JP2680931B2 - 希少細胞の絶対数を数える方法 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本出願は1990年８月７日に出願された米国出願番号07
/570,569号（現在放棄）の一部継続出願である1993年４
月８日に出願された現在係属中の米国出願番号08/046,3
43号の一部継続出願である。

産業上の利用分野 本発明は、細胞サンプル中の希少細胞の絶対数を測定
する方法に関するが、特定すれば、フローサイトメトリ
ー手段により末梢血、または骨髄細胞のサンプル中の始
原細胞（progenitor cell）の絶対数を測定する方法に
関する。

発明の背景 伝統的には、免疫蛍光フローサイトメトリー測定にお
いて、細胞集団はそれらの相対的分布により定量される
（即ち、計数されたサンプル中の細胞のパーセンテージ
として）。末梢血において、赤血球は約1000対１で白血
球に数でまさる。即ち、フローサイトメトリーを用いる
ほとんどの作業は赤血球の溶解、続く遠心分離、懸濁、
残りの細胞の標識および計数を含む。残念ながら、この
工程は血液体積の函数としての残りの細胞の正確な計数
の可能性を損なわせる。

AIDSの危機の到来と共に、CD4⁺細胞の計数がこの疾患
の診断および監視においてより重要になった。正確な測
定を得るための一つの方法において、CD4の絶対数の計
数は、血液分析機（例えば、コウルターカウンター）に
より測定された白血球数に、共に血液分析機により測定
されたリンパ球のパーセンテージを、フローサイトメト
リーにより測定されたCD4⁺のパーセンテージと共に掛け
ることにより試みれられた。NCCLSのガイドラインの報
告を参照されたい。この試みは血液分析の装置の精密度
におけるよく認識されている変動のため、多大な不正確
さを被る。

他の試みは、フローサイトメトリーと複合したシリン
ジ送達システムの使用を含むが、その際、既知のサンプ
ル体積を装置に送達して、そのサンプル体積中の事象
（event）を数える。さらに他の試みは、既知サンプル
体積に既知数の蛍光ビーズを付加し、そして一定時間ユ
ニットあたりのビーズおよび事象の数を数える。細胞に
対するビーズの比率はユニット体積あたりの細胞数を提
供する。米国特許第4,110,604号を参照されたい。

これらの試みは、サンプルの５％以上の集団の細胞の
計数には適している。しかしながら、希少細胞の計数に
関して、これらの試みは所望の正確さを達成しないかも
しれない。サンプル中の抗原密度および希少細胞分布
は、希少種に関する単一マーカーをあてにする場合の、
「陽性」と「陰性」の細胞の識別を困難にする。即ち、
グロス（Gross）らはマーカーの組み合わせを用いて極
めて希少な細胞（即ち、１×10^-6のオーダー）の検出法
を開発した。（Cytometry,14:519,19931;および1993年
１月26日に出願された米国特許出願第08/009,185号を参
照されたい。）この方法は、例えば乳癌の最小残余疾患
（minimum residual disease）の評価において特に有
用である。

極く希少な細胞と５％を越える細胞集団の間には、絶
対数の計数がしだいに重要になりつつある「希少な」細
胞集団がある。米国特許4,714,680号のシビン（Civin）
は、成熟リンパ球細胞および骨髄細胞とは実質的に異な
った多能性リンパ−造血細胞集団を記載した。シビン
は、これらの細胞上に存在した抗原MY−10（CD34として
も公知）および（同じ名前の）モノクローナル抗体も記
載した。これらの「始原」細胞は、正常成人骨髄中のす
べての細胞の約１％以上を占め、そして通常、共通な幹
細胞、造血幹細胞、および後者の優勢な細胞と系統的に
関連する始原細胞からなる。

シビンは、始原細胞のための多くの治療法を記載し
た。これらの使用法の多くは、患者の造血システムの再
構築のみならず対移植片宿主疾患を避けることをも目的
として、糖尿病患者の骨髄にCD34⁺細胞を移植すること
を含む。

始原細胞の移植を含む現在の治療法は、全世界の多く
の会社により実施されつつある。これらの多くの方法に
おいて、白血球は末梢血、臍帯血または骨髄から集めら
れ、そしてCD34⁺細胞は、陽性選択工程におけるCD34モ
ノクローナル抗体または非始原細胞を除外するひとつ以
上の他の抗体の組み合わせのいずれかを用いて、サンプ
ル中の残りの細胞から分離される。細胞は異種源から、
または患者から回収される。患者から得る場合、循環す
る始原細胞の数を増幅するために回収前において、患者
は最初に成長因子、例えばGM−CSFまたはＧ−CSFを与え
られる。

回収法を実施するための手段は、蛍光活性化ソーティ
ング（例えば、米国特許第3,826,364号および5,030,002
号を参照されたい）、ビオチン／アビジンカラム（例え
ば米国特許第5,215,927号、5,225,353号および5,240,85
6号を参照されたい）および磁気ビーズに基づくシステ
ム（例えば、国際公開91/09141号およびカトー（Kato）
ら、Cytometry,14:384（1993）を参照されたい）を含
む。システムはフローサイトメトリー、データ集積およ
び分析ハードウエアおよびソフトウエアを含み、そして
試薬は多くの会社、例えばベクトンディッキンソンイム
ノサイトメトリーシステムズ社（BDIS）から市販されて
いる。

始原細胞集団を用いる医療に加えて、始原細胞のサブ
セットに関する別の研究が存在する。（これらの細胞は
ほとんどの細胞サンプルにおいて始原細胞よりもさらに
希少である。）この研究において、タースタペン（Ters
tappen）と他の研究者は、多能性造血幹細胞および全能
性の普遍的（common）幹細胞に富む集団を見つけるため
に、細胞中のCD34サブセットの機能に関する研究に焦点
を絞った。1991年９月６日に出願された米国特許出願07
/759,092号の一部継続出願である、1992年６月２日に出
願された米国特許出願番号07/895,491号を参照された
い。1991年12月にScientific Americanにおいて公開さ
れた文献において、ゴールデ（Golde）は、幹細胞を一
般的に記載しており、幹細胞の単離に関する研究および
治療のための幹細胞の使用法を記載している。

すべての場合において、どれほど多くのCD34⁺細胞が
移植された物質中に存在するかを知ることは重要なこと
である。一般的には、あらゆるドナー物質中にて移植が
成功するのに無理のないCD34⁺細胞の必要数は、体重の
キログラムあたり１×10⁶であると信じられている。他
の場合（即ち、サイトカインを用いて回収前に始原細胞
の生産を刺激する場合）、血液中の始原細胞のレベルを
知ることにより、最大数の生産をもってドナーからそれ
らの細胞を回収する好機をねらうことが重要である。即
ち、始原細胞（またはそのサブセット中の細胞）の絶対
数を正確に測定することを可能にすることが重要であ
る。フローサイトメトリーは、迅速かつ性格に細胞を計
数する便利な手段を提供する。

発明の概要 本発明は、サンプル中の希少（即ち５％未満）細胞の
絶対数を正確に測定するための試薬および方法からな
る。方法は、サンプル中のCD34⁺細胞の数の測定、およ
びCD34⁺サブセット例えばCD34⁺/CD38^-/HLA−DR⁺の数の
測定に特に有用である。

この方法は、以下の工程： （ａ）（１）サンプル中のすべての細胞と別々に反応す
るひとつ以上の蛍光マーカー；（２）希少細胞と選択的
に反応するひとつ以上の蛍光マーカー；および（３）既
知数の蛍光ビーズからなる組成物であって、その際すべ
ての蛍光マーカーは異なる放射スペクトルを有する上記
組成物を用いてサンプル中の細胞を標識し；そして （ｂ）標識された細胞をフローサイトメトリー手段によ
り分析するが、その際、以下の工程：（１）上記（ａ）
の（１）のマーカーで標識された細胞により放射される
蛍光に閾値を設定することによりデータ分析セットにす
べての標識された細胞およびビーズを含め、（２）ひと
つ以上の光散乱および蛍光放射に関する閾値に合致する
かまたは越える細胞セットを分析し、（３）サンプル中
に含まれるさまざまな細胞集団間およびこれら細胞集団
とビーズを識別するために記録されたデータを用い、そ
して（４）ビーズおよび希少細胞の数を計数してその比
率を計算すること からなる。

本発明の好ましい態様において、方法は以下の工程： （ａ）（１）サンプル中のすべての細胞集団と別々に反
応する、第１の蛍光色素（fluorochrome）で標識された
ひとつ以上のモノクローナル抗体、（２）希少細胞と選
択的に反応する、第１の蛍光色素の放射スペクトルとは
区別される蛍光色素で標識されたひとつ以上のモノクロ
ーナル抗体、および（３）既知数の蛍光ビーズからなる
組成物でサンプル中の細胞を標識し；そして、 （ｂ）標識された細胞をフローサイトメトリー手段によ
り分析するが、その際、以下の工程：（１）上記（ａ）
の（１）の蛍光染料で標識された細胞により放射される
蛍光に蛍光閾値を設定することによりデータ分析セット
にすべての標識された細胞およびビーズを含め、（２）
ひとつ以上の光散乱および蛍光放射に関する閾値に合致
するかまたは越える細胞セットを分析し、（３）サンプ
ル中に含まれるさまざまな細胞集団間およびこれら細胞
集団とビーズを識別するために記録されたデータを用
い、そして（４）ビーズおよび希少細胞の数を計数して
その比率を計算すること からなる。

この方法において、組成物は、細胞サンプルを添加す
る前または後に分析チューブに加えてよい。別法として
は、組成物の各々の要素を、別々に、または分類した組
み合わせ（sub−combination）により添加してよい。要
素を一塊の組成物として加えることが好ましい。

本発明の実施に用いられるビーズは一定の特性を有す
る。第１に、小さいことであり（即ち、0.2μｍから20
μｍが好ましい）、それにより混合物中で懸濁されたま
まであり、そのためサンプル中の細胞よりも早く沈殿し
ないべきである。第２に、塊を形成したり凝集すること
を回避する物質で作られるべきである。第３に、蛍光物
質であり、そして／またはサンプル中の細胞から識別さ
れる大きさであるべきである。蛍光は自己蛍光を発する
微小粒子からなる物質を選択することにより達成される
か、または蛍光染料を付加されることにより蛍光を発生
させることができる。

蛍光物質を用いるならば、ひとつの蛍光チャンネルに
おいて、ビーズの蛍光がバックグラウンドのノイズレベ
ルよりも十分に大きいものであることにより識別される
ものでなければならず、また、ひとつまたは複数の他の
蛍光チャンネルにおいて、蛍光マーカーの一部として用
いられるひとつまたは複数の蛍光染料から識別されなけ
ればならない。ひとつまたは複数の染料とビーズの蛍光
の間の１ログの相違（one log difference）は十分で
ある。これらの特性を有するビーズは、固定されたチキ
ン赤血球細胞、クマリンビーズ、蛍光染料を含むリポソ
ーム、フルオレセインビーズ、ローダミンビーズ、固定
された蛍光細胞、蛍光細胞核、蛍光染料を付加された微
生物または他の合成ビーズからなる群から選択されてよ
い。後者のタイプのビーズはモリキュラープローブ社お
よびフローサイトメトリースタンダード社から市販され
ている。

蛍光マーカーは、蛍光染料、例えば核酸染料、および
／または蛍光色素（fluorochrome）標識されたモノクロ
ーナル抗体（または特定の標的分子に高い結合親和性を
有する他の試薬）からなる。

モノクローナル抗体のための蛍光色素は、フルオレセ
インイソチオシアネート（“FITC"）、フィコエリスリ
ン（“PE"）、アロフィコシアニン（“APC"）、ペリジ
ニンクロロフィン複合体蛋白質（“PerCP"、BDIS社）、
CY3およびCY5（バイオロジカルディテクションシステム
ズ社）、テキサスレッド（モリキュラープローブ社）お
よびそれらの縦列結合体例えばPE/CY5からなる群から選
択される。米国特許第4,542,104号および第4,520,110号
を参照されたい。

核酸と反応した場合にストークシフトを示す蛍光染料
は、チアゾールオレンジ（BDIS社）、７−アミノ−アク
チノマイシンＤ（シグマ社）、SY−III−８（モリキュ
ラープローブ社）、LDS−751（モリキュラープローブ
社）、および米国特許第4,544,546号、第4,945,171号お
よび第5,066,580号に記載された染料を含む。

サンプル内の細胞集団とビーズを識別するための手段
は、細胞分析機（例えば、FACScanブランドのフローサ
イトメトリー、BDIS社）と細胞ソーター（例えば、FACS
ortブランドのフローサイトメトリー、BDIS社）の両者
からなる。閾値は、蛍光マーカーの一つから放射される
蛍光に関して、製造者の指示書にしたがって設定され
る。これは、すべての細胞を別々に標識するための、モ
ノクローナル抗体に結合させた核酸染料または蛍光色素
であってよい。（この態様において、複数閾値を「Ａお
よびＢ」または「ＡであるがＢではない」配置として設
定してよい。）ひとつまたは複数の蛍光閾値を越える各
々の事象に関して、ひとつまたは複数の光散乱および蛍
光放射パラメーターを記録する。（米国特許第4,727,02
0号を参照されたい。）２つの光散乱および３つの蛍光
パラメーターを記録して、細胞集団間およびビーズの識
別のために用いることが好ましい。少なくとも希少細胞
集団内の細胞数およびビーズの数を次に測定し、そして
その比は細胞の絶対数を生じる。付加的な細胞集団も
（例えば、白血球またはＴリンパ球）、ひとつまたは複
数のマーカーまたは他のパラメーターにより同定される
限り計数される（例えば、CD45⁺またはCD3⁺）。

この方法を用いてまとめられたデータの分析において
は、サンプルが分析される装置が正確に組み立てられ
て、サンプルが正確に調製される（例えば、すべての試
薬を加えたか否か）ことを確認することが望ましい。

細胞のサンプルはあらゆる組織源、例えば末梢血、臍
帯血、骨髄、胸腺、脾臓またはリンパ節から得ることが
できる。末梢血および骨髄からの細胞源は、特に本発明
の方法に適している。

他の態様において、組成物を修飾して希少細胞に特異
的な蛍光標識抗体に代えて蛍光標識された無関係なアイ
ソトープ対照を用いてよい。サンプルは、アイソトープ
組成物で染色された一方のアリコートおよび標準組成物
を含むアリコートに分けられる。次に、前者のアリコー
トは、第２アリコートの分析前に最初にバックグラウン
ド蛍光レベルを測定するために分析されうる。

この方法は、末梢血、臍帯血、または骨髄からCD34⁺
細胞（およびそのサブセット）の計数に特に有用であ
る。この様式において、この方法は、以下の工程： （ａ）（１）有核細胞と選択的に反応する核酸染料、
（２）成熟リンパ球、好中球、赤血球および単核球と選
択的に反応し且つ始原細胞と弱く反応する、第１の蛍光
色素で標識されたモノクローナル抗体、（３）第２の蛍
光色素で標識されたCD34モノクローナル抗体、および
（４）既知数の蛍光ビーズからなる組成物でサンプルか
らの細胞を標識し；そして、 （ｂ）標識された細胞をフローサイトメトリー手段によ
り分析するが、その際、以下の工程：（１）核酸染料に
より放射される蛍光に関して蛍光閾値を設定することに
よりデータ分析セットにすべての有核細胞およびビーズ
を含め、（２）光散乱および蛍光放射に関する閾値に合
致するかまたは越える、サンプル中の細胞およびビーズ
を分析し、（３）サンプル中に含まれるさまざまな細胞
集団間およびこれら細胞集団とビーズを識別するために
記録されたデータを用い、そして（４）ビーズおよびCD
34⁺細胞の数を計数してその比率を計算すること からなる。

この方法において、チアゾールオレンジおよび／また
はSY−III−８が好ましい核酸染料である。SY−III−８
は特に好ましい。CD45はすべての白血球と別々に反応す
る好ましい抗体である。PE/CY5の縦列複合体は蛍光色素
として好ましく、そしてPEは他の蛍光色素として好まし
い。ナイルレッド（Nile Red）ビーズ（モロキュラー
プローブズ社）が好ましい。

別の態様においては、核酸染料を除去してよく、閾値
は第１蛍光色素により標識された細胞により放射される
蛍光上に設定される。

本発明の方法により計数される他の希少細胞集団は、
抗原特異的ＢまたはＴリンパ球および特異的エフェクタ
ー細胞（例えば、毒性Ｔ細胞）を含む。

図面の説明 図１は、50,000の蛍光ビーズを添加してフローサイト
メトリー手段により分析された、溶解された正常末梢血
の２つのドットプロットであり、Ａはトランスフォーム
された直交光散乱対前方光散乱のプロットであり、そし
てＢは564−606nmにおける蛍光放射のlog対515−545nm
における蛍光放射のlogのプロットである。

図２は、核酸染料SY−III−８も加えて図１のように
処理された、溶解された正常末梢血の２つのドットプロ
ットであり、Ａは光散乱の閾値を用いて回収された事象
に関する、トランスフォームされた直交光散乱対蛍光の
logであり、そしてＢは蛍光の閾値を用いて回収された
事象に関する、トランスフォームされた直交光散乱対蛍
光のlogである。

図３は、蛍光閾値を用いて回収された事象に関して、
CD45 PE/CY5も加えて図２のように処理された、溶解さ
れた異常末梢血の２つのドットプロットであり、ＡはSY
−III−８の蛍光のlog対前方光散乱のプロットであり、
そしてＢはトランスフォームされた直交光散乱対PE/CY5
蛍光のlogである。

図４は、IgG₁ PE対照抗体も用いた場合（A,Cおよび
Ｅ）またはCD34 PE抗体も用いた場合（B,DおよびＦ）
のいずれかの、蛍光閾値を用いて回収された事象に関す
る、図３のように処理された溶解正常末梢血の一連の６
つのドットプロットであり、ＡおよびＢはPE蛍光のlog
対SY−III−８蛍光のlogのプロット、ＣおよびＤはトラ
ンスフォームされた直交光散乱対前方前方光散乱のプロ
ットであり、そしてＥおよびＦはトランスフォームされ
た直交光散乱対PE/CY5蛍光のlogである。

図５は、蛍光閾値を用いて回収された事象に関する、
CD34 PE抗体を図４のように処理した２つの異なる溶解
末梢血サンプル（低いCD34カウントは□、高いCD34カウ
ントは■）の５つの反復分析物中のμｌあたりのCD34⁺
細胞の数を示すヒストグラムであり、Ａは１回処理され
て５回分析された一つのサンプルを表し、Ｂは５つに分
けられたアリコートの各々を別々に処理して分析された
一つのサンプルを表す。

図６は、50,000の蛍光ビーズ、SY−III−８、CD45 P
E/CY5およびIgG₁ PE（Ａ−Ｄ）または50,000の蛍光ビ
ーズ、SY−III−８、CD45 PE/CYおよびCD34 PE（Ｅ−
Ｈ）を加えられた、溶解された白血球成分（leukophere
sis）サンプルの一連の８つのドットプロットであり、
ＡおよびＥはトランスフォームされた直交光散乱対前方
光散乱のプロットであり、ＢおよびＦはトランスフォー
ムされた直交光散乱対PE/CY5蛍光のlogのプロットであ
り、ＣおよびＧはPEのlog対SY−III−８蛍光のlogのプ
ロットであり、そしてＤおよびＨはPEのlog対PE/CY5の
蛍光のlogのプロットである。

詳細な説明 骨髄吸引物、末梢血および白血球成分のサンプルを患
者および正常ドナーから集めた。骨髄サンプルの抗凝血
剤としてはヘパリンを用い、末梢血サンプルの抗凝血剤
としてはEDTA_K3を用いた。各々の試験に関して、50μｌ
の末梢血、骨髄または白血球成分のサンプルを用いた。

サンプルは10μｌの対照または試験試薬、および50,0
00の凍結乾燥された2.49μｍナイルレッド（Nile Re
d）ビーズと共にインキュベートした。対照および試験
試薬の混合物は、試験試薬中においては核酸染料（即
ち、5ngのSY−III−８、モリキュラープロープズ社）、
PE/CY5とCD45の縦列複合体（100ngのクローンHLe−１、
BDIS社）およびCD34のPE縦列複合体（100ngのクローンH
Le−２、BDIS社）を、そして対照試薬中においてはIgG₁
対照抗体（50ng、BDIS社）を含んだ。いくつかの実験に
おいて、チアゾールオレンジとSY−III−８の混合物を
用いた。サンプルは室温において20分間インキュベート
した。インキュベート後、サンプルは0.5mlの赤血球溶
解溶液（FACSLysing溶液、BDIS社）により希釈した。

SY−III−８はRNAよりもDNAによりよく結合する核酸
染料である。チアゾールオレンジは同種類の染料であ
り、RNAよりもDNAによりよく結合し、同じ程度には結合
しない。標識有核細胞へのチアゾールオレンジの使用法
は米国特許第4,883,867号に記載されている。SY−III−
８は488nmにおいて励起可能であり、その放射スペクト
ルはPE/CY5およびPEのスペクトルと識別可能である。

フローサイトメトリー分析はアルゴンレーザー（488n
m）を備えたFACScanブランドのフローサイトメトリー
（BDIS社）により実施された。データの獲得はLYSIS I
Iブランドのデータ獲得ソフトウエア（BDIS社）を用い
て実施した。前方光散乱、直交光散乱および３つの蛍光
シグナルは各々の細胞に関して測定され、リストモード
データファイルに保存された。各末梢血の測定はSY−II
I−８上（即ち、有核細胞上）に設定された閾値を越え
るすべての事象を含む20,000リストモード事象からなっ
た。リストモードデータファイルの分析はPAINT−Ａ−G
ATEブランドのデータ分析ソフトウエア（BDIS社）を用
いて実施した。（米国特許第4,845,653号を参照された
い）直交光散乱のデータは米国特許第5,224,058号に開
示された方法によりトランスフォームされた。

当業界の現在の状況の一面を例示するために、50,000
の蛍光ビーズを上記末梢血サンプルに加えた。事象の閾
値は上記のとおりにして、前方光散乱およびフローサイ
トメーター上の20,000の事象に関して集められたデータ
上に設定された。図１は、光散乱およびビーズの蛍光特
性を示す。ビーズは赤、細胞は緑、そして残渣は灰色で
示された。データを分析したところ、9.8％の事象がビ
ーズであり、28.6％の事象が細胞であったことが示され
た。50,000ビーズが50μｌの血液に加えられたことを考
えれば、細胞の絶対数はμｌあたり2.9×10³であると計
算される。しかしながら、光散乱の閾値における残渣と
細胞の分離はよくなかったため、この数は正確ではない
かもしれず、重要なことは、サンプル間または装置間で
変動しうることである。即ち、単にサンプルに蛍光ビー
ズを加えることは、必ずしも正確な絶対数をもたらさな
い。

細胞と残渣の識別を改良するために、核酸染料をサン
プル調製物に加えてよい。（米国特許第5,057,413号を
参照されたい。）光散乱と核酸含有量の組み合わせの使
用は、図１に示された方法以上のさらなる重要さを付加
する。

図２を参照すると、末梢血は図１のとおりに調製した
が、しかしながら、核酸染料SY−III−８を加えた。図
２のＡは、前方光散乱上に設定された閾値の範囲の前方
光散乱対蛍光のlogのプロットを示す。残渣、細胞およ
びビーズは図１のとおりに発色した。サンプルのデータ
分析から、9.6％の事象がビーズ、34.1％の事象が有核
細胞そして56.3％の事象が無核残渣であったことが示さ
れた。

核酸染料の蛍光上に事象の閾値を設定すると、全く異
なった結果がもたらされる。図２のＢは、測定された事
象の内で、ビーズのパーセンテージが22.8％であり、有
核細胞のパーセンテージが77.0％であったことを示す。
図２のＡにおけるアプローチを用いると、有核細胞の絶
対数はμｌあたり3.55×10³であったと測定されたが、
図２のＢにおいては細胞の絶対数は3.38×10³μｌであ
ると測定された。事象の閾値としての光散乱の使用は、
したがって、５％のエラーを導いた。

希少でないと測定される（即ち、＞５％）それらの細
胞集団に関しては、核酸染料、蛍光ビーズおよび興味の
ある細胞集団のための単一の免疫蛍光マーカーを用いた
現在の免疫蛍光測定方法が適している。（米国特許第5,
047,321号）を参照されたい。）希少細胞集団に関して
は、しかしながら、興味のある抗原に関して陽性または
陰性の細胞を識別するためには、細胞表面抗原の密度の
重要性が増すようになる。この困難に貢献するための一
つの問題は、モノクローナル抗体があるレベルの非特異
的結合を一般的に有することである。これは、骨髄性細
胞がもっとも周知であるFcリセプターを持つ細胞におい
て、特にわずらわしい。

希少細胞を同定する能力を増すために、興味のある細
胞集団以外のすべての白血球とは個別に反応するが希少
細胞集団とは反応しない。蛍光標識モノクローナル抗体
を用いる。この例においてはCD45が蛍光標識されたが、
それは、CD45が、すべての白血球と個別に反応するが原
子細胞上ではほんのかすかに発現するからである。

図３は、図２において用いられた組成物を加えた、化
学療法を受けている患者からの末梢血サンプルを例示す
る。CD45 PE/CY5も組成物に加えた。ビーズは赤に、単
球は青に、白血球は緑に、好中球および好酸球は黄色
に、そして有核赤血球細胞は紫に発色した。灰色に発色
した細胞集団は、CD34⁺細胞、血漿細胞および好塩基細
胞等の始原細胞を含む。SY−III−８の閾値を広げた事
象に関するデータ分析は、トランスフォームされた前方
光散乱対PE/CY5蛍光のlogのプロットにおいて、各々の
細胞集団が始原細胞を含めて規定された領域に落ちるこ
とを示す。この実施例において、単球は事象の12.5％μ
ｌあたり0.77×10³）、白血球は事象にの15.8％（μｌ
あたり0.98×10³）、好中球および好酸球は事象の50.2
％（μｌあたり3.1×10³）、有核赤血球細胞は事象の3.
5％（μｌあたり0.22×10³）、そして始原細胞は事象の
1.75％（μｌあたり0.11×10³）であった。

有核細胞およびCD45のみの使用は始原細胞から白血球
を識別するのに十分らしいが、正確にCD34⁺細胞を数え
るためには、CD34に特異的な、蛍光標識モノクローナル
抵抗を加えることが必要である。カートシビン（Curt
Civin）により発見された抗体であるMY−10は、ヒト白
血球抗原の国際ワークショップにより「CD34」として示
される群に分類された。CD34モノクローナル抗体はBDIS
社を含む多くの供給源から市販されている。

図４を参照すると、末梢血サンプルを２つのアリコー
トに分類して図３のとおりに処理したが、しかし、一つ
のアリコートにはPE標識IgG₁アイソトープ対照を組成物
に加え、そして他方のアリコートにはPE標識CD34抗体を
加えた。図４のＡ、ＣおよびＥは対照アリコートを示
し、そしてＢ、ＤおよびＦはCD34 PEを用いたアリコー
トを示す。細胞およびビーズは図３のとおりに発色する
が、CD34⁺細胞は黒に発色した。図４のＥにおいて、矢
印は図４のＦにおいて確認されたCD34⁺の期待された位
置を指す。図４のＦからのCD34⁺は、図４のＥの矢印に
より示されたスペースにおいて同定されたほんの約30％
の始原細胞からなる。

この実施例においては、３つの蛍光標識間の補償（co
mpensation）は用いられなかった。補償は、フローサイ
トメーター内の３つの蛍光チャンネル各々からの各々の
標識の蛍光シグナルの差し引きに通じるはずである。こ
のことは、各々のチャンネルにおける事象の密度を低下
させる。結果として、希少事象を含む興味ある領域を限
定することがより難しくなる。

記載された方法を用いたCD34の絶対数の計数の実施を
試験するために、一方が相対的に高い量で、他方が相対
的に低い量のCD34⁺を含む２つの白血球サンプルを得
た。図５のＡを参照すると、各々のサンプルは図４のと
おりに処置され、次に図４のとおりに５回連続して分析
した。図５のＢを参照すると、両方の白血球サンプルか
らの血液をさらに５つのアリコートに分けて、そして各
々を図４のとおりに処理して分析した。

図５のＡを参照すると、「低い量」のCD34⁺を含むサ
ンプルからのCD34⁺の平均絶対数はμｌあたり37.2（CV1
0.4％）であり、そして「高い量」のCD34⁺を含むサンプ
ルからのCD34⁺の平均絶対数はμｌあたり399.1（CV8.2
％）であった。「低い量」のCD34⁺を含むサンプルから
のCD34⁺の平均パーセンテージは0.2％（CV4.4％）であ
り、そして「高い量」のCD34⁺を含むサンプルからのCD3
4⁺の平均パーセンテージ1.2％（CV6.0％）であった。
「低い量」のCD34⁺を含むサンプルからの有核細胞の平
均絶対数はμｌあたり24.6×10³（CV4.7％）であり、そ
して「高い量」のCD34⁺を含むサンプルからの有核細胞
の平均絶対数はμｌあたり34.1×10³（CV3.8％）であっ
た。

図５のＢを参照すると、「低い量」のCD34⁺を含むサ
ンプルからのCD34⁺の平均絶対数はμｌあたり39.7（CV
9.7％）であり、そして「高い量」のCD34⁺を含むサンプ
ルからのCD34⁺の平均絶対数はμｌあたり322.2（CV9.0
％）であった。「低い量」のCD34⁺を含むサンプルから
のCD34⁺の平均パーセンテージは0.2％（CV13.3％）であ
り、そして「高い量」のCD34⁺を含むサンプルからのCD3
4⁺の平均パーセンテージは1.1％（CV9.3％）であった。
「低い量」のCD34⁺を含むサンプルからの有核細胞の平
均絶対数はμｌあたり26.7×10³（CV3.8％）であり、そ
して「高い量」のCD34⁺を含むサンプルからの有核細胞
の平均絶対数はμｌあたり29.8×10³（CV5.5％）であっ
た。

サンプルをアリコートに分けてアイソトープ対照を組
成物で交換した場合のこの方法の有用性を照明するため
に、ビーズの懸濁液を用いてビーズを特定の位置に設置
しそれに従い検出機を調整することにより、装置の蛍光
および光散乱検出機を設定した。図４において用いられ
た組成物（IgG対照およびCD34抗体）は次に、溶解され
た末梢血サンプルに加えられた。対照サンプルからの情
報を用いて、CD34⁺およびビーズの蛍光の位置を決定し
た。（図６のＡ−Ｄを参照されたい。）次に、CD34含有
サンプルを分析して40,000の事象を得た。図６のＦ−Ｉ
における細胞はCD34⁺細胞に関するすべての基準を満た
す。

本発明の方法がモノクローナル抗体を利用することは
認識されるであろう。細胞上に存在する抗原と特異的に
反応する他のマーカーも用いてよい。例えば、モノクロ
ーナル抗体に由来する一本鎖結合蛋白質であるFabおよ
び国際公開番号91/19813に記載されているような核酸結
合蛋白質もこの方法に用いてよい。モノクローナル抗体
を用いることは必須ではない。マーカーが所望の抗原ま
たは分子に選択的であることが必須である。

本明細書にて言及されたすべての出版物および特許出
願は、本発明の属する技術分野の通常のレベルを示唆す
る。すべての出版物および特許出願は、各々の出版物お
よび特許出願が特定的または個別に引用により取り込ま
れることのように、引用により本明細書の一部をなす。

当業者には、請求の範囲の精神または範囲から離れる
ことがなければ、あらゆる変更および修飾が本発明にな
されてよいことは明らかである。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−161153（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−73157（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の工程： （ａ）（１）有核細胞と選択的に反応する核酸染料、
   （２）成熟リンパ球、好中球、赤血球および単核球と選
   択的に反応し且つ始原細胞と弱く反応する、第１の蛍光
   色素で標識されたモノクローナル抗体、（３）第２の蛍
   光色素で標識されたCD34モノクローナル抗体、および
   （４）既知数の蛍光ビーズからなる組成物で、サンプル
   中の細胞を標識し；そして、 （ｂ）標識された細胞をフローサイトメトリー手段によ
   り分析するが、その際、以下の工程：（１）核酸染料に
   より放射される蛍光に関して蛍光閾値を設定することに
   よりすべての有核細胞およびビーズを含め、（２）光散
   乱および蛍光放射に関する閾値に合致するかまたは越え
   る、サンプル中の細胞およびビーズを分析し、（３）サ
   ンプル中に含まれるさまざまな白血球細胞集団間および
   それらの細胞集団とビーズを識別するために記録された
   蛍光放射および散乱に関するデータを用い、そして
   （４）ビーズおよびCD34⁺細胞の数を計数してその比率
   を計算すること、 からなる、サンプル中の始原細胞の絶対数を計数するた
   めの方法。
2. 【請求項２】モノクローナル抗体がCD45である、請求項
   １記載の方法。
3. 【請求項３】CD34モノクローナル抗体がPEで標識されて
   いる、請求項１記載の方法。