NO175506B - Fremgangsmåte for analyse av cellulære komponenter i en væske og et kit for analysen - Google Patents

Fremgangsmåte for analyse av cellulære komponenter i en væske og et kit for analysen

Info

Publication number
NO175506B
NO175506B NO892302A NO892302A NO175506B NO 175506 B NO175506 B NO 175506B NO 892302 A NO892302 A NO 892302A NO 892302 A NO892302 A NO 892302A NO 175506 B NO175506 B NO 175506B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
sample
cells
cell
blood
bone marrow
Prior art date
Application number
NO892302A
Other languages
English (en)
Other versions
NO892302D0 (no
NO175506C (no
NO892302L (no
Inventor
Michael R Loken
Leon W M M Terstappen
Original Assignee
Becton Dickinson Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Becton Dickinson Co filed Critical Becton Dickinson Co
Publication of NO892302D0 publication Critical patent/NO892302D0/no
Publication of NO892302L publication Critical patent/NO892302L/no
Publication of NO175506B publication Critical patent/NO175506B/no
Publication of NO175506C publication Critical patent/NO175506C/no

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1456—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56977—HLA or MHC typing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1402—Data analysis by thresholding or gating operations performed on the acquired signals or stored data
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/973—Simultaneous determination of more than one analyte
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805—Optical property
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for multiparameteranalyse av celler i en kroppsvæske, og en fremgangsmåte for korrigering av en multi-parameteranalyse av en benmargsprøve for å justere forøkede hvite blodcellenivåer forårsaket av blodforurensning av benmargsprøven.
Et kit for multi-parameteranalyse av celler i en kropps-væskeprøve er også beskrevet.
Fremgangsmåten for multiparameteranalyse av celler i en kroppsvæske ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at man utfører følgende trinn: til en væskeprøve fra et individ; 1) tilsettes to fluoreserende nukleinsyrefarvestoffer til prøven for å merke DNA og RNA i hver celle forskjellig, hvori hvert farvestoff har et fluorescens-topp-emisjonsspekter som er forskjellig fra den andre; 2) tilsette en fluorescensmerket celleoverflatemarkør til prøven, hvori markøren gjenkjenner et antigen som blir uttrykt forskjellig på cellene i nevnte væskeprøve og hvori fluorescensmarkøren har et topp-emisjonsspekter forskjellig fra fluorescensfarvestoffene, og 3) analyserer cellene i prøven i et instrument som kan påvise og registrere tre kanaler fluorescens og to kanaler lysspredning for hver av cellene i prøven.
Fremgangsmåte for korrigering av en multi-parameteranalyse av en benmargsprøve for å justere forøkende hvite blodcellenivåer forårsaket av blodforurensing av benmargsprøven er også beskrevet og er kjennetegnet ved at man utfører følgende trinn: 1) utfører trinnene i fremgangsmåten i krav 1 på fullblod; 2) påviser prosentandelene av de forskjellige hvite blodcellekomponentene i blodet; 3) utfører trinnene ifølge fremgangsmåten i krav 8; 4) bestemmer de absolutte tellingene av forskjellige hvite blodcellekomponenter i benmargen, og 5) multipliserer hver av prosentandelene tilveiebragt i trinn (2) med det totale antallet celler i ben-margsprøven og subtraherer det tallet fra de respektive absolutte tellingene tilveiebragt i trinn (4).
Ovennevnte kit for multi-parameteranalyse av celler i en kroppsvæskeprøve er kjennetegnet ved at det omfatter en første beholder inneholdende minst to nukleinsyrefarvestoffer for forskjellig merking av DNA og RNA i hver celle, og hvori hvert farvestoff har et fluorescens-topp-emisjonsspekter som er forskjellig fra den andre, og en annen beholder inneholdende minst én med fluorescens merket celleoverflate-markør, hvori markøren gjenkjenner et antigen som blir uttrykt forskjellig på cellene i væskeprøven og hvori fluor-escensmarkøren har et toppemisjonsspekter som er forskjellig fra fluorescensfarvestoffene.
To av de mest viktige målene på hematologisk status i et individ er fullblodtelling og leukocyttdifferensiale. Fullblodtellinger og leukocyttdifferentialer omfatter diskriminering og deretter telling av de forskjellige cellulære komponentene i blodet. De forskjellige komponentene av blodet som kan fremkomme i en enkelt prøve omfatter røde blodceller (RBC), blodplater og kjerneceller. I sistnevnte kategori eksisterer et antall forskjellige leukocytt-typer som omfatter lymfocytter (både B og T-celler), naturlig killer (eller "NK") celler og forskjellige undergrupper derav), monocytter og granulocytter (inkludert neutrofiler, eosinofiler og basofiler i alle modningstrinnene). På grunn av det store området av celletyper og modningstrinn til en enkelt celletype, er tilveiebringing av fullblodtellinger av leukocyttdifferensialer ofte en vanskelig og omfattende prosedyre i et normalt individ, men det er enda mer vanskelig og omfattende i et unormalt individ. Denne kompleksiteten kommer ennå mer til uttrykk når analyse på benmargsprøver blir forsøkt.
Tradisjonelt har fullblodtellinger (dvs. antall celler pr. standard volumenhet) og leukocyttdifferensialer (dvs. antall celler av gitt type pr. standard volumenhet) blitt utført manuelt ved telling av et lite cellevolum ved anvendelse av et lysmikroskop og deretter multiplisering av det telte tallet med en faktor for å ta volumet med i betraktning. På grunn av at både prøvestørrelsen målt og ferdighetsnivået som er nødvendig for å skjeldne de forskjellige celletypene, kan både en høy og ofte uakseptabel grad av variabilitet oppstå ved denne metoden.
Nylig er det blitt konstruert instrumenter for å tilveiebringe fullblodtellinger eller leukocyttdifferensialer uten å måtte anvende manuell mikroskopisk eksaminasjon. For tiden tilgjengelige instrumenter påviser celler, enten elektronisk ved aperture impedance (dvs. Coulter Counter"^<111> beskrevet i Coulter, Proe. Nat. Electronics Conf., 12:1034 (1956) eller eventuelt ved lysspredning og absorpsjon (f.eks., Technicon H-6000Tm, beskrevet i Breakell et al., Blood Cells, 11:257
(1985)). I disse instrumentene må den røde blodcellefrak-sjonen separeres fra leukocyttene, og hver måling blir utført uavhengig av den andre. Dette skyldes at RBC generelt overgår tallmessig leukocytter med minst 1000:1 i en normal pasient. I en unormal pasient (f.eks. leukopenisk pasient), kan dette forholdet være vesentlig høyere.
Andre måter å oppnå leukocyttdifferensialer på eksisterer også. Flow-cytometre, som generelt er blitt beskrevet i US-patent nr. 4.661.913, 4.284.412 og 3.826.364 og i en artikkel til Herzenberg et al., Sei. Am.,234:108 (1976), er blitt anvendt for å identifisere forskjellige populasjoner av leukocytter i en heterogen prøve ved påvisning av multiple uavhengige parametre i individuelle celler som passerer gjennom detektorområdet. Disse parametrene omfatter vanligvis foroverlysspredning (FLS som er et mål på relativ partik-kelstørrelse), ortogonallysspredning (OLS som er et mål på relativ granularitet) og fluorescens. Fluorescens kan bli målt fra celler som inkorporerer en nukleinsyremarkør eller kan bli målt fra celler med overflatemarkører som er merket med monoklonale antistoffer (MAb-er) konjugert direkte eller indirekte til fluorokromer som f.eks. beskrevet i US-patent nr. 4.520.110. Forskjellige kanaler innenfor flow-cytometre detekterer og registrerer hver av de forskjellige celle-målingene. Ved kombinering og sammenligning av disse parametrene, kan de forskjellige leukocyttkomponentene skjeldnes. US-patent nr. 4.727.020 tilveiebringer et eksempel på hvordan et flow-cytometer kan bli anvendt i denne metoden for å tilveiebringe leukocyttdifferensialet fra blod.
Denne tilnaermelsesmetoden er derimot bare begrenset til leukocyttdifferensialet, og bare de som blir tilveiebragt fra blod.
For å nevne som oppsummering, eksisterer det ingen enkelt standard nøyaktig instrumentering eller metodologi fortiden tilgjengelig som tillater at en enkelt blodprøve eller benmargsprøve blir analysert slik at alle de forskjellige celletypene som er tilstede i blodet og benmargen kan bli diskriminert og deretter tellet.
Foreliggende oppfinnelse omfatter som nevnt ovenfor en fremgangsmåte for simultan, multiparameteranalyse av celler i en kroppsvæske hvori væsken omfatter enten spinal, peritoneal eller hjernevæske, urin eller fullblod og kan i tillegg omfatte en vevcellesuspensjon hvori vevet omfatter benmargsoppsug, lymfeknuter, milt- eller leverceller, så som fra biopsi, og hvori parametrene omfatter minst to mål på lysspredningsevne av hver celle som blir undersøkt, og minst tre mål på fluorescensemmisjon eller aktivitet fra hver undersøkte celle. Fremgangsmåten omfatter følgende trinn: Man tar en væskeprøve fra individ, kombinerer væskeprøven med minst to farvestoffer og med minst én merket celleoverflate-markør, idet farvestoffene uavhengig vil vurdere forskjellige kjennetegn til cellene i prøven og hvori markøren gjenkjenner et antigen som blir uttrykt forskjellig i celler fra forskjellige herkomster, for å danne en merket oppløsning. Hver av farvestoffene og markørene er fluoriserende og har et toppemisjonsspektra som kan skjeldnes fra de andre. Den merkede oppløsningen blir deretter sendt gjennom et detek-sjonsinstrument hvori hver celle i oppløsningen blir vesentlig undersøkt enkeltvis og målinger på fluorescensintensitet og lysspredning blir utført for hver celle som blir undersøkt. Målingene (eller paramnetrene) som blir tatt for hver celle, kan bli lagret på data og analysesystem og rekombinert og analysert på samme tid eller senere. Ved analysering av disse parametrene kan celletypene og celle-linjene som omfatter blod og benmargsprøver bli skjeldnet og spesifisert.
Fremgangsmåten omfatter spesifikt at man tar en kropps-væskeprøve fra et individ, kombinerer væskeprøven med nukleinsyrefarvestoffet, så som et RNSA-farvestoff, et DNA-farvestoff og et merket monoklonalt antistoff (MAb), som gjenkjenner et celleoverflateantigen som blir uttrykt forskjellig i forskjellige cellelinjer, for å danne en merket oppløsning, sender den merkede oppløsningen gjennom et flow-cytometer, måler fluorescensintensiteten, OLS og FLS, og lagrer de registrerte dataene for analyse. Hver av nuklein-syref arvestoff ene og immunmarkøren er fluoreserende, er eksiterbar ved samme bølgelengde og har et toppemisjonsspektra som kan skjeldnes fra de andre.
Alle seks figurer representerer log-skala farvedotsplot inneholdende omtrent 22.000 celler fra en væskeprøve merket med nukleinsyrefarvestoffene LDS-751 og tiazol-orange og med CD45 MAb så som HLe-l(PE). Merkede celler ble analysert på et FACScan<Tm> flow-cytometer utstyrt med en enkelt argonlaser innstilt på 488 nm (Becton Dickinson Immunocytometry Systems (eller BDIS)), og målinger av OLS og FLS og fluroescence-intensitet ble utført på hver celle. Datatilegnelsen av de fem parametrene digetallisert og lagret på liste ble utført ved anvendelse av en Consort 30 computer (BDIS). Data-analyser og utskrifter ble utført ved anvendelse av Paint-A-Gate<Tm> software (BDIS). Fig. 1 omfatter flere dot plots av celler fra en normal perifer blodprøve analysert ved forskjellige kombinasjoner av de fem parametrene hvori cellene som er farvet gule, er erytrocytter, celle farvet svart er leukocytter, celler farvet røde er retikulocytter og partikler farvet mørke blå er blodplater; Fig. 2 omfatter flere dot plots bare av kjernedannede celler i blodprøve analysert i fig. 1 med LDS-751 og tiazol-orange fluorescence (fig. lb), hvori celler merket mørke blå er lymfocytter, celler merket rødt er monocytter, celler merket grønt er neutrofiler og celler merket svart er eosinofiler; Fig. 3 omfatter flere dot plots av celler fra et normalt benmargsutsug analysert ved forskjellige kombinasjoner av fire parametre hvori celletypene er farvet som i fig. 1; Fig. 4 omfatter flere dot plots av bare kjerneinneholdende celler fra benmargsprøven analysert i fig. 3 og signalutvalgt ("gated on") på LDS-751 og tiazol-orange fluorescence, idet celletypene er farvet som i fig. 2 og hvori de kjerneinneholdende erytroidcellene er farvet violett og umodne leukocytter (blast celler) er farvet lyse blå; Fig. 5 omfatter flere dot plots av perifere blodceller fra en trombocytopenisk B-CLL-pasient analysert ved forskjel-
lige kombinasjoner av de fem parametrene hvori cellene er farvet som i fig. 1; og
Fig. 6 omfatter flere dot plots av bare de kjerneinneholdende cellene fra blodprøven analysert i fig. 5 og basert på LDS-751 og tiazol-orange fluorescence hvori cellene er farvet som i fig. 4.
Foreliggende oppfinnelse omfatter som nevnt ovenfor en fremgangsmåte for simultan, multi-parameteranalyse av celler i en kroppsvæske hvori væsken omfatter enten spinal, peritoneal eller hjernefluid, urin eller fullblod og kan i tillegg omfatte en vevscellesuspensjon hvori nevnte celle-suspensjon blir preparert fra benmargsutsug, lever, milt eller lymfeknute, så som fra et biopsy, og hvori parametrene omfatter minst to mål på lyset som blir spredt i mer enn én retning av hver celle som blir undersøkt og minst tre mål på fluorescenceaktiviteten fra hver undersøkte celle. Fremgangsmåten omfatter at man tar en prøve av kroppsvæsken fra et individ, kombinerer væskeprøven med minst to farvestoffer og minst én merket celleoverflatemarkør hvori hver av farvestoffene uavhengig vil vurdere forskjellige kjennetegn til cellene i prøven, og hvori markøren gjenkjenner et antigen som blir uttrykt forskjellig hos celler fra forskjellige cellelinjer, for å danne en merket oppløsning. Hver av farvestoffene og markøren er fluorescerende og har et toppemisjonsspektra som kan skjeldnes fra de andre. Den merkede oppløsningen blir deretter sendt gjennom et detek-sjonsinstrument hvori hver celle i oppløsningen blir vesentlig undersøkt én av gangen og målingene av fluorescensintensiteten og lysspredningen blir utført for hver under-søkte celle. Målingene (eller parametrene) utført for hver celle, kan bli lagret på data og rekombinert og påny analysert på samme tid eller senere.
Foreliggende oppfinnelse tillater diskriminering og identifikasjon av celler i en væskeprøve ved analyse av minst fem parametre. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis at man utfører følgende trinn: 1) isolerer en celle inneholdende fluidprøven fra et individ hvor kroppsvæsken fortrinnsvis omfatter enten fullblod eller benmargsutsug; 2) tilsetter to fluorescence-nukleinsyrefarvestoffer til prøven for å merke DNA og RNA forskjellig i hver celle, hvori hvert farvestoff har et fluorescence-topp-emisjonsspektra forskjellig fra den andre; 3) tilsetter en fluorescencemerket celleoverflatemarkør til prøven, hvori markøren gjenkjenner et antigen som blir uttrykt forskjellig på cellene i væsken og hvori fluorescens-immunomarkøren har et topp emisjonsspektra som er forskjellig fra fluorescensfarvestoffene; og 4) analyserer cellene i prøven i et automatisert instrument som detekterer og registrerer både fluorescensen til de individuelle cellene ved, eller nære ved, topp emisjonsspektra og OLS og FLS til individuelle celler.
I den foretrukne utførelsesformen omfatter deteksjonsinstru-mentet et flowcytometer, så som et FACScan^<m> (BDIS). Flow-cytometret er fortrinnsvis utstyrt med en enkelt laser for eksitasjon av de f luroescensmerkede cellene så som en argonionlaser og er innstilt ved, eller nære, 488 nm. Fluorescensnukleinfarvestoffene og fluorescensmarkøren må derfor være eksiterbar ved 488 nm. LDSW-751 (eksiton) blir fortrinnsvis anvendt som et DNA farvestoff og tiazol-organge (BDIS) blir anvendt som et RNA farvestoff. LDS-751 har et topp emisjonsspekter ved 670 nm og tiazol-orange har et topp emisjonsspekter ved 530 nm. Andre fluorescensnukleinsyrefar-vestoffer som kan være egnet for utførelse av foreliggende oppfinnelse, omfatter de som er beskrevet i US-patent US nr. 4.544.546.
Det er innlysende for fagmannen at hvis flow-cytometret er utstyrt med mer enn én laser, kan fluorescensfarvestoffene og/eller fluroescensmarkøren bli eksitert ved forskjellige bølgelengder. I en slik utførelsesform er den eneste forutsetningen at topp emisjonsspektra for farvestoffene og immunfluorescensmarkøren alle er forskjellige. Flow-cytometret utstyrt med helium/neon og argonionelasere innstilt på 633 nm og 488 nm respektivt, omfatter FACStar Plus<Tm> (BDIS).
I den foretrukne utførelsesformen er celleoverflatemarkøren et monoklonalt antistoff som selektivt vil bli knyttet til et celleoverflateantigen som blir uttrykt forskjellig på overflaten av hematopoetiske celler. Det er ønskelig at antigenet vil bli uttrykt i forskjellig mengder på de forskjellige typene og modningstrinnene til de kjerneinneholdende cellene. Et slikt antigen er CD45. Dette antigenet har en molekylvekt på omtrent 180-220 kD, og blir uttrykt i forskjellige nivåer på alle lymfocytter, monocytter og granulocytter som er fraværende fra modne blodplater eller RBC. Monoklonale antistoffer som spesifikt reagerer med CD45 antigenet (f.eks. CD45 MAb-er) omfatter HLe-1 (også referert til som et anti-leukocytt, BDIS) og LCA (Dako Corp.) HLe-1 blir fortrinnsvis anvendt.
CD45 MAb er direkte koblet til en fluorescensmarkør så som et fluorokrom. I den direkte metoden blir MAb konjugert direkte til en fluorescensmarkør som kjent for fagmannen. US-patent nr. 4.520.110 tilveiebringer en fremgangsmåte for konjugering av en fluorescensmarkør til et MAb.
I den foretrukne utførelsesformen er fluorokromet phycobili-protein, så som phycoerytrin (PE), som kan bli eksitert ved 488 nm og har en emisjonstopp ved 575 nm. Kombinasjonen av HLe-1 og PE blir generelt referert til som HLe-l(PE).
Andre fluorokromer kan også bli anvendt i denne oppfinnelsen. Det eneste kravet er at fluorkromene eksiteres ved 488 nm, hvis en argonlaser blir anvendt, eller ved en annen bølge-lengde, hvis en dobbel laserkilde blir anvendt (f.eks. 633 nm for en He/Ne laser) og at fluorokromet har et toppemisjonsspekter som ikke overlapper med nukleinsyrefarvestoffene .
Det er forøvrig ønskelig at flowcytometeret er koblet til anordninger for å registrere og analysere datane som blir oppsamlet for hver enkelt celle. Anordning for å registrere og analysere dataene kan omfatte en personlig komputer utstyrt med hensiktsmessig software. Softwaret bør kunne analysere minst fire parametre for hver celle, diskriminere mellom eller identifisere populasjoner av like celler i et femdimensjonalt område og fremvise minst to av parametrene i to dimensjoner. I tillegg bør softwaret kunne koble én eller flere parametre og fremvise kombinasjon av de andre parametrene i to dimensjoner.
I den foretrukne utførelsesformen blir Paint-A-Gate^<111 >software (BDIS) anvendt i sammenheng med en Consort 30 data-lagre og analysesystem (BDIS). Softwaret er fullstendig beskrevet i US-serie nr. 046.619 (inngitt 7. mai 1987).
Det ovennevnte kittet for multi-parameteranalyse av cellene i en kroppsvæske omfatter en første beholder inneholdende minst to nukleinsyrefarvestof f er for å merke DNA og RNA i hver celle, hvori farvestoffene har topp emisjonsspektra som kan skjelnes fra de andre, og en annen beholder inneholdende en med fluorescensmerket celleoverflatemarkør, hvori celleoverf latemarkøren spesifikt vil reagere med et celleoverf lateantigen som blir uttrykt forskjellig på forskjellige celler i prøven. Farvestoffene er fortrinnsvis nukleinsyrefarvestoffer som merker DNA og RNA forskjellig. I den foretrukne utførelsesformen er nukleinsyrefarvestoffene eller LDS-751 og tiazol-orange og den fluoroscensmerkede celleoverf latemarkøren er HLe-(PE). Det er innlysende for fagmannen at andre nukleinsyrefarvestoffer og/eller celleoverf latemarkørkombinasj oner kan være innbefattet i kitet. Det er også å bemerke at nukleinsyrefarvestoffene og/eller celleoverflatemarkørene kan være separat innbefattet i beholdere.
EKSEMPLER
Perifert blod fra normale givere ble samlet ved punktering av venen inn i Vacutainer-rør inneholdende EDTA(k3) som antikoagulasjonsmiddel (Becton Dickinson). Blod ble også samlet fra en pasient med en B-celle kronisk lymfocytisk leukemi (B-CLL) grad trinn IV ifølge RAI. Blodcelletellinger bestemt på en automatisert blodcelleanalysator (Hl, Technicon var: RBC 3,3 x 10<9>/ml; leukocytter 81,9 x 10<6>/ml; og blodplater 35 x 10^/ml korrigert etter manuel telling til 20 x 10<6>/ml. Benmarksutsug ble tilveiebragt fra normale givere. Oppsugene ble overført til Vacutainer-rør og fortynnet 1:1 med RPMI 1640 (GIBCO).
For hver test ble 10 pl av en blodprøve eller benmargsprøve anvendt. Prøvene ble inkubert i 30 minutter med 10 pl av en LDS-751 oppløsning (0,1 mg i 5 ml PBS), 10 pl tiazol-orange-oppløsning (0,1 mg i 1 ml PBS) og 10 pl HLe-l(PE). Prøven ble fortynnet med 1 ml fosfatbuffer saltvann (PBS) før måling.
Spektral kompensasjon ble anvendt for å korrigere for PE emisjon innført i LDS-751-kanalen (5$ subtraksjon), LDS-751 innført i PE kanalen ( 11% subtraksjon), PE innført i tiazol-orange-kanalen ( 23% subtraksjon) og tiazol-orange innført i PE kanalen (0,4$ subtraksjon). Ingen kompensasjon var nødvendig mellom tiazol-orange og LDS-751-kanalene.
Flow-cytometriske målinger ble utført på et FACScan<Tm> flow-cytometer utstyrt med en enkel argonionlaser. Oppnåelse av data av de fem parametrene digitalisert og lagret på liste ble utført med FACScan<Tm> forsknings-software ved anvendelse av en Consort 30Tm computer. For hver prøve ble 22.000 celler analysert. For diskriminering innenfor de kjerneinneholdende cellene ble akvisisjonen utført ved kobling av fluorescensintensiteten til LDS-751 og tiazol-orange. Dataanalyse ble utført ved anvendelse av Paint-A-Gate^<111> software-program som tillater visualisering av multiparameterdata.
Det er å bemerke at analyse av en prøve kan bli utført i to separate prosedyrer. Først blir en splitt-prøve av kroppsvæsken tatt, idet en eller flere blir fortynnet som ovenfor og en som ikke blir fortynnet eller som blir fortynnet mindre. Deretter blir den ovenfor beskrevne fremgangsmåten fulgt ved anvendelse av en splittprøve for å identifisere og diskriminere RBC, blodplater og ritikulocytter mens man signalutveksler på "gating on" men ikke teller kjerneinneholdende celler. Fremgangsmåten blir også anvendt for identifisering og diskriminering av de kjerneinneholdende cellene ved utvelgelse på, men ikke telling av, de ikke-kjerneinneholdende cellene. Splitting av prøven og undersøk-ing av de kjerneinneholdende cellene i mindre fortynnet format muliggjør at de relativt mere skjeldne kjerneinneholdende cellene i prøven blir tellet hurtigere.
Cellesortering ble utført på en FACS 440Tm som var tilpasset til å påvise to lysspredende signaler og tre fluorescens-signaler ved anvendelse av en enkelt argonionelaser innstilt på 488 nm. Cellene ble sortert i RPMI 1640 inneholdende 10% fetalt kalveserum (FCS). De sorterte cellene ble sentrifugert i 5 minutter ved 200 g og resuspendert i 100 pl RPMI inneholdende 10% FCS. Mikroskopobjektglasspreparater ble laget ved anvendnenlse av en Shandon Cyto-sentrifuge (Southern Product Ltd., England). Glassene ble farvet med Wright-farve og undersøkt med et lysmikroskop. For retikulo-cytt-identif ikasjon ble 100 pl av en 1% ny metylen blå oppløsning satt til de resuspenderte sorterte cellene. Cellene ble overført til et objektglass, tildekket og undersøkt i et lysmikroskop.
Analyser av filene på listen med fem parametre ble utført med et computerprogram som anvendte farve for å identifisere sammenhopninger av dotter i multiple dimensjoner. Forskjellige kombinasjoner av de fem parametrene ble fremvist på én gang. Sammemnhopninger av celler identifisert ved en kombinasjon av parametre, ble malt med en farve som deretter fremkom samtidig i de andre projeksjonene av dataene.
Et stort område lysspredende signaler blir tilveiebragt fra ulyserte blodprøver som et resultat av tilstedeværelsen av små blodplater (l-4u), erytrocytter (6-8u) og større leukocytter (6-20u). For å vurdere hele området av lysspredende signaler ble de forover og ortogonale lysspredende signalene ervervet ved anvendelse av fire dekade logarit-miske forsterkere. Under disse betingelsene ble to hoved-populasjoner av celler identifisert i fullblod. Se fig. la. Ytterligere diskriminering mellom cellepopulasjonene krevde ytterligere parametere.
Tiazol-orange har en høyere affinitet eller preferanse overfor RNA sammenlignet med DNA og gjennomgår fluorescens-forsterkning ved binding. Toppemisjonen til det bundede farvestoffet oppstår ved 530 nm. Derimot har LDS-751 en høyere affinitet eller preferanse for DNA sammenlignet med RNA. Dette farvestoffet gjennomgår også fluorescensforsterk-ning ved binding, men med maksimal emisjon ved 670 nm. Til tross for at det er velkjent at blodplater ikke har kjerner, vil LDS-751 selektivt farve slike celler. Det er derfor ventet at andre farvestoffer enn LDS-751 også selektivt vil bindes til blodplater og andre kjerneinneholdende celler for å skjeldne blodplater fra ikke-kjerneinneholdende RBC.
Tiazol-orange og LDS-751 tilveiebringer i kombinasjon stor separasjon mellom erytrocytter, som både mangler RNA og DNA, og kjerneinneholdende leukocytter som har begge nuklein-syrene. I fig. lb er erytrocyttene og leukocyttene (svart, i det øvre høyere hjørnet) separert i en størrelsesorden på omtrent tre i deres fluorescens-signaler. Ingen signifikant interferens mellom disse farvestoffene ble observert for kjerneinneholdende celler.
Til tross for at tiazol-orange og LDS-751 kunne bli anvendt for å skjelne mellom erytrocytter, retikulocytter og blodplater, ble det observert en interaksjon mellom disse farvestoffene i både blodplatene og retikulocyttene. For blodplatene påvirket rekkefølgen hvorpå begge farvestoffene ble tilsatt fluorescensintensiteten. Tilsetting av LDS-751 før eller sammen med tiazol-orange hemmet farvingen av blodplatene med tiazol-orange. Blodplater ble farvet med tiazol-orange bare når farvestoffet ble tilsatt alene eller hvis det ble tilsatt etter tilsetting av LDS-751. I retikulocyttene var fluorescensintensiteten med tiazol-orange noe mindre i nærvær av LDS-751. Ved inkubering av prøvene samtidig med tiazol-orange og LDS-751, ble maksimal separasjon mellom blodplatene og retikulocyttene tilveiebragt mens god separasjon av disse populasjonene med hensyn på erytrocyttene ble opprettholdt.
Separasjonen av emisjonsspektret mellom tiazol-orange og LDS-751 tillot at bindingen av et MÅb-konjugert med PE ble vurdert samtidig. CD45 ble valgt på grunn av at antigenet som ble gjenkjent av dette antistoffet er blitt vist å oppstå i forskjellige tettheter på celler fra forskjellige cellelinjer, kombinering av immunofluorescensintensiteten med forover og ortogonal lysspredning muliggjorde en omfattende differensialanalyse av kjerneinneholdende celler som beskrevet nedenfor.
I. Differensialanalyse av normale blodceller
Perifert blod ble inkubert med LDS-751, tiazol-orange og HLe-1(PE). Blodpreparatet ble fortynnet 1:100 med PBS før måling. I lys av kompleksiteten til dataene er identifikasjon av de forskjellige blodcellepopulasjonene beskrevet separat. Identiteten til cellesubpopulasjonene ble verifisert ved mikroskopisk undersøking av de sorterte cellene. Renheten til de sorterte cellefraksjonene var høyere enn 90$ idet hovedandelen av forurensende celler var erytrozytter. Den høye. frekvensen av erytrozyttene muliggjorde at de ble avledet sammen med den signalutvalgte ("gated") cellepoplu-lasjonen som et resultat av fastsetting av terskelverdien i løpet av sortering av leukocyttpopulasjonene.
Den dominerende cellepopulasjonen i blod består av modne erytrocytter (RBC). RBC blir identifisert ved deres relativt store forover og ortogonale lysspredningssignal (fig. la, gul), mangel på fluorescence med LDS-751 og tiazol-orange (fig. lb) og fravær av anti-CD45 binding (fig. lc,d).
Retikulocyttene (rød i fig. 1) ble skjeldnet fra modne erytrocytter hovedsakelig ved deres reaktivitet med tiazol-orange (fig. lb). Retikulocyttene har en noe forsterket fluorescensintensitet med LDS-751 sammenlignet med erytrocytter. Hverken RBC eller retikulocytter uttrykker overflate-gener gjenkjent av CD45 (fig. lc,d). Retikulocyttene kunne ikke bli skjeldnet fra leukocytter og RBC basert på deres lysspredende karakteristika (fig. la).
Kjerneinneholdende røde celler, som vanligvis ikke blir funnet i perifert blod, blir diskutert senere som en del av analysen av benmarg.
Blodplater er kjennetegnet ved deres relative lave forover og ortogonale lysspredning (fig. la, blå) samt deres farving på LDS-751 (fig. 751 (fig. lb). Blodplatene ble tydelig separert fra RBC (gul), retikulocytter (rød) og leukocytter (svart)
(fig. _ lb) ved anvendelse av disse tre parametrene. Som med erytroidcellene, uttrykte blodplatene ikke antigenene
gjenkjent av CD45 (fig. lc, d). Ved anvendelse av multi-parameteranalyse kan "normale" blodplater bli kjennetegnet som partikler med relativt lav lysspredende signaler, en høy f luorescensintensitet med LDS-751 enn den til RBC, ingen reaktivitet med tiazol-orange og fravær av CD45-binding.
Leukocytter ble kjennetegnet med et relativt høyt ortogonalt og foroverlysspredningssignal (fig. la, svart). Til tross for at deres lysspredende kjennetegn var like, ble leukocyttene klart separert fra erytroidcellene (gul) ved deres høye fluorescenssignaler dannet av både LDS-751 og tiazol-orange (fig. lb). Denne resulosjonen tilveiebringer en nøyaktig fremgangsmåte for telling av hvite blodceller i tilstedevær-else av et overveldende antall RBC. En ytterligere dis-tinksjon av leukocytter fra blodplater, RBC og retikulocytter blir tilveiebragt ved deres reaktivitet med CD45 (fig. lc,
d).
For å analysere de kjerneinneholdende cellene i mere detalj,
ble signalutvelgingen ("gate") satt på tiazol-orange og LDS-751 som angitt i fig. lb. Et leukocytt-dif f erensial ble tilveiebragt ved korrelering av lysspredningsegenskapene til de kjerneinneholdende cellene med fluorescensintensiteten til CD45. See fig. 2a. Lymfocytter (blå) ble kjennetegnet ved den klareste uttrykning av CD45 antigen og de laveste ortogonale lysspredningssignalene. Monocyttene (rød) ble identifisert ved at de binder noe mindre CD45 enn lymfocytter, men utviser et høyere forover og ortogonalt lysspredningssignal. Neutrofile granulocytter (grønn) uttrykt ved CD45 antigen svakt og hadde høye lysspredende signaler. Eosinofile granulocytter (svart) bundet til samme mengde CD45 som monocytter men som kunne skjeldnes fra disse cellene ved stort ortogonalt lysspredningssignal og svakere foroverlysspredningssignal.
II. Differensialanalyse av normale benmargceller
Den f eindimensjonale analysen anvendt på blod ble også anvendt for kvantitativ karakterisering av benmarg. Oppsuget benmarg ble inkubert med LDS-751, tiazol-orange og HLe-1(PE) som anvendt for perifert blod. Akvisisjon av dataene ble utført med det samme instrumentoppsettet som ble anvendt for analyse av perifert blod. Et typisk eksperiment (som anvender det samme utstyret og farvevalget som ble anvendt for analyse av perifert blod) er vist i fig. 3. RBC (gul), retikulocytter (rød), blodplater (mørke blå) og kjerneinneholdende celler (sort) okkuperer lignende beliggenheter i femdimensjonalt rom som deres perifere blodcellemotparter (sammenlign fig. 1 og 3).
Det er interessante forskjeller mellom blod og margpopula-sjonene. Ved analyse av blodplatene ble lysspredningsregionen som er vanlig for disse cellulære partiklene farvet blå i fig. 3 som den ble ved analyse av blodprøven (fig. 1). I kontrast til perifert blod ble hovedparten av disse delene fra benmarg ikke farvet med LDS-751 (identifisert som svarte prikker projisert på gult i fig. 3b). Derfor ble disse delene ikke identifisert som normale blodplater. Cellesortering av denne populasjonen viste hovedsakelig debris, inkludert benmargspartikler og cellulære partikler som ikke er blitt identifisert.
De kjerneinneholdende benmargscellene ble identifisert ved deres høye fluorescenssignaler med LDS-751 samt tiazol-orange (fig. 3b). En utvelging ble satt på LDS-751 og tiazol-orange intensitet, som angitt i fig. 3b, for å samle mere kjerneinneholdende celleandeler. De lysspredende egenskapene og deres korrelasjon med immunofluorescenssignalene med CD45 til disse kjerneinneholdende cellene vist i fig. 4. De vanlige beliggenhetene til lymfocytter, monocytter og granulocytter som identifisert fra studiene av perifert blod ble farvet mørke blå, rød og grønn respektivt.
For tre forskjellige benmargsoppsug ble differensiale morfologiske tellinger utført på kjerneinneholdende celler sortert ved ortogonal lysspredning og CD45 uttrykking. De sorterte regionene var de som ble angitt ved de forskjellige farvene i fig. 4b. Resultatene var tilstede i tabell I som gjennomsnittlige prosentandeler av kjerneinnholdende celler funnet i de tre eksperimentene.
Farvene er referert til regionene illustrert i figur 4B. Dataene er gitt som prosentandelen av kjerneinneholdende celler. <+>n=3 "blast.
Lysmikroskopisk undersøking av de sorterte populasjonene bekreftet cellelinjeklassifikasjonen til disse cellene, men ikke alle cellene i mørke blå, rød og den grønne regionen var modne. Innenfor populasjonen som var farvet grønn, i tillegg til modne nøytrofiler, bånd ("band") og metamyelocyt-ter også funnet. Omtrent 5% av cellene farvet mørkeblå
(lymfocytter) var lymfoblaster og 20% av cellene farvet rød (monocytter var umodne monomyeloidceller).
I kontrast til perifert "blod ble to populasjoner benmargscel-ler identifisert ved lave ortogonale lysspredningssignaler og svakt uttrykt CD45 antigen, farvet violett og lyse blå respektivt i fig. 4b. Ut i fra denne figuren er det tydelig at det ikke er noen klar separasjon mellom populasjonen av celler som blir farvet lyse blå og andre farvede populasjoner. Lysmikroskopiundersøkning av populasjonen av celler som uttrykte det laveste nivået av CD45 antigen (violett), viste at den bestod eksklusivt av normoblaster og erytroblaster (tabell I). Populasjonen som uttrykte noe høye mengder CD45 antigen (lys blå) inneholdt de mest umodne cellene innbefattet monomyeloid og lymfoide forløpere og noen få erytroblaster (tabell I).
III. Differensial blodcelleanalyse av en trombocvttopenisk B- kronisk lymfocyttisk
leukemisk pasient
Anvendelsen av denne teknikken er demonstrert ved analyse av blodet fra en B-CLL-pasient. Fase IV i en RAI B-CLL pasient ble valgt på grunn av at unormale tellinger vanligvis blir funnet for alle blodcellelinjene. Den 10 til 100 ganger økningen i antallet lymfocytter gjør distinksjonen av disse cellene fra gjenværende normale leukocytter og retikulocytter mere vanskelig. De lave blodplatetellingene i disse pasient-ene gjør nummerering av blodplatene mindre pålitelige.
Blodet fra B-CLL pasienten ble inkubert med LDS-751, tiazol-orange og HLe-l(PE) som for normalt blod. Dataene ble fremstilt på samme måte som for normalt perifert blod (fig. 1) og benmarg (fig. 3): RBC ble malt gul, reticulocytter fremkom røde; blodplatene var blå og de kjerneinneholdende cellene fremkom svart (fig. 5a,b,c,d).
Frekvensen av celler som fremkom i den lysspredende regionen som er typisk for blodplatene (fig. 5a) var lav sammenlignet med normalt perifert blod (sammenlign blå flekker i fig. la, b med fig. 5a,b). Bare noen få av flekkene identifisert som blodplater med lysspredning i fig. 5a (blå) viser fluorescensintensiteten med LDS-751 som er typisk for blodplatene i fig. 5b og som kan bli betraktet som normale blodplater. Diskrimineringen av blodplatene fra retikulocytter (røde) er enda veldig god (fig. 5b).
Som en konsekvens av den store økningen i frekvensen av kjerneinneholdende celler (sort), er separasjonen av leukocytter og retikulocytter (rød) tilveiebragt med LDS-751 og tiazol-orange mindre klart. Leukocyttene kan derimot klart bli separert fra retikulocytter basert på deres ekspresjon av CD45 antigenet (fig. 5c, d).
De lysspredende egenskapene og CD45 antigenuttrykkingen til de kjerneinneholdende cellene (signalutvalgt i fig. 5b) er vist i fig. 6a, b. Hovedmengden av cellene uttrykker CD45 antigen svakt og utviser lave forover og ortogonale lysspredende signaler (lys blå) kjennetegnende for umodne lymfocytter. Bare noen få leukocytter ble påvist som normale, lymfocytter (mørke blå), granulocytter (grønn) og monocytter (rød), til tross for at separasjonen ikke var helt tydelig som et resultat av det overveldende antallet umodne lymfoide celler. Merk de få cellene (violett) som ikke uttrykte CD45 antigen og som hadde et lavt ortogonalt lysspredende signal. Se fig. 6B. Disse cellene ble identifisert som kjerneinneholdende erytroide celler som var i samsvar med den store økningen av retikulocytter i denne pasienten.
IV. Fullblod som en forurenser i benmarg
Ved fjerning av benmargsoppsug kan ofte blod bli ført inn i oppsuget som en forurensning i prøven. Hvis man dermed skulle analysere prøven uten korreksjon for forurensning med blod, ville leukocyttdifferensialene bli feilaktige.
Ved kjøring av en blodprøve som beskrevet i eksempel I ovenfor, kan prosentandelen hvite blodcelletyper i blodet bli beregnet. Når margprøven ble kjørt som beskrevet i eksempel II, kan den ventede prosentandelen hvite blodceller i blodprøven trekkes fra benmargsprøven for å tilveiebringe en mere nøyaktig avlesning uten blodforurensende stoffer (idet man antar alle de forurensede stoffene kommer fra blod).
Lymfocytter, granulocytter og monocytter omfatter derfor for eksempel 1,0, 1,0 og 0, 2% av de totale cellene i en blodprøve respektivt, idet de gjenværende 97,8$ av cellene hovedsakelig er RBC. Som et resultat av dette er det omtrent en lymfocytt og granulocytt og 0,2 monocytter pr. 100. RBC i blodprøven. De absolutte tellingene av de samme cellene i en benmargsprøve er henholdsvis 800, 490 og 165 i en 20.000 celleprøve, idet de gjenværende cellene hovedsakelig er RBC (dvs. 18,545). Som et eksempel ville antallet lymfocytter, granulocytter og monocytter som er ventet å forurense benmargsprøven, være 185 lymfocytter (dvs. 1% x 18,545), 185 granulocytter (dvs. 1% x 18.545) og 37 monocytter (dvs. 0,2$ x 18,545). De korrigerte tellingene ville derfor være 615 lymfocytter, 305 granulocytter og 128 monocytter. Ved hjelp av denne fremgangsmåten kan nøyaktigere tellinger bli tilveiebragt.

Claims (17)

1. Fremgangsmåte for multiparameteranalyse av celler i en kroppsvæske, karakterisert ved at man utfører følgende trinn: til en væskeprøve fra et individ;
1) tilsettes to fluoreserende nukleinsyrefarvestoffer til prøven for å merke DNA og RNA i hver celle forskjellig, hvori hvert farvestoff har et fluorescens-topp-emisjonsspekter som er forskjellig fra den andre;
2) tilsette en fluorescensmerket celleoverflatemarkør til prøven, hvori markøren gjenkjenner et antigen som blir uttrykt forskjellig på cellene i nevnte væskeprøve og hvori fluorescensmarkøren har et topp-emisjonsspekter forskjellig fra fluorescensfarvestoffene, og
3) analyserer cellene i prøven i et instrument som kan påvise og registrere tre kanaler fluorescens og to kanaler lysspredning for hver av cellene i prøven.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kroppsvæsken som anvendes omfatter peritoneal, spinal eller hjernefluid, urin, fullblod eller en cel-lesuspensjon av benmarg, lymfeknuter, lever eller milt.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at kroppsvæsken som anvendes er fullblod.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at kroppsvæsken som anvendes er benmarg.
5 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en av nukleinsyrefarvestoffene som anvendes er LDS-751 (2-[2-[4-(dimetylamino )fenyl]etyl)-l-etylquinolinium-iodid).
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en av nukleinsyrefarvestoffene som anvendes er tiazol-orange (l-metyl-4-( [3-metyl-2( 3H)-benzothiazol-yliden)quinolinium 4-metylbenzensulfonat).
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at celleoverf latemarkøren som anvendes er et MAb konjugert til et fluorokrom.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at MAb som anvendes er et CD45 MAb.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at CD45 MAb som anvendes er HLe-1.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at fluorokromet som anvendes er phycoerytrin.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at instrumentet som anvendes er et flow-cytometer.
12. Fremgangsmåte for fem-parameteranalyse av celler i en blodprøve ifølge krav 1, karakterisert ved at man utfører følgende trinn: til en blodprøve fra et individ;
1) tilsettes LDS-751 (2-(2-[4-(dimetylamino)fenyl]etyl)-1-etylquinoliniumiodid) og tiazol-orange (l-metyl-4-( [3-metyl-2 (3H )-benzothiazol-yliden )quinolinium 4-metylbenzensulfonat) til prøven;
2) tilsetter HLe-l(PE) til prøven;
3) sender prøven gjennom et flow-cytometer med enkel laserkilde innstilt på 488 nm og med mulighet for registrering og lagring av målingene av OLS og FLS lysspredning og LDS-751 (2-[2-[4-dimetylamino )-fenyl]etyl)-l-etylquinoliniumiodid, tiazol-orange (1-metyl-4-([3-metyl-2(3H)-benzothiazol-yliden)-quinolinium 4-metylbenzensulfonat) og PE fluorescens-emisjoner for hver celle i prøven.
13. Fremgangsmåte for fem-parameteranalyse av celler i en benmargsprøve ifølge krav 1, karakterisert ved at man utfører følgende trinn: til en benmargsprøve fra et individ,
1) tilsettes LDS-751 og tiazol-orange til prøven;
4) sender prøven gjennom et flow-cytometer med enkel laserkilde innstilt på 488 nm og med mulighet for registrering og lagring av målingene av OLS og FLS lysspredning og LDS-751, tiazol-orange og PE fluorescens-emisjoner for hver celle i prøven.
14. Fremgangsmåte for korrigering av en multi-parameteranalyse av en benmargsprøve for å justere forøkede hvite blodcellenivåer forårsaket av blodforurensning av benmargsprøven, karakterisert ved at man utfører følgende trinn:
1) utfører trinnene i fremgangsmåten i krav 1 på fullblod;
2) påviser prosentandelene av de forskjellige hvite blodcellekomponentene i blodet;
3) utfører trinnene ifølge fremgangsmåten i krav 8;
4) bestemmer de absolutte tellingene av forskjellige hvite blodcellekomponenter i benmargen, og
5) multipliserer hver av prosentandelene tilveiebragt i trinn (2) med det totale antallet celler i ben-margsprøven og subtraherer det tallet fra de respektive absolutte tellingene tilveiebragt i trinn (4).
15. Kit for multi-parameteranalyse av celler i en kropps-væskeprøve, karakterisert ved at det omfatter en første beholder inneholdende minst to nukleinsyrefarvestoffer for forskjellig merking av DNA og RNA i hver celle, og hvori hvert farvestoff har et fluorescens-topp-emisjonsspekter som er forskjellig fra den andre, og en annen beholder inneholdende minst én med fluorescens merket celleoverflatemarkør, hvori markøren gjenkjenner et antigen som blir uttrykt forskjellig på cellene i væskeprøven og hvori fluor-escensmarkøren har et toppemisjonsspekter som er forskjellig fra fluorescensfarvestoffene.
16. Kit ifølge krav 15, karakterisert ved at nukleinsyrefarvestoffene omfatter LDS-751 (2-(2-[4-(dimetylamino)fenyl]etyl)-l-etylquinoliniumiodid og tiazol-orange (l-metyl-4-([3-metyl-2(3H)-benzothia-zolyliden )quinolinium 4-metylbenzensulfonat.
17. Kit ifølge krav 15, karakterisert ved at den med fluorescensmerkede celleoverflatemarkøren omfatter HLe-1(PE).
NO892302A 1988-06-15 1989-06-05 Fremgangsmåte for analyse av cellulære komponenter i en væske og et kit for analysen NO175506C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/207,099 US5047321A (en) 1988-06-15 1988-06-15 Method for analysis of cellular components of a fluid

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO892302D0 NO892302D0 (no) 1989-06-05
NO892302L NO892302L (no) 1989-12-18
NO175506B true NO175506B (no) 1994-07-11
NO175506C NO175506C (no) 1994-10-19

Family

ID=22769201

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO892302A NO175506C (no) 1988-06-15 1989-06-05 Fremgangsmåte for analyse av cellulære komponenter i en væske og et kit for analysen

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5047321A (no)
EP (1) EP0347210B1 (no)
JP (1) JPH0726954B2 (no)
AT (1) ATE111227T1 (no)
AU (1) AU613197B2 (no)
CA (1) CA1340170C (no)
DE (1) DE68918004T2 (no)
DK (1) DK296889A (no)
ES (1) ES2063820T3 (no)
FI (1) FI94180C (no)
NO (1) NO175506C (no)

Families Citing this family (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO164622C (no) * 1988-05-11 1990-10-24 Tore Lindmo Binaer immunometrisk partikkelbasert metode for maaling av spesifikke serum-antigener ved hjelp av vaeskestroemsmikrofotometri og et ferdigpreparert maaloppsett derav.
US4963478A (en) * 1988-07-05 1990-10-16 Immucor, Inc. Article for preforming immunological assays utilizing organic dyes and method for producing and utilizing same
FR2638848B1 (fr) * 1988-11-04 1993-01-22 Chemunex Sa Procede de detection et/ou de dosage dans un milieu liquide ou semi-liquide d'au moins une substance organique, biologique ou medicamenteuse soluble, par une methode d'agglutination
FR2653447B1 (fr) * 1989-10-20 1991-12-27 Bio Merieux Procede et reactifs pour la detection de micro-organismes.
EP0448931B1 (en) * 1990-01-26 1996-04-03 Canon Kabushiki Kaisha Method for measuring a specimen by the use of fluorescence light
US5229265A (en) * 1990-03-13 1993-07-20 Litron Laboratories Process for analyzing clastogenic agents
US5401847A (en) * 1990-03-14 1995-03-28 Regents Of The University Of California DNA complexes with dyes designed for energy transfer as fluorescent markers
US5622853A (en) * 1990-05-01 1997-04-22 Becton Dickinson And Company T lymphocyte precursor
US5641629A (en) * 1990-06-11 1997-06-24 Nexstar Pharmacueticals Inc Spectroscopically detectable nucleic acid ligands
US5650275A (en) * 1990-06-11 1997-07-22 Nexstar Pharmacueticals Inc Target detection method using spectroscopically detectable nucleic acid ligands
IE76732B1 (en) * 1990-08-07 1997-11-05 Becton Dickinson Co One step test for absolute counts
DE69132843T2 (de) * 1990-12-06 2002-09-12 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben
JP2927979B2 (ja) * 1991-02-22 1999-07-28 シスメックス株式会社 フローサイトメトリーによる赤芽球の分類方法
US5776709A (en) * 1991-08-28 1998-07-07 Becton Dickinson And Company Method for preparation and analysis of leukocytes in whole blood
CA2087086A1 (en) * 1992-01-22 1993-07-23 Leon Wmm Terstappen Multidimensional cell differential analysis
DE69326731T2 (de) * 1992-09-04 2000-05-18 Becton Dickinson Co Kontroll-Teilchen für die Zellzählung und Instrumentenlinearität
DE69428552T2 (de) * 1993-01-26 2002-04-11 Becton Dickinson Co Verfahren zum Nachweis von seltenen Ereignissen
US5294799A (en) * 1993-02-01 1994-03-15 Aslund Nils R D Apparatus for quantitative imaging of multiple fluorophores
CA2156752C (en) * 1993-02-25 1999-01-05 Young Ran Kim Multipurpose reagent system for rapid lysis of whole blood samples
WO1995013540A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 Becton Dickinson And Company Method for absolute counting of rare cells
GB9326238D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Sinvent As Method of assay
DE69533660T2 (de) * 1994-04-29 2005-11-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Homogenes Verfahren zum Nachweis von Doppelstrang-Nukleinsäuren mittels fluoreszierender Farbstoffe und dafür nützliche Kits
US5631165A (en) * 1994-08-01 1997-05-20 Abbott Laboratories Method for performing automated hematology and cytometry analysis
US5891734A (en) * 1994-08-01 1999-04-06 Abbott Laboratories Method for performing automated analysis
US5656499A (en) * 1994-08-01 1997-08-12 Abbott Laboratories Method for performing automated hematology and cytometry analysis
US5879900A (en) * 1994-12-15 1999-03-09 Abbott Laboratories Method for simultaneous analysis of cell viability, nucleated red blood cells and white blood cell differentials
US5559037A (en) * 1994-12-15 1996-09-24 Abbott Laboratories Method for rapid and simultaneous analysis of nucleated red blood cells
US6329158B1 (en) * 1995-09-15 2001-12-11 Becton Dickinson And Company Use of dimly fluorescing nucleic acid dyes in the identification of nucleated cells
ATE472725T1 (de) * 1995-12-15 2010-07-15 Abbott Lab Verfahren für gleichzeitige analyse von zelllebensfähigkeit, nukleierten roten blutkörperchen und leukozytendifferential
TW438973B (en) * 1995-12-19 2001-06-07 Sysmex Corp Apparatus and method for analyzing solid components in urine
JP3308441B2 (ja) * 1995-12-19 2002-07-29 シスメックス株式会社 尿中有形成分分析装置
JP3783808B2 (ja) * 1997-05-19 2006-06-07 シスメックス株式会社 白血球分類計数用試薬
DE19756782A1 (de) * 1997-12-19 1999-06-24 Dade Behring Marburg Gmbh Nachweis und Bestimmung festphasenassoziierter Faktoren
US6911313B2 (en) * 1998-02-06 2005-06-28 Sysmex Corporation Process for discriminating and counting erythroblasts
DE19857692C1 (de) 1998-12-14 2000-08-24 Evotec Biosystems Ag Verfahren und Vorrichtung zur zellspurbasierten Zelluntersuchung
JP3817091B2 (ja) * 1999-07-02 2006-08-30 テルモ株式会社 細胞数測定装置
JP3929283B2 (ja) * 2000-11-08 2007-06-13 シスメックス株式会社 骨髄有核細胞の分類計数方法
US6403378B1 (en) * 2001-04-26 2002-06-11 Guava Technologies, Inc. Cell viability assay reagent
GB0118995D0 (en) * 2001-08-03 2001-09-26 Univ Wales Medicine Detection of mutations in nucleic acids
US20030134305A1 (en) * 2001-08-16 2003-07-17 Dertinger Stephen D. Method for the enumeration of mammalian micronucleated erythrocyte populations with a single-laser flow cytometer
ATE314650T1 (de) * 2002-05-14 2006-01-15 Univ Salamanca Multidimensionale analyse von leukozyten
JP4299597B2 (ja) * 2002-07-29 2009-07-22 シスメックス株式会社 血液分析装置及び方法
US7507548B2 (en) 2003-03-04 2009-03-24 University Of Salamanca Multidimensional detection of aberrant phenotypes in neoplastic cells to be used to monitor minimal disease levels using flow cytometry measurements
US7674598B2 (en) * 2004-05-21 2010-03-09 Beckman Coulter, Inc. Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential
US7625712B2 (en) * 2004-05-21 2009-12-01 Beckman Coulter, Inc. Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential
US7321843B2 (en) * 2005-09-30 2008-01-22 Universidad De Salamanca Method for generating new flow cytometry data files containing an infinite number of dimensions based on data estimation
US8958990B2 (en) * 2005-10-03 2015-02-17 Sysmex Corporation Sample analyzer and sample analyzing method
WO2008018905A2 (en) * 2006-01-17 2008-02-14 Cellumen, Inc. Method for predicting biological systems responses
US8114615B2 (en) 2006-05-17 2012-02-14 Cernostics, Inc. Method for automated tissue analysis
WO2008060483A2 (en) * 2006-11-10 2008-05-22 Cellumen, Inc. Protein-protein interaction biosensors and methods of use thereof
WO2009058876A1 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 Beckman Coulter, Inc. Method for a rapid antibody-based analysis of platelet populations
US8159670B2 (en) * 2007-11-05 2012-04-17 Abbott Laboratories Method and apparatus for rapidly counting and identifying biological particles in a flow stream
DE102008030515A1 (de) * 2008-06-27 2009-12-31 Christian Seliger Durchflusszytometrisches Verfahren zur Bestimmung von Gesamtleukozytenzahl und Thrombozytenzahl sowie zur Leukozytendifferenzierung in Blutproben von Vögeln
WO2010056732A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Marv Enterprises Llc Utilization of stents for the treatment of blood borne carcinomas
WO2010068812A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-17 Abqmr, Inc. Nuclear magnetic resonance apparatus, methods and associated technology
US9216386B2 (en) 2009-03-17 2015-12-22 Marv Enterprises, LLC Sequential extracorporeal treatment of bodily fluids
JP5452058B2 (ja) * 2009-03-31 2014-03-26 シスメックス株式会社 血液分析装置
EP2259065A1 (en) 2009-06-03 2010-12-08 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods, reagents and kits for flow cytometric immunophenotyping
JP2011092104A (ja) * 2009-10-30 2011-05-12 Hitachi Engineering & Services Co Ltd 微生物などの検査方法及び検査装置
SG174650A1 (en) * 2010-03-31 2011-10-28 Agency Science Tech & Res A method of monitoring parasite development in blood
US9476812B2 (en) 2010-04-21 2016-10-25 Dna Electronics, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US9428547B2 (en) 2010-04-21 2016-08-30 Dna Electronics, Inc. Compositions for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US20110262989A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Nanomr, Inc. Isolating a target analyte from a body fluid
US8841104B2 (en) 2010-04-21 2014-09-23 Nanomr, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
CA2830501C (en) 2011-03-17 2023-10-17 Cernostics, Inc. Systems and compositions for diagnosing barrett's esophagus and methods of using the same
CN103917868B (zh) * 2011-05-04 2016-08-24 雅培制药有限公司 嗜碱性粒细胞分析系统和方法
US20150027950A1 (en) * 2012-03-27 2015-01-29 Marv Enterprises, LLC Treatment for atherosclerosis
WO2013177099A1 (en) * 2012-05-21 2013-11-28 Felder Mitchell S Method for treating infectious diseases using emissive energy
US10000557B2 (en) 2012-12-19 2018-06-19 Dnae Group Holdings Limited Methods for raising antibodies
US9804069B2 (en) 2012-12-19 2017-10-31 Dnae Group Holdings Limited Methods for degrading nucleic acid
US9434940B2 (en) 2012-12-19 2016-09-06 Dna Electronics, Inc. Methods for universal target capture
US9551704B2 (en) 2012-12-19 2017-01-24 Dna Electronics, Inc. Target detection
US9599610B2 (en) 2012-12-19 2017-03-21 Dnae Group Holdings Limited Target capture system
US9995742B2 (en) 2012-12-19 2018-06-12 Dnae Group Holdings Limited Sample entry
WO2016089521A1 (en) 2014-12-04 2016-06-09 Becton, Dickinson And Company Flow cytometry cell sorting systems and methods of using the same
WO2016093970A1 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Becton, Dickinson And Company Methods for optically aligning light collection components and optically aligned light collection systems thereof
WO2016100954A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Captl Llc Flow cytometry using hydrodynamically planar flow
WO2016099538A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Captl Llc Flow cytometry using hydrodynamically planar flow
JP6937697B2 (ja) 2015-02-18 2021-09-22 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 光検出システム及びその使用方法
ES2965719T3 (es) 2015-06-17 2024-04-16 Becton Dickinson Co Unidad de tapón de dispersión de detector óptico que tiene una barra de dispersión desmontable y métodos para usar la misma
GB201601073D0 (en) * 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
AU2016339956B2 (en) 2015-10-13 2021-07-01 Omega Biosystems Incorporated Multi-modal fluorescence imaging flow cytometry system
CA3002401A1 (en) * 2015-10-23 2017-04-27 Geosyntec Consultants, Inc. Use of visibly detectable compounds as performance reference compounds in passive sampling devices
US20190086319A1 (en) 2016-03-10 2019-03-21 Becton, Dickinson And Company Methods of evaluating a cellular sample for her-2/neu expression and compositions for practicing the same
KR20180129832A (ko) 2016-03-17 2018-12-05 비디 바이오사이언시스 고효율 형광 유세포분석기를 사용하는 세포 선별
WO2017184776A1 (en) 2016-04-22 2017-10-26 Becton, Dickinson And Company High density deposition for array production
CN109477785B (zh) 2016-09-13 2022-09-27 贝克顿·迪金森公司 具有光学均衡的流式细胞仪
WO2018067210A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 Becton, Dickinson And Company Methods and systems for determining a drop delay of a flow stream in a flow cytometer
ES2950436T3 (es) 2016-12-14 2023-10-10 Becton Dickinson Co Métodos y composiciones para obtener una valoración de tuberculosis en un sujeto
WO2018148098A2 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Becton, Dickinson And Company Dried dye reagent devices and methods for making and using the same
US10585031B2 (en) 2017-02-27 2020-03-10 Becton, Dickinson And Company Light detection systems and methods for using thereof
US11346762B2 (en) 2018-01-23 2022-05-31 Becton, Dickinson And Company Systems for dynamic light detection obscuration and methods for using thereof
US10844228B2 (en) 2018-03-30 2020-11-24 Becton, Dickinson And Company Water-soluble polymeric dyes having pendant chromophores
EP3785017A4 (en) 2018-04-27 2022-01-26 Becton, Dickinson and Company COLLECTION SYSTEMS FOR STREAM CYTOMETRICALLY SORTED SAMPLES AND METHODS OF USE THEREOF
JP7416729B2 (ja) 2018-06-19 2024-01-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 検出器アレイのための可変多重化スイッチ、システム、およびその使用方法
WO2020197787A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 Becton, Dickinson And Company Spectral unmixing of fluorescence imaging using radiofrequency-multiplexed excitation data

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3826364A (en) * 1972-05-22 1974-07-30 Univ Leland Stanford Junior Particle sorting method and apparatus
US4284412A (en) * 1979-07-13 1981-08-18 Ortho Diagnostics, Inc. Method and apparatus for automated identification and enumeration of specified blood cell subclasses
US4544546A (en) * 1980-04-21 1985-10-01 Abbott Laboratories Fluorescent nucleic acid stains
US4520110A (en) * 1981-10-06 1985-05-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing a phycobiliprotein labeled ligand or receptor
CA1254134A (en) * 1984-03-28 1989-05-16 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Specific binding flow cytometry method
US4661913A (en) * 1984-09-11 1987-04-28 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for the detection and classification of articles using flow cytometry techniques
US4727020A (en) * 1985-02-25 1988-02-23 Becton, Dickinson And Company Method for analysis of subpopulations of blood cells
ZA867698B (en) * 1985-10-11 1987-07-29 Smithkline Beckman Corp Methods and reagents for performing subset analysis
CA1279008C (en) * 1985-10-11 1991-01-15 Smith Kline & French Canada Ltd. Methods and reagents for performing subset analysis
US4883867A (en) * 1985-11-01 1989-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes, RNA or DNA
US5016283A (en) * 1985-11-04 1991-05-14 Cell Analysis Systems, Inc. Methods and apparatus for immunoploidy analysis

Also Published As

Publication number Publication date
NO892302D0 (no) 1989-06-05
NO175506C (no) 1994-10-19
JPH0273157A (ja) 1990-03-13
CA1340170C (en) 1998-12-08
FI892926A (fi) 1989-12-16
AU3596189A (en) 1989-12-21
DK296889D0 (da) 1989-06-15
AU613197B2 (en) 1991-07-25
FI94180B (fi) 1995-04-13
NO892302L (no) 1989-12-18
FI94180C (fi) 1995-07-25
DE68918004D1 (de) 1994-10-13
EP0347210B1 (en) 1994-09-07
JPH0726954B2 (ja) 1995-03-29
DE68918004T2 (de) 1995-01-05
ATE111227T1 (de) 1994-09-15
ES2063820T3 (es) 1995-01-16
DK296889A (da) 1989-12-16
EP0347210A2 (en) 1989-12-20
EP0347210A3 (en) 1990-10-17
US5047321A (en) 1991-09-10
FI892926A0 (fi) 1989-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO175506B (no) Fremgangsmåte for analyse av cellulære komponenter i en væske og et kit for analysen
EP1747460B1 (en) Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential
US7674598B2 (en) Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential
EP0552707B1 (en) Multidimensional cell differential analysis
Terstappen et al. Five‐dimensional flow cytometry as a new approach for blood and bone marrow differentials
EP1250585B1 (en) Method and apparatus for analyzing cells in a whole blood sample
CA2207396C (en) Method for rapid and simultaneous analysis of nucleated red blood cells
EP0347039B1 (en) Method for discriminating between intact and damaged cells in a sample
US5296378A (en) Method for classifying leukocytes by flow cytometry
US8008029B2 (en) Method and device for characterizing cellular components of a biological fluid
US5776709A (en) Method for preparation and analysis of leukocytes in whole blood
Drach et al. Simultaneous flow cytometric analysis of surface markers and nuclear Ki‐67 antigen in leukemia and lymphoma
JP4087560B2 (ja) 赤芽球の識別方法
EP0586183B1 (en) Control particles for cell counting and instrument linearity
EP0559208B1 (en) Method for preparation and analysis of leukocytes in whole blood utilizing flow cytometry
Yuan et al. DRAQ5‐based DNA content analysis of hematolymphoid cell subpopulations discriminated by surface antigens and light scatter properties
EP0866960B1 (en) Method for simultaneous analysis of cell viability, nucleated red blood cells and white blood cell differential
CA1309327C (en) Reagent and method for classifying leukocytes by flow cytometry
Ronot et al. Assessment of cell viability in mammalian cell lines
WO1997021994A9 (en) Method for simultaneous analysis of cell viability, nucleated red blood cells and white blood cell differential
Villamor et al. Interference of blood leucocytes in the measurements of immature red cells (reticulocytes) by two different (semi‐) automated flow‐cytometry technologies
Nguyen et al. Hematopathology
Nguyen et al. FCM immunophenotyping and DNA analysis: practical aspects that can affect data analysis and interpretation
Nguyen et al. FCM immunophenotyping and DNA analysis: Practical aspects that can affect data analysis and interpretation
Stewart Multiparameter flow cytometry for clinical applications