３色免疫螢光の場合にFACS400TMを用
いて行つた（カリフオルニア州マウンテンビユー、ベク
トン・デイツキンソン・イムノサイトメトリー・システ
ムズ社）。アルゴンイオンレーザーは200mWの電力を用
いて488nmで操作した。FITC発光は530/30BPフイルター
を用いて集められ、一方PE発光は585/42BPフイルターを
通して集められた。３色免疫螢光は上記のようなアルゴ
ンレーザーと共に633nm、40mWのHeNeレーザーを用いて
実施した。APC発光は660/20BPフイルターを用いて集め
られた。Consort 30 Data Management System（ベクト
ン・デイツキンソン社）に50,000の事例を一覧表形式で
収集した。これによりデータを再分析して、前方および
直角の光散乱により固定した細胞集団の免疫螢光の異な
る色同士の相関関係を立証することが可能になつた。す
べての等高線プロツトにおいて、最低レベルは３つの事
例であり、等高線は4,6,8,10,16,32,64,128のところに
引いた。
これらのパラメーターの使用および意味のより詳細な記
述については、ローケン（Loken）、Cell Surface Anti
gen and Morphological Characterization of Leucocyt
e Populations by Flow Cytometry（フローサイトメト
リーによる白血球集団の細胞表面抗原および形態学的同
定）、Monoclonal Antibodies、チヤーチル・リビング
ストン（P.ビバリー編集）、1986を参照されたい。以下
の細胞分析はフローサイトメトリーによつて行われた
が、当業者には細胞の大きさ、顆粒度および螢光を測定
するために螢光光学顕微鏡を使用しうることが明らかで
あるだろう。
述については、ローケン（Loken）、Cell Surface Anti
gen and Morphological Characterization of Leucocyt
e Populations by Flow Cytometry（フローサイトメト
リーによる白血球集団の細胞表面抗原および形態学的同
定）、Monoclonal Antibodies、チヤーチル・リビング
ストン（P.ビバリー編集）、1986を参照されたい。以下
の細胞分析はフローサイトメトリーによつて行われた
が、当業者には細胞の大きさ、顆粒度および螢光を測定
するために螢光光学顕微鏡を使用しうることが明らかで
あるだろう。
第１図を参照すると、前角および直角の光散乱の物理的
パラメーターにより３種の異なる細胞集団が識別される
らしいことが分かるであろう。これらの窓は“LYMPH"、
“BLAST"および“GRAN"と表示された。残りの物質は一
般に細胞破片（すなわち、破壊された細胞および細胞断
片またはその他の断片）から成る。
パラメーターにより３種の異なる細胞集団が識別される
らしいことが分かるであろう。これらの窓は“LYMPH"、
“BLAST"および“GRAN"と表示された。残りの物質は一
般に細胞破片（すなわち、破壊された細胞および細胞断
片またはその他の断片）から成る。
第１図（および実際には残りのすべての図面）は二次元
空間に示されているが、これは単に本発明を見ることの
できる形で表示するためになされたものであることが理
解されるであろう。本発明を二次元空間に限定するつも
りはない。実際、好適な態様では、測定値（すなわち、
FLS、SLS、FL1およびFL2）は四次元空間で解釈される。
空間に示されているが、これは単に本発明を見ることの
できる形で表示するためになされたものであることが理
解されるであろう。本発明を二次元空間に限定するつも
りはない。実際、好適な態様では、測定値（すなわち、
FLS、SLS、FL1およびFL2）は四次元空間で解釈される。
正常な骨髄から成る種々の系統を同定するために、第一
のモノクローナル抗体は試料中の実質的に全部の白血球
を同定しうるものが選ばれた。CD45は実質的にすべての
白血球に見られる抗原である。〔“CD"すなわちクラス
ター表示（cluster designation）はthe International
Workshops on Human Differentiation Antigens（ヒト
分化抗原に関する国際ワークシヨツプ）により定められ
た。反応する“Leu"系はスタンフオード大学の研究者達
により定められた。〕この抗原に対するモノクローナル
抗体を選択することにより、白血球を標識することがで
きる。Anti−HLe−１はこのようなモノクローナル抗体
の１つである。別のこのような抗体はLCA（カルター・
エレクトロニクス社）である。Anti−HLe−１は精製さ
れたものと（FITC）に結合されたものの両方が市販され
ている。純粋な抗CD45抗体を使用する場合、当分野で知
られた方法によりその抗体を螢光色素（例えばFITCまた
はPE）に結合させることができる。
のモノクローナル抗体は試料中の実質的に全部の白血球
を同定しうるものが選ばれた。CD45は実質的にすべての
白血球に見られる抗原である。〔“CD"すなわちクラス
ター表示（cluster designation）はthe International
Workshops on Human Differentiation Antigens（ヒト
分化抗原に関する国際ワークシヨツプ）により定められ
た。反応する“Leu"系はスタンフオード大学の研究者達
により定められた。〕この抗原に対するモノクローナル
抗体を選択することにより、白血球を標識することがで
きる。Anti−HLe−１はこのようなモノクローナル抗体
の１つである。別のこのような抗体はLCA（カルター・
エレクトロニクス社）である。Anti−HLe−１は精製さ
れたものと（FITC）に結合されたものの両方が市販され
ている。純粋な抗CD45抗体を使用する場合、当分野で知
られた方法によりその抗体を螢光色素（例えばFITCまた
はPE）に結合させることができる。
第二のモノクローナル抗体は白血球系統のサブ集団を同
定するために選ばれた。好適な実施態様において、第二
のモノクローナル抗体は白血球の２つの系統：すなわち
単球および顆粒球を同定する。これらの系統はCD15抗原
により同定される。この抗原に対するモノクローナル抗
体を選択することにより、これらの２つの系統を同定す
ることができる。Anti−Leu−M1はそのような抗CD15抗
体の１つであり、他にはMy1がある。
定するために選ばれた。好適な実施態様において、第二
のモノクローナル抗体は白血球の２つの系統：すなわち
単球および顆粒球を同定する。これらの系統はCD15抗原
により同定される。この抗原に対するモノクローナル抗
体を選択することにより、これらの２つの系統を同定す
ることができる。Anti−Leu−M1はそのような抗CD15抗
体の１つであり、他にはMy1がある。
好適な第二モノクローナル抗体は抗CD15、より特定的に
はAnti−Leu−M1であるが、当業者は他のモノクローナ
ル抗体もそれらが種々の系統および成熟段階を識別する
限り使用可能であることを、図面および以下の実施例か
ら理解できるだろう。例えば、抗CD11b、抗CD16および
抗CD19（すなわち、Anti−Leu−15、Anti−Leu−11およ
びAnti−Leu−12）はすべて系統および段階を区別する
ように機能する。従つて、これらのモノクローナル抗体
および実施例に記載の他のモノクローナル抗体は抗CD45
（またはAnti−Leu−M1）の代わりに使用できる。
はAnti−Leu−M1であるが、当業者は他のモノクローナ
ル抗体もそれらが種々の系統および成熟段階を識別する
限り使用可能であることを、図面および以下の実施例か
ら理解できるだろう。例えば、抗CD11b、抗CD16および
抗CD19（すなわち、Anti−Leu−15、Anti−Leu−11およ
びAnti−Leu−12）はすべて系統および段階を区別する
ように機能する。従つて、これらのモノクローナル抗体
および実施例に記載の他のモノクローナル抗体は抗CD45
（またはAnti−Leu−M1）の代わりに使用できる。
Anti−Leu−M1は精製された形で市販されているが、Ant
i−HLe−１（FITC）と対合させるために、当分野で知ら
れた方法により第二段階の（PE）結合抗体と反応させ
る。PEは、それがFITCと実質的に類似した励起波長を有
するが、異なるスペクトルで発光するので選ばれた。ひ
とたび選ばれると、螢光色素で標識された第一および第
二モノクローナル抗体は先に述べたように試料と混合さ
れる。Anti−HLe−１（FITC）およびAnti−Leu−M1（P
E）はそれぞれ好適な第一および第二モノクローナル抗
体である。
i−HLe−１（FITC）と対合させるために、当分野で知ら
れた方法により第二段階の（PE）結合抗体と反応させ
る。PEは、それがFITCと実質的に類似した励起波長を有
するが、異なるスペクトルで発光するので選ばれた。ひ
とたび選ばれると、螢光色素で標識された第一および第
二モノクローナル抗体は先に述べたように試料と混合さ
れる。Anti−HLe−１（FITC）およびAnti−Leu−M1（P
E）はそれぞれ好適な第一および第二モノクローナル抗
体である。
FLSおよびSLSにより測定して試料中の細胞の物理的パラ
メーターが分かると、本発明を二次元空間で考え続ける
ために、それぞれの集団に対してゲートが確立される。
そのゲートはゲートの外側にある全細胞についての分析
情報を効果的に除外するであろう。Anti−HLe−１（FIT
C）およびAnti−Leu−M1（PE）を用いて順次“LYMPH"、
“BLAST"および“GRAN"についてゲートが定まると、そ
れぞれの細胞系統が識別でき、同様に各系統のいくつか
の段階も識別できる。
メーターが分かると、本発明を二次元空間で考え続ける
ために、それぞれの集団に対してゲートが確立される。
そのゲートはゲートの外側にある全細胞についての分析
情報を効果的に除外するであろう。Anti−HLe−１（FIT
C）およびAnti−Leu−M1（PE）を用いて順次“LYMPH"、
“BLAST"および“GRAN"についてゲートが定まると、そ
れぞれの細胞系統が識別でき、同様に各系統のいくつか
の段階も識別できる。
第２図を参照すると、骨髄細胞の“LYMPH"窓はリンパ様
細胞（集団2:前Ｂ細胞、集団3:成熟リンパ様細胞）およ
び有核赤芽球系前駆細胞（集団1a）を伴う成熟赤血球
（集団1a）の混合物を含む。“BLAST"窓は未熟および成
熟単球（集団４）、並びに種々の血液細胞系統の未熟細
胞（集団1b初期赤芽球、5a初期好中球、および集団６芽
細胞）を含む。“GRAN"窓はもつぱら成熟しつつある顆
粒球（集団5b）から成つている。これらの結果は、ロー
ケン（Loken）らの上記文献に記載される標準染色法に
従つて細胞を光学顕微鏡で調べることにより確かめるこ
とができる。
細胞（集団2:前Ｂ細胞、集団3:成熟リンパ様細胞）およ
び有核赤芽球系前駆細胞（集団1a）を伴う成熟赤血球
（集団1a）の混合物を含む。“BLAST"窓は未熟および成
熟単球（集団４）、並びに種々の血液細胞系統の未熟細
胞（集団1b初期赤芽球、5a初期好中球、および集団６芽
細胞）を含む。“GRAN"窓はもつぱら成熟しつつある顆
粒球（集団5b）から成つている。これらの結果は、ロー
ケン（Loken）らの上記文献に記載される標準染色法に
従つて細胞を光学顕微鏡で調べることにより確かめるこ
とができる。
第２図において同定した系統が記載した通りであること
をさらに確かめるために、各系統に対して特異的なモノ
クローナル抗体を用いて一連のフローサイトメトリー分
析を行つた。
をさらに確かめるために、各系統に対して特異的なモノ
クローナル抗体を用いて一連のフローサイトメトリー分
析を行つた。
赤血球を検出するために、ヒト骨髄細胞は赤芽球系細胞
を同定する抗体の抗グリコホリン（PE）およびAnti−HL
e−１（FITC）と反応させた。前方および側方の光散乱
によりゲートがつくられた。これらの２つのマーカー間
の相関関係を第3A図に示す。“LYMPH"窓ではGPA+/CD45-
成熟赤芽球系細胞（集団1a）がGPA-/CD45+リンパ様細胞
（集団２、３）から容易に識別された。GPA+細胞は“GR
AN"窓に全く存在していなかつた。
を同定する抗体の抗グリコホリン（PE）およびAnti−HL
e−１（FITC）と反応させた。前方および側方の光散乱
によりゲートがつくられた。これらの２つのマーカー間
の相関関係を第3A図に示す。“LYMPH"窓ではGPA+/CD45-
成熟赤芽球系細胞（集団1a）がGPA-/CD45+リンパ様細胞
（集団２、３）から容易に識別された。GPA+細胞は“GR
AN"窓に全く存在していなかつた。
“BLAST"窓では、明らかに区別しうるGPA+初期赤芽球系
細胞（集団1b）が中程度のGPA量を発現する細胞から区
別された。第3A図参照。CD45発現は、細胞が赤芽球系統
に近づくにつれて次第に減少し、一方GPAの発現は増加
した。
細胞（集団1b）が中程度のGPA量を発現する細胞から区
別された。第3A図参照。CD45発現は、細胞が赤芽球系統
に近づくにつれて次第に減少し、一方GPAの発現は増加
した。
Ｔリンパ球を検出するために、正常骨髄細胞はCD3 pan
Tリンパ球モノクローナル抗体のAnti−Leu−４（PE）お
よびAnti−HLe−１（FITC）と反応させた。第3B図参
照。CD3+Tリンパ様細胞（集団3a）はすべて“LYMPH"光
散乱窓に見られ、CD45の強い同時発現を伴つていた。
Tリンパ球モノクローナル抗体のAnti−Leu−４（PE）お
よびAnti−HLe−１（FITC）と反応させた。第3B図参
照。CD3+Tリンパ様細胞（集団3a）はすべて“LYMPH"光
散乱窓に見られ、CD45の強い同時発現を伴つていた。
Ｂリンパ球を検出するために、骨髄細胞はAnti−Leu−1
2（PE）（CD19）およびAnti−HLe−１（FITC）の組み合
わせと反応させ、それにより未熟（集団２）および成熟
（集団3b）の発生段階を含むすべてのＢリンパ様細胞を
同定した。これら２つの抗原同士の相関関係を第3D図に
示す。CD19+Bリンパ様細胞は“LYMPH"窓に限定された。
これらのＢ系統細胞は異なる３つのCD45発現レベルを示
した：すなわち、CD19+/CD45+++（集団3b）、CD19+/CD4
5++、およびCD19+/CD45+（集団２）。Ｂ系統細胞間の成
熟度の差をさらに識別するために、骨髄細胞はCD45およ
び他の２種類のモノクローナル抗体：すなわち、未熟Ｂ
リンパ様細胞を同定する抗体のAnti−CALLA（PE）（CD1
0）（図示せず）、または後期Ｂ細胞を同定するAnti−L
eu−16（PE）（CD20）の組み合わせで染色した。CD10お
よび中間レベルのCD45を発現する未熟Ｂ細胞は集団２と
して同定された。
2（PE）（CD19）およびAnti−HLe−１（FITC）の組み合
わせと反応させ、それにより未熟（集団２）および成熟
（集団3b）の発生段階を含むすべてのＢリンパ様細胞を
同定した。これら２つの抗原同士の相関関係を第3D図に
示す。CD19+Bリンパ様細胞は“LYMPH"窓に限定された。
これらのＢ系統細胞は異なる３つのCD45発現レベルを示
した：すなわち、CD19+/CD45+++（集団3b）、CD19+/CD4
5++、およびCD19+/CD45+（集団２）。Ｂ系統細胞間の成
熟度の差をさらに識別するために、骨髄細胞はCD45およ
び他の２種類のモノクローナル抗体：すなわち、未熟Ｂ
リンパ様細胞を同定する抗体のAnti−CALLA（PE）（CD1
0）（図示せず）、または後期Ｂ細胞を同定するAnti−L
eu−16（PE）（CD20）の組み合わせで染色した。CD10お
よび中間レベルのCD45を発現する未熟Ｂ細胞は集団２と
して同定された。
NK細胞を検出するために、骨髄細胞はAnti−HLe−１（F
ITC）およびAnti−Leu−11（PE）（CD16）またはAnti−
Leu−15（PE）（CD11b）のいずれかの組み合わせで染色
した。これらのモノクローナル抗体は“LYMPH"光散乱窓
内のNK細胞（集団3c）を同定する。これらの抗体によつ
て同定された“LYMPH"光散乱窓内の細胞はCD45+++を示
した。（第4Aおよび4B図参照。）CD16およびCD11bで標
識された“BLAST"および“GRAN"窓内の細胞は単骨髄系
細胞（monomyeloid cell）であり、以下で論ずる。
ITC）およびAnti−Leu−11（PE）（CD16）またはAnti−
Leu−15（PE）（CD11b）のいずれかの組み合わせで染色
した。これらのモノクローナル抗体は“LYMPH"光散乱窓
内のNK細胞（集団3c）を同定する。これらの抗体によつ
て同定された“LYMPH"光散乱窓内の細胞はCD45+++を示
した。（第4Aおよび4B図参照。）CD16およびCD11bで標
識された“BLAST"および“GRAN"窓内の細胞は単骨髄系
細胞（monomyeloid cell）であり、以下で論ずる。
単球系統の細胞は、成熟したおよび成熟しつつある単球
（集団４）に結合するモノクローナル抗体のCD11bまた
はAnti−Leu−M3（PE）（CD14）のいずれかで骨髄細胞
を染色することにより同定した。CD45と共にこれら２つ
のマーカーの関連ある発現を第4Bおよび5A図に示す。
（集団４）に結合するモノクローナル抗体のCD11bまた
はAnti−Leu−M3（PE）（CD14）のいずれかで骨髄細胞
を染色することにより同定した。CD45と共にこれら２つ
のマーカーの関連ある発現を第4Bおよび5A図に示す。
単球系統の細胞は“BLAST"光散乱窓にのみ存在し、それ
故に他の系統に属する細胞から識別されるであろう。
“LYMPH"窓にはCD14+細胞が全く存在せず、一方“GRAN"
窓にはCD14+細胞が低い比率で存在していた（第５図
Ａ）。
故に他の系統に属する細胞から識別されるであろう。
“LYMPH"窓にはCD14+細胞が全く存在せず、一方“GRAN"
窓にはCD14+細胞が低い比率で存在していた（第５図
Ａ）。
単球系統によるCD11b抗原の発現はまた“BLAST"光散乱
窓内に同定されるであろう。二変数相関プロツトの凸形
状（第4B図、“BLAST"）は、CD11bの発現が成熟しつつ
ある単球（集団４）によるCD45の強度変化に優先するこ
とを示唆している。CD14とCD45の高度に関連した発現
は、単球成熟期間中のCD45の強度変化がCD14の発現と同
時期に起こることを示している。その他の研究は、CD11
bが単球発生期間中CD14発現にまさることを示した。“L
YMPH"窓中に見られるCD11bを発現する細胞（第4B図）は
NK細胞（集団3c）であることが先に示された。
窓内に同定されるであろう。二変数相関プロツトの凸形
状（第4B図、“BLAST"）は、CD11bの発現が成熟しつつ
ある単球（集団４）によるCD45の強度変化に優先するこ
とを示唆している。CD14とCD45の高度に関連した発現
は、単球成熟期間中のCD45の強度変化がCD14の発現と同
時期に起こることを示している。その他の研究は、CD11
bが単球発生期間中CD14発現にまさることを示した。“L
YMPH"窓中に見られるCD11bを発現する細胞（第4B図）は
NK細胞（集団3c）であることが先に示された。
骨髄系細胞の発生は、骨髄細胞をCD45と組み合わせたCD
15、CD11b、CD16を含む数種類のモノクローナル抗体で
染色することにより評価した。CD15は顆粒球（集団5a＆
ｂ）により豊富に発現され、そして単球（集団４）によ
り少量発現される（第２図参照）。“GRAN"窓内のすべ
ての成熟しつつある顆粒球（集団5b）はCD15に対して高
度に陽性であり、一方CD45に対しては中程度に陽性であ
つた。
15、CD11b、CD16を含む数種類のモノクローナル抗体で
染色することにより評価した。CD15は顆粒球（集団5a＆
ｂ）により豊富に発現され、そして単球（集団４）によ
り少量発現される（第２図参照）。“GRAN"窓内のすべ
ての成熟しつつある顆粒球（集団5b）はCD15に対して高
度に陽性であり、一方CD45に対しては中程度に陽性であ
つた。
“BLAST"ゲート内の比較的未熟な骨髄系細胞（骨髄球、
前骨髄球）はCD15に対して明らかに陽性であり、CD15に
対して比較的陰性であるがより高レベルのCD45を発現す
る単球（集団４）と区別されるであろう（第２図参
照）。
前骨髄球）はCD15に対して明らかに陽性であり、CD15に
対して比較的陰性であるがより高レベルのCD45を発現す
る単球（集団４）と区別されるであろう（第２図参
照）。
CD11bは骨髄系細胞の発生過程においてCD15よりも遅れ
て発現される。“GRAN"細胞（集団5b）の一部のみがCD1
1bを発現したが、CD15は全部が発現した。“GRAN"窓内
のより少数の細胞がCD16と反応した（第4A図参照）。CD
11bと反応した“BLAST"窓内の細胞（集団４）（第4B図
参照）は、それらがわずかにより高レベルのCD45を発現
したので、主として単球であつた。
て発現される。“GRAN"細胞（集団5b）の一部のみがCD1
1bを発現したが、CD15は全部が発現した。“GRAN"窓内
のより少数の細胞がCD16と反応した（第4A図参照）。CD
11bと反応した“BLAST"窓内の細胞（集団４）（第4B図
参照）は、それらがわずかにより高レベルのCD45を発現
したので、主として単球であつた。
造血コロニーを形成しうる細胞はすべてヒト前駆細胞抗
原CD34を発現する。前駆細胞によるCD34とCD45の発現の
相関関係を第5B図に示す。CD34+細胞（集団６）はCD45
に対してわずかに陽性であつた。以前の研究から、CD34
陽性細胞のほぼ半分はＢリンパ様細胞（集団２）である
ことが分かつている。これらのCD34+未熟Ｂリンパ様細
胞は“LYMPH"窓内に見られ、CD19およびCD10を発現し
た。これらの細胞は先に同定して論じた第3D図に示すCD
19およびCD108系統マーカーと同じものであつた。しか
しながら、in vitro検定でコロニーを形成する骨髄およ
び赤芽球の前駆細胞を含むCD34+細胞の残りは“BLAST"
窓内に存在し（第5B図参照）、それらはまた低レベルの
CD45を発現した。
原CD34を発現する。前駆細胞によるCD34とCD45の発現の
相関関係を第5B図に示す。CD34+細胞（集団６）はCD45
に対してわずかに陽性であつた。以前の研究から、CD34
陽性細胞のほぼ半分はＢリンパ様細胞（集団２）である
ことが分かつている。これらのCD34+未熟Ｂリンパ様細
胞は“LYMPH"窓内に見られ、CD19およびCD10を発現し
た。これらの細胞は先に同定して論じた第3D図に示すCD
19およびCD108系統マーカーと同じものであつた。しか
しながら、in vitro検定でコロニーを形成する骨髄およ
び赤芽球の前駆細胞を含むCD34+細胞の残りは“BLAST"
窓内に存在し（第5B図参照）、それらはまた低レベルの
CD45を発現した。
要約すると、“LYMPH"光散乱窓内の赤芽球系細胞は、そ
れらのGPA発現によつてその窓内の他の細胞から容易に
識別された。中間正赤芽球から網状赤血球段階までのGP
A+赤芽球系細胞（集団1a）はCD45をほとんど、あるいは
全く発現しなかつた。対照的に、CD3+T細胞（集団3
a）、CD16+およびCD11b+NK細胞（集団3c）、ならびにCD
20+成熟Ｂ細胞（集団3b）を含めたこの光散乱窓内の成
熟リンパ球はすべて多量のCD45高原を発現した。
れらのGPA発現によつてその窓内の他の細胞から容易に
識別された。中間正赤芽球から網状赤血球段階までのGP
A+赤芽球系細胞（集団1a）はCD45をほとんど、あるいは
全く発現しなかつた。対照的に、CD3+T細胞（集団3
a）、CD16+およびCD11b+NK細胞（集団3c）、ならびにCD
20+成熟Ｂ細胞（集団3b）を含めたこの光散乱窓内の成
熟リンパ球はすべて多量のCD45高原を発現した。
この光散乱窓内の唯一の他の細胞は未熟Ｂリンパ球（集
団２）であり、このリンパ球はそれらの成熟子孫よりも
少ない量のCD45を発現した。
団２）であり、このリンパ球はそれらの成熟子孫よりも
少ない量のCD45を発現した。
“LYMPH"光散乱ゲート内のすべての細胞は、これらのモ
ノクローナル抗体を使用する理由を説明することができ
る。この窓は細胞表面で発現されたCD45の量に基づいて
識別しうる成熟Ｔ細胞（集団3a）、Ｂ細胞（集団3b）お
よびNK細胞（集団3c）、並びに成熟しつつある赤芽球系
細胞（集団1a）およびＢリンパ様細胞（集団２）を含ん
でいる。骨髄系統の細胞はこの光散乱窓内に現れない。
ノクローナル抗体を使用する理由を説明することができ
る。この窓は細胞表面で発現されたCD45の量に基づいて
識別しうる成熟Ｔ細胞（集団3a）、Ｂ細胞（集団3b）お
よびNK細胞（集団3c）、並びに成熟しつつある赤芽球系
細胞（集団1a）およびＢリンパ様細胞（集団２）を含ん
でいる。骨髄系統の細胞はこの光散乱窓内に現れない。
“BLAST"光散乱窓内の３つの細胞集団は、CD45およびCD
15抗原発現の強度に基づいて識別された。CD45抗原発現
が最も低い（CD45±）細胞は赤芽球（集団1b）であり、
それらのGPA発現により同定された（第2B図参照）。CD4
5を最も多量に発現したこの窓内の細胞は単球（集団
４）であり、単球特異的CD14抗原の同時発現により証明
された。これらのCD45+細胞はまた高レベルのCD11bおよ
び中間レベルのCD15抗原を発現した。中間レベルのCD45
を発現した。“BLAST"窓内の細胞は、他の細胞表面抗原
の発現によつてさらに再分割された。CD15はこれらの中
間レベルのCD45+細胞を２つの集団に分けた。CD15+細胞
は前骨髄球および骨髄球を含む好中球系統（集団5a）に
深く関係していた。残りのCD15-、CD45+細胞はCD15とCD
34が骨髄で重なり合わないのでCD34+細胞を含む。従つ
て、CD34+として同定された前駆細胞（集団６）はま
た、CD45とCD15の組み合わせによつても検出された。
15抗原発現の強度に基づいて識別された。CD45抗原発現
が最も低い（CD45±）細胞は赤芽球（集団1b）であり、
それらのGPA発現により同定された（第2B図参照）。CD4
5を最も多量に発現したこの窓内の細胞は単球（集団
４）であり、単球特異的CD14抗原の同時発現により証明
された。これらのCD45+細胞はまた高レベルのCD11bおよ
び中間レベルのCD15抗原を発現した。中間レベルのCD45
を発現した。“BLAST"窓内の細胞は、他の細胞表面抗原
の発現によつてさらに再分割された。CD15はこれらの中
間レベルのCD45+細胞を２つの集団に分けた。CD15+細胞
は前骨髄球および骨髄球を含む好中球系統（集団5a）に
深く関係していた。残りのCD15-、CD45+細胞はCD15とCD
34が骨髄で重なり合わないのでCD34+細胞を含む。従つ
て、CD34+として同定された前駆細胞（集団６）はま
た、CD45とCD15の組み合わせによつても検出された。
“GRAN"窓内のすべての細胞は、細胞質中に顆粒を有し
且つ低レベルのCD45を発現するものとして特徴づけられ
た。CD15はこれらの細胞の全部を標識したが、CD11bま
たはCD16は少数の細胞を同定した。CD14はこれらの“GR
AN"窓細胞の小集団を同定した。これらの細胞は骨髄系
抗原の発現の差に対応して、好中球系統（集団5b）の異
なる成熟段階を構成していた。
且つ低レベルのCD45を発現するものとして特徴づけられ
た。CD15はこれらの細胞の全部を標識したが、CD11bま
たはCD16は少数の細胞を同定した。CD14はこれらの“GR
AN"窓細胞の小集団を同定した。これらの細胞は骨髄系
抗原の発現の差に対応して、好中球系統（集団5b）の異
なる成熟段階を構成していた。
in vitroで検定した前駆細胞（集団６）、そしておそら
くは多能性幹細胞も“BLAST"光散乱窓内に見い出され
る。これらの細胞は表面で低レベルのCD45を発現する。
細胞が赤芽球系統に深くかかわりをもつにつれて、それ
らのCD45発現は減少し、同時にGPAのような赤芽球系抗
原を発現し始める。CD45発現はこれらの細胞がさらに成
熟するにつれて（前方光散乱の低下を伴う）次第に減少
する。
くは多能性幹細胞も“BLAST"光散乱窓内に見い出され
る。これらの細胞は表面で低レベルのCD45を発現する。
細胞が赤芽球系統に深くかかわりをもつにつれて、それ
らのCD45発現は減少し、同時にGPAのような赤芽球系抗
原を発現し始める。CD45発現はこれらの細胞がさらに成
熟するにつれて（前方光散乱の低下を伴う）次第に減少
する。
前駆細胞（集団６）がＢ系統（集団２）に深くかかわり
をもつようになるにつれて、それらはCD34の発現を維持
しつつCD10およびCD19を発現し始める。これは前方光散
乱の低下、ひいては細胞サイズの縮小を伴うが、それら
は低レベルCD45発現を維持する。Ｂ系統細胞は成熟し続
けるにつれて、それらはCD34を失い、CD45の発現を増
す。Ｂリンパ様細胞（集団3b）の最終成熟段階は、CD45
発現の異なる増加、CD20の獲得、およびCD10の消失によ
り特徴づけられる。
をもつようになるにつれて、それらはCD34の発現を維持
しつつCD10およびCD19を発現し始める。これは前方光散
乱の低下、ひいては細胞サイズの縮小を伴うが、それら
は低レベルCD45発現を維持する。Ｂ系統細胞は成熟し続
けるにつれて、それらはCD34を失い、CD45の発現を増
す。Ｂリンパ様細胞（集団3b）の最終成熟段階は、CD45
発現の異なる増加、CD20の獲得、およびCD10の消失によ
り特徴づけられる。
ひとたび細胞が単球系統（４）に深くかかわるようにな
ると、それらはCD11bを発現し始め、続いてCD45レベル
を増し、それに伴つてCD14を獲得する。成熟しつつある
単球はまたCD15を発現するが、顆粒球よりも少量であ
る。
ると、それらはCD11bを発現し始め、続いてCD45レベル
を増し、それに伴つてCD14を獲得する。成熟しつつある
単球はまたCD15を発現するが、顆粒球よりも少量であ
る。
前駆細胞（集団６）の顆粒球成熟化（集団5b）へのかか
わり合いはCD15発現を変化させない。成熟過程中にこの
系統により数種の他の抗原が発現されるようになるが、
CD45の発現レベルは低いままで一定である。
わり合いはCD15発現を変化させない。成熟過程中にこの
系統により数種の他の抗原が発現されるようになるが、
CD45の発現レベルは低いままで一定である。
本発明のこれらの実施態様ならびに他の態様は当業者に
とつておのずと思い浮かぶことである。従つて、ここに
開示された内容は制限する意味で解釈されるべきではな
い。
とつておのずと思い浮かぶことである。従つて、ここに
開示された内容は制限する意味で解釈されるべきではな
い。
第１図はフローサイトメトリーによつて分析されたヒト
正常骨髄試料に関する前方光散乱対側方（すなわち“直
角”）光散乱の等高線プロツトである。 第２図はフローサイトメトリーによつて分析された、An
ti−Leu−MI（PE）およびAnti−HLe−１（FITC）で標識
されたヒト正常骨髄中の細胞の等高線プロツトであり、
その際第１図の“LYMPH"、“BLAST"または“GRAN"窓内
に現れたものを除くすべての細胞を排除するようにゲー
トが定められる。 第３−５図はフローサイトメトリーによつて分析され
た、PEに結合させた種々のモノクローナル抗体で標識さ
れ且つAnti−HLe−１（FITC）で標識されたヒト正常骨
髄中の細胞の等高線プロツトであり、その際第１図の
“LYMPH"、“BLAST"または“GRAN"窓内に現れたものを
除くすべての細胞を除外するようにゲートが定められ
る。
正常骨髄試料に関する前方光散乱対側方（すなわち“直
角”）光散乱の等高線プロツトである。 第２図はフローサイトメトリーによつて分析された、An
ti−Leu−MI（PE）およびAnti−HLe−１（FITC）で標識
されたヒト正常骨髄中の細胞の等高線プロツトであり、
その際第１図の“LYMPH"、“BLAST"または“GRAN"窓内
に現れたものを除くすべての細胞を排除するようにゲー
トが定められる。 第３−５図はフローサイトメトリーによつて分析され
た、PEに結合させた種々のモノクローナル抗体で標識さ
れ且つAnti−HLe−１（FITC）で標識されたヒト正常骨
髄中の細胞の等高線プロツトであり、その際第１図の
“LYMPH"、“BLAST"または“GRAN"窓内に現れたものを
除くすべての細胞を除外するようにゲートが定められ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カート・アイ・シヴィン アメリカ合衆国メリーランド州バルティモ ア，サウス・ロード 2217 (72)発明者 ヴィレンドラ・オー・シャー アメリカ合衆国カリフォルニア州キュパー チノ，アルカザー・アベニュー 21816 (56)参考文献 特表 昭61−502280（ＪＰ，Ａ)
Claims (7)
- 【請求項１】血液または骨髄から試料を分離し；該試料
を、別々の発光スペクトルを有する相異なる蛍光色素に
直接または間接的にそれぞれ結合させた、実質的に全て
の白血球と反応する第一モノクローナル抗体および白血
球の特定のサブ集団と反応する第二モノクローナル抗体
と反応させて混合物を形成し；そして該混合物をフロー
サイトメトリーにより分析して試料中の細胞の大きさ、
顆粒度および蛍光の各特性を調べ、該特性の組み合わせ
によって、造血細胞試料中の異なる発生系統の細胞また
は異なる発生段階の細胞を検出・同定する方法。 - 【請求項２】第一モノクローナル抗体は抗CD45である、
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】第二モノクローナル抗体は抗CD15、抗CD1
6、抗CD10、抗CD34、抗CD20、抗CD19、抗CD14、抗CD3お
よび抗CD11bよりなる群から選ばれる、請求項１記載の
方法。 - 【請求項４】第二モノクローナル抗体は抗CD15である、
請求項３記載の方法。 - 【請求項５】蛍光色素で標識された第一モノクローナル
抗体はAnti−Hle−１（FITC）である、請求項２記載の
方法。 - 【請求項６】蛍光色素で標識された第二モノクローナル
抗体はAnti−Leu−M1（PE）、Anti−Leu−11（PE）およ
びAnti−Leu−15（PE）よりなる群から選ばれる、請求
項３記載の方法。 - 【請求項７】蛍光色素で標識された第二モノクローナル
抗体はAnti−Leu−M1（PE）である、請求項６記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11849887A | 1987-11-09 | 1987-11-09 | |
| US118498 | 1999-02-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01161153A JPH01161153A (ja) | 1989-06-23 |
| JPH06105253B2 true JPH06105253B2 (ja) | 1994-12-21 |
Family
ID=22378975
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63283547A Expired - Lifetime JPH06105253B2 (ja) | 1987-11-09 | 1988-11-09 | 骨髄試料の組成の検出方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5137809A (ja) |
| EP (1) | EP0317156B2 (ja) |
| JP (1) | JPH06105253B2 (ja) |
| AT (1) | ATE81724T1 (ja) |
| DE (1) | DE3875456T3 (ja) |
| ES (1) | ES2035317T5 (ja) |
| GR (2) | GR3006183T3 (ja) |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991013974A1 (en) * | 1990-03-14 | 1991-09-19 | The Biomembrane Institute | Monoclonal antibody and immunoconjugates for the treatment and detection of b cell disorders |
| US5622853A (en) * | 1990-05-01 | 1997-04-22 | Becton Dickinson And Company | T lymphocyte precursor |
| US5367057A (en) | 1991-04-02 | 1994-11-22 | The Trustees Of Princeton University | Tyrosine kinase receptor flk-2 and fragments thereof |
| US5185438A (en) * | 1991-04-02 | 1993-02-09 | The Trustees Of Princeton University | Nucleic acids encoding hencatoporetic stem cell receptor flk-2 |
| GR920100123A (el) * | 1991-04-12 | 1993-03-16 | Ortho Diagnostic Systems Inc | Αντιδραστήριο πολυχρωματικής κηλίδωσης και μέ?οδος ανάλυσης. |
| FR2676847A1 (fr) * | 1991-05-22 | 1992-11-27 | Immunotech Sa | Procede d'enumeration des reticulocytes et les kits destines a cette enumeration. |
| FR2684186B1 (fr) * | 1991-11-25 | 1994-02-25 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Trousse pour le denombrement rapide des granulocytes, et procede utilisant ladite trousse. |
| ES2051651B1 (es) * | 1992-12-10 | 1995-01-01 | Univ Salamanca | Procedimiento para la cuantificacion simultanea, en una sola medicion, de los principales tipos de linfocitos humanos y sus subpoblaciones. |
| US5692220A (en) * | 1993-09-02 | 1997-11-25 | Coulter Corporation | Decision support system and method for diagnosis consultation in laboratory hematopathology |
| JP2680931B2 (ja) * | 1993-11-12 | 1997-11-19 | ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー | 希少細胞の絶対数を数える方法 |
| FI951778A (fi) * | 1995-04-12 | 1996-10-13 | Aboatech Ab Oy | Menetelmä allergian toteamiseksi |
| US5876956A (en) * | 1995-05-15 | 1999-03-02 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods for identification or purification of cells containing an enzymatic intracellular marker |
| US6117985A (en) | 1995-06-16 | 2000-09-12 | Stemcell Technologies Inc. | Antibody compositions for preparing enriched cell preparations |
| US5877299A (en) * | 1995-06-16 | 1999-03-02 | Stemcell Technologies Inc. | Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations |
| US6306575B1 (en) | 1995-06-16 | 2001-10-23 | Stemcell Technologies, Inc. | Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations |
| DK0877941T3 (da) * | 1995-11-13 | 2003-05-05 | Biotransplant Inc | Fremgangsmåde til masseforøgelse af en population eller subpopulation af celler |
| EP0929300B1 (en) | 1996-09-06 | 2004-05-26 | Medarex, Inc. | Cyanidin compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor |
| JP3620946B2 (ja) | 1997-03-17 | 2005-02-16 | シスメックス株式会社 | スキャッタグラムの表示方法および粒子計測装置 |
| WO2000052472A1 (en) * | 1999-03-01 | 2000-09-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Rapid assay for infection in small children |
| AU3712200A (en) * | 1999-03-01 | 2000-09-21 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Rapid assay for chorioamnionitis |
| AU763162B2 (en) * | 1999-04-13 | 2003-07-17 | Wilex Ag | Diagnostic and therapeutic use of antibodies against the urokinase receptor |
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