JPH01161153A - 骨髄試料の組成の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は試料中の造血細胞の検出および分析に関し、よ
シ詳細には標識モノクローナル抗体および細胞の光散乱
特性を用いて、骨髄試料中の異なる系統の未熟細胞およ
び成熟細胞全検出して分析する方法に関する。

（従来の技術） 骨髄は複雑な組織である。主として、骨髄は造血細胞の
分化と成熟に開力する部位である。多能性幹細胞から、
多数の細胞系統が分化する。これらの系統のうちで主な
成分はリンパ系（Ｂ、ＴおよびＮＫ細胞）、赤芽球系（
赤血球）および骨髄系（好塩基球、好中球、好酸球、巨
核球およびマクロファージ）である。常時、これらの系
統のそれぞれの細胞は一般に骨髄試料中に存在している
。

ひとたび分化すると、各種の細胞系統はいくつかの段階
を経て成熟する。成熟は骨髄および他の場所で起こる。

例えば、赤芽球系において、赤血球は一定の形態を有す
る芽細胞（幼若細胞）として骨髄中で発生し始める。そ
の段階から網状赤血球の段階捷で、多くの段階を通して
形態学的変化が何度も起こり、結局核を放出して網状赤
血球となる。その後、網状赤血球は血液中に入り、そこ
で最終的な成熟変化を受けて赤血球になる。他の細胞系
統も同様の発生段階を経るが、発生段階の数および場所
は相違する（例えば、未熟Ｔ細胞は骨髄で発生し始める
が、成熟および分化の主な場所は胸腺である）。従って
、骨髄試料を調べることにより、試料に含まれる種々の
細胞系統ばかりでなく、各系統のいくつかの発生段階を
も同定することが可能である。

試料中の細胞系統および／または発生段階を同定できる
ことは重要である。その結果は臨床的症状の指標を与え
ることができろ。例えば、貧血患者において、その症状
の原因を治療するために、それが血液中での赤血球の破
壊の結果であるのか、あるいは芽細胞が成熟するのに失
敗した結果であるのか知る必要がある。骨髄を調べるこ
とによシ、幹細胞、芽細胞および網状赤血球の正常量で
の存在は診断を不可能にし、それらの正常量での不在は
診断を確実なものにする。従って、パ正常″状態からの
変化を見分けろことにより、異常な現象の診断を下すこ
とが可能である。

種々の細胞系統および発生段階を同定するために、試料
は相当詳しく調べなければならない。それぞれの細胞系
統および１つの系統のそれぞれの段階がある一定の形態
学的特徴を有することは知られている。こうして、現在
一般に行われている手段は、吸引寸たは生検法により骨
髄試料を採取し、それ全染色し、その後光学顕微鏡でそ
れを観察することである。このような方法は主観的であ
り、時間がかかり、半定量的であり、そして肉眼で見え
る結果を得るために多数回の染色を必要とするＯ 成熟および分化に伴って生じる肉眼で見える形態学的変
化のほかに、詳細な変化が遺伝子発現の面で起こる。多
くの研究は、成熟期間中に単一の系統（例えば正常な赤
血球）において種々のこのような細胞表面抗原が出現（
又は消失）することについて開示しており、またそれら
の成熟過程で数種の系統に対して発現された単一の抗原
について開示している。例えば、ローケン（Ｌｏｋｅｎ
　）ら、Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗ　（
ヒト骨髄のフローサイトメトリー分析）＝１、　Ｎｏｒ
ｍａｌ　Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｒｎｅｎ
ｔ　　（正常赤芽球の発生）、Ｂｌｏｏｄ、６９：　２
５５−２６３（１９８７）、およびシビン（Ｃｉｖｉｎ
）ら・Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　
Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ（造血の抗原分析）。Ｖｌ
、　　ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃＣｈａｒａｃｔｅ
ｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＹ　−１０−ｐｏｓｉｔｉ
ｖｅＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｎｏ
ｒｍａｌ　　Ｈｕｍａｎ　ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗ　（正
常ヒト骨髄中のＭＹ−１０−陽性前駆細胞のフローサイ
トメトリー同定）、Ｅｘｐ。

Ｈｅｍａｔｏｌ、、　１５　：　１０−１７　（１−９
８７）　ｆそれぞれ参照されたい。骨髄中の細胞の不均
質性のために、細胞表面抗原を検出するマーカーの使用
は系統間の細胞を識別するのに十分というわけではない
。

こうして、目下のところ、系統間の細胞および発生段階
金単一力法で同定し且つ識別する手段は全く知られてい
ない。このような手段は異常な造血疾患を診断すく）だ
めの迅速で特異な手法を提供するであろう。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、正常な造血細胞の系統および発生段階を同定
し、分析するだめの方法およびキットに関する。本発明
の１つの実施態様である成熟段階によえしば、骨髄試料
が個体から採取される。その試料は不ｑ」的に白血球の
みから成る第二試料を提供するように処理される。第一
のモノクローナル抗体全第一の螢光色素で標識する。第
一のモノクローナル抗体は、それが実質的にすべての白
血球と反応するように選ばれる。第二のモノクローナル
抗体も第二の螢光色素で標識する。第二のモノクローナ
ル抗体は、それが白血球のサブ集団（例えば半球および
顆粒球）と反応するように選ばれろ。第一および第二の
螢光色素は、それぞれが類似した励起エネルギーレベル
を有するが、異なる発光スペクトルを示すように選択さ
れる。

その後、第二試料、第一螢光色素で標識したモノクロー
ナル抗体および第二螢光色素で標識したモノクローナル
抗体の混合物全調製し、それにより第二混合物中の白血
球が第一のモノクローナル抗体で標識され、且つ白血球
のサブ集団が第二のモノクローナル抗体で標識されるよ
うにする。次に、この混合物をフローサイトメトリー（
流動細胞計測法）で分析して、細胞の大きさおよび顆粒
度（ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ　）　により系統を識別し
、同時に細胞に対する第一および第二抗体の結合分布を
記録する０４つのパラメーターのすべてを組み合わせろ
と、各系統およびその系統の発生段階を識別するのに十
分なデータが得られる。そのデータはコンピュータのよ
うなデータ収集手段に貯えらオｔろ。

（課題を解決するだめの手段） 骨髄吸引液を正常な成人から採取した。骨髄は以下の実
施例において造血細胞の供給源であったが、当業者には
造血細胞全血液から分離し得ることが明らかであるだろ
う。この供給源からの細胞を同定ずろために、本発明ノ
ｊ法全変更ずイ）必要はない。

低密度白血球［１，０７７￥／ｉ、Ｆｉｃｏｌ］−Ｈｙ
　ｐ　ａ　ｑ　ｕ　ｅ　　にュージャージー州ビスカタ
ウエイ、ファルマシア社）を用いた密度勾配遠心法によ
り得られたもの〕は１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＴ
　　１６　ｄ　Ｏ（ＧＩＢＣＯ）で洗い、免疫螢光染色
のために分取した。低密度白血球は第一の試料を作るた
めに使用した。しかしながら、当業者には全面液捷たは
骨髄吸引液全使用できることが明らかであるだろう。こ
のような場合には、第一試料を調製するために、例えば
塩化アンモニウムを用いろ。

低密度骨髄白血球は１０７／ｍｌの濃度で懸濁した。両
方の抗体が螢光色素に直接結合された実験において、第
一の抗体は最大螢光を与える抗体量を用いて１０６個の
細胞に添加した。細胞は氷上で２０分間インキュベート
した。その後、細胞全遠心により沈殿させ、第二抗体を
加えろ前にＲＰＭ１１６４０緩衝液（染色容量の少なく
とも５倍）で洗った。氷上で２０分後、細胞を再度緩衝
液で洗い、その後１係パラホルムアルデヒド中で固定し
た。

螢光色素に直接結合された１つの抗体全利用する実験で
は、４段階法が用いられた。初めに、細胞は未結合抗体
と反応さぜた。洗浄段階後、細胞をラット抗マウスＫａ
ｐｐａ　（Ｐ　Ｅ　）　　と反応させ、氷上でインキュ
ベートし、そして洗浄した。次いで、細胞を１０％正常
マウス血清にさらして第二段階抗体の遊離結合部位をブ
ロックした。その後、細胞は第二の（螢光色素に直接結
合された）モノクローナル抗体で染色し、洗浄し、そし
て前のように固定した。

３色分析のために、細胞は初めに未結合抗体と反応させ
、続いてラット抗マウスＫａｐｐａ−ＡＰＣ第二段階抗
体と反応させた。細胞を洗い、１０係正常マウス血清と
反応させ、続いてＰＥ結合およびＦＩＴＣ結合抗体と２
０分間反応させ、洗浄し、そして前のように固定した。

フルオレセイン・インチオシアネー）　（ＦＩＴＣ）に
結合したおよび／またはフイコエリトリン（ＰＥ）に直
接又は間接結合したＣＤ３（Ｌｅｕ−４）、ＣＤｌ−０
（ＣＡＬＬＡ）、ＣＤ１１ｂ（Ｌｅｕ−１５）、ＣＤ１
４（Ｌｅｕ　　Ｍ３）、ＣＤ１５（Ｌｅｕ　−１１）、
　ＣＤ１９　（Ｌｅｕ−１２）、　ＣＤ２０　（Ｌｅｕ
　−１６）、ＣＤ４−５Ｒ（Ｌｅｕ−１，８）、　マウ
スＩｇＧ１　。

マウスＩｇＧ２、ラット抗マウスＫａｐｐａ　、ラット
抗マウスＫａｐｐａ−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、
および精製ＣＤ　３４　（Ｉ−ＩＰＣＡ−１）はカリフ
ォルニア州マウンテンビュー、ベクトン・デイツキンソ
ン・イムノサイトメトリー・システムズ社から入手した
。抗グリコホリン（１０Ｆ７　）はカリフォルニア州リ
バーモア、ランクロイス（ＲｏＬａｎｇｌｏｉｓ　）博
士から贈与された。

未染色細胞、ＩｇＧｊ−ＦＩＴＣ１ＩｇＧ２−ＰＥおよ
びラット抗マウスＫａｐｐａ−ＡＰＣ標識細胞は対照と
して使用した。

初めに、上記の通シに調製した骨髄吸引液はフローサイ
トメトリーにより分析した。現在利用されているフロー
サイトメーターは細胞の体積、前方の光散乱および／丑
たけ側方の光散乱を測定するのに有用である。その後、
これらのパラメーターを用いて、細胞系統はそれらの光
学的および物理的特性に基づいて分類することができる
。

簡単に述べると、前方光散乱（ＦＬＳ）は細胞の大きさ
の測定をもたらす。（細胞の体積は同様に細胞の大きさ
を表し、そのように装備された計測器も使用できる。）
一方、側方光散乱（ＳＬＳ）は細胞の゛顆粒度（ｇｒａ
ｎｕｌａｒｉｔｙ　）”　にほぼ等しい。Ｓ　Ｌ　Ｓは
細胞から反射された光を測定するものであり、細胞中の
核および／または顆粒のような構造の存在（又は不在）
の関数である。Ｆ　Ｌ　ＳおよびＳＬＳは、組み合わせ
ろと、異なる型の細胞を識別するのに役立つ。

ＦＬＳおよびＳＬＳのほかに、フローサイトメーターは
１つ以上、通常２つの螢光流路を含む。

これらの流路は励起された際に異なる波長の光を発する
ことのできる螢光色素で標識された細胞を識別するため
に使用される。別々の螢光色素で標識された別々の抗体
を用いて、異なる細胞表面抗原の発現に基づいて細胞型
を識別することができる。４つのパラメーター（すなわ
ち、ＦＬＳ、ＳＬＳ、ＦＬＩおよびＦＬ２）をすべて組
み合わせることにより、系統およびそれらの発生段階が
四次元の空間で識別されろ。

フローサイトメトリー分析は、２色免疫螢光の場合にＦ
ＡＣＳ　ｔａｒ　ＴＭｔ、そして３色免疫螢光の場合に
ＦＡＣ８４４０ＴＭ　　’に用いて行った（カリフォル
ニア州マウンテンビュー、ベクトン・デイツキンソン・
イムノザイトメトリーーシステムズ社）。アルゴンイオ
ンレーザ−は２００ｍＷの電力を用いて４８８ｎｍで操
作した。ＦＩＴＣ発光は５３０／３０ＢＰフイルターを
用いて集められ、一方ＰＥ発光は５８５／４２ＢＰフイ
ルターを通して集められた。３色免疫螢光は上記のよう
なアルゴンレーザーと共に６３３ｎｍ、４０ｍＷのＨｅ
　Ｎ　ｅレーザーを用いて実施した。ＡＰＣ発光は６６
０／２０ＢＰフイルターを用いて集められた○Ｃｏｎ５
ｏｒｔ　３０　Ｄａｔａ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　Ｓｙ
Ｓｔｅｍ（ベクトン・デイツキンソン社）に５０，００
０の事例を一覧表形式で収集した。これによりデータを
再分析して、前方および直角の光散乱によｐ固定した細
胞集団の免疫螢光の異なる色同士の相関関係を立証する
ことが可能になった。すべての等高純プロットにおいて
、最低レベルは３つの事例であり、等高純は＜、６，８
，１０，１．６，３２゜６４、．１２８のところに引い
た。

これらのパラメーターの使用および意味のより詳細な記
述については、ローケン（Ｌｏｋｅｎ　）、Ｃｅｌ］　
５ｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ　ａｎｄ　Ｍｏｒｐｈ
ｏｌｏｇｉｃａ］Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　
ｏｆ　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　Ｐｏｐｕ］ａ、−ｔｉｏｎ
ｓ　ｂ３’　Ｆｌｏｗ　ＣｙｔｏｍｃｔｒＹ　（フロー
サイトメトリーによる白血球集団の細胞表面抗原および
形態学的同定）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ　、　　チャーチル・リビングストン（Ｐ　　
ビハリー編集）、１、９８６　ｆ参照されたい。以下の
細胞分析はフローザイトメトリーによって行われたが、
当業者には細胞の大きさ、顆粒度および螢光を測定する
ために螢光光学顕微鏡を使用しうろことが明らかである
だろう。

第１図を参照すると、曲角および直角の光散乱の物理的
パラメーターにより３神の異なる細胞集団が識別される
らしいことが分かるであろう。これらの窓は”ＬＹＭＰ
Ｈ”、”ＢＬＡＳＴ”および”ＧＲＡＮ’″と表示され
た。残りの物質は一般に細胞破片（すなわち、破壊され
た細胞および細胞断片またはその他の断片）から成る。

第１図（および実際にＱ」′残りのすべての図面）は二
次元空間に示されているか、こノｔは単に本発明を見る
ことのできる形で表示するためになされたものであるこ
とが理解さね、るであろう。本発明全二次元空間に限定
するつもりはない。実際、好適な態様では、測定値（す
ブエわち、ＦＬＳ、ＳＬＳ、ＦＬＩおよびＩｉ’　Ｌ　
２　）は四次元空間で解釈される。

正常な骨髄から成る種々の系統を同定するために、第一
のモノクローナル抗体は試料中の実質的に全部の白血球
を同定しうるものが選ばれた。

ＣＤ４５は実質的にすべての白血球に見られろ抗原であ
る。〔“’　ＣＩ）　”すなわちクラスター表示（ｃｌ
ｕｓｔｅｒ　ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）はｔｈｅ　Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉ−ｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ　Ｏｎ
　Ｈｕｍａｎ　Ｄｉｆｆｃｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ａｎ
ｔｉｇｅｎｓ　　（ヒト分化抗原に関する国際ワークシ
ョップ）により定められた。対応するＩＩ　Ｌ　ｅｕＩ
Ｉ系はスタンノオード犬学の研究者達により定められた
。〕この抗原に封するモノクローナル抗体を選択するこ
とにより、白血球全標識することができろｏ　Ａ、ｎｔ
ｉ　−ＨＬ　ｅ　−１はこのようなモノクローナル抗体
の１つである。別のこのような抗体はＬＣＡ　（カルタ
ー・エレクトロニクス社）である。Ａｎｔｉ　−ＨＬ　
ｅ　−１は精製されたものと（Ｆ　Ｉ　Ｔ　Ｃ）に結合
されたものの両方が市販されている。純粋な抗ＣＤ４５
抗体を使用ずろ場合、当分野で知られた方法によりその
抗体を螢光色素（例えばＦＩＴＣ捷たはＰＥ）に結合さ
せろことができる。

第一［二のモノクローナル抗体は白血球系統のサブ集団
を同定するために選はれた。好適プｚ実施態様において
、第二のモノクロ・−ナル抗体は白血球の２つの系統：
すなわち単球および顆粒球を同定する。これらの系統は
ＣＤ１５抗原により同定される。この抗原に対するモノ
クローナル抗体を選択ずろことにより、これらの２つの
系統全同定することがてきろ。Ａ、ｎｔ、１−Ｌｅｕ　
−ＩＶＩ　１はそのような抗ＣＩ）　１５抗体の１つで
あり、他にはＭｙｌがあろＯ 好適な第二モノクローナル抗体は抗ＣＤ１５、より特定
的にはＡｎｔｉ−Ｌｅｕ　−Ｍ　］であるが、当業者は
他のモノクロ・−ナル抗体もそれらが種々の系統および
成熟段階を識別する限り使用可能であることを、図面お
よび以下の実施例から理解できろだろう。例えば、抗Ｃ
Ｄ１１ｂ、抗ＣＤ１６および抗ＣＤ１９（すなわち、Ａ
、ｎｊ；１−Ｌｅｕ　−１５、Ａｎｔ　ｉ　−Ｌｅｕ　
−１１，：Ｊ’、□よびＡｎｔｉ−Ｌｅｕ　−１２）は
すべて系統および段階を区別するように機能する。従っ
て、これらのモノクローナル抗体および実施例に記載の
他のモノクローナル抗体は抗ＣＤ４５（またはＡｎｔｉ
　　Ｌｃｕ　−Ｍ　１　）の代わりに使用できる。

Ａｎｔｉ　−Ｌｅｕ　−Ｍ　］　　は精製された形で市
販されているが、Ａｎｔｉ−ＨＬｅ−１（Ｆ　ＩＴＣ）
と対合させるために、当分野で知られた方法により第二
段階の（ＰＥ）結合抗体と反応させろ。ＰＥは、ぞれが
ＦＩＴＣと実質的に類似した励起波長を有すイ）が、異
なるスペクトルで発光するので選ばれた。

ひとたび選ばれると、螢光色素で標識された第一・およ
び第二モノクローナル抗体は先に述べたように試料と混
合されるｏ　Ａｎｔｉ　−ＨＬ　ｅ−１（Ｆ　Ｉ　ＴＣ
）およびＡｎｔｉ　−Ｌｅｕ　−Ｍ　１　（Ｐ　Ｅ　）
はそれぞれ好適な第一および第二モノクローナル抗体で
ある。

ＦＬＳおよびＳＬＳにより測定して試ｔ１中の却１胞の
物理的パラメーターが分かると、本発明を二次元空間で
考え続けるために、それぞれの集団に対してゲートが確
立されろ。そのゲートはゲートの外側にある全細胞につ
いての分析情報を効果的に除外するであろうｏ　Ａｎｔ
ｉ−ＨＬｅ−１（ＦＩＴＣ）およびＡｎｔｉ　−Ｌｅｕ
　−Ｍ　］、　（Ｐ　Ｅ　）　’ｆｆ：用いて順次”　
ＬＹＩＶＩＰＨ”、”ＢＬＡＳＴ”および’ＧＲＡＮ’
″についてゲートが定捷ると、それぞれの細胞系統が識
別でき、同様に各系統のいくつかの段階も識別できろ。

第２図を参照すると、骨髄細胞の”ＬＹＭＰＨ”窓はリ
ンパ様細胞（集団２：前Ｂ細胞、集団３：成熟リンパ様
細胞）および有核赤芽球系前駆細胞（集団１ａ）ｋ伴う
成熟赤血球（集団］、　ａ　）の混合物を含む。”ＢＬ
ＡＳＴ”　　窓は未熟および成熟単球（集団４）、並び
に種々の血液細胞系統の未熟細胞（集団１ｂ初期赤芽球
、５Ｂ初期好中球、および集団６芽細胞）を含む。”Ｇ
ＲＡＮ”　　窓はもっばら成熟しつつある顆粒球（集団
ｓｂ）から成っている。これらの結果は、ローケン（Ｌ
ｏｋｅｎ）らの上記文献に記載される標準染色法に従っ
て細胞を光学顕微鏡で調べることにより確かめることが
できる。

第２図において同定した系統が記載した通りであること
をさらに確かめろために、各系統に対して特異的なモノ
クローナル抗体を用いて一連のフローサイトメトリー分
析を行った。

赤血球を検出するために、ヒト骨髄細胞は赤芽球系細胞
を同定する抗体の抗グリコホリン（ＰＥ）およびＡｎｔ
ｉ−ＨＬｅ−１（ＦＩＴＣ）と反応させた。

前方および側方の光散乱によりゲートがつくられた、こ
れらの２つのマーカー間の相関関係を第３Ａ図に示す。

”ＬＹＭＰＨ”窓ではＧ　Ｐ　Ａ　”　／ＣＤ４５−成
熟赤芽球系細胞（集団１ａ）がＧＰＡ　／ＣＤ４５＋リ
ンパ様細胞（集団２．３）から容易に識別された。ＧＰ
Ａ十細脳細胞’ＧＲＡＮ”窓に全く存在していなめ）つ
た。

”ＢＬＡＳＴ”　　窓では、明らかに区別しうるＧＰＡ
　　初期赤芽球系細胞（集団ｘｂ）が中程度のＧＰＡ量
を発現する細胞から区別された。

第３Ａ図参照。ＣＤ４５発現は、細胞が赤芽球系統に近
づくにつれて次第に減少し、一方ＧＰＡの発現は増加し
た。

Ｔリンパ球を検出するために、正常骨髄細胞はＣＤ３ｐ
ａｎＴ’Ｊンパ球モノクローナル抗体のＡｎｔｉ−Ｌｅ
ｕ−４（ＰＥ）およびＡｎｔｉ−ＨＬｅ　−１（ＦＩＴ
Ｃ）と反応させた。第３Ｂ図参照。

ＣＤ３Ｔ！Ｊンパ様細胞（集団３ａ）はすべて”　ＬＹ
ＭＰＨ”光散乱窓に見られ、ＣＤ４５の強い同時発現を
伴っていた。

Ｂ　ｌ）ンパ球を検出するために、骨髄細胞はＡｎｔ　
１−Ｌｅｕ−１２（ＰＥ）　（ＣＤ　１９　）およびＡ
ｎｔｉ　−ＨＬｅ　−１（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）の組み合わせ
と反応させ、それにより未熟（集団２）および成熟（集
団３ｂ）の発生段階を含むすべてのＢ　’Ｊタンパ様胞
を同定した。これら２つの抗原同士の相関関係を第３Ｄ
図に示す。ＣＤ１．９”Ｂリンパ様細胞は’ＬＹＭＰＨ
”窓に限定された○これらのＢ系統細胞は異なる３つの
ＣＤ４５発現レベルを示した：すなわち、ＣＤ　１．９
″−／ＣＤ４５”＋（集団３ｂ）、ＣＤ１．９＋／ＣＤ
４５”、およびＣＤ１９″−／ＣＤ４５’頁集団２）。

Ｂ系統細胞間の成熟度の差をさらに識別するために、骨
髄細胞はＣＤ４５および他の２種類のモノクローナル抗
体：ずなわち、未熟Ｂリンノく株細胞を同定する抗体の
Ａｎｔｉ−ＣＡＬＬＡ（ＰＥ）（ＣＤＩＯ）（図示せず
）、または後期Ｂ細胞を同定するＡｎｔｉ　−Ｌｅｕ−
１６（ＰＥ）　（ＣＤ２０　）の組み合わせで染色した
。ＣＤ１．０および中間レベルのＣＤ　４５　ｋ発現す
る未熟Ｂ細胞は集団２として同定された。

ＮＫ細胞を検出するために、骨髄細胞はＡｎｔｉ−ＨＬ
ｅ　−１（Ｆ　Ｉ　Ｔ　Ｃ）およびＡｎｔｉ　−Ｌｅｕ
　−１１（ＰＥ）（ＣＤ１６）またはＡｎｔｉ　−Ｌｅ
ｕ　−１５（ＰＥ）（ｃＤｌｘｂ）のいずれかの組み合
わせで染色した０これらのモノクローナル抗体は”ＬＹ
ＭＰＨ”光散乱窓内のＮＫ細胞（集団３ｃ）を同定する
。これらの抗体によって同定された”　ＬＹＭＰＨ”光
散乱窓内の細胞はＣＤ　４５″−０を示した。（第４Ａ
および４・Ｂ図参照。）ＣＤ１６およびＣＤ１．］、ｂ
で標識された’ＢＬＡＳＴ”および’ＧＲＡＮ”窓内の
細胞は単骨髄系細胞（ｍｏｎｏｍｙｅｌｏｉｄ　ｃｅｌ
ｌ　）であり、以下で論する○単球系統の細胞は、成熟
したおよび成熟しつつあろ単球（集団４）に結合するモ
ノクローナル抗体のＣＤ１１ｂｌたはＡｎｔｉ　−Ｌｅ
ｕ−Ｍ３　（ＰＥ　）（ＣＤ　１４．　）のいずれかで
骨髄細胞を染色することによりＩＥＪ定した。ＣＩ）　
４５と共にこ′ｉ″１７ら２つのマーカーの関連ある発
現を第４Ｂおよび５Ａ図に示す。

単球系統の細胞は”１３ＬＡＳＴ”光散乱窓にのみ存在
（〜、それ故に他の系統に属ずろ細胞から識別されるで
あろう。”　ＬＹＭＰＨ”窓にはＣＤ１４＋細胞が全く
存在せず、−力”ＧＲＡＮ”　窓にはＣＤ１４″　細胞
が低い比率で存在していた（第５Ａ図）。

単球系統によるＣＤ１１ｂ抗原の発現はまた”ＢＬＡＳ
Ｔ”光散乱窓内に同定されるであろう〇二変数相関プロ
ットの凸形状（第４Ｂ図、’Ｍ３ｒ、ＡｓＴ”　　）は
、ＣＤＩ］、ｂの発現が成熟しつつある単球（集団４）
によるＣＤ４５の強度液化に優先することを示唆してい
る。ＣＤ　１．４とＣ］）　４５の高度に関連した発現
は、単球成熟期間中のＣＤ４５の強度変化がＣＤ１．４
の発現と同時期に起こることを示している。その他の研
究は、ＣＤ１］、ｌ）が単球発生期間中ＣＤ　１４発現
に寸さろことを示した。”　ＬＹｆＶＩＩ）Ｉ（”窓中
に見ら力、ろＣＤ１１ｂを発現する細胞（第４Ｂ図）は
Ｎｆ（細胞（集団３ｃ）てあることが先に示された。

骨髄系細胞の発生は、骨髄細胞ｆｃＴ）４５と組み合わ
せたＣＤ１５、ＣＤ　１　ｌｂ、　ＣＤ　１．６　ｋ會
む数種類のモノクローナル抗体で染色することにより評
価した。ＣＤ１５は顆粒球（集団５ａ＆ｂ）により豊富
に発現され、そして単球（集団４）により少量発現され
る（第２図参照）。”ＧＲＡＮ”窓内のすべての成熟し
つつある顆粒球（集団５ｂ）はＣＤ１５に対して高度に
陽性であり、一方ＣＤ４５に対しては中程度に陽性であ
った。

”　ＢＬＡＳＴ　”ゲート内の比較的未熟な骨髄系細胞
（骨髄球、前骨髄球）はＣＤ１５に対して明らかに陽性
てあり、ＣＤ１５に対して比較的陰性であろがより高レ
ベルのＣＤ　４−５を発現する単球（集団４）と区別さ
れろであろう（第２図参照）。

ＣＤ　１］−ｂは骨髄系細胞の発生過程においてＣＩ）
１５よりも遅ね７て発現されろ。”　ＧＲＡＮ”細胞（
集団５ｂ）の一部のみがＣＤｌ−１，ｂ＝ｉ発現したが
、ＣＤ１５は全部が発現した。”ＧＲＡＮ’″窓内のよ
り少数の細胞がＣＤ　１．６と反応した（第４Ａ図参照
）。ＣＤ１１ｂと反応した゛’ＢＬＡＳＴ’″窓内の細
胞（集団４）（第４Ｂ図参照）は、それらがわずかによ
り高レベルのＣＤ４５抗原発現したので、主として単球
であった。

造血コロニーを形成しうろ細胞はすべてヒト前駆細胞抗
原ＣＤ　３４　全発現ずろ。前駆細胞によるＣ　Ｉ）　
３４どＣＩ）　４５の発現の相関関係全第５Ｂ図に示す
。ＣＤ３４．−＋細胞（集団６）はＣＤ４５に対してわ
ずかに陽性であった。以前の研究から、ＣＤ３４陽性細
胞のほぼ半分はＢ　ＩＪンバ様細胞（集団２）であるこ
とが分かつている。これらのＣＤ３４−１−未熟Ｂリン
パ様細胞は’　ＬＹＭＰＨ”窓内に見られ、ＣＤ１９お
よびＣＩ）　］−０’を発現した。これらの細胞は先に
同定して論じた第３Ｄ図に示すＣＤ１９およびＣＤｌ０
Ｂ系統マーカーと同じものであった。しかしながら、口
］ｖｉｔｒｏ検定でコロニーを形成する骨髄および赤芽
球の前駆細胞を含むＣＤ３４″細胞の残りは’ＢＬＡＳ
Ｔ”窓内に存在しく第５Ｂ図参照）、それらは丑だ低レ
ベルのＣＤ４５を発現した。

要約すると、”　ＬＹＭＰＨ”光散乱窓内の赤芽球系細
胞は、それらのＧＰＡ発現によってその窓内の他の細胞
から容易に識別された。中間圧赤芽球から網状赤血球段
階までのＧＰＡ＋赤芽球系細胞（集団１ａ）はＣＤ４５
’ｆｆｉはとんど、あるいは全く発現しなかった。対照
的に、ＣＤ３″Ｔ細胞（集団３ａ）、ＣＤ１６’−およ
びＣＤ１］、ｂ″ＮＫＮＫ細胞３ｃ）、ならびにＣＤ２
０　　成熟Ｂ細胞（集団３　ｂ　）　ｆ、１含めたこの
光散乱窓内の成熟リンパ球はすべて多量のＣＤ４５抗原
を発現した。

この光散乱窓内の唯一の他の細胞は未熟Ｂ　ｌ）ンバ球
（集団２）であり、このリンパ球はそれらの成熟子孫よ
りも少ない量のＣＤ　４５　＝’、発現した。

”　ＬＹＭＰＨ″′光散乱ゲート内のすグーの細胞は、
これらのモノクローナル抗体を使用する理由を説明する
ことができる。この窓は細胞表面で発現されたＣＤ４５
の量に基づいて識別しうろ成熟Ｔ細胞（集団３ａ）、Ｂ
細胞（集団３ｂ）およびＮＫ細胞（集団３ｃ）、並びに
成熟しつつあろ赤芽球系細胞（集団１ａ）およびＢ　Ｉ
Ｊンパ様細胞（集団２）を含んでいる。骨髄系統の細胞
はこの光散乱窓内に現れない。

”ＢＬＡＳＴ″′光散乱窓内の３つの細胞集団は、ＣＤ
　４５およびＣＤ１５抗原発現の強度に基づいて識別さ
れた。ＣＤ　４５抗原発現が最も低い（ＣＤ４５±）細
胞は赤芽球（集団１ｂ）であり、それらのＧＰＡ発現に
より同定された（第２Ｂ図参照）。ＣＤ　４５を最も多
量に発現したこの窓内の細胞は単球（集団４）であり、
単球特異的ＣＤ１４抗原の同時発現により証明された。

これらのＣＤ４５１ｊ胞はまた高レベルのＣＤ１１ｂお
よび中間レベルのＣＤ１５抗原を発現した。中間しく２
７） ベルのＣＤ４５を発現した’ＢＬＡＳＴ”窓内の細胞は
、他の細胞表面抗原の発現によってさらに再分割された
。ＣＤ１５はこれらの中間レベルのＣＤ４５　　細胞を
２つの集団に分けた。ＣＤ１５＋細胞は前骨髄球および
骨髄球を含む好中球系統（集団５ａ）に深く関係してい
た。残りのＣＤ１５−１ＣＤ４５　　細胞はＣＤ１５と
ＣＤ３４が骨髄で重なり合わないのでＣＤ　３４”細胞
を含む。

従って、ＣＤ　３４＋とじて同定された前駆細胞（集団
６）＆−１４＆、ＣＤ４５とＣＤ１５の組み合わせによ
っても検出された。

”　ＧＲＡＮ”窓内のすべての細胞は、細胞質中に顆粒
を有し且つ低レベルのＣＤ４５を発現するものとして特
徴づけられた。ＣＤ１５はこれらの細胞の全部を標識し
たが、ＣＤ］、１ｂｔたはＣＤ１６は少数の細胞を同定
した。ＣＤ１４はこれらの’ＧＲＡＮ”窓細胞の小集団
を同定した。これらの細胞は骨髄系抗原の発現の差に対
応して、好中球系統（集団５ｂ）の異なる成熟段階を構
成していた。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏで検定した前駆細胞（集団６）、そし
ておそらくは多能性幹細胞も’ＢＬＡＳＴ”　光散乱窓
内に見い出される。これらの細胞は表面で低レベルのＣ
Ｄ　４５　’（ｅ発現する。細胞が赤芽球系統に深くか
かわりをもつにつれて、それらのＣＤ４５発現は減少し
、同時にＧＰＡのような赤芽球系抗原を発現し始める。

ＣＤ４５発現はこれらの細胞がさらに成熟するにつれて
（前方光散乱の低下を伴う）次第に減少する。

前駆細胞（集団６）がＢ系統（集団２）に深く力・かわ
りをもつようになるにつれて、それらはＣＤ３４の発現
を維持しつつＣＤｌ０およびＣＤ１９を発現し始める。

これは前方光散乱の低下、ひいては細胞サイズの縮小を
伴うが、それらは低レベルのＣＤ４５発現を維持する。

Ｂ系統細胞は成熟し続けるにつれて、それらはＣＤ３４
を失い、ＣＤ４５の発現を増す。Ｂ　’Ｊンパ様細胞（
集団３ｂ）の最終成熟段階は、ＣＤ４５発現の更なる増
加、ＣＤ２０の獲得、およびＣＤｌ０の消失により特徴
づけられる。

（２ｑ） ひとたび細胞が単球系統（４）に深くかかわるようにな
ると、それらはＣＤ１１ｂ’ｌｒ発現し始め、続いてＣ
Ｄ４５レベルを増し、それに伴ってＣＤ１４を獲得する
。成熟しつつある単球はまたＣＤ１５を発現するが、顆
粒球よりも少量である。

前駆細胞（集団６）の顆粒球成熟化（集団ｓｂ）へのか
かわ９合いはＣＤ１５発現を変化させない。

成熟過程中にこの系統により数種の他の抗原が発現され
るようになるが、ＣＤ４５の発現レベルは低いままで一
定である。

本発明のこれらの実施態様ならびに他の態様は当業者に
とっておのずと思い浮かぶことである。

従って、ここに開示された内容は制限する意味で解釈さ
れるべきではない。

【図面の簡単な説明】

第１図はフローサイトメトリーによって分析されたヒト
正常骨髄試料に関する前方光散乱対側方（すなわち゛′
直角″）光散乱の等高純プロットである。 第２図はフローサイトメトリーによって分析された、Ａ
ｎｔｉ−Ｌｅｕ−Ｍｌ　（ＰＥ）およびＡｎｔｉ−ＨＬ
ｅ−１，（ＦＩＴＣ）　　で標識されたヒト正常骨髄中
の細胞の等高線プロットであり、その際第１図の”ＬＹ
ＭＰＨ”、”ＢＬＡＳＴ”または’ＧＲＡＮ”窓内に現
れたものを除くすべての細胞を排除するようにゲートが
定められる。 第３−５図はフローサイトメトリーによって分析された
、Ｉ）　Ｅに結合させた種々のモノクローナル抗体て標
識され且つＡｎｔｉ　−ＨＬｅ　−１（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）
で標識されたヒト正常骨髄中の細胞の等高線プロットで
あり、その際第１図の’ＬＹＭＰＨ’″、”ＢＬＡＳＴ
”または”ＧＲＡＮ″′窓内に現れたものを除くすべて
の細胞を除外するようにゲートが定めらノコ、る。 （外４名〕 ＦＩＧ、１ アソチーＨＬｅ−１／ＣＤ４５　（ＦＩＴＣ）ＦＩＧ、
２ ＦＩＧ、３ ７ノ子−ＨＬｅ−１／ＣＤ４５　（ＦＩＴＣ）八日 ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、造血細胞の試料において細胞発生の異なる系統およ
   び段階を検出・同定する方法であつて、個体の血液また
   は骨髄から試料を分離し；該試料を、別々の発光スペク
   トルを有する相異なる螢光色素に直接または間接結合さ
   せた第一モノクローナル抗体および第二モノクローナル
   抗体と反応させて混合物を形成し；そして該混合物をフ
   ローサイトメトリーにより分析して試料中の細胞の大き
   さ、顆粒度および螢光特性を同定する；ことから成る上
   記方法。 ２、第一モノクローナル抗体は本質的に全ての白血球を
   標識するように選ばれる、請求項１記載の方法。 ３、第一モノクローナル抗体は抗ＣＤ４５である、請求
   項２記載の方法。 ４、第二モノクローナル抗体は白血球のサブ集団を標識
   するように選ばれる、請求項１記載の方法。 ５、第二モノクローナル抗体は抗ＣＤ１５、抗ＣＤ１６
   、抗ＣＤ１０、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ１９、
   抗ＣＤ１４、抗ＣＤ３および抗ＣＤ１１６よりなる群か
   ら選ばれる、請求項４記載の方法。 ６、第二モノクローナル抗体は抗ＣＤ１５である、請求
   項５記載の方法。 ７、骨髄の造血細胞試料において細胞発生の異なる系統
   および段階を検出・同定する方法であつて、個体から試
   料を分離し；該試料を、実質的に全ての白血球と反応す
   る第一の螢光色素で標識されたモノクローナル抗体およ
   び白血球のサブ集団と反応する第二の螢光色素で標識さ
   れたモノクローナル抗体と反応させて混合物を形成し；
   そして該混合物をフローサイトメトリーにより分析して
   試料中の細胞の大きさ、顆粒度および螢光特性を同定す
   る；ことから成る上記方法。 ８、第一の螢光色素で標識されたモノクローナル抗体は
   Ａｎｔｉ−ＨＬｅ−１（ＦＩＴＣ）である、請求項７記
   載の方法。 ９、第二の螢光色素で標識されたモノクローナル抗体は
   Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ−Ｍ１（ＰＥ）、Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ−
   １１（ＰＥ）およびＡｎｔｉ−Ｌｅｕ−１５（ＰＥ）よ
   りなる群から選ばれる、請求項８記載の方法。 １０、第二の螢光色素で標識されたモノクローナル抗体
   はＡｎｔｉ−Ｌｅｕ−Ｍ１（ＰＥ）である、請求項９記
   載の方法。