JPH0726954B2 - 流体内細胞成分の分析法 - Google Patents
流体内細胞成分の分析法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は体液中の細胞成分の多角的パラメーター分析に
関し、より詳細には、フローサイトメトリーを用いた５
種類のパラメーター分析による血液または骨髄吸引物中
の細胞成分の識別および定量に関する。
関し、より詳細には、フローサイトメトリーを用いた５
種類のパラメーター分析による血液または骨髄吸引物中
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（従来の技術） 固体の血液状態を知る上でも最も重要な二種類の測定は
全血細胞数の計測および白血球の分画である。全血細胞
数の計測および白血球の分画には血液中のさまざまな細
胞成分を識別し、さらにその数を計測することが含まれ
る。任意の１個のサンプルに見い出されるさまざまな血
液成分には赤血球（RBC），血小板および有核細胞が含
まれる。有核細胞の範疇において、白血球には多数の異
なる型が存在し、その中にはリンパ球「Ｂ細胞,T細胞，
ナチュラルキラー（NK）細胞およびそれらのさまざまな
サブセット］，単球，ならびに顆粒球（すべての成熟段
階における好中球，好酸球および好塩基球を含む）が含
まれる。細胞の型が多種類存在し、かつ任意の１種類の
細胞型にも多岐にわたる成熟段階が存在する故、全血細
胞数の計測および白血球の分画を行なうためには正常固
体においてさえも時には困難かつ複雑な手順が必要とさ
れ、異常固体においてはより困難かつ複雑な手順が必要
とされる。このような複雑さは、骨髄サンプルの分析を
試みる場合により強調される。
全血細胞数の計測および白血球の分画である。全血細胞
数の計測および白血球の分画には血液中のさまざまな細
胞成分を識別し、さらにその数を計測することが含まれ
る。任意の１個のサンプルに見い出されるさまざまな血
液成分には赤血球（RBC），血小板および有核細胞が含
まれる。有核細胞の範疇において、白血球には多数の異
なる型が存在し、その中にはリンパ球「Ｂ細胞,T細胞，
ナチュラルキラー（NK）細胞およびそれらのさまざまな
サブセット］，単球，ならびに顆粒球（すべての成熟段
階における好中球，好酸球および好塩基球を含む）が含
まれる。細胞の型が多種類存在し、かつ任意の１種類の
細胞型にも多岐にわたる成熟段階が存在する故、全血細
胞数の計測および白血球の分画を行なうためには正常固
体においてさえも時には困難かつ複雑な手順が必要とさ
れ、異常固体においてはより困難かつ複雑な手順が必要
とされる。このような複雑さは、骨髄サンプルの分析を
試みる場合により強調される。
伝統的には、全血細胞総数の計測（即ち、標準単位容量
当りの細胞数）および白血球の分画（即ち、標準単位容
量当りの所定の型の細胞数）は光学顕微鏡を用いて少容
量の細胞数を計測すること、さらにそうした後計測した
数に単位容量にするための係数を掛けることによって手
作業で行なわれてきた。測定したサンプル容量および細
胞の型の識別に必要とされる技術水準の両方が原因とな
って、このような方法では、得られる計測値は非常に変
化しやすく時としては容認しがたい水準に達するであろ
う。
当りの細胞数）および白血球の分画（即ち、標準単位容
量当りの所定の型の細胞数）は光学顕微鏡を用いて少容
量の細胞数を計測すること、さらにそうした後計測した
数に単位容量にするための係数を掛けることによって手
作業で行なわれてきた。測定したサンプル容量および細
胞の型の識別に必要とされる技術水準の両方が原因とな
って、このような方法では、得られる計測値は非常に変
化しやすく時としては容認しがたい水準に達するであろ
う。
最近になって、手動で顕微鏡試験を行なうことなく全血
細胞数の計測および白血球の分画を行なう手段が考案さ
れた。現在利用可能な装置は、開口インピーダンスによ
る電気的手段［例えばコールターカウンター（商標）
（Coulter CounterTm），コールター（Coulter），プロ
ク・ナット・エレクトロニクス・コンフ（Nroc.Nat.Ele
ctronics Conf）,.12,1034（1956）に記載］または光散
乱および光吸収による光学的手段［例えば、テクニコン
（Technico）,H−600Tm］（商標），ブリーケル（Break
ell）ら，ブロード セル（Blood Cells），11,257（19
85）に記載］のどちらかによって細胞を検出する。この
ような装置では、赤血球細胞画分を白血球から分離する
必要があり、また各々の測定は他のものとは独立して行
なわれる。これは、一般的には赤血球が白血球より数が
多い（正常固体で少なくとも1000:1）ので行なわなけれ
ばならない。正常でない患者（例えば、白血球減少症の
患者）では、この比率は実質上高くなるだろう。
細胞数の計測および白血球の分画を行なう手段が考案さ
れた。現在利用可能な装置は、開口インピーダンスによ
る電気的手段［例えばコールターカウンター（商標）
（Coulter CounterTm），コールター（Coulter），プロ
ク・ナット・エレクトロニクス・コンフ（Nroc.Nat.Ele
ctronics Conf）,.12,1034（1956）に記載］または光散
乱および光吸収による光学的手段［例えば、テクニコン
（Technico）,H−600Tm］（商標），ブリーケル（Break
ell）ら，ブロード セル（Blood Cells），11,257（19
85）に記載］のどちらかによって細胞を検出する。この
ような装置では、赤血球細胞画分を白血球から分離する
必要があり、また各々の測定は他のものとは独立して行
なわれる。これは、一般的には赤血球が白血球より数が
多い（正常固体で少なくとも1000:1）ので行なわなけれ
ばならない。正常でない患者（例えば、白血球減少症の
患者）では、この比率は実質上高くなるだろう。
また、白血球を分画するための手段は他にも存在する。
フローサイトメーターは、一般的には米国特許第4,661,
913号，第4,284,412号および第3,826,364号明細書なら
びにヘルゼンベルグ（Herzenberg）ら，サイエンティフ
ィックアメリカ（Sci.Am.）234,108（1976）の論文に記
載されており、これは検出領域を通過する個々の細胞の
複数の独立パラメーターを検出することによって異成分
からなるサンプル内に存在する異なる白血球集団を同定
するために使用されている。代表的には、これらのパラ
メーターには前方散乱光（FLS,これは相対的な粒子の大
きさの測定である），直角方向散乱光（OLS,これは相対
的な顆粒度（granluarity）の測定である）、および蛍
光が含まれる。蛍光は核酸染色を行なった細胞より測定
されるであろう。または、例えば米国特許第4,520,110
号明細書に記載されているように、蛍光色素に直接また
は間接的に結合したモノクローナル抗体（MAb）で標識
された表面抗原をもつ細胞から測定されるであろう。フ
ローサイトメーター内の別々のチャンネルによっていろ
いろな細胞の各々の測定値が感知され記録される。これ
らのパラメーターを組み合わせたり比較したりすること
によって、いろいろな白血球成分が識別されるであろ
う。米国特許第4,727,020号は、フローサイトメーター
を血液から白血球の各分画を得るための手段として用い
る方法についての一例を提供している。しかしながら、
この方法は白血球の分画、しかも血液から得られたサン
プルのそれのみに限られている。
フローサイトメーターは、一般的には米国特許第4,661,
913号，第4,284,412号および第3,826,364号明細書なら
びにヘルゼンベルグ（Herzenberg）ら，サイエンティフ
ィックアメリカ（Sci.Am.）234,108（1976）の論文に記
載されており、これは検出領域を通過する個々の細胞の
複数の独立パラメーターを検出することによって異成分
からなるサンプル内に存在する異なる白血球集団を同定
するために使用されている。代表的には、これらのパラ
メーターには前方散乱光（FLS,これは相対的な粒子の大
きさの測定である），直角方向散乱光（OLS,これは相対
的な顆粒度（granluarity）の測定である）、および蛍
光が含まれる。蛍光は核酸染色を行なった細胞より測定
されるであろう。または、例えば米国特許第4,520,110
号明細書に記載されているように、蛍光色素に直接また
は間接的に結合したモノクローナル抗体（MAb）で標識
された表面抗原をもつ細胞から測定されるであろう。フ
ローサイトメーター内の別々のチャンネルによっていろ
いろな細胞の各々の測定値が感知され記録される。これ
らのパラメーターを組み合わせたり比較したりすること
によって、いろいろな白血球成分が識別されるであろ
う。米国特許第4,727,020号は、フローサイトメーター
を血液から白血球の各分画を得るための手段として用い
る方法についての一例を提供している。しかしながら、
この方法は白血球の分画、しかも血液から得られたサン
プルのそれのみに限られている。
今までに得られた方法をすべてまとめて考えたとして
も、単一の血液または骨髄のサンプルを分析して血液お
よび骨髄に存在するいろいろな細胞型をすべて識別し、
さらに計数するような単一で標準的かつ正確な装置また
は方法論は現在のところ得られていない。
も、単一の血液または骨髄のサンプルを分析して血液お
よび骨髄に存在するいろいろな細胞型をすべて識別し、
さらに計数するような単一で標準的かつ正確な装置また
は方法論は現在のところ得られていない。
（発明の構成） 本発明は体液中の細胞の多数のパラメータを同時に分析
する方法であり；上記体液は骨髄，腹膜あるいは脳内の
流体，尿，または全血のいづれかよりなり、さらには生
体組織検査といったようなものから得られる骨髄吸引
液，リンパ節，脾臓または肝臓の細胞からなる組織の細
胞懸濁液からなる可能性もあり；かつ上記パラメーター
は検査した各細胞の光散乱能の少なくとも二種類を測定
すること、および検査した各細胞から検出される蛍光発
光（エミッション）または活性の少なくとも三種類を測
定することからなる。本方法は個体から流体サンプルを
採取する段階、ならびに流体サンプルを少なくとも二種
類の色素および少なくとも一種細胞表面マーカーと混合
させる段階からなり、上記色素はそれぞれ別々にサンプ
ル内の細胞の異った特徴を評価し、かつ上記マーカーは
異なる系統の細胞に別様に発現する抗原を認識し、標識
した溶液を形成する。それぞれの色素および標識は蛍光
を発し、かつ互いに識別可能な放出スペクトルのピーク
を持つ。さらに標識した溶液は検出器を通過させ、その
中で溶液中の各細胞は一度に実質上１個づつ試験され、
蛍光強度および散乱光の測定が試験しようとするそれぞ
れの細胞について行なわれた。それぞれの細胞について
調べられた測定値（またはパラメーター）は、データ貯
蔵・分析システム保存され、即時にまたは後程、再結合
され分瀬されるであろう。これら数種類のパラメーター
を分析することによって、血液および骨髄のサンプルを
構成する細胞の型および系統が識別され同定されるであ
ろう。
する方法であり；上記体液は骨髄，腹膜あるいは脳内の
流体，尿，または全血のいづれかよりなり、さらには生
体組織検査といったようなものから得られる骨髄吸引
液，リンパ節，脾臓または肝臓の細胞からなる組織の細
胞懸濁液からなる可能性もあり；かつ上記パラメーター
は検査した各細胞の光散乱能の少なくとも二種類を測定
すること、および検査した各細胞から検出される蛍光発
光（エミッション）または活性の少なくとも三種類を測
定することからなる。本方法は個体から流体サンプルを
採取する段階、ならびに流体サンプルを少なくとも二種
類の色素および少なくとも一種細胞表面マーカーと混合
させる段階からなり、上記色素はそれぞれ別々にサンプ
ル内の細胞の異った特徴を評価し、かつ上記マーカーは
異なる系統の細胞に別様に発現する抗原を認識し、標識
した溶液を形成する。それぞれの色素および標識は蛍光
を発し、かつ互いに識別可能な放出スペクトルのピーク
を持つ。さらに標識した溶液は検出器を通過させ、その
中で溶液中の各細胞は一度に実質上１個づつ試験され、
蛍光強度および散乱光の測定が試験しようとするそれぞ
れの細胞について行なわれた。それぞれの細胞について
調べられた測定値（またはパラメーター）は、データ貯
蔵・分析システム保存され、即時にまたは後程、再結合
され分瀬されるであろう。これら数種類のパラメーター
を分析することによって、血液および骨髄のサンプルを
構成する細胞の型および系統が識別され同定されるであ
ろう。
より詳細には、本方法は、個体から体液サンプルを採取
する段階；流体サンプルをRNA染料,DNA染料のような核
酸染色用染料、および異なる系統の細胞に別様に発現す
る細胞表面抗原を認識する標識したモノクローナル抗体
（MAb）と混合し標識溶液を形成させる段階；標識溶液
がフローサイトメーターを通過する段階；蛍光強度,OLS
およびFLSを測定する段階；ならびに分析のために記録
されたデータを貯蔵する段階からなる。各々の核酸染料
および免疫標識は蛍光であり、これらは同一波長で励起
され、かつ互いに識別可能な放出（エミッション）スペ
クトルのピークを持つ。
する段階；流体サンプルをRNA染料,DNA染料のような核
酸染色用染料、および異なる系統の細胞に別様に発現す
る細胞表面抗原を認識する標識したモノクローナル抗体
（MAb）と混合し標識溶液を形成させる段階；標識溶液
がフローサイトメーターを通過する段階；蛍光強度,OLS
およびFLSを測定する段階；ならびに分析のために記録
されたデータを貯蔵する段階からなる。各々の核酸染料
および免疫標識は蛍光であり、これらは同一波長で励起
され、かつ互いに識別可能な放出（エミッション）スペ
クトルのピークを持つ。
本発明に有用な核酸染料および標識した細胞表面マーカ
ーのキットもまた、本発明の範囲に含まれる。
ーのキットもまた、本発明の範囲に含まれる。
本発明は体液内細胞を同時に多数のパラメーターについ
て分析する方法であって；前記体液は脊髄，腹膜あるい
は脳内の流体，尿，または全血のいずれかによりなり、
さらには生体組織検査といったようなものから得られる
骨髄吸引液，肝臓，脾臓あるいはリンパ節から調製した
組織の細胞懸濁液をも含む可能性があり；前記パラメー
ターは試験する各々の細胞からの散乱光を一以上の方向
において少なくとも二種類測定することおよび試験する
各々の細胞の蛍光活性を少なくとも三種類測定すること
からなる。本方法は、個体から体液サンプルを採取する
段階、ならびに体液サンプルを少なくとも二種類の染料
および少なくとも一種類の標識した細胞表面マーカーと
混合させる段階からなり、前記染料のそれぞれはサンプ
ル内に存在する細胞の異なる特徴を別々に評価し、かつ
前記マーカーは異なる系統の細胞に別様に発現する抗原
を認識して標識溶液を形成する。各々の染料および標識
は蛍光を発し、かつ互いに識別可能な放出スペクトルの
ピークを持つ。さらに標識した溶液は検出器を通過さ
せ、その内で溶液中の各々の細胞は一度に実質的に１個
づつ試験され、蛍光強度および散乱光の測定が試験しよ
うとする個々の細胞について行なわれる。個々の細胞に
ついて調べられた測定値（またはパラメーター）はデー
タ保存手段に保存され、即時にまたは後程再結合され再
分析されるであろう。
て分析する方法であって；前記体液は脊髄，腹膜あるい
は脳内の流体，尿，または全血のいずれかによりなり、
さらには生体組織検査といったようなものから得られる
骨髄吸引液，肝臓，脾臓あるいはリンパ節から調製した
組織の細胞懸濁液をも含む可能性があり；前記パラメー
ターは試験する各々の細胞からの散乱光を一以上の方向
において少なくとも二種類測定することおよび試験する
各々の細胞の蛍光活性を少なくとも三種類測定すること
からなる。本方法は、個体から体液サンプルを採取する
段階、ならびに体液サンプルを少なくとも二種類の染料
および少なくとも一種類の標識した細胞表面マーカーと
混合させる段階からなり、前記染料のそれぞれはサンプ
ル内に存在する細胞の異なる特徴を別々に評価し、かつ
前記マーカーは異なる系統の細胞に別様に発現する抗原
を認識して標識溶液を形成する。各々の染料および標識
は蛍光を発し、かつ互いに識別可能な放出スペクトルの
ピークを持つ。さらに標識した溶液は検出器を通過さ
せ、その内で溶液中の各々の細胞は一度に実質的に１個
づつ試験され、蛍光強度および散乱光の測定が試験しよ
うとする個々の細胞について行なわれる。個々の細胞に
ついて調べられた測定値（またはパラメーター）はデー
タ保存手段に保存され、即時にまたは後程再結合され再
分析されるであろう。
本発明は体液サンプル内の細胞を少なくとも五種類のパ
ラメーターで分析することによって識別し同定すること
を可能にするであろう。望ましくは、本発明の方法は、
１）個体から得られた体液サンプルに含まれる細胞を分
離する段階であり、選択的には、体液が全血または骨髄
吸引液のいづれかよりなる上記の分離段階;2）二種類の
核酸蛍光染料を前記サンプルに添加してそれぞれの細胞
内のDNAおよびRNAを差別的に標識する段階であり、それ
ぞれお染料が互いに異なる蛍光放出スペクトルのピーク
持つ上記の蛍光核酸染料添加段階;3）蛍光標識した細胞
表面マーカーを前記サンプルに加える段階であり、前記
マーカーが前記体液中の前記細胞に別様に発現する抗原
を認識し、かつ前記蛍光免疫標識が前記蛍光染料とは異
なる放出スペクトルのピークを持つ前記の段階;4）前記
サンプル内に存在する前記細胞を、放出スペクトルのピ
ークまたはその付近での個々の細胞の蛍光ならびに個々
の細胞のOLSおよびFLSの両方を検出しかつ記録する能力
を持つ自動装置で分析する段階；からなる。
ラメーターで分析することによって識別し同定すること
を可能にするであろう。望ましくは、本発明の方法は、
１）個体から得られた体液サンプルに含まれる細胞を分
離する段階であり、選択的には、体液が全血または骨髄
吸引液のいづれかよりなる上記の分離段階;2）二種類の
核酸蛍光染料を前記サンプルに添加してそれぞれの細胞
内のDNAおよびRNAを差別的に標識する段階であり、それ
ぞれお染料が互いに異なる蛍光放出スペクトルのピーク
持つ上記の蛍光核酸染料添加段階;3）蛍光標識した細胞
表面マーカーを前記サンプルに加える段階であり、前記
マーカーが前記体液中の前記細胞に別様に発現する抗原
を認識し、かつ前記蛍光免疫標識が前記蛍光染料とは異
なる放出スペクトルのピークを持つ前記の段階;4）前記
サンプル内に存在する前記細胞を、放出スペクトルのピ
ークまたはその付近での個々の細胞の蛍光ならびに個々
の細胞のOLSおよびFLSの両方を検出しかつ記録する能力
を持つ自動装置で分析する段階；からなる。
好適な実施態様においては、検出器はFACScanTm（商標B
DIS）のようなフローサイトメーターを含む。好適に
は、フローサイトメーターは前記蛍光標識細胞を励起す
るためにアルゴンイオンレーザーのような単一のレーザ
ーを備えており、その波長は488nmまたはその付近であ
る。それ故、蛍光核酸染料および蛍光標識は488nmで励
起され得なければならない。好適には、LDS−751［エキ
シトン（Exciton）］がDNA染料として使用され、チアゾ
ールオレンジ（Thiazole−Orange）（BDIS）がRNA染料
として使用される。
DIS）のようなフローサイトメーターを含む。好適に
は、フローサイトメーターは前記蛍光標識細胞を励起す
るためにアルゴンイオンレーザーのような単一のレーザ
ーを備えており、その波長は488nmまたはその付近であ
る。それ故、蛍光核酸染料および蛍光標識は488nmで励
起され得なければならない。好適には、LDS−751［エキ
シトン（Exciton）］がDNA染料として使用され、チアゾ
ールオレンジ（Thiazole−Orange）（BDIS）がRNA染料
として使用される。
LDS−751は670nmに放出スペクトルピークを持ち、チア
ゾールオレンジは530nmに放出スペクトルのピークをも
つ。本発明の実施にあたって適切な他の蛍光核酸色素に
は、米国特許第4,544,546号明細書に記載の色素が含ま
れる。
ゾールオレンジは530nmに放出スペクトルのピークをも
つ。本発明の実施にあたって適切な他の蛍光核酸色素に
は、米国特許第4,544,546号明細書に記載の色素が含ま
れる。
当業者は、フローサイトメーターが一種類以上のレーザ
ーを備えている場合には蛍光染料および／または蛍光標
識が異なる波長で励起されることを理解するであろう。
そのような実施態様において必要とされるのは、唯一、
染料および免疫蛍光標識のすべての放出スペクトルのピ
ークが異なることのみである。ヘリウム／ネオンおよび
アルゴンイオンレーザー（波長はそれぞれ633nmおよび4
88nmである）を備えたフローサイトメーターにはFASSta
r PlusTm（商標）（BDIS）が含まれる。
ーを備えている場合には蛍光染料および／または蛍光標
識が異なる波長で励起されることを理解するであろう。
そのような実施態様において必要とされるのは、唯一、
染料および免疫蛍光標識のすべての放出スペクトルのピ
ークが異なることのみである。ヘリウム／ネオンおよび
アルゴンイオンレーザー（波長はそれぞれ633nmおよび4
88nmである）を備えたフローサイトメーターにはFASSta
r PlusTm（商標）（BDIS）が含まれる。
また、好適な実施態様において、細胞表面マーカーは造
血細胞の表面に別様に発現する細胞表面抗原に選択的に
付着するモノクローナル抗体である。抗原は有角細胞の
いろいろな型および成熟段階で発現量が異なることが望
ましい。そのような抗原の一つにCD45がある。CD4抗原
はおよそ180〜220KDの分子量を持ち、すべてのリンパ
球，単球および顆粒球に異なるレベルで発現するが、成
熟した血小板またはRBCには存在しない。CD抗原と特異
的に反応するモノクローナル抗体（即ちCD45 MAb）に
はHLe−１（または抗白血球とも呼ばれる、BDIS）およ
びLCA（Dako Corp）が含まれる。好適にはHLe−１が用
いられる。
血細胞の表面に別様に発現する細胞表面抗原に選択的に
付着するモノクローナル抗体である。抗原は有角細胞の
いろいろな型および成熟段階で発現量が異なることが望
ましい。そのような抗原の一つにCD45がある。CD4抗原
はおよそ180〜220KDの分子量を持ち、すべてのリンパ
球，単球および顆粒球に異なるレベルで発現するが、成
熟した血小板またはRBCには存在しない。CD抗原と特異
的に反応するモノクローナル抗体（即ちCD45 MAb）に
はHLe−１（または抗白血球とも呼ばれる、BDIS）およ
びLCA（Dako Corp）が含まれる。好適にはHLe−１が用
いられる。
CD45 MAbには蛍光色素のような蛍光標識を直接付加す
る。直接的な方法では、MAbは当業者に既知の手段によ
って蛍光標識に直接結合させる。米国特許第4,520,110
号明細書には蛍光標識をMAbに結合させるための一つの
方法を提供している。
る。直接的な方法では、MAbは当業者に既知の手段によ
って蛍光標識に直接結合させる。米国特許第4,520,110
号明細書には蛍光標識をMAbに結合させるための一つの
方法を提供している。
好適な実施態様において、蛍光色素はフィコエリトン
（PE）のようなフィコビリ蛋白質であり、この色素は48
8nmで励起され、575nmに放出ピークをもつ。HLe−１お
よびPEの複合物は一般的にHLe−１（PE）と呼ばれる。
（PE）のようなフィコビリ蛋白質であり、この色素は48
8nmで励起され、575nmに放出ピークをもつ。HLe−１お
よびPEの複合物は一般的にHLe−１（PE）と呼ばれる。
これ以外の蛍光色素もまたは本発明において使用される
であろう。蛍光色素としての必要条件は、アルゴンレー
ザーが使用される場合には488nm、または二種類のレー
ザー源を用いる場合には488nm以外のある波長（例え
ば、He/Neレーザーでは633nm）で蛍光色素が励起される
こと、および蛍光色素が核酸染料と重複しない放出スペ
クトルピークをもつことのみである。
であろう。蛍光色素としての必要条件は、アルゴンレー
ザーが使用される場合には488nm、または二種類のレー
ザー源を用いる場合には488nm以外のある波長（例え
ば、He/Neレーザーでは633nm）で蛍光色素が励起される
こと、および蛍光色素が核酸染料と重複しない放出スペ
クトルピークをもつことのみである。
さらに、フローサイトメーターは個々の細胞毎から収集
したデータを記録分析する手段と連結させることが望ま
しい。データを記録分析する手段には適切なソフトウェ
アを備えたパーソナルコンピューターが含まれるであろ
う。ソフトウェアは各細胞それぞれについて少なくとも
五種類のパラメーターを分析する能力、五次元空間で類
似した細胞集団を識別または同定する能力、および二次
元に少なくとも二種類のパラメーターを表示する能力を
またねばならない。さらに、ソフトウェアは一種類以上
のパラメーターのゲートを設定し、かつ他のパラメータ
ーと組み合わせて二次元に表示する能力をもたねばなら
ない。
したデータを記録分析する手段と連結させることが望ま
しい。データを記録分析する手段には適切なソフトウェ
アを備えたパーソナルコンピューターが含まれるであろ
う。ソフトウェアは各細胞それぞれについて少なくとも
五種類のパラメーターを分析する能力、五次元空間で類
似した細胞集団を識別または同定する能力、および二次
元に少なくとも二種類のパラメーターを表示する能力を
またねばならない。さらに、ソフトウェアは一種類以上
のパラメーターのゲートを設定し、かつ他のパラメータ
ーと組み合わせて二次元に表示する能力をもたねばなら
ない。
好適な実施態様においては、Paint−Ａ−GateTm（商
標）ソフトウェア（BDIS）をコンソルト（Consort）30
データ保存分析システム（BDIS）に連結させて用いる。
ソフトウェアは米国特許第046,619号明細書（1987年５
月７日出願）にそのすべてが記載されており、本願と同
様に、本発明の譲渡人に譲渡されている。
標）ソフトウェア（BDIS）をコンソルト（Consort）30
データ保存分析システム（BDIS）に連結させて用いる。
ソフトウェアは米国特許第046,619号明細書（1987年５
月７日出願）にそのすべてが記載されており、本願と同
様に、本発明の譲渡人に譲渡されている。
本明細書に記載した方法に加えて、本発明はまた体液内
細胞の複数のパラメーター分析のためのキットをも含
む。このキットは各々の細胞のDNAおよびRNAを標識する
ための核酸染料であって、他のものから識別可能な放出
スペクトルピークをもつ染料を少なくとも二種類収納す
る第一容器、および蛍光標識した細胞表面マーカーであ
って、サンプルに含まれる異種細胞において別様に発現
する細胞表面抗原と特異的に反応する細胞表面マーカー
を蛍光標識した上記物質を収納する第二容器からなる。
染料はDNAおよびRNAを差別的に標識する核酸染料が望ま
しい。好適な実施態様において、核酸染料はLDS−751お
よびチアゾールオレンジであり、かつ蛍光標識した細胞
表面マーカーはHLe−１（PE）である。当業者は、本明
細書に開示した核酸染料および／または細胞表面マーカ
ーの組み合わせ以外の組み合わせもキットに含みうるこ
とを理解するであろう。同様に、核酸染料および／また
は細胞表面マーカーを容器内に分けて入れることも理解
されるであろう。
細胞の複数のパラメーター分析のためのキットをも含
む。このキットは各々の細胞のDNAおよびRNAを標識する
ための核酸染料であって、他のものから識別可能な放出
スペクトルピークをもつ染料を少なくとも二種類収納す
る第一容器、および蛍光標識した細胞表面マーカーであ
って、サンプルに含まれる異種細胞において別様に発現
する細胞表面抗原と特異的に反応する細胞表面マーカー
を蛍光標識した上記物質を収納する第二容器からなる。
染料はDNAおよびRNAを差別的に標識する核酸染料が望ま
しい。好適な実施態様において、核酸染料はLDS−751お
よびチアゾールオレンジであり、かつ蛍光標識した細胞
表面マーカーはHLe−１（PE）である。当業者は、本明
細書に開示した核酸染料および／または細胞表面マーカ
ーの組み合わせ以外の組み合わせもキットに含みうるこ
とを理解するであろう。同様に、核酸染料および／また
は細胞表面マーカーを容器内に分けて入れることも理解
されるであろう。
以下に図面について簡単に説明する。
６種類の図面はすべて対数目盛りであり、核酸染料であ
るLDS−751およびチアゾールオレンジならびにHLe−１
（PE）のようなCD45MAbで標識した体液サンプルより得
られたおよそ22,000個の細胞を含むドットプロットを示
している。標識した細胞は波長488nmの単一アルゴンレ
ーザーを装備したFACScanTmフローサイトメーター［ベ
クトン ディキンソン イムノサイトメトリーシステム
ズ（Becton Dickinso Immunocytometry Systems）
（またはBDIS）］で分析し、OLCおよびFLSならびに蛍光
強度の測定を各々の細胞について行なった。デジタル化
しリストモードに存在した五種類のパラメーターのデー
タの獲得はコンソルト（Consort）30コンピューター（B
DIS）を用いて行なった。データの分析およびプリント
アウトはPaint−Ａ−GateTm（商標）ソフトウェア（BDI
S）を用いて行なった。
るLDS−751およびチアゾールオレンジならびにHLe−１
（PE）のようなCD45MAbで標識した体液サンプルより得
られたおよそ22,000個の細胞を含むドットプロットを示
している。標識した細胞は波長488nmの単一アルゴンレ
ーザーを装備したFACScanTmフローサイトメーター［ベ
クトン ディキンソン イムノサイトメトリーシステム
ズ（Becton Dickinso Immunocytometry Systems）
（またはBDIS）］で分析し、OLCおよびFLSならびに蛍光
強度の測定を各々の細胞について行なった。デジタル化
しリストモードに存在した五種類のパラメーターのデー
タの獲得はコンソルト（Consort）30コンピューター（B
DIS）を用いて行なった。データの分析およびプリント
アウトはPaint−Ａ−GateTm（商標）ソフトウェア（BDI
S）を用いて行なった。
第１図は、五種類のパラメーターのさまざまな組み合わ
せによって分析した正常な末梢血液サンプルから得られ
た細胞のいろいろなドットプロットからなり、図中、
（○）で示した細胞は赤血球，（●）で示した細胞は白
血球，（）で示した細胞は網状赤血球，（△）で示し
た粒子は血小板である。
せによって分析した正常な末梢血液サンプルから得られ
た細胞のいろいろなドットプロットからなり、図中、
（○）で示した細胞は赤血球，（●）で示した細胞は白
血球，（）で示した細胞は網状赤血球，（△）で示し
た粒子は血小板である。
第２図は第１図で分析され、かつLDS−751およびチアゾ
ールオレンジ蛍光（第１図Ｂ）にゲートが設定された、
血液サンプル内に存在する有核細胞のみについて行なっ
たいろいろなドットプロットからなり、図中、（△）で
示した細胞はリンパ球，（）で示した細胞は単球，
（×）で示した細胞は好中球，（●）で示した細胞は好
酸球である。
ールオレンジ蛍光（第１図Ｂ）にゲートが設定された、
血液サンプル内に存在する有核細胞のみについて行なっ
たいろいろなドットプロットからなり、図中、（△）で
示した細胞はリンパ球，（）で示した細胞は単球，
（×）で示した細胞は好中球，（●）で示した細胞は好
酸球である。
第３図は五種類のパラメーターのいろいろな組み合わせ
によって分析した正常な骨髄吸引液から得られた細胞の
さまざまなドットプロットからなり、図中、細胞の型は
第１図と同様のマークで示した。
によって分析した正常な骨髄吸引液から得られた細胞の
さまざまなドットプロットからなり、図中、細胞の型は
第１図と同様のマークで示した。
第４図は、第３図で分析され、かつLDS−751およびチア
ゾールオレンジ蛍光にゲートが設定された、骨髄サンプ
ル内に存在する有核細胞についてのみ行なったさまざま
なドットプロットからなり、図中、細胞の型は第２図と
同様のマークで示し、さらに有核の赤芽球は（□），未
成熟白血球（芽球）は で示した。
ゾールオレンジ蛍光にゲートが設定された、骨髄サンプ
ル内に存在する有核細胞についてのみ行なったさまざま
なドットプロットからなり、図中、細胞の型は第２図と
同様のマークで示し、さらに有核の赤芽球は（□），未
成熟白血球（芽球）は で示した。
第５図は五種類のパラメーターのいろいろな組み合わせ
によって分析した血小板減少症Ｂ−CLL患者から得られ
た末梢血液細胞のさまざまなドットプロットであり、図
中、細胞は第１図と同様のマークで示した。
によって分析した血小板減少症Ｂ−CLL患者から得られ
た末梢血液細胞のさまざまなドットプロットであり、図
中、細胞は第１図と同様のマークで示した。
第６図は第５図で分析され、かつLDS−751およびチアゾ
ールオレンジ蛍光にゲートが設定された、血液サンプル
中に存在する有核細胞についてのみ行なったさまざまな
ドットプロット分析からなり、図中、細胞は第４図と同
様のマークで示した。
ールオレンジ蛍光にゲートが設定された、血液サンプル
中に存在する有核細胞についてのみ行なったさまざまな
ドットプロット分析からなり、図中、細胞は第４図と同
様のマークで示した。
実施例 正常なボランティアからの末梢血液を静脈穿刺によりED
TA（K3）を抗凝血物質として含んだバクテナー チュー
ブ（Vactainre tubu）［ベクトン ディキンソン（Bec
ton Dickinson）］に集めた。血液またはＢ細胞慢性リ
ンパ球白血病（Ｂ−CLL）の第IV期の患者からもRAIに従
って集めた。血液細胞の計数は自動血液細胞アナライザ
ー［H1,テクニコン（Techniocn）］によって行なった
（RBC 3.3×109/ml;リンパ球81.9×106/ml;および血小
板は手操作で35×106/mlと計数の後、20×106/mlと訂正
された）。骨髄吸引液は正常なボランティアより得た。
集めた吸引液をバクテナー チューブに移し、RPMI1640
（GIBCO）を加えて1:1に希釈した。
TA（K3）を抗凝血物質として含んだバクテナー チュー
ブ（Vactainre tubu）［ベクトン ディキンソン（Bec
ton Dickinson）］に集めた。血液またはＢ細胞慢性リ
ンパ球白血病（Ｂ−CLL）の第IV期の患者からもRAIに従
って集めた。血液細胞の計数は自動血液細胞アナライザ
ー［H1,テクニコン（Techniocn）］によって行なった
（RBC 3.3×109/ml;リンパ球81.9×106/ml;および血小
板は手操作で35×106/mlと計数の後、20×106/mlと訂正
された）。骨髄吸引液は正常なボランティアより得た。
集めた吸引液をバクテナー チューブに移し、RPMI1640
（GIBCO）を加えて1:1に希釈した。
各々の試験には10μの血液または骨髄サンプルを用い
た。サンプルは10μのLDS−751溶液（0.1mg/5mlPB
S）、10μチアゾールオレンジ溶液（0.1mg/5mlPB
S）、および10μHLe−１（PE）と共に30分間インキュ
ベーションした。サンプルは測定前に1mlリン酸緩衝生
理食塩溶液（PBS）で希釈した。
た。サンプルは10μのLDS−751溶液（0.1mg/5mlPB
S）、10μチアゾールオレンジ溶液（0.1mg/5mlPB
S）、および10μHLe−１（PE）と共に30分間インキュ
ベーションした。サンプルは測定前に1mlリン酸緩衝生
理食塩溶液（PBS）で希釈した。
スペクトルの補正を行なってLDS−751チャンネルにはい
るPE放出（エミッション）（５％削減）、PEチャンネル
にはいるLDS−751（11％削減）、チアゾールオレンジチ
ャンネルにはいるPE（23％削減）、およびPE経路にはい
るチアゾールオレンジ（0.4％削減）を補償した。チア
ゾールオレンジとLDS−751チャンネルとの間の補正は必
要でなかった。
るPE放出（エミッション）（５％削減）、PEチャンネル
にはいるLDS−751（11％削減）、チアゾールオレンジチ
ャンネルにはいるPE（23％削減）、およびPE経路にはい
るチアゾールオレンジ（0.4％削減）を補償した。チア
ゾールオレンジとLDS−751チャンネルとの間の補正は必
要でなかった。
フローサイトメーターの測定は単一のアルゴンイオンレ
ーザーを備えたFACScanTmフローサイトメーターで行な
った。デジタル化し、リスト−モードに保存した五種類
のパラメーターのデータの獲得は、コンソルト（Consor
t）30Tmコンピューターを用いFACScanTm研究用ソフトウ
ェアで行なった。各々のサンプルについて22,000個の細
胞を分析した。有核細胞を識別するために、データの獲
得はLDS−751およびチアゾールオレンジの蛍光強度にゲ
ートを設定して行なった。データの分析は多数のパラメ
ーターデータを目に見えるようにするPaint−Ａ−GateT
mソフトウェアプログラムを用いて行なった。
ーザーを備えたFACScanTmフローサイトメーターで行な
った。デジタル化し、リスト−モードに保存した五種類
のパラメーターのデータの獲得は、コンソルト（Consor
t）30Tmコンピューターを用いFACScanTm研究用ソフトウ
ェアで行なった。各々のサンプルについて22,000個の細
胞を分析した。有核細胞を識別するために、データの獲
得はLDS−751およびチアゾールオレンジの蛍光強度にゲ
ートを設定して行なった。データの分析は多数のパラメ
ーターデータを目に見えるようにするPaint−Ａ−GateT
mソフトウェアプログラムを用いて行なった。
当業者は、サンプルの分析が二分割法で行なわれること
を理解するであろう。最初に体液サンプルを分割し、こ
の分割サンプルのうち１個以上を上述のように希釈し、
もう１個は希釈せずにおくかまたはより少なく希釈倍率
で希釈する。次いで上記の方法を行なった後、１個の分
割サンプルを用い、有核細胞にゲートを設定するがその
数は計測せずにRBC,血小板および網状赤血球を同定し識
別した。また、上記の方法を行なった後、無核細胞にゲ
ートを設定するがその数は計測せずに有核細胞を同定し
かつ識別した。サンプルを分割して有核細胞をより少な
い希釈倍率で希釈して試験すると、サンプル内の比較的
少ない有核細胞がより早く計測できるであろう。
を理解するであろう。最初に体液サンプルを分割し、こ
の分割サンプルのうち１個以上を上述のように希釈し、
もう１個は希釈せずにおくかまたはより少なく希釈倍率
で希釈する。次いで上記の方法を行なった後、１個の分
割サンプルを用い、有核細胞にゲートを設定するがその
数は計測せずにRBC,血小板および網状赤血球を同定し識
別した。また、上記の方法を行なった後、無核細胞にゲ
ートを設定するがその数は計測せずに有核細胞を同定し
かつ識別した。サンプルを分割して有核細胞をより少な
い希釈倍率で希釈して試験すると、サンプル内の比較的
少ない有核細胞がより早く計測できるであろう。
細胞の分類は、波長488nmに調製された単一アルゴンレ
ーザーを用いた三種類の蛍光信号および二種類の散乱光
信号を検出するために調整されたFACS440Tmで行なっ
た。細胞は10％ウシ胎児血清（FCS）を含むRPMI1640内
に分類した。分類した細胞は５分間200Gで遠心分離し、
再び10％FCS含有のRPMI100μに懸濁した。顕微鏡用ス
ライド調製物はシャンドン サイトセントリフュージ
（Shandon Cytocentrifuge）［サザン プロダクト
（Southern Product Ltd），英国］を用いて作製し
た。スライドはライト ステイン（Wright Stain）で
染色し、光学顕微鏡で調べた。網状赤血球を同定するた
めには、100μの１％ニューメチレンブルー溶液を再
懸濁した分類細胞に加えた。細胞はスライド上に移し、
おゝいかぶせ、光学顕微鏡で調べた。
ーザーを用いた三種類の蛍光信号および二種類の散乱光
信号を検出するために調整されたFACS440Tmで行なっ
た。細胞は10％ウシ胎児血清（FCS）を含むRPMI1640内
に分類した。分類した細胞は５分間200Gで遠心分離し、
再び10％FCS含有のRPMI100μに懸濁した。顕微鏡用ス
ライド調製物はシャンドン サイトセントリフュージ
（Shandon Cytocentrifuge）［サザン プロダクト
（Southern Product Ltd），英国］を用いて作製し
た。スライドはライト ステイン（Wright Stain）で
染色し、光学顕微鏡で調べた。網状赤血球を同定するた
めには、100μの１％ニューメチレンブルー溶液を再
懸濁した分類細胞に加えた。細胞はスライド上に移し、
おゝいかぶせ、光学顕微鏡で調べた。
五種類のパラメーターのリストモードファイルの分析
は、色を多次元空間のドットのクラスターの同定に利用
するコンピュータープログラムで行なった。五種類のパ
ラメーターのうちの異なる組み合わせが一度に画面に表
示された。パラメーターの１つの組み合わせによって同
定された細胞クラスターを色付けして、さらにデータの
他の投影も同時に現わした。
は、色を多次元空間のドットのクラスターの同定に利用
するコンピュータープログラムで行なった。五種類のパ
ラメーターのうちの異なる組み合わせが一度に画面に表
示された。パラメーターの１つの組み合わせによって同
定された細胞クラスターを色付けして、さらにデータの
他の投影も同時に現わした。
広い範囲の散乱光信号が未溶解の血液サンプルから、微
小な血小板（１〜４μｍ），赤血球（６〜８μｍ）およ
びより大きい白血球（60〜20μｍ）が存在する結果とし
て得られた。全範囲の散乱光信号を評価するために、前
方および直角方向散乱光信号は104対数増幅器を用いて
検知した。このような条件下では二種類の主要細胞集団
が全血内に同定された。第１図Ａを参照されたい。細胞
集団をさらに識別するためにはさらなるパラメーターが
必要である。
小な血小板（１〜４μｍ），赤血球（６〜８μｍ）およ
びより大きい白血球（60〜20μｍ）が存在する結果とし
て得られた。全範囲の散乱光信号を評価するために、前
方および直角方向散乱光信号は104対数増幅器を用いて
検知した。このような条件下では二種類の主要細胞集団
が全血内に同定された。第１図Ａを参照されたい。細胞
集団をさらに識別するためにはさらなるパラメーターが
必要である。
チアゾールオレンジはDNAと比較してRNAにより高い親和
性または選択性をもち、結合すると蛍光が強くなる。結
合染料の放出（エミッション）ピークは530nmである。
これに対して、LDS−751はRNAと比較してDNAにより高い
親和性または選択性をもつ。この染料も結合すると蛍光
が強くなるが、その最大放出ピークは670nmである。血
小板は核をもたないことが認められているにもかゝら
ず、LDS−751はそのような細胞をも選択的に染色する。
従って、LDS−751以外の染料もまた血小板および他の有
核細胞と選択的に結合して血小板を無核のRBCから識別
するであろうと予想される。
性または選択性をもち、結合すると蛍光が強くなる。結
合染料の放出（エミッション）ピークは530nmである。
これに対して、LDS−751はRNAと比較してDNAにより高い
親和性または選択性をもつ。この染料も結合すると蛍光
が強くなるが、その最大放出ピークは670nmである。血
小板は核をもたないことが認められているにもかゝら
ず、LDS−751はそのような細胞をも選択的に染色する。
従って、LDS−751以外の染料もまた血小板および他の有
核細胞と選択的に結合して血小板を無核のRBCから識別
するであろうと予想される。
チアゾールオレンジおよびLDS−751の組み合わせは、RN
AおよびDNAを両方共もたない赤血球と、両方の核酸をも
つ有核の白血球とを大別する。第１図Ｂに示すように、
赤血球および白血球（（●），右上方角）が分離され、
それらの蛍光信号はほゞ３桁の大きさで異なる。これら
の染料間の重大な干渉は、有核細胞には認められなかっ
た。
AおよびDNAを両方共もたない赤血球と、両方の核酸をも
つ有核の白血球とを大別する。第１図Ｂに示すように、
赤血球および白血球（（●），右上方角）が分離され、
それらの蛍光信号はほゞ３桁の大きさで異なる。これら
の染料間の重大な干渉は、有核細胞には認められなかっ
た。
チアゾールオレンジおよびLDS−751は、赤血球、網状赤
血球および血小板の間の識別にも用いうるが、血小板お
よび網状赤血球の両方において、これらの染料間の相互
作用に認められた。血小板では、両染料を加える順序が
蛍光強度に影響を与えた。LDS−751をチアゾールオレン
ジより先にまたは一緒に加えると、チアゾールオレンジ
による血小板の染色が阻害された。血小板はチアゾール
オレンジを単独に加えた場合、またはLDS−751に添加に
先立って加えた場合にのみ、チアゾールオレンジで染色
された。網状赤血球では、チアゾールオレンジによる蛍
光強度がLDS−751存在下でわずかに小さくなった。チア
ゾールオレンジおよびLDS−751を同時に加えてサンプル
をインキュベーションすることによって、血小板と網状
赤血球との間には最も効果的な分離が認められ、同時
に、赤血球とこれら二種類の集団との間にも良好な分離
が保たれた。
血球および血小板の間の識別にも用いうるが、血小板お
よび網状赤血球の両方において、これらの染料間の相互
作用に認められた。血小板では、両染料を加える順序が
蛍光強度に影響を与えた。LDS−751をチアゾールオレン
ジより先にまたは一緒に加えると、チアゾールオレンジ
による血小板の染色が阻害された。血小板はチアゾール
オレンジを単独に加えた場合、またはLDS−751に添加に
先立って加えた場合にのみ、チアゾールオレンジで染色
された。網状赤血球では、チアゾールオレンジによる蛍
光強度がLDS−751存在下でわずかに小さくなった。チア
ゾールオレンジおよびLDS−751を同時に加えてサンプル
をインキュベーションすることによって、血小板と網状
赤血球との間には最も効果的な分離が認められ、同時
に、赤血球とこれら二種類の集団との間にも良好な分離
が保たれた。
チアゾールオレンジおよびLDS−751の間の放出スペクト
ルの分離は、PE複合MAbの結合状態の同時評価を可能に
する。CD45が選ばれた理由は、この抗体によって認識さ
れる抗原が異なる系統の細胞では異なる密度で発生する
ことが明らかにされているためである。免疫蛍光強度と
前方および直角方向散乱光との組み合わせは、以下の項
に記載するように有核細胞の広範な分画分析を可能にす
る。
ルの分離は、PE複合MAbの結合状態の同時評価を可能に
する。CD45が選ばれた理由は、この抗体によって認識さ
れる抗原が異なる系統の細胞では異なる密度で発生する
ことが明らかにされているためである。免疫蛍光強度と
前方および直角方向散乱光との組み合わせは、以下の項
に記載するように有核細胞の広範な分画分析を可能にす
る。
I.正常血液細胞の分画分析 末梢血液をLDS−751,チアゾールオレンジおよびHLe−１
（PE）と共にインキュベーションした。血液調製物は測
定前にPBSで1:100に希釈した。
（PE）と共にインキュベーションした。血液調製物は測
定前にPBSで1:100に希釈した。
データが複雑なため、異なる血液細胞集団の同定は分け
て記載した。関連する細胞亜集団の同一性は、選別した
細胞の顕微鏡によって確かめられた。選別細胞画分の純
度は90％以上であり、主な混入細胞は赤血球であった。
そのような閾値を設定した結果として白血球集団を選別
する間に、赤血球は非常にしばしばゲートを設定したそ
の細胞集団と伴に偏向する傾向がある。
て記載した。関連する細胞亜集団の同一性は、選別した
細胞の顕微鏡によって確かめられた。選別細胞画分の純
度は90％以上であり、主な混入細胞は赤血球であった。
そのような閾値を設定した結果として白血球集団を選別
する間に、赤血球は非常にしばしばゲートを設定したそ
の細胞集団と伴に偏向する傾向がある。
血液中の主な細胞集団は成熟型赤血球（RBC）からな
る。RBCは、前方および直角方向の散乱光信号が相対的
に大きいこと（第１図A,（○））,LDS−751およびチア
ゾールオレンジによる蛍光を発しないこと（第１図
Ｂ），ならびに抗−CD45と結合しないこと（第１図C,
D）から同定した。
る。RBCは、前方および直角方向の散乱光信号が相対的
に大きいこと（第１図A,（○））,LDS−751およびチア
ゾールオレンジによる蛍光を発しないこと（第１図
Ｂ），ならびに抗−CD45と結合しないこと（第１図C,
D）から同定した。
網状赤血球（第１図，（））は、主にチアゾールオレ
ンジとの反応性に基づいて成熟型赤血球から識別された
（第１図Ｂ）。網状赤血球は赤血球に比べてLDS−751に
よる蛍光強度もわずかに強い。RBCおよび網状赤血球は
両方共、CD45によって認識される表面抗原を発現しない
（第１図ＣおよびＤ）。網状赤血球をその散乱光特徴に
基づいて白血球およびRBCから識別することはできない
（第１図Ａ）。
ンジとの反応性に基づいて成熟型赤血球から識別された
（第１図Ｂ）。網状赤血球は赤血球に比べてLDS−751に
よる蛍光強度もわずかに強い。RBCおよび網状赤血球は
両方共、CD45によって認識される表面抗原を発現しない
（第１図ＣおよびＤ）。網状赤血球をその散乱光特徴に
基づいて白血球およびRBCから識別することはできない
（第１図Ａ）。
有核赤血球は普通末梢血液中には見い出されないので、
後ほど骨髄の分析の項で議論する。
後ほど骨髄の分析の項で議論する。
血小板は、前方および直角方向の散乱光が比較的小さい
こと（第１図A,（△））に加えて、LDS−751による染色
が比較的少ないこと（第１図Ｂ）によって特徴付けられ
る。血小板はこれら三種類のパラメーターを用いること
によってRBC（○）、網状赤血球（），白血球（●）
から明確に分離された（第１図Ｂ）。赤血球細胞と同様
に、血小板はCD45によって認識される抗原を発現しなか
った（第１図ＣおよびＤ）。多数のパラメーター分析を
用いることによって、“正常な”血小板は散乱光信号が
比較的低く、LDS−751による蛍光強度がRBCのそれより
大きく、チアゾールオレンジとの反応性を示さず、且つ
CD45結合物の存在しない粒子として特徴付けられた。
こと（第１図A,（△））に加えて、LDS−751による染色
が比較的少ないこと（第１図Ｂ）によって特徴付けられ
る。血小板はこれら三種類のパラメーターを用いること
によってRBC（○）、網状赤血球（），白血球（●）
から明確に分離された（第１図Ｂ）。赤血球細胞と同様
に、血小板はCD45によって認識される抗原を発現しなか
った（第１図ＣおよびＤ）。多数のパラメーター分析を
用いることによって、“正常な”血小板は散乱光信号が
比較的低く、LDS−751による蛍光強度がRBCのそれより
大きく、チアゾールオレンジとの反応性を示さず、且つ
CD45結合物の存在しない粒子として特徴付けられた。
白血球は直角方向および前方散乱光信号が比較的大きい
ことによって特徴付けられた（第１図A,（●））。白血
球と赤血球系細胞の散乱光の特徴はよく似ているが、白
血球はLDS−751およびチアゾールオレンジの両方から生
じる蛍光信号がより大きいこと（第１図Ｂ）によって赤
血球系細胞（○）から明確に分離された。このような分
離によってRBCが圧倒的に多数存在する中で白血球の数
を正確に測定する手段が提供された。白血球と血小板、
RBCおよび網状赤血球とのさらなる区別はCD45との反応
性によって得られた（第１図ＣおよびＤ）。
ことによって特徴付けられた（第１図A,（●））。白血
球と赤血球系細胞の散乱光の特徴はよく似ているが、白
血球はLDS−751およびチアゾールオレンジの両方から生
じる蛍光信号がより大きいこと（第１図Ｂ）によって赤
血球系細胞（○）から明確に分離された。このような分
離によってRBCが圧倒的に多数存在する中で白血球の数
を正確に測定する手段が提供された。白血球と血小板、
RBCおよび網状赤血球とのさらなる区別はCD45との反応
性によって得られた（第１図ＣおよびＤ）。
有核細胞をより詳細に分析するために、第１図Ｂに示す
ようにゲートをチアゾールオレンジおよびLDS−751に設
定した。白血球の分画は有核細胞の散乱光特性とCD45に
よる蛍光強度との相関々係によって得られた（第２図Ａ
を参照されたい）。リンパ球（△）は最も明るいCD45抗
原の発現、および最も低い直角方向散乱光信号によって
特徴付けられた。単球（）はCD45による結合がリンパ
球よりわずかに少ないこと、およびより大きい前方およ
び直角方向の散乱光信号を示すことに基づいて同定され
た。好中球顆粒細胞（×）はCD45抗原をかすかに発現
し、かつ散乱光信号は大きかった。好酸球顆粒細胞
（●）は単球と同程度量のCD45をもつが、より大きい直
角方向散乱光信号およびより低い前方散乱光信号によっ
て他の有核細胞から識別しうる。
ようにゲートをチアゾールオレンジおよびLDS−751に設
定した。白血球の分画は有核細胞の散乱光特性とCD45に
よる蛍光強度との相関々係によって得られた（第２図Ａ
を参照されたい）。リンパ球（△）は最も明るいCD45抗
原の発現、および最も低い直角方向散乱光信号によって
特徴付けられた。単球（）はCD45による結合がリンパ
球よりわずかに少ないこと、およびより大きい前方およ
び直角方向の散乱光信号を示すことに基づいて同定され
た。好中球顆粒細胞（×）はCD45抗原をかすかに発現
し、かつ散乱光信号は大きかった。好酸球顆粒細胞
（●）は単球と同程度量のCD45をもつが、より大きい直
角方向散乱光信号およびより低い前方散乱光信号によっ
て他の有核細胞から識別しうる。
II.正常骨髄細胞の分画分析 血液で用いた五次元分析を骨髄の量的分析にも応用し
た。骨髄吸引物は、末梢血液のために用いたのと同様
に、LDS−751,チアゾールオレンジおよびHLe−１（PE）
と共にインキュベーションした。基板の獲得は末梢血液
の分析のために用いたのと同じ様に計器を設定して行な
った。典型的な実験例（表示および色（マーク）付は末
梢血液の分析に用いたのと同一のものを用いた）を第３
図に示した。RBC（○），網状赤血球（），血小板
（△），および有核細胞（●）は五次元空間において末
梢血液細胞対応物と同じような位置を占めた（第１図お
よび第３図を比較されたい）。
た。骨髄吸引物は、末梢血液のために用いたのと同様
に、LDS−751,チアゾールオレンジおよびHLe−１（PE）
と共にインキュベーションした。基板の獲得は末梢血液
の分析のために用いたのと同じ様に計器を設定して行な
った。典型的な実験例（表示および色（マーク）付は末
梢血液の分析に用いたのと同一のものを用いた）を第３
図に示した。RBC（○），網状赤血球（），血小板
（△），および有核細胞（●）は五次元空間において末
梢血液細胞対応物と同じような位置を占めた（第１図お
よび第３図を比較されたい）。
血液集団と骨髄集団との間には興味ある相違点が存在す
る。血小板の分析において、これらの細胞粒子を代表す
る散乱光領域は、血液サンプルの分析の場合（第１図）
と同様、第３図も（△）で示した。末梢血液とは対照的
に、骨髄からの血小板の大部分はLDS−751で染色されか
った（第３図Ｂでは（○）と重なって（●）ドットとし
て同定された）。それ故、これらのものは正常な血小板
として同定されなかった。この細胞集団を選別した結
果、これらの細胞集団は主に破片からなり、同定されな
かった骨髄の小棘および細胞粒子を含んでいることがわ
かった。
る。血小板の分析において、これらの細胞粒子を代表す
る散乱光領域は、血液サンプルの分析の場合（第１図）
と同様、第３図も（△）で示した。末梢血液とは対照的
に、骨髄からの血小板の大部分はLDS−751で染色されか
った（第３図Ｂでは（○）と重なって（●）ドットとし
て同定された）。それ故、これらのものは正常な血小板
として同定されなかった。この細胞集団を選別した結
果、これらの細胞集団は主に破片からなり、同定されな
かった骨髄の小棘および細胞粒子を含んでいることがわ
かった。
有核骨髄細胞は、チアゾールオレンジと同様にしてLDS
−751による蛍光信号が大きいことによって同定した
（第３図Ｂ）。第３図Ｂに示すように、ゲートをLDS−7
51およびチアゾールオレンジに設定して有核細胞を収集
した。散乱光特性および有核細胞に存在するCD45による
免疫蛍光信号との相関々系を第４図に示した。末梢血液
の研究から同定したのと同様にリンパ球，単球および顆
粒球の典型的な位置をそれぞれ（Δ），（）および
（×）で示した。
−751による蛍光信号が大きいことによって同定した
（第３図Ｂ）。第３図Ｂに示すように、ゲートをLDS−7
51およびチアゾールオレンジに設定して有核細胞を収集
した。散乱光特性および有核細胞に存在するCD45による
免疫蛍光信号との相関々系を第４図に示した。末梢血液
の研究から同定したのと同様にリンパ球，単球および顆
粒球の典型的な位置をそれぞれ（Δ），（）および
（×）で示した。
三種類の異なる骨髄吸引液について、直角方向散乱光お
よびCD45の発現によって選別された有核細胞の数を形態
学的相違に基づいて計測した。選別した領域は第４図Ｂ
に異なるマークで示した領域である。結果は第１表に示
し、その値は三種類の実験から得られた有核細胞の百分
率の平均として示した。
よびCD45の発現によって選別された有核細胞の数を形態
学的相違に基づいて計測した。選別した領域は第４図Ｂ
に異なるマークで示した領域である。結果は第１表に示
し、その値は三種類の実験から得られた有核細胞の百分
率の平均として示した。
マークは第４図Ｂに例示した領域を表わす。データは有
核細胞の百分率で示す。+ m＝3,＊芽球 選択した集団の光学顕微鏡試験を行なうことによって、
これらの細胞の系統分類が確認されたが、（△），
（）および（×）の領域内の細胞のすべてが成熟型と
いうわけではなかった。（×）で示した集団内には、成
熟型好中球に加えて、杆状球（band）および後骨髄球も
見い出された。（△）で示した細胞（リンパ球）のおよ
そ５％がリンパ芽球であり、（）で示した細胞（単
球）の20％が未成熟型のモノミエロイド細胞であった。
核細胞の百分率で示す。+ m＝3,＊芽球 選択した集団の光学顕微鏡試験を行なうことによって、
これらの細胞の系統分類が確認されたが、（△），
（）および（×）の領域内の細胞のすべてが成熟型と
いうわけではなかった。（×）で示した集団内には、成
熟型好中球に加えて、杆状球（band）および後骨髄球も
見い出された。（△）で示した細胞（リンパ球）のおよ
そ５％がリンパ芽球であり、（）で示した細胞（単
球）の20％が未成熟型のモノミエロイド細胞であった。
末梢血液とは対照的に、低い直角方向散乱光信号および
かすかに発現したCD45抗原をもつ二つの集団が骨髄細胞
から同定され、これらの細胞集団は第４図Ｂでそれぞれ
（□）および で示した。この図から、 で示した細胞集団と他のマークで示した集団とその間は
明確に分かれていないことが明白である。最も低レベル
のCD45抗原を発現している細胞集団（□）の光学顕微鏡
試験は、その集団が正常芽細胞および赤芽球のみからな
ることを示した（第１表）。わずかに高い量のCD45抗原
を発現する集団 はモノミエロイドおよびリンパ球前駆体を含む最も未成
熟な細胞ならびに少数の赤芽球を含んでいた。
かすかに発現したCD45抗原をもつ二つの集団が骨髄細胞
から同定され、これらの細胞集団は第４図Ｂでそれぞれ
（□）および で示した。この図から、 で示した細胞集団と他のマークで示した集団とその間は
明確に分かれていないことが明白である。最も低レベル
のCD45抗原を発現している細胞集団（□）の光学顕微鏡
試験は、その集団が正常芽細胞および赤芽球のみからな
ることを示した（第１表）。わずかに高い量のCD45抗原
を発現する集団 はモノミエロイドおよびリンパ球前駆体を含む最も未成
熟な細胞ならびに少数の赤芽球を含んでいた。
III.血小板減少性Ｂ細胞慢性リンパ球白血病（Thrmocyt
openic Ｂ−Chronic Lymphocytic Leukemic）患者の
血液細胞の分画分析 本発明の技術の有用性はＢ−CLL患者から得た血液の分
析においても証明された。RAIB−CLLの第４期の患者を
選んだ理由は、細胞数の異常がすべての血液細胞系統に
見い出されることによる。リンパ球数が10〜100倍に増
加するため、残りの正常な白血球および網状赤血球から
リンパ球細胞を区別することはより困難になる。さらに
これらの患者では血小板の数が少ないため、血小板の計
数の信頼性がより低くなる。
openic Ｂ−Chronic Lymphocytic Leukemic）患者の
血液細胞の分画分析 本発明の技術の有用性はＢ−CLL患者から得た血液の分
析においても証明された。RAIB−CLLの第４期の患者を
選んだ理由は、細胞数の異常がすべての血液細胞系統に
見い出されることによる。リンパ球数が10〜100倍に増
加するため、残りの正常な白血球および網状赤血球から
リンパ球細胞を区別することはより困難になる。さらに
これらの患者では血小板の数が少ないため、血小板の計
数の信頼性がより低くなる。
Ｂ−CLL患者から得た血液は正常な血液について行なっ
たのと同様に、LDS−751、チアゾールオレンジおよびHL
e−１（PE）と共にインキュベーションした。データは
正常末梢血液（第１図）および骨髄（第３図）について
選択したのと同じ方法で表示した:RBC（○）で示し；網
状赤血球は（）で示し、血小板は（△），および有核
細胞は（●）で示した（第５図A,B,CおよびＤ）。
たのと同様に、LDS−751、チアゾールオレンジおよびHL
e−１（PE）と共にインキュベーションした。データは
正常末梢血液（第１図）および骨髄（第３図）について
選択したのと同じ方法で表示した:RBC（○）で示し；網
状赤血球は（）で示し、血小板は（△），および有核
細胞は（●）で示した（第５図A,B,CおよびＤ）。
血小板を代表する散乱光領域に存在する細胞頻度は正常
な末梢血液と比較して低い（第１図A,Bおよび第５図A,B
の（△）マークを比較されたい）。第５図Ａ（△）にお
いて散乱光から血小板と同定されたドットのうちの数個
のみが第５図Ｂにおいて血小板を代表するLDS−751によ
る蛍光強度を示し、正常な血小板であると考えうる。網
状赤血球（）から血小板を識別することはすぐれてい
る（第５図Ｂ）。
な末梢血液と比較して低い（第１図A,Bおよび第５図A,B
の（△）マークを比較されたい）。第５図Ａ（△）にお
いて散乱光から血小板と同定されたドットのうちの数個
のみが第５図Ｂにおいて血小板を代表するLDS−751によ
る蛍光強度を示し、正常な血小板であると考えうる。網
状赤血球（）から血小板を識別することはすぐれてい
る（第５図Ｂ）。
有核細胞（●）頻度の著しい増加のため、LDS−751およ
びチアゾールオレンジから得られる白血球と網状赤血球
（）との分離は余り明確ではない。しかしながら、白
血球はCD抗原の発現量に基づいて網状赤血球とは明確に
分離されうる（第５図ＣおよびＤ）。
びチアゾールオレンジから得られる白血球と網状赤血球
（）との分離は余り明確ではない。しかしながら、白
血球はCD抗原の発現量に基づいて網状赤血球とは明確に
分離されうる（第５図ＣおよびＤ）。
有核細胞の散乱光特性およびCD45抗原の発現（第５図Ｂ
におけるゲート設定）を第６図ＡおよびＢに示す。細胞
の大部分はCD45抗原をかすかに発現しており、未成熟型
リンパ球の特徴である低い前方および直角方向の散乱光
信号 を示した。少数の白血球のみが正常なリンパ球（△），
顆粒球（×）および単球（）として検出されたがその
分離は圧倒的多数の未成熟型リンパ球が存在するために
明確ではなかった。CD45抗原を発現せず、かつ低い直角
方向散乱光信号をもつ少数の細胞（□）に注目されたい
（第６図Ｂを参照されたい）。これらの細胞は、この患
者における網状赤血球の著しい増加を裏付ける、有核の
赤芽球であると同定された。
におけるゲート設定）を第６図ＡおよびＢに示す。細胞
の大部分はCD45抗原をかすかに発現しており、未成熟型
リンパ球の特徴である低い前方および直角方向の散乱光
信号 を示した。少数の白血球のみが正常なリンパ球（△），
顆粒球（×）および単球（）として検出されたがその
分離は圧倒的多数の未成熟型リンパ球が存在するために
明確ではなかった。CD45抗原を発現せず、かつ低い直角
方向散乱光信号をもつ少数の細胞（□）に注目されたい
（第６図Ｂを参照されたい）。これらの細胞は、この患
者における網状赤血球の著しい増加を裏付ける、有核の
赤芽球であると同定された。
IV.骨髄混入物質としての全血 時として、骨髄吸引液を採取中に血液がサンプルへの混
入物質として吸引液内に持込まれる。このため、血液混
入物質についての補正を行なわずにサンプルを分析する
と、白血球の分画に誤りが生ずる。
入物質として吸引液内に持込まれる。このため、血液混
入物質についての補正を行なわずにサンプルを分析する
と、白血球の分画に誤りが生ずる。
前記実施例Ｉの方法に従って血液サンプルを分析する
と、血液内に存在する白血球細胞の百分率が計算される
であろう。一度、骨髄サンプルを実施例IIに記載の方法
に従って分析した後血液サンプルに存在する白血球細胞
の予想百分率を骨髄サンプルから減ずると血液混入物質
の影響を除去したより正確な値が得られるであろう（事
実上混入物質のすべてが血液に起源を有するものと仮定
した）。
と、血液内に存在する白血球細胞の百分率が計算される
であろう。一度、骨髄サンプルを実施例IIに記載の方法
に従って分析した後血液サンプルに存在する白血球細胞
の予想百分率を骨髄サンプルから減ずると血液混入物質
の影響を除去したより正確な値が得られるであろう（事
実上混入物質のすべてが血液に起源を有するものと仮定
した）。
例えばリンパ球、顆粒球および単球は血液サンプルの全
細胞のそれぞれ1,0,1,0および0.2％からなり、残り97.8
％の細胞は本質的にRBCである。結果として、血液サン
プルには100のRBC当りおよそ１のリンパ球および顆粒球
ならびに0.2の単球が存在することになる。骨髄サンプ
ルに存在するリンバ球，顆粒球および単球の絶対数は2
0,000個の細胞サンプル中にそれぞれ800,490および165
個であり、残りの細胞は本質的にRBC（即ち、18,545
個）である。従って、例示のみの目的のために、骨髄サ
ンプルに混入すると予想されるリンパ球、顆粒球および
単球の数は185個のリンパ球（即ち１％×18,545）、185
個の顆粒球（即ち、１％×18,545）および37個の単球
（即ち0.2％×18,545）であろう。それ故、訂正した数
は615個のリンパ球,305個の顆粒球および128個の単球で
あろう。このような方法を用いることによって、より正
確な細胞数が得られるであろう。
細胞のそれぞれ1,0,1,0および0.2％からなり、残り97.8
％の細胞は本質的にRBCである。結果として、血液サン
プルには100のRBC当りおよそ１のリンパ球および顆粒球
ならびに0.2の単球が存在することになる。骨髄サンプ
ルに存在するリンバ球，顆粒球および単球の絶対数は2
0,000個の細胞サンプル中にそれぞれ800,490および165
個であり、残りの細胞は本質的にRBC（即ち、18,545
個）である。従って、例示のみの目的のために、骨髄サ
ンプルに混入すると予想されるリンパ球、顆粒球および
単球の数は185個のリンパ球（即ち１％×18,545）、185
個の顆粒球（即ち、１％×18,545）および37個の単球
（即ち0.2％×18,545）であろう。それ故、訂正した数
は615個のリンパ球,305個の顆粒球および128個の単球で
あろう。このような方法を用いることによって、より正
確な細胞数が得られるであろう。
本明細書に列挙したすべての文献および特許出願は本発
明に関係する当業者の技術水準で表示されている。それ
ぞれ個々の文献あるいは特許出願を特別かつ個別的に参
照として合体させる必要があるのと同程度に、すべての
文献および特許出願を参照としてこゝに合体させる。
明に関係する当業者の技術水準で表示されている。それ
ぞれ個々の文献あるいは特許出願を特別かつ個別的に参
照として合体させる必要があるのと同程度に、すべての
文献および特許出願を参照としてこゝに合体させる。
普通の技術の熟練者にとって、多くの変更および修正が
特許請求の範囲の精神および観点から離れることなく本
発明内で実行しうることは明らかであろう。
特許請求の範囲の精神および観点から離れることなく本
発明内で実行しうることは明らかであろう。
第１図Ａ〜Ｄは、五種類のパラメーターのさまざまな組
み合わせによって分析した正常な末梢血液細胞のドット
プロットである。 第２図ＡおよびＢは、正常末梢血液の有核細胞のドット
プロットである。 第３図Ａ〜Ｄは、五種類のパラメーターのさまざまな組
み合わせによって分析した正常な骨髄吸引液細胞のドッ
トプロットである。 第４図ＡおよびＢは、正常骨髄吸引液の有核細胞につい
てのみ行なったドットプロットである。 第５図Ａ〜Ｄは、血小板減少症Ｂ−CLL患者から得られ
た末梢血液細胞のドットプロットである。 第６図Ａ〜Ｂは、第５図中の有核細胞についてのみ行な
ったドットプロットである。
み合わせによって分析した正常な末梢血液細胞のドット
プロットである。 第２図ＡおよびＢは、正常末梢血液の有核細胞のドット
プロットである。 第３図Ａ〜Ｄは、五種類のパラメーターのさまざまな組
み合わせによって分析した正常な骨髄吸引液細胞のドッ
トプロットである。 第４図ＡおよびＢは、正常骨髄吸引液の有核細胞につい
てのみ行なったドットプロットである。 第５図Ａ〜Ｄは、血小板減少症Ｂ−CLL患者から得られ
た末梢血液細胞のドットプロットである。 第６図Ａ〜Ｂは、第５図中の有核細胞についてのみ行な
ったドットプロットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−195358（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−112067（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−8664（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−16872（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−165958（ＪＰ，Ａ)
Claims (17)
- 【請求項１】（ａ）流体サンプルを固体から採取し； （ｂ）二種類の蛍光核酸染料を前記サンプルに添加して
個々の細胞内のDNAおよびRNAを区別して標識するが、そ
の際、前記二種類の染料が互いに異なる蛍光放出スペク
トルピークを有し； （ｃ）蛍光標識した細胞表面マーカーを前記サンプルに
加えるが、その際、前記マーカーが前記流体サンプル内
の前記細胞表面において別々に発現される抗原を認識
し、且つ前記蛍光標識が前記蛍光染料とは異なる放出ス
ペクトルピークをもち；そして （ｄ）前記サンプル中の個々の細胞についての三チャン
ネルの蛍光および二チャンネルの散乱光を検出かつ記録
できる装置で、前記サンプル中の前記細胞を分析する； 工程からなる、体液中の細胞を多数のパラメーターで分
析する方法。 - 【請求項２】体液が腹膜液、脊髄液あるいは脳内の流
体、尿、全血または骨髄、リンパ節、肝臓、あるいは脾
臓の細胞懸濁液からなる、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】体液が全血である、請求項２記載の方法。
- 【請求項４】体液が骨髄液である、請求項２記載の方
法。 - 【請求項５】核酸染料のうちの１つがLDS−751である、
請求項１記載の方法。 - 【請求項６】核酸染料のうちの１つがチアゾールオレン
ジである、請求項１記載の方法。 - 【請求項７】細胞表面マーカーが蛍光色素に結合したモ
ノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。 - 【請求項８】モノクローナル抗体がCD45モノクローナル
抗体である、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】CD45モノクローナル抗体がHLe−１であ
る、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】蛍光色素がフィコエリトリン（PE）であ
る、請求項７記載の方法。 - 【請求項１１】装置がフローサイトメーターである、請
求項１記載の方法。 - 【請求項１２】（ａ）血液サンプルを固体から採取し； （ｂ）LDS−751およびチアゾールオレンジを前記サンプ
ルに添加し； （ｃ）HLe−１（PE）を前記サンプルに添加し；そして （ｄ）前記サンプルを、波長488nmに調整された単一レ
ーザー源を備え、かつ前記サンプル内の個々の細胞につ
いてのOLSおよびFLS散乱光の測定値、並びにLDS−751、
チアゾールオレンジおよびPE蛍光放出の測定値を記録か
つ保存する能力をもつフローサイトメーター内を通過さ
せる； 工程からなる、血液サンプル内に存在する細胞を５種類
のパラメーターで分析する方法。 - 【請求項１３】（ａ）骨髄サンプルを固体から採取し； （ｂ）LDS−751およびチアゾールオレンジを前記サンプ
ルに添加し； （ｃ）HLe−１（PE）を前記サンプルに添加し；そして （ｄ）前記サンプルを、波長488nmに調整された単一レ
ーザー源を備え、かつ前記サンプル内の個々の細胞につ
いてのOLSおよびFLS散乱光の測定値、並びにLDS−751、
チアゾールオレンジおよびPE蛍光放出の測定値を記録か
つ保存する能力をもつフローサイトメーター内を通過さ
せる； 工程からなる、骨髄サンプル内に存在する細胞を５種類
のパラメーターで分析する方法。 - 【請求項１４】（ａ）個々の細胞内のDNAおよびRNAを標
識するための少なくとも二種類の核酸染料であって、互
いに異なる蛍光放出スペクトルピークを有するそれぞれ
の核酸染料を含む第１容器；および （ｂ）少なくとも一種類の蛍光物質で標識した細胞表面
マーカーであって、前記マーカーが前記流体サンプル内
に存在する前記細胞上で別々に発現した抗原を認識し、
かつ、前記蛍光標識が前記蛍光染料とは異なる放出スペ
クトルピークをもつ、上記マーカーを含む第２容器； からなる、体液サンプル内に存在する細胞の複数パラメ
ーター分析のためのキット。 - 【請求項１５】前記核酸染料がLDS−751およびチアゾー
ルオレンジからなる、請求項14記載のキット。 - 【請求項１６】蛍光標識した細胞表面マーカーがHLe−
１（PE）からなる、請求項14記載のキット。 - 【請求項１７】（ａ）全血について請求項１記載の各工
程を実施し； （ｂ）血液中に存在する種々の白血球細胞成分の百分率
を定量し； （ｃ）請求項１記載の各工程を実施し； （ｄ）骨髄に存在する種々の白血球細胞成分の絶対数を
定量し；そして （ｅ）上記（ｂ）で得られた各々の百分率に骨髄サンプ
ル中に全細胞数を掛け、その結果得られた数を上記工程
（ｄ）で得られたそれぞれの細胞の絶対数から引き算す
る； 工程からなる、骨髄サンプルへの血液混入による白血球
細胞レベルの上昇を調整するために骨髄サンプルの複数
パラメーター分析を補正するための方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/207,099 US5047321A (en) | 1988-06-15 | 1988-06-15 | Method for analysis of cellular components of a fluid |
| US207099 | 1988-06-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0273157A JPH0273157A (ja) | 1990-03-13 |
| JPH0726954B2 true JPH0726954B2 (ja) | 1995-03-29 |
Family
ID=22769201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1153564A Expired - Lifetime JPH0726954B2 (ja) | 1988-06-15 | 1989-06-15 | 流体内細胞成分の分析法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5047321A (ja) |
| EP (1) | EP0347210B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0726954B2 (ja) |
| AT (1) | ATE111227T1 (ja) |
| AU (1) | AU613197B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340170C (ja) |
| DE (1) | DE68918004T2 (ja) |
| DK (1) | DK296889A (ja) |
| ES (1) | ES2063820T3 (ja) |
| FI (1) | FI94180C (ja) |
| NO (1) | NO175506C (ja) |
Families Citing this family (96)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO164622C (no) * | 1988-05-11 | 1990-10-24 | Tore Lindmo | Binaer immunometrisk partikkelbasert metode for maaling av spesifikke serum-antigener ved hjelp av vaeskestroemsmikrofotometri og et ferdigpreparert maaloppsett derav. |
| US4963478A (en) * | 1988-07-05 | 1990-10-16 | Immucor, Inc. | Article for preforming immunological assays utilizing organic dyes and method for producing and utilizing same |
| FR2638848B1 (fr) * | 1988-11-04 | 1993-01-22 | Chemunex Sa | Procede de detection et/ou de dosage dans un milieu liquide ou semi-liquide d'au moins une substance organique, biologique ou medicamenteuse soluble, par une methode d'agglutination |
| FR2653447B1 (fr) * | 1989-10-20 | 1991-12-27 | Bio Merieux | Procede et reactifs pour la detection de micro-organismes. |
| EP0448931B1 (en) * | 1990-01-26 | 1996-04-03 | Canon Kabushiki Kaisha | Method for measuring a specimen by the use of fluorescence light |
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| US5401847A (en) * | 1990-03-14 | 1995-03-28 | Regents Of The University Of California | DNA complexes with dyes designed for energy transfer as fluorescent markers |
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| US5650275A (en) * | 1990-06-11 | 1997-07-22 | Nexstar Pharmacueticals Inc | Target detection method using spectroscopically detectable nucleic acid ligands |
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| DE69132843T2 (de) * | 1990-12-06 | 2002-09-12 | Affymetrix Inc N D Ges D Staat | Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben |
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