JP6937697B2 - 光検出システム及びその使用方法 - Google Patents

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Description

フローサイトメトリーは、血液サンプルの細胞又は任意の種類の生物学的若しくは化学的サンプルにおいて対象となる粒子など、生物学的材料を特徴付け分類するために用いられる技術である。その技術は、分布を記録するか又は生物学的材料を物理的に分類するために用いられてもよい。
フローサイトメータは、典型的には、流体サンプルを収容するためのサンプル貯蔵部、及びシース流体を含むシース貯蔵部を備える。フローサイトメータは、流体サンプルにおける粒子（細胞を含む）を細胞ストリームとしてフローセルに搬送し、一方でまたシース流体をフローセルに導く。フローセル内において、ほぼ均一な速度を細胞ストリームに与えるために、細胞ストリームのまわりに流体シースが形成される。フローセルは、光（例えばレーザ光）がサンプル上に向けられる検査ポイントを通過させるようにストリーム内の細胞を流体力学的に集中させる。
フローストリームの成分が、検査ポイントにおいて光を通過するときに、フローストリームの成分からの光が、（検出ゾーンにおいて）放射されて散乱される。この光は、例えば光レンズアセンブリを用いて集束されて結像され、且つ検出器に伝達される。形態又は蛍光標識など、材料における変化は、１つ又は複数の光検出器上に光を集束することによって特徴付けを可能にする観察光の変化を引き起こす。
フローサイトメータプラットホームにおける多くの光検出システムは、蛍光及び側方散乱（ＳＳＣ）波長光の両方の集束のために、対物レンズアセンブリ及び多重モード光ファイバ光コンベア（対物レンズの結像集束光を１つ又は複数の検出器に伝達する）の組み合わせを用いる。ほとんどのプラットホームにおいて、光ファイバの集光コアの直径は、対物レンズアセンブリによって生成される画像よりかなり大きく、背景光（又はノイズ）の検出につながる。ＳＳＣ波長光の測定に関して、このノイズは、サンプルにおけるサブ細胞サイズの粒子（例えば、サブマイクロメートルサイズの粒子）の検出を妨害する可能性がある。しかしながら、部分的には、多数の相異なる光波長を対物レンズで結像することで観察される色収差のために、１つの集束された光波長（例えばＳＳＣ波長）用のノイズに取り組むために、光ファイバ光コンベアの集光コアのサイズを縮小することは、別の光波長（例えば蛍光波長）における画像信号の低減に帰着する。
サンプルによって放射された光を集束し検出するように構成された光検出システムが提供される。システムの態様は、集束光のコア領域からの選択的側方散乱（ＳＳＣ）波長光の選択的検出を可能にするように構成されたコア領域のＳＳＣ集束モジュールを備える。光検出システムにおけるコア領域の選択的ＳＳＣ集束モジュールを備えることは、サブマイクロメートルサイズの粒子を含むサンプル成分の改善された検出に応じる。
ある態様において、本開示は、フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された集光システムと、対物レンズの結像集束光を少なくとも２つの光波長に分離するように構成された光分散モジュールと、少なくとも２つの光波長の第１の光波長を検出するように構成された第１の検出器及び少なくとも２つの光波長の第２の光波長を検出するように構成された第２の検出器であって、第１の波長がＳＳＣ波長光である第１及び第２の検出器と、集光システムと光分散モジュールとの間に配置されたアパーチャであって、コア領域の外側にある対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光が、第１の検出器に達することを選択的にブロックするように構成された光マスクを含むアパーチャとを備える光検出システムを提供する。ある実施形態において、アパーチャは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる直径を有する。ある実施形態において、光マスクは、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光の通過をブロックしない。ある実施形態において、非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子から放射される光である。ある実施形態において、光検出システムは、アパーチャと光分散モジュールとの間に配置された光ファイバ光コンベアを更に備え、光ファイバ光コンベアは、アパーチャを通過した対物レンズの結像集束光を光分散モジュールに伝達するように構成されている。ある実施形態において、検出器は、フォトダイオードに基づいた光検出器又は光電子増倍管（ＰＭＴ）を含む。ある実施形態において、光ファイバ光コンベアは、コア領域より大きい直径を有するコアを含む。
ある態様において、本開示は、フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された集光システムと、対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光を受光するように構成された検出器と、対物レンズの結像集束光の少なくとも第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタであって、第１の光路が、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含み、且つ第１の光路が検出器に伝達される光フィルタと、コア領域の外側にある、第１の光路におけるＳＳＣ波長光が通過して検出器に達することをブロックするように構成されたアパーチャとを備える光検出システムを提供する。ある実施形態において、第１の光路は、集束ＳＳＣ波長光の５０％〜９９％を含む。ある実施形態において、光検出システムは、対物レンズの結像集束光の第２の光路を少なくとも２つの光波長に分離するように構成された光分散モジュールと、少なくとも２つの光波長の第１の光波長を検出するように構成された第２の検出器及び少なくとも２つの光波長の第２の光波長を検出するように構成された第３の検出器とを更に備える。ある実施形態において、アパーチャは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる直径を有する。ある実施形態において、第２の光路は、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光を含む。ある実施形態において、非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子から放射される光である。ある実施形態において、光検出システムは、アパーチャと検出器との間に配置された光ファイバ光コンベアを更に備え、光ファイバ光コンベアは、アパーチャを通過した対物レンズの結像集束光を検出器に伝達するように構成されている。ある実施形態において、光ファイバ光コンベアは、コア領域より大きい直径を有するコアを含む。ある実施形態において、アパーチャは、光ファイバ光コンベアに直接装着される。ある実施形態において、アパーチャは、検出器に直接装着される。ある実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を反射するように構成されている。ある実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を通過させるように構成されている。
ある態様において、本開示は、フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された集光システムと、対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光を受光するように構成された検出器と、対物レンズの結像集束光の少なくとも第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタであって、第１の光路が、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含み、且つ第１の光路が検出器に伝達される光フィルタと、ＳＳＣ波長光のコア領域からの第１の光路におけるＳＳＣ波長光を検出器に選択的に伝達するように構成された光ファイバ光コンベアとを備える光検出システムを提供する。ある実施形態において、第１の光路は、集束ＳＳＣ波長光の５０％〜９９％を含む。ある実施形態において、光検出システムは、対物レンズの結像集束光の第２の光路を少なくとも２つの光波長に分離するように構成された光分散モジュールと、少なくとも２つの光波長の第１の光波長を検出するように構成された第２の検出器及び少なくとも２つの光波長の第２の光波長を検出するように構成された第３の検出器とを更に備える。ある実施形態において、光ファイバ光コンベアの光伝達コアは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる断面直径を有する。ある実施形態において、第２の光路は、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光を含む。ある実施形態において、非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子から放射される光である。ある実施形態において、検出器は、フォトダイオードに基づいた光検出器又は光電子増倍管（ＰＭＴ）を含む。ある実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を反射するように構成されている。ある実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を通過させるように構成されている。
ある態様において、本開示は、光源と、検出ゾーンを含むフローセルと、上記（及び本明細書の他のところ）で説明されるような光検出システムとを含むフローサイトメータを提供する。
ある態様において、本開示は、フローストリームを分析する方法であって、フローストリームを光源で照射することと、照射されたフローストリームの検出ゾーンから集束される対物レンズの結像光を生成することと、アパーチャを通して光分散モジュールまで対物レンズの結像集束光を通過させることであって、（ｉ）アパーチャが、コア領域の外側にある側方散乱（ＳＳＣ）波長光が通過することを選択的にブロックする光マスクを含み、（ｉｉ）光分散モジュールが、対物レンズの結像集束光を少なくとも第１及び第２の光波長に分離するように構成され、第１の光波長がＳＳＣ波長光であることと、フローストリームを分析するために、第１及び第２の光波長を検出することとを含む方法を提供する。ある実施形態において、アパーチャは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる直径を有する。ある実施形態において、アパーチャは、コア領域と一致するために２００μｍ〜４００μｍにわたる直径を有する。ある実施形態において、光マスクは、少なくとも１つの非ＳＳＣ光波長の通過をブロックしない。ある実施形態において、非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子から放射される光である。ある実施形態において、方法は、光ファイバ光コンベアによってアパーチャを通過される対物レンズの結像光を光分散モジュールに伝達することを更に含む。
ある態様において、本開示は、フローストリームを分析する方法であって、フローストリームを分析するために、フローストリームを光源で照射することと、照射されたフローストリームの検出ゾーンから集束される対物レンズの結像光を生成することと、対物レンズの結像集束光の少なくとも第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタ上に対物レンズの結像集束光を導くことであって、第１の光路が、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含むことと、第１の光路におけるＳＳＣ波長光のコア領域を検出器に選択的に伝達するように構成された光ファイバ光コンベアを通して集束ＳＳＣ波長光の第１の光路を伝達することとを含む方法を提供する。ある実施形態において、光ファイバ光コンベアの光伝達コアは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる断面直径を有する。ある実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を反射するように構成される。ある実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を通過させるように構成される。ある実施形態において、第１の光路は、集束ＳＳＣ波長光の５０％〜９９％を含む。ある実施形態において、集束ＳＳＣ波長光の第２の光路にあるＳＳＣ波長光は、第２の検出器によって検出される。ある実施形態において、検出器は、フォトダイオードに基づいた光検出器又は光電子増倍管（ＰＭＴ）を含む。ある実施形態において、第２の光路は、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光を含み、方法は、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光を検出することを更に含む。ある実施形態において、非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子から放射される光である。
ある態様において、本開示は、フローストリームを分析する方法であって、フローストリームを分析するために、フローストリームを光源で照射することと、照射されたフローストリームの検出ゾーンから集束される対物レンズの結像光を生成することと、対物レンズの結像集束光の少なくとも第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタ上に対物レンズの結像集束光を導くことであって、第１の光路が、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含むことと、アパーチャを通して検出器まで集束ＳＳＣ波長光の第１の光路を通過させることであって、アパーチャが、コア領域の外側にある側方散乱（ＳＳＣ）波長光の通過をブロックすることとを含む方法を提供する。ある実施形態において、アパーチャは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる直径を有する。ある実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を反射するように構成される。ある実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を通過させるように構成される。ある実施形態において、第１の光路は、集束ＳＳＣ波長光の５０％〜９９％を含む。ある実施形態において、集束ＳＳＣ波長光の第２の光路にあるＳＳＣ波長光は、第２の検出器によって検出される。ある実施形態において、検出器は、フォトダイオードに基づいた光検出器又は光電子増倍管（ＰＭＴ）を含む。ある実施形態において、第２の光路は、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光を含み、方法は、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光を検出することを更に含む。ある実施形態において、非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子から放射される光である。ある実施形態において、方法は、光ファイバ光コンベアによってアパーチャを通過した第１の光路を検出器に伝達することを更に含む。ある実施形態において、アパーチャは、光ファイバ光コンベアに直接装着される。ある実施形態において、アパーチャは、検出器に直接装着される。
本開示の追加の態様及び実施形態は、以下で明らかにされる。
本開示の態様は、添付の図面と関連して読んだ場合に以下の詳細な説明から最もよく理解され得る。図面には以下の図が含まれる。
次の要素、即ち、検出ゾーン１０を備えたフローセル、対物レンズアセンブリ１１、光ファイバ光コンベア１２、光分散モジュール１３、第１の蛍光波長光検出器１４、第２の蛍光波長光検出器１５、及びＳＳＣ波長光検出器１６を含む光検出システムの例を示す。光路は、点線矢印によって表される。 左のパネルは、光伝達要素の表面（又は光検出器の表面）のサイズ２２より小さい対物レンズの集束光のコア画像サイズ２０を示す。右のパネルは、コア画像に近いサイズ２４であるように構成され、それによって非コア光が検出されることを防ぐ光受光面を有する光コンベア（又は検出器）を示す。 光検出システムに対する色収差の影響を示す。レンズ３２によって集束された３つの相異なる光波長（ラインペア２４、２６及び２８）用の光路及び焦点距離／焦点である。焦点距離は、同じ番号を付けられたラインが交差する場所（時に焦点と呼ばれる）である。色収差によって、波長２４の非コア領域の光の通過をブロックするアパーチャ３０（アパーチャの開口部は、３４によって示されている）が、集光システムと検出器（図示せず）との間に配置された場合に、それは、他の波長（例えば、ライン２６及び２８）における光の大部分をブロックし、それは、例えば追加の検出器／光コンベアを用いる他の波長の検出に否定的な影響を及ぼす。 本明細書で詳述されるようなアパーチャを有する際の本開示の実施形態の概略図を示す。要素１０〜１６の呼称は、図１Ａにおけるものと同様である。この実施形態において、集束結像光（点線矢印は光路を示す）は、コア領域の外側にあるＳＳＣ波長光が（光ファイバ光コンベア１２及び光分散モジュール１３を通して）ＳＳＣ検出器１６に達することを選択的にブロックする光マスクを有するアパーチャ１７を通して導かれる。光マスクは、蛍光検出器１４及び１５によって検出される蛍光光波長をブロックしない。 集束撮像光の第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタを含む本開示の実施形態の概略図を示す。集束撮像光（点線矢印は光路を示す）は、第１の光路を形成するために、ＳＳＣ波長光の少なくとも一部を反射し、一方で第２の光路を形成するために、他の光波長が通過できるようにするように構成された光フィルタ１８に導かれる（第１及び第２の光路は、点線ボックスによって示されている）。第１の光路（この場合には、光フィルタ１８からの反射された光路）は、コア領域の外側にあるＳＳＣ波長光が（光ファイバ光コンベア１２ｂを通して）ＳＳＣ検出器１６ｂに達することをブロックするアパーチャ１９を通して導かれる。この実施形態において、アパーチャ１９は、追加の光波長が第２の光路において検出されるので、全ての光をブロックできることに留意されたい。更に、第１の光路に方向転換されなかったＳＳＣ波長光は、（図１Ａ及び２Ａにおけるような）第２の光路において別個のＳＳＣ波長検出器１６によって検出される。この構成は、本明細書で詳述するように二重ＳＳＣ波長検出を可能にする。 ＳＳＣ波長光の第１の光路が検出器１６ｂに直接送られるという点（即ち、図２Ｂの光コンベア要素１２ｂは、この実施形態において除去される）を除いて、図２Ｂに示されている実施形態に似た追加の実施形態の概略図を示す。 光フィルタからの第１の光路における光検出の３つの構成の代表的な例を示す。要素５０は、集束ＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含む第１の入射光路を表す。左のパネルにおいて、第１の光路（即ちＳＳＣ波長光の一部）は、コア領域の外側にある第１の光路が通過して検出器に達することをブロックするアパーチャ要素１９を通して導かれる。第１の光路が通過するアパーチャ要素の部分４０は、コア領域の直径である。第１の光路のコア領域４２（即ち４０を通過する光）は、直接検出される（図示せず）又は光コンベア１２ｂによって伝達され、この場合に、光ファイバ光コンベアは、コア領域より大きい直径を有するコア４４（即ち光伝達面）を有する。中央のパネルにおいて、アパーチャ要素１９は、光コンベアに直接配置（直接装着）されている（又は検出器（図示せず）に直接装着されている）。かかる実施形態において、光コンベア／検出器は、アパーチャの背後に直接配置されていると言うことができる。右のパネルにおいて、光コンベア１２ｂは、そのコア４４が、第１の光路のコア領域のサイズであるように、従ってアパーチャ要素が必要とされないように構成されている。幾つかの実施形態において、検出器は、コア領域のサイズである光検出領域を有し、従って、アパーチャは、必要とされない（図示せず）。
サンプルによって放射された光を集束及び検出するように構成された光検出システムが提供される。システムの態様は、集束光のコア領域からの選択的側方散乱（ＳＳＣ）波長光の選択的検出を可能にするように構成されたコア領域のＳＳＣ集束モジュールを備える。光検出システムにおけるコア領域の選択的ＳＳＣ集束モジュールは、サブマイクロメートルサイズの粒子を含むサンプル成分の改善された検出に応じる。
本発明をより詳細に説明する前に、本発明が、説明される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして変化可能であることを理解されたい。本発明の範囲が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で用いられる用語が、特定の実施形態だけを説明するためにあり、且つ限定的であるようには意図されていないこともまた理解されたい。
値域が与えられる場合に、その範囲の上限及び下限と、その表示範囲における任意の他の表示値又は介在値との間で、文脈が明白に別段の指示をしていない限り、下限の単位の１０分の１まで、各介在値が、本発明内に包含されると理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、より小さな範囲に独立して含まれてもよく、且つまた表示範囲における任意の特に除外された境界に従って、本発明内に包含される。表示範囲が、境界の１つ又は両方を含む場合に、これらの含まれる範囲のどちらか又は両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
別段の定義がされない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野の当業者よって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で説明される方法及び材料と類似の又は等価などんな方法及び材料もまた、本発明の実施又は試験において用いることができるが、代表的な実例的方法及び材料が、今説明される。
本明細書で列挙される全ての出版物及び特許は、あたかも各個別の出版物又は特許が、参照によって援用されるように具体的に個々に示されているかのように参照によって本明細書に援用され、且つ列挙される出版物が関連する方法及び／又は材料を開示し説明するために、参照によって本明細書で援用される。どんな出版物の引用も、出願日に先立つその開示に対してであり、本発明が先行発明によるかかる出版に先行する資格がないという承認として解釈されるべきでない。更に、提供される発行日は、独立して確認される必要があり得る実際の発行日とは異なる可能性がある。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明白に別段の指示をしていない限り、複数の指示物を含むことが注目される。特許請求の範囲が、どんな任意選択の要素も排除するように起草され得ることが、更に注目される。かかるものとして、この明細書は、クレーム要素の列挙に関連する「もっぱら（ｓｏｌｅｌｙ）」、「だけ（ｏｎｌｙ）」等のようなかかる排他的な用語の使用又は「否定的な」制限の使用のための先行的根拠として働くように意図されている。
この開示を読めば当業者に明らかになるように、本明細書で説明され図示される個別実施形態のそれぞれは、本発明の範囲又は趣旨から逸脱せずに、他の幾つかの実施形態のいずれかにおける特徴から容易に分離されるか又はそれらの特徴と組み合わされ得る別個のコンポーネント及び特徴を有する。どんな列挙される方法も、列挙されたイベントの順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行することができる。
光検出システム
上記で要約したように、サンプルによって放射された光を集束及び検出するように構成された光検出システムが提供される。システムの態様は、コア領域の選択的側方散乱（ＳＳＣ）集束モジュールを含む。本明細書で説明されるようなコア領域のＳＳＣ集束モジュールは、集束光のコア領域からのＳＳＣ波長光の選択的検出を可能にするように構成されている。幾つかの実施形態において、コア領域の選択的ＳＳＣ集束モジュールを光検出システムに包含することは、サブマイクロメートルサイズの粒子を含むサンプル成分の改善された検出に応じる。
本明細書で説明されるようなコア領域のＳＳＣ集束モジュールを含む光検出システムは、現在利用可能なシステムと比較して、ＳＳＣ検出において信号対雑音比を改善することに用途を見出す。これは、例えば、サブ細胞サイズの粒子、例えばサブマイクロメートルサイズの範囲にある粒子の検出における改善を可能にする。ある実施形態において、光検出システムは、二重ＳＳＣ検出に応じるように構成され、それは、細胞及びサブ細胞サイズの粒子の両方の同時検出及び分析を可能にする。ここで、かかる実施形態の例が、以下でより詳細に説明される。
図１Ａは、検出ゾーン１０を有するフローセルと、検出ゾーンから結像集束光を生成するための対物レンズアセンブリ１１と、光分散モジュール１３及び１つ又は複数の検出器（図１Ａにおいて１４、１５及び１６として示されている）に集束光を伝達する光コンベア１２とを備える一般的な光検出システムの概略図を提供する。光路は、点線矢印によって表される。この図において、検出器１４及び１５は、（２つの相異なる波長用の）蛍光波長検出器を表し、検出器１６は、ＳＳＣ波長光の検出器を表す。
光検出システムにおいて、対物レンズの集束光の画像サイズ（図１Ｂ、２０を参照）は、集束光を検出器に伝達するシステムの光伝達要素の表面のサイズ（図１Ｂ、２２）、例えば光ファイバ光コンベアのコアよりかなり小さくなり得る。（検出器の活性表面に光を伝播する適切な光ファイバプロトコルは、限定するわけではないが、米国特許第６，８０９，８０４号明細書に記載されているフローサイトメータ光ファイバプロトコルなどのフローサイトメータ光ファイバプロトコルを含み、その米国特許の開示は、参照によって本明細書で援用される。）例えば、ある光検出システムは、光ファイバ光コンベアのコア直径が、約８００マイクロメートルであるのに対して、直径（「コア領域」とも呼ばれる）約２００マイクロメートルの画像を生成する集光システムを含む。サイズにおけるこの差は、かなりの量の集束された背景ＳＳＣ波長光が検出器に伝達されることを可能にし、それによって、信号対雑音比を低減する。従って、光検出システムにおける非コア領域結像ＳＳＣ波長光の検出の除去又は低減は、検出効率に影響せずに、光ノイズをかなり低減する（図１Ｂ、２４で表される）。
以下で詳述するように、コア領域の選択的ＳＳＣ集束モジュールは、コア領域の外側にあるＳＳＣ光の通過を選択的にブロックする光マスクを有する１つ又は複数のアパーチャと、１つ又は複数の光フィルタと、１つ又は複数の光伝達要素と、１つ又は複数の検出器と、それらの任意の組み合わせとから選択された、対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光のコア領域の選択的検出を単独で又は組み合わせで可能にする１つ又は複数の要素を含む。代表的な実施形態が、以下で提示される。
ある実施形態において、フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された集光システムと、対物レンズの結像集束光を受光するように構成された検出器と、集光システムと検出器との間に配置されたアパーチャであって、コア領域の外側にある対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光が検出器に達することをブロックするように構成された光マスクを含むアパーチャと、を含む光検出システムが提供される。換言すれば、アパーチャは、対物レンズの結像集束光のコア領域と一致するサイズ（光マスクによって画定される）を有する。
開示される光検出システムの集光システムは、任意の便利な方法で構成されてもよい。ある態様において、集光システムは、コリメートレンズ、集束レンズ、拡大鏡、縮小レンズ又は他のレンズの１つ又は組み合わせを含み得る１つ又は複数の対物レンズであって、フローセルの検出ゾーンから光を受光し、且つシステムにおける１つ又は複数の検出器に伝達される結像光を生成するように構成される１つ又は複数の対物レンズを備える。フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された任意の便利な集光システムを用いることができる。使用され得る集光システムの例は、米国特許第３，９６０，４４９号明細書、同第４，３４７，９３５号明細書、同第４，６６７，８３０号明細書、同第５，２４５，３１８号明細書、同第５，４６４，５８１号明細書、同第５，４８３，４６９号明細書、同第５，６０２，０３９号明細書、同第５，６４３，７９６号明細書、同第５，７００，６９２号明細書、同第６，３７２，５０６号明細書、及び同第６，８０９，８０４号明細書に開示されている集光システムを含み、これらの米国特許の開示は、参照によって本明細書で援用される。
ある実施形態において、対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光のコア領域は、７０μｍ〜４５０μｍ、７０μｍ〜４００μｍ、１００μｍ〜４００μｍ、２００μｍ〜４００μｍ等を含む５０μｍ〜５００μｍにわたる直径を有する。かかるものとして、ある実施形態において、コア領域は、約５００μｍ、約４７５μｍ、約４５０μｍ、約４２５μｍ、約４００μｍ、約３７５μｍ、約３５０μｍ、約３２５μｍ、約３００μｍ、約２７５μｍ、約２５０μｍ、約２２５μｍ、約２００μｍ、約１７５μｍ、約１５０μｍ、約１２５μｍ、約１００μｍ、約７５μｍ、約５０μｍ、又は中間の何れかにおける直径を有する。
ある実施形態において、光検出システムは、ＳＳＣ波長光以外の波長光を集束し検出するように構成される。当該技術分野において周知のように、例えば対物レンズアセンブリを備えた集光システムによって集束され結像された光の相異なる波長の焦点距離は、互いに異なる場合が多い。この現象は、色収差と呼ばれ、図１Ｃにおいて図式化される。この図は、レンズ３２によって集束された光の３つの相異なる波長用の光路及び焦点距離／焦点を示す（ライン２４、２６及び２８のペアによって表される光の波長を伴う。焦点距離は、同様に番号を付けられたラインの交点であり、時には焦点と呼ばれる）。色収差によって、波長２４の非コア領域の光の通過をブロックするアパーチャ３０（アパーチャにおける開口部は、３４で示されている）が、集光システムと検出器（図示せず）との間に配置された場合に、それは、他の波長（ライン２６及び２８）における光の大部分をブロックし、それは、例えば追加の検出器／光コンベアを用いる他の波長の検出に否定的な影響を及ぼす。
従って、ある実施形態において、アパーチャの光マスクは、コア領域の外側にある対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光が検出器に達することを選択的にブロックする。「選択的にブロックする」ことによって、光マスクが、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０の、少なくとも１５の、少なくとも２０の、少なくとも３０の、少なくとも４０の、少なくとも５０の、又はより多くの光波長を含む少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光の通過をブロックしない。ある実施形態において、アパーチャの光マスクは、ＳＳＣ波長光の通過だけをブロックする。従って、ある実施形態において、アパーチャの光マスク要素は、光（又は帯域通過）フィルタに似た方法で機能するが、光（又は帯域通過）フィルタは、種々様々な光検出用途に用いられる（以下で更に詳細に説明される）。
ある実施形態において、非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子、例えば細胞又はサブ細胞粒子から放射される光である。光は、粒子自体から、且つ／又は発光特性を有する粒子上の若しくは粒子における成分、例えば蛍光分子から放射され得る。かかる実施形態は、蛍光タグ付き抗体に結合される、且つ／又は蛍光蛋白質に関連付けられるかそれを表す細胞又は粒子を含む。この点に関して限定は意図されていない。
ある実施形態において、光検出システムは、１つ又は複数の検出器に伝達される前に対物レンズの結像集束光を処理する分散（又は分離）モジュールを更に含む。光分散／分離モジュールは、多色光をその成分波長に分離する装置を指す（かかるものとして、これらのモジュールは、時に「波長分離器」と呼ばれる）。ある実施形態によれば、波長分離は、多色光の特定の波長もしくは波長領域を選択的に通過させるか又はブロックすることを含んでもよい。対象の光分散装置は、限定するわけではないが、数ある波長分離装置の中で、着色ガラス、帯域通過フィルタ、干渉フィルタ、ダイクロイックミラー、回折格子、モノクロメータ、及びそれらの組み合わせを含む。ある例において、光分散モジュールは、３ｎｍ〜９５ｎｍ、５ｎｍ〜９５ｎｍ、１０ｎｍ〜９０ｎｍ、１２ｎｍ〜８５ｎｍ、１５ｎｍ〜８０ｎｍなど２ｎｍ〜１００ｎｍにわたる最小帯域幅を有する１つ又は複数の帯域通過フィルタを含み、且つ２０ｎｍ〜５０ｎｍにわたる最小帯域幅を有する帯域通過フィルタを含む。
ある実施形態において、光検出システムは、アパーチャと検出器との間に配置された光コンベアを更に備え、光コンベアは、アパーチャを通過した対物レンズの結像集束光を検出器に伝達するように構成されている。幾つかの実施形態において、光コンベアは、光ファイバ光コンベアである。ある実施形態において、光コンベアは、光分散モジュールと検出器との間に配置されている。更に、多数の光コンベアが、光検出システムに存在し、各光コンベアが、対応する（相異なる）検出器に関連付けられてもよい。例えば、本明細書で説明されるような光検出システムは、光分散モジュールによって処理（又は分離）される光の各相異なる波長を検出するように構成された光コンベア及び検出器を有することができる。光コンベアが、光ファイバである実施形態において、光ファイバのコアの直径（光ファイバの光伝達部分である）は、アパーチャを通過する集束ＳＳＣ光のコア領域の直径より大きい。従って、アパーチャは、コア領域の外側にあるＳＳＣ波長光が、光コンベアによって検出器に伝達されることを防ぐように機能し、そのようにしてＳＳＣ波長集束光における光ノイズを低減する。
結像集束光を検出するための任意の便利な検出器が、本明細書で説明される光検出システムにおいて用いられてもよい。対象の検出器は、限定するわけではないが、数ある光検出器の中で、能動画素センサ（ＡＰＳ）、アバランシェフォトダイオード、画像センサ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、強化型電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、発光ダイオード、光子計数器、ボロメータ、焦電検出器、フォトレジスタ、光電池、フォトダイオード、光電子増倍管（ＰＭＴ）、フォトトランジスタ、量子ドット光伝導体又はフォトダイオード、及びそれらの組み合わせなどの光センサ又は光検出器を含んでもよい。ある実施形態において、集束光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）、半導体電荷結合素子（ＣＣＤ）、能動画素センサ（ＡＰＳ）、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）画像センサ、又はＮ型金属酸化膜半導体（ＮＭＯＳ）画像センサで測定される。
幾つかの実施形態において、結像センサは、ＣＣＤカメラである。例えば、カメラは、電子倍増ＣＣＤ（ＥＭＣＣＤ）カメラ又は強化型ＣＣＤ（ＩＣＣＤ）カメラであってもよい。他の実施形態において、結像センサは、ＣＭＯＳ型カメラである。集束光が、ＣＣＤで測定される場合に、ＣＣＤの活性検出表面積は、０．０１ｃｍ2 〜１０ｃｍ2 、０．０５ｃｍ2〜９ｃｍ2 、０．１ｃｍ2 〜８ｃｍ2 、０．５ｃｍ2 〜７ｃｍ2 、及び１ｃｍ2 〜５ｃｍ2 などで変化してもよい。
主題のシステムにおける光検出器の数は、希望どおり変化してもよい。例えば、主題のシステムは、２つ以上の光検出器、３つ以上の光検出器、４つ以上の光検出器、５つ以上の光検出器、及び１０以上の光検出器など、１つ以上の光検出器を備えてもよい。ある実施形態において、システムは、１つの光検出器を備える。他の実施形態において、システムは、２つの光検出器を備える。
主題のシステムが、１つを超える光検出器を備える場合に、各光検出器は、同じであってもよく、又は２つ以上の光検出器の集合は、相異なるタイプの光検出器の組み合わせであってもよい。例えば、主題のシステムが、２つの光検出器を備える場合に、幾つかの実施形態において、第１の光検出器は、ＣＣＤ型装置であり、第２の光検出器（又は結像センサ）は、ＣＭＯＳ型装置である。他の実施形態において、第１及び第２の光検出器の両方とも、ＣＣＤ型装置である。更に他の実施形態において、第１及び第２の光検出器の両方とも、ＣＭＯＳ型装置である。更に他の実施形態において、第１の光検出器は、ＣＣＤ型装置であり、第２の光検出器は、光電子増倍管（ＰＭＴ）である。更に他の実施形態において、第１の光検出器は、ＣＭＯＳ型装置であり、第２の光検出器は、光電子増倍管である。更に他の実施形態において、第１及び第２の光検出器の両方とも、光電子増倍管である。
本開示の実施形態において、対象の検出器は、２つ以上の波長、５つ以上の相異なる波長、１０以上の相異なる波長、２５以上の相異なる波長、５０以上の相異なる波長、１００以上の相異なる波長、２００以上の相異なる波長、３００以上の相異なる波長などの１つ又は複数の波長における集束光、及び４００以上の相異なる波長で、フローストリームにおけるサンプルによって放射された測定光を測定するように構成されている。幾つかの実施形態において、本明細書で説明されるような光検出システムにおける２つ以上の検出器は、集束光の同じ波長又は重複する波長を測定するように構成されている（以下で更に説明される）。
幾つかの実施形態において、対象の検出器は、一連の波長（例えば２００ｎｍ〜１０００ｎｍ）にわたる集束光を測定するように構成されている。ある実施形態において、対象の検出器は、一連の波長にわたる光スペクトルを集束するように構成されている。例えば、システムは、２００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長領域の１つ又は複数にわたる光スペクトルを集束するように構成された１つ又は複数の検出器を含んでもよい。更に他の実施形態において、対象の検出器は、１つ又は複数の特定波長で、フローストリームにおけるサンプルによって放射された光を測定するように構成されている。例えば、システムは、４５０ｎｍ、５１８ｎｍ、５１９ｎｍ、５６１ｎｍ、５７８ｎｍ、６０５ｎｍ、６０７ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６６０ｎｍ、６６７ｎｍ、６７０ｎｍ、６６８ｎｍ、６９５ｎｍ、７１０ｎｍ、７２３ｎｍ、７８０ｎｍ、７８５ｎｍ、６４７ｎｍ、６１７ｎｍ、及びそれらの任意の組み合わせの１つ又は複数で光を測定するように構成された１つ又は複数の検出器を含んでもよい。ある実施形態において、１つ又は複数の検出器は、蛍光測定においてサンプルと共に用いられるフルオロフォアなど、特定のフルオロフォアとペアにされるように構成されていてもよい。
実施形態において、検出器は、連続的に又は離散間隔で光を測定するように構成されている。幾つかの例において、対象の検出器は、集束光の測定を連続的に行うように構成されている。他の例において対象の検出器は、０．００１ミリ秒ごとに、０．０１ミリ秒ごとに、０．１ミリ秒ごとに、１ミリ秒ごとに、１０ミリ秒ごとに、１００ミリ秒ごとに、及び１０００ミリ秒ごとに、又はある他の間隔で光を測定するなど、離散間隔で測定を行うように構成されている。
本開示の追加の態様は、フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された集光システムと、対物レンズの結像集束光を受光するように構成された検出器と、対物レンズの結像集束光の少なくとも第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタであって、第１の光路が、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含み、且つ例えば光コンベアを介して検出器に伝達される光フィルタとを備える光検出システムに向けられる。
開示される光検出システムに用途を見出す集光システム及び検出器の例は、上記で提示されたので、ここでは反復されない。
ある実施形態において、光フィルタが、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を反射するように構成されているのに対して、他の実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を通過させるように構成されている。
図２Ａは、本明細書で詳述されるようなアパーチャを有する際の本開示の実施形態の概略図を提示する（要素１０〜１６の名称が、図１Ａにおける通りであることに留意されたい）。この図において、集束結像光（点線矢印は光路を示す）は、コア領域の外側にあるＳＳＣ波長光が、（光ファイバ光コンベア１２及び光分散モジュール１３を通って）ＳＳＣ検出器１６に達することを選択的にブロックする光マスクを有するアパーチャ１７を通して導かれる。光マスクは、蛍光検出器１４及び１５によって検出される光の蛍光波長をブロックしない。従って、アパーチャ１７は、検出器１４及び１５によって検出される光の波長に影響を及ぼさない一方で、ＳＳＣ波長光におけるノイズを低減する働きをする。ある実施形態において、１つの追加の光波長だけが、ＳＳＣ波長以外に検出され、従って単一の追加の検出器だけが用いられる（即ち検出器１４又は検出器１５であり、両方ではない）。
図２Ｂは、光フィルタが、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも少なくとも一部を検出器に反射するように構成される本開示の実施形態の概略図を提示する。この図において、集束結像光は、第１の光路を形成するためにＳＳＣ波長光の少なくとも一部を反射するように構成される一方で、第２の光路を形成するために他の光波長が通過できるようにする光フィルタ１８に導かれる。ある実施形態において、第１の光路に反射されないＳＳＣ波長光の部分は、第２の光路の一部として光フィルタ１８を通過する。次に、第１の光路は、コア領域の外側にあるＳＳＣ波長光が、（光ファイバ光コンベア１２ｂを通って）ＳＳＣ検出器１６ｂに達することをブロックするアパーチャ１９を通して導かれる。この実施形態において、アパーチャ１９は、追加の光波長が第２の光路において検出されるので、全ての光をブロックできることに留意されたい。更に、第１の光路に方向転換されなかったＳＳＣ波長光は、（図１Ａ及び図２Ａにおけるように）第２の光路において別個のＳＳＣ波長検出器１６によって検出される。この構成は、本明細書で詳述するように二重ＳＳＣ波長検出を可能にする。
光フィルタが、第１の光路を形成するために、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の一部を（反射するのではなく）通過させるように構成される実施形態がまた考えられることがここで注目される。従って、ある実施形態において、集束結像光は、集束光の第１の光路を形成するために、ＳＳＣ波長光の少なくとも一部を通過させる一方で、第２の光路を形成するために他の光波長を反射するように構成される光フィルタに導かれる。ある実施形態において、光フィルタを通過しないＳＳＣ波長光の部分（即ち第１の光路の部分）は、第２の光路の部分として光フィルタによって反射される。次に、第１の光路は、図２Ｂにおいて第１の光路用に説明されているような検出器に導かれる。
図２Ｃは、ＳＳＣ波長光の第１の光路が、検出器１６ｂに直接送られるという点を除いて、図２Ｂに示されている実施形態に似た追加の実施形態の概略図を示す（即ち、図２Ｂの光コンベア要素１２ｂは、この実施形態においては削除される）。
図３は、光フィルタからの第１の光路における光検出の３つの構成の代表的な例を示す。要素５０は、集束ＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含む第１の入射光路を表す。左のパネルにおいて、第１の光路（即ちＳＳＣ波長光の一部）は、コア領域の外側にある第１の光路が通過して検出器に達することをブロックするアパーチャ要素１９を通して導かれる。第１の光路が通路するアパーチャ要素の部分４０は、コア領域の直径である。第１の光路のコア領域４２（即ち４０を通過する光）は、直接検出されるか（図示せず）又は光コンベア１２ｂによって伝達される。この場合に、光ファイバ光コンベアは、コア領域より大きい直径を有するコア４４（即ち光伝達面）を有する。中央のパネルにおいて、アパーチャ要素１９は、光コンベアに直接配置（直接装着）されている（又は検出器（図示せず）に直接装着されている）。かかる実施形態において、光コンベア／検出器は、アパーチャの背後に直接配置されていると言うことができる。右のパネルにおいて、光コンベア１２ｂは、そのコア４４が、第１の光路のコア領域のサイズであるように、従ってアパーチャ要素が必要とされないように構成されている。幾つかの実施形態において、検出器は、コア領域のサイズである光検出領域を有し、従ってアパーチャは、必要とされない（図示せず）。
ある実施形態において、第１の光路は、５５％〜９８％、６０％〜９６％、７０％〜９４％、８０％〜９２％、８５％〜９０％、及びそれらの間の任意の範囲を含む、対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光の５０％〜９９％を含む。従って、ある実施形態において、第１の光路は、対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、及び少なくとも約９９％を含む。
上記で注目したように、光フィルタは、第１の光路が、光フィルタによって反射された光によって生成されるように構成することができるか、又は第１の光路が、光フィルタを通過する光によって生成されるように構成することができる。
ある実施形態において、光検出システムは、対物レンズの結像集束光の第２の光路にあるＳＳＣ波長光を受光するように構成された第２の検出器を含む。これらの実施形態の幾つかにおいて、光検出システムは、第２の検出器が、コア及び非コア領域のＳＳＣ波長光の両方を検出するように構成されている。かかる実施形態において、光検出システムは、第１の検出器を用いてサブ細胞粒子（第１の光路におけるコア領域のＳＳＣ波長光）を、且つ第２の検出器を用いて、より大きな粒子（例えば細胞）を検出することができる。これらの実施形態の幾つかにおいて、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光のより多くの部分が、第２の光路と比較して、第１の光路に存在する。例えば、その場合に、第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９９％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約１％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９８％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約２％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９７％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約３％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９６％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約４％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９５％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約５％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９０％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約１０％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約８０％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約２０％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約７０％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約３０％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約６０％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約４０％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約５１％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約４９％を含む。（光フィルタの使用からのどんな光損失も、上記の数字において除外されることに留意されたい）。
ある実施形態において、光フィルタは、第２の光路が、集束光の少なくとも１つの非ＳＳＣ波長を含むように構成されている。例えば、第２の光路は、フローストリームにおける粒子、例えばサブ細胞粒子又は細胞から放射される非ＳＳＣ波長光を含むことができる。非ＳＳＣ光波長及びそれらの検出の例は、上記で提示されたので、ここでは反復されない。
本開示の態様は、サンプルによって放射された光を測定するためのシステムであって、光源と、検出ゾーンを有するフローセルと、本開示の光検出システムとを備えるシステムを提供する。上記で詳述したように、本開示の光検出システムは、本開示のコア領域の選択的側方散乱（ＳＳＣ）集束モジュールを含むことができる。コア領域のＳＳＣ集束モジュールは、集束光のコア領域からのＳＳＣ波長光の選択的検出を可能にするように構成されている。上記で説明されたコア領域のＳＳＣ集束モジュールの任意の構成を用いることができる。
ある態様において、サンプルによって放射された光を測定するためのシステムの光検出システムは、対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光のコア領域の選択的検出を単独で又は組み合わせで可能にする１つ又は複数の要素を有するコア領域の選択的ＳＳＣ集束モジュールを含む。かかる要素は、コア領域の外側にあるＳＳＣ光の通過を選択的にブロックする光マスクを有する１つ又は複数のアパーチャと、１つ又は複数の光フィルタと、１つ又は複数の光伝達要素と、１つ又は複数の検出器と、それらの任意の組み合わせとから選択することができる。
従って、ある実施形態において、サンプルによって放射された光を測定するためのシステムであって、光源と、検出ゾーンを有するフローセルと、フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された集光システムと、対物レンズの結像集束光を受光するように構成された検出器と、集光システムと検出器との間に配置されたアパーチャであって、コア領域の外側にある対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光が検出器に達することをブロックするように構成された光マスクを含むアパーチャとを備えるシステムが提供される。従って、アパーチャは、対物レンズの結像集束光のコア領域に一致するサイズ（光マスクによって画定される）を有する。ある実施形態において、サンプルによって放射された光を測定するためのシステムは、ＳＳＣ波長光以外の光の波長を集束して検出するように構成されている。従って、幾つかの実施形態において、アパーチャの光マスクは、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光の通過をブロックしない。かかる実施形態は、上記で詳細に説明されたので、ここでは反復されない。
本開示の追加の態様は、サンプルによって放射された光を測定するためのシステムであって、光源と、検出ゾーンを有するフローセルと、フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された集光システムと、対物レンズの結像集束光を受光するように構成された検出器と、対物レンズの結像集束光の少なくとも第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタであって、第１の光路が、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含み、且つ例えば光コンベアを介して検出器に伝達される光フィルタとを備えるシステムに向けられる。
ある実施形態において、光フィルタが、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を反射するように構成されているのに対して、他の実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を通過させるように構成されている。かかる実施形態は、上記で詳細に説明されたので、ここでは反復されない。
実施形態において、サンプルによって放射された光を測定するためのシステムの光源は、任意の適切な広帯域又は狭帯域光源であってもよい。サンプルにおける成分（例えば細胞、ビード、非細胞粒子等）に依存して、光源は、２５０ｎｍ〜１２５０ｎｍなど、３００ｎｍ〜１０００ｎｍなど、３５０ｎｍ〜９００ｎｍなど、及び４００ｎｍ〜８００ｎｍなど、２００ｎｍ〜１５００ｎｍにわたって変化する光波長を放射するように構成されてもよい。例えば、光源は、２００ｎｍ〜９００ｎｍの波長を有する光を放射する広帯域光源を含んでもよい。他の例において、光源は、２００ｎｍ〜９００ｎｍにわたる波長を放射する狭帯域光源を含む。例えば、光源は、２００ｎｍ〜９００ｎｍにわたる波長を有する光を放射する狭帯域ＬＥＤ（１ｎｍ〜２５ｎｍ）であってもよい。幾つかの実施形態において、光源は、連続波レーザなどのレーザである。例えば、レーザは、ヘリウムネオン（ＨｅＮｅ）レーザであってもよい。ある実施形態において、光源は、フローサイトメータにおけるレーザである。
他の実施形態において、光源は、限定するわけではないが、ハロゲンランプと、重水素アークランプと、キセノンアークランプと、連続スペクトルを備えた広帯域ＬＥＤ、スーパールミネッセンス発光ダイオード、半導体発光ダイオード、ワイドスペクトルＬＥＤ白色光源、一体型マルチＬＥＤなどの発光ダイオードとを有するランプなどの非レーザ光源である。幾つかの例において、非レーザ光源は、数ある光源の中で、安定したファイバ結合広帯域光源、白色光源、又はそれらのその任意の組み合わせである。
光源は、フローストリームから０．００１ｍｍ以上、０．００５ｍｍ以上、０．０１ｍｍ以上、０．０５ｍｍ以上、０．１ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上、１ｍｍ以上、５ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、２５ｍｍ以上、及び１００ｍｍ以上など、サンプル（例えばフローサイトメータにおけるフローストリーム）から任意の適切な距離に配置されてもよい。加えて、光源は、１０°〜９０°など、１５°〜８５°など、２０°〜８０°など、２５°〜７５°など、及び３０°〜６０°などの任意の適切な角度（例えば、フローストリームの垂直軸に対して）、例えば９０°でサンプルを照射する。
光源は、連続的に又は離散間隔でサンプルを照射するように構成されてもよい。幾つかの例において、システムは、フローサイトメータにおける検査ポイントで連続的にフローストリームを照射する連続波レーザを有するなど、サンプルを連続的に照射するように構成される光源を備える。他の例において、対象のシステムは、０．００１ミリ秒ごと、０．０１ミリ秒ごと、０．１ミリ秒ごと、１ミリ秒ごと、１０ミリ秒ごと、１００ミリ秒ごと、及び１０００ミリ秒ごと、又はある他の間隔など、離散間隔でサンプルを照射するように構成される光源を含む。光源が、離散間隔でサンプルを照射するように構成される場合に、システムは、光源を用いたサンプルの間欠照射に応じるために、１つ又は複数の追加コンポーネントを備えてもよい。例えば、これらの実施形態において主題のシステムは、光源に対してサンプルをブロックするか又はさらすために１つ又は複数のレーザビームチョッパー、手動又はコンピュータ制御ビームストップを備えてもよい。
ある実施形態において、主題のシステムは、フローストリームにおけるサンプルによって放射された光を検出するためのフローセルノズル及び光学サブシステムを使用するフローサイトメータシステムを備える。サンプルを分析するための適切なフローサイトメータシステム及び方法は、限定するわけではないが、Ｏｒｍｅｒｏｄ（ｅｄ．），Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｎｏ．９１，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（１９５５）；Ｖｉｒｇｏ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊａｎ：４９（ｐｔ１）：１７−２８；Ｌｉｎｄｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍ Ｈｅｍｏｓｔ．２００４ Ｏｃｔ；３０（５）：５０２−１１；Ａｌｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２０１０ Ｄｅｃ；２２２（４）：３３５−３４４；ａｎｄ Ｈｅｒｂｉｇ，ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２４（３）：２０３−２５５；に説明されるフローサイトメータシステム及び方法を含み、これらの文献の開示は、参照によって本明細書に援用される。ある例において、対象のフローサイトメトリーシステムは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）フローサイトメータ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（登録商標），ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳｏｒｔ（登録商標），ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣｏｕｎｔ（登録商標），ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標），及びＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）システム、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｆｌｕｘ（登録商標）セルソータ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｚｚ（登録商標）セルソータ、及びＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｒｉａ（登録商標）セルソータ等を含む。
ある実施形態において、主題のシステムは、米国特許第３，９６０，４４９号明細書、同第４，３４７，９３５号明細書、同第４，６６７，８３０号明細書、同第４，７０４，８９１号明細書、同第４，７７０，９９２号明細書、同第５，０３０，００２号明細書、同第５，０４０，８９０号明細書、同第５，０４７，３２１号明細書、同第５，２４５，３１８号明細書、同第５，３１７，１６２号明細書、同第５，４６４，５８１号明細書、同第５，４８３，４６９号明細書、同第５，６０２，０３９号明細書、同第５，６２０，８４２号明細書、同第５，６２７、０４０号明細書、同第５，６４３，７９６号明細書、同第５，７００，６９２号明細書、同第６，３７２，５０６号明細書、同第６，８０９，８０４号明細書、同第６，８１３，０１７号明細書、同第６，８２１，７４０号明細書、同第７，１２９，５０５号明細書、同第７，２０１，８７５号明細書、同第７，５４４，３２６号明細書、同第８，１４０，３００号明細書、同第８，２３３，１４６号明細書、同第８，７５３，５７３号明細書、同第８，９７５，５９５号明細書、同第９，０９２，０３４号明細書、同第９，０９５，４９４、及び同第９，０９７，６４０号明細書で説明されるフローサイトメータの１つ又は複数のコンポーネントを組み込むフローサイトメータシステムであり、これらの米国特許の開示は、参照によって本明細書で援用される。
サンプルによって放射された光を測定するための方法
本開示の態様は、サンプルから放射された光を測定するための方法を含む。ある実施形態において、サンプルによって放射された光は、本明細書で説明されるようなコア領域のＳＳＣ集束モジュールを有する光検出システムを用いて集束され測定される。
ある実施形態において、フローストリームを分析する方法であって、フローストリームを光源で照射することと、照射されたフローストリームの検出ゾーンから集束される対物レンズの結像集束光を生成することと、対物レンズの結像集束光をコア領域のＳＳＣ集束モジュールを通して検出器へ通過させることであって、コア領域のＳＳＣ集束モジュールが、コア領域の外側にある側方散乱（ＳＳＣ）波長光が検出器に達することを選択的にブロックし、それによって、フローストリームを分析することとを含む方法が提供される。
分析されるサンプルは、ユーザに対象となる任意のサンプルとすることができる。ある実施形態において、サンプルは、生物学的成分を含むか、又は生物学的サンプルである。「生物学的サンプル」と言う用語は、生物全体、例えば原核細胞、真核細胞、植物、菌類、又はある場合に血液、粘液、リンパ液、関節液、脳脊髄液、唾液、気管支肺胞洗浄、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液及び精液において見つかり得る動物組織のサブセット、細胞又は構成成分に由来するか又はそれらを含むサンプルを指すために、従来的な意味で用いられる。かかるものとして、「生物学的サンプル」は、本来の生物又はその組織のサブセットと同様に、限定するわけではないが、例えば血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚片、呼吸器、消化管、心臓血管、尿生殖路、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、臓器を含む、生物から又はその組織のサブセットから調製されたホモジネートと、分離、浄化又は強化された生物学的粒子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、サブ細胞器官等）と、溶解物又は抽出物とを指す。生物学的サンプルは、健康な組織及び病変組織（例えば、癌性、悪性、壊死等）の両方を含む任意のタイプの生体組織であってもよい。ある実施形態において、生物学的サンプルは、血液又はその派生物、例えば血漿、涙、尿、精液などの液体サンプルであり、幾つかの例において、サンプルは、静脈穿刺又は指穿刺から取得された血液など、全血を含む血液サンプルである（ここで血液は、防腐剤、抗凝血剤など、分析に先立って任意の試薬と組み合わされるか又は組み合わされなくてもよい）。
ある実施形態において、サンプルの起源は、「哺乳動物」又は「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食動物目（例えばイヌ及びネコ）、げっ歯目（例えばマウス、モルモット及びラット）並びに霊長目（例えばヒト、チンパンジー及びサル）を含む哺乳綱内の生物を説明するために広く用いられる。幾つかの例において、主題は、ヒトである。方法は、両性の、且つあらゆる成長段階（即ち新生児、幼児、年少者、青年又は成人）におけるヒト被験者から得られたサンプルに適用されてもよく、ある実施形態において、ヒト被験者は、年少者、青年又は成人である。本開示の実施形態は、ヒト被験者からのサンプルに適用されてもよいが、方法が、限定するわけではないが、トリ、マウス、ネズミ、イヌ、ネコ、家畜及びウマなどの他の被験動物（即ち「非ヒト被験者」）からのサンプルに対して実行されてもよいことを理解されたい。
ある実施形態に従って方法を実行する際に、サンプル（例えばフローサイトメータのフローストリームにおける）は、光源からの光で照射される。任意の便利な光源が、用いられてもよい。例えば、幾つかの実施形態において、サンプルは、広帯域光源で照射され、広帯域光源は、例えば、５０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、２５０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、及び５００ｎｍ以上にわたるなど、広範囲の波長を有する光を放射する。他の実施形態において、方法は、例えば、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２５ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、５ｎｍ以下、２ｎｍ以下の範囲のような狭い範囲の光を放射する光源で且つ特定の光波長（即ち単色光）を放射する光源を含むなど、特定の波長又は狭い範囲の波長を狭帯域光源で放射することを含む。方法が、狭帯域光源で照射することを含む場合に、対象の狭帯域光源プロトコルは、限定するわけではないが、狭波長ＬＥＤ、１つ又は複数の光帯域通過フィルタに結合されたレーザダイオード若しくは広帯域光源、回折格子、モノクロメータ、又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ある実施形態において、方法は、１つ又は複数のレーザでサンプルを照射することを含み、レーザのタイプ及び数は、集束される所望の光と同様にサンプルに依存して変化する。かかるものとして、レーザ（単数又は複数）は、１つ又は複数のガスレーザ、１つ又は複数の色素レーザ、１つ又は複数のエキシマレーザ、１つ又は複数の金属蒸気レーザ、１つ又は複数の固体レーザ、及びそれらの組み合わせから選択することができる。
サンプルは、２つ以上の光源、３つ以上の光源、４つ以上の光源、５つ以上の光源、及び１０以上の光源など、上記で言及した光源の１つ又は複数で照射されてもよい。光源は、光源タイプの任意の組み合わせを含んでもよい。例えば、幾つかの実施形態において、方法は、１つ又は複数のガスレーザ、１つ又は複数の色素レーザ、及び１つ又は複数の固体レーザを有するアレイなどのレーザアレイで、フローストリームにおけるサンプルを照射することを含む。
サンプルは、２５０ｎｍ〜１２５０ｎｍなど、３００ｎｍ〜１０００ｎｍなど、３５０ｎｍ〜９００ｎｍなど、及び４００ｎｍ〜８００ｎｍなど、２００ｎｍ〜１５００ｎｍにわたる波長で照射されてもよい。例えば、光源が、広帯域光源である場合に、サンプルは、２００ｎｍ〜９００ｎｍの波長で照射されてもよい。他の例において、光源が、複数の狭帯域光源を含む場合に、サンプルは、２００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲における特定の波長で照射されてもよい。例えば、光源は、複数の狭帯域ＬＥＤ（１ｎｍ〜２５ｎｍ）であって、それぞれが、２００ｎｍ〜９００ｎｍの一連の波長を有する光を独立して放射する複数の狭帯域ＬＥＤであってもよい。他の実施形態において、狭帯域光源は、１つ又は複数のレーザ（レーザアレイなど）を含み、サンプルは、上記で説明したように、ガスレーザ、エキシマレーザ、色素レーザ、金属蒸気レーザ、及び固体レーザを有するレーザアレイなどを用いて、２００ｎｍ〜７００ｎｍにわたる特定の波長で照射される。
１つを超える光源が用いられる場合に、サンプルは、同時に若しくは連続して、又はそれらの組み合わせで、光源によって照射されてもよい。例えば、サンプルは、両方の光源で同時に照射されてもよい。他の実施形態において、フローストリームは、両方の光源で連続して照射される。２つの光源が、連続して照射する場合に、各光源がサンプルを照射する時間は、０．０１マイクロ秒以上、０．１マイクロ秒以上、１マイクロ秒以上、５マイクロ秒以上、１０マイクロ秒以上、３０マイクロ秒以上、及び６０マイクロ秒以上など、他と関係なく０．００１マイクロ秒以上であってもよい。例えば、方法は、０．０１マイクロ秒〜７５マイクロ秒、０．１マイクロ秒〜５０マイクロ秒、１マイクロ秒〜２５マイクロ秒、及び５マイクロ秒〜１０マイクロ秒など、０．００１マイクロ秒〜１００マイクロ秒にわたる期間の間、光源（例えばレーザ）でサンプルを照射することを含んでもよい。サンプルが、２つ以上の光源で連続して照射される実施形態において、サンプルが各光源によって照射される時間は、同じか又は異なってもよい。
サンプルは、連続的に又は離散間隔で照射されてもよい。幾つかの例において、方法は、サンプルを光源で連続的に照射することを含む。他の例において、サンプルは、０．００１ミリ秒ごと、０．０１ミリ秒ごと、０．１ミリ秒ごと、１ミリ秒ごと、１０ミリ秒ごと、１００ミリ秒、及び１０００ミリ秒ごと又はある他の間隔で照射するなど、離散間隔で光源によって照射される。
光源に依存して、サンプルは、０．０１ｍｍ以上など、０．０５ｍｍ以上など、０．１ｍｍ以上など、０．５ｍｍ以上など、１ｍｍ以上など、２．５ｍｍ以上など、５ｍｍ以上など、１０ｍｍ以上など、１５ｍｍ以上など、２５ｍｍ以上など、及び５０ｍｍ以上など、変化する距離から照射されてもよい。同様に角度又は照射もまた、１５°〜８５°など、２０°〜８０°など、２５°〜７５°など、及び３０°〜６０°の１０°〜９０°にわたって、例えば９０°の角度に変化してもよい。
ある実施形態において、照射されたサンプルによって放射された光は、集光システム、例えば対物レンズアセンブリによって処理され、且つ上記で説明したようなコア領域のＳＳＣ集束モジュールを有する光検出システムによって測定される。
従って、ある実施形態において、方法は、照射されたサンプルから（例えば照射されたフローストリームの検出ゾーンから）放射された光を集束すること、及びそこから対物レンズの結像光を生成することを含む。ある態様において、対物レンズの結像光を生成することは、１つ又は複数の対物レンズに集束光を通過させることを含み、１つ又は複数の対物レンズは、コリメートレンズ、集束レンズ、拡大鏡、縮小レンズ、又は（例えばフローセルの検出ゾーンから）集束光を受光するように、且つ結像光を生成するように構成された他のレンズの１つ又は組み合わせを有してもよい。
ある実施形態において、方法は、アパーチャを通して検出器へ対物レンズの結像集束光を通過させることを含み、アパーチャは、コア領域の外側にあるＳＳＣ波長光が検出器の達することをブロックする光マスクを有する。（開示される方法のこの態様は、コア領域の外側にあるＳＳＣ波長光が、検出器に達することをブロックすると説明することができる。）上記のように、ある実施形態において、対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光のコア領域は、７０μｍ〜４５０μｍ、７０μｍ〜４００μｍ、１００μｍ〜４００μｍ、２００μｍ〜４００μｍ等を含む、５０μｍ〜５００μｍにわたる直径を有する。かかるものとして、ある実施形態において、コア領域は、約５００μｍ、約４７５μｍ、約４５０μｍ、約４２５μｍ、約４００μｍ、約３７５μｍ、約３５０μｍ、約３２５μｍ、約３００μｍ、約２７５μｍ、約２５０μｍ、約２２５μｍ、約２００μｍ、約１７５μｍ、約１５０μｍ、約１２５μｍ、約１００μｍ、約７５μｍ、約５０μｍ、又は中間の何れかの直径を有する。
ある実施形態において、アパーチャの光マスクは、コア領域の外側にある対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光が検出器に達することを選択的にブロックする。「選択的にブロックする」ことによって、光マスクが、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０の、少なくとも１５の、少なくとも２０の、少なくとも３０の、少なくとも４０の、少なくとも５０の又はより多くの光波長を含む、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光の通過をブロックしないことが意味される。ある実施形態において、アパーチャの光マスクは、ＳＳＣ波長光の通過だけをブロックする。従って、ある実施形態において、アパーチャの光マスク要素は、光フィルタ（又は帯域通過フィルタ）に似た方法で機能し、光フィルタ（又は帯域通過フィルタ）は、種々様々な光検出用途において用いられる。
ある実施形態において、方法は、１つ又は複数の追加の検出器（例えば第２の検出器、第３の検出器等）によって、アパーチャの光マスクを通過する１つ又は複数の非ＳＳＣ光波長を検出することを含む。ある実施形態において、１つ又は複数の非ＳＳＣ光波長は、フローストリームにおける粒子、例えば細胞、サブ細胞粒子から放射される光である。光は、粒子自体から、且つ／又は発光特性を有する粒子上の又は粒子における構成物質、例えば蛍光分子から放射されてもよい。かかる実施形態は、蛍光タグ付き抗体に結合される、且つ／又は蛍光蛋白質に関連付けられるかそれを表す細胞又は粒子を含む。この点に関して限定は意図されていない。
ある実施形態において、方法は、１つ又は複数の検出器に伝達される前に光を処理する光分散（又は分離）モジュールに、対物レンズの結像集束光を通過させることを更に含む。光分散／分離モジュールは、多色光をその成分波長に分離する装置を指す（かかるものとして、これらのモジュールは、時に「波長分離器」と呼ばれる）。ある実施形態によれば、波長分離は、多色光の特定の波長又は波長領域を選択的に通過させるか又はブロックすることを含んでもよい。対象の光分散装置は、限定するわけではないが、数ある波長分離装置の中で、着色ガラス、帯域通過フィルタ、干渉フィルタ、ダイクロイックミラー、回折格子、モノクロメータ、及びそれらの組み合わせを有する。ある例において、光分散モジュールは、３ｎｍ〜９５ｎｍなど、５ｎｍ〜９５ｎｍなど、１０ｎｍ〜９０ｎｍなど、１２ｎｍ〜８５ｎｍなど、１５ｎｍ〜８０ｎｍなど、及び２０ｎｍ〜５０ｎｍにわたる最小帯域幅を持つ帯域通過フィルタを有する、２ｎｍ〜１００ｎｍにわたる最小帯域幅を持つ１つ又は複数の帯域通過フィルタを有する。
上記で詳述した態様に加えて、開示される方法のある実施形態は、対物レンズの結像集束光の少なくとも第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタに対物レンズの結像集束光を導くことを含む。実施形態において、光フィルタは、上記のようにＳＳＣ波長光を選択的にブロックする光マスクを有するアパーチャの代わりに用いられる。かかる場合に、対物レンズの結像集束光の第１の光路は、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含む。ある実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を反射するのに対して、他の実施形態において、光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を通過させる。
ある実施形態において、第１の光路は、５５％〜９８％、６０％〜９６％、７０％〜９４％、８０％〜９２％、８５％〜９０％、及びそれらの間の任意の範囲を含む、対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光５０％〜９９％を含む。従って、第１の光路は、対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を含んでもよい。
ある実施形態において、集束光の第１の光路にないＳＳＣ波長光の部分は、第２の光路に存在する。一般に、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光のより多くの部分が、第２の光路と比較して、第１の光路に存在する。その場合に、例えば、第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９９％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約１％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９８％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約２％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９７％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約３％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９６％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約４％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９５％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約５％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約９０％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約１０％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約８０％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約２０％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約７０％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約３０％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約６０％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約４０％を含む。第１の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約５１％を含み、第２の光路は、対物レンズの集束ＳＳＣ波長光の約４９％を含む。
ある実施形態において、方法は、対物レンズの結像集束光の第１の光路を、アパーチャを通して検出器に導くことを更に含み、アパーチャは、コア領域の外側にあるＳＳＣ波長光が通過して検出器に達することをブロックする（コア領域の寸法は、上記で説明された）。ある実施形態において、上記で詳細に説明されたように（例えば図３及びその説明を参照）、第１の光路におけるＳＳＣ波長光のコア領域は、直接検出されるか、又は光コンベア（例えば光ファイバ）によって検出器に伝達される。かかる実施形態において、光コンベアは、アパーチャを通過した第１の光路のコア領域より大きい直径を持つ光伝達面を有してもよい。幾つかの例において、アパーチャ及び光コンベア（又は検出器）は、直接接していてもよく、一方で他の実施形態において、それらは、接していなくてもよい（例えば図３の左及び中央のパネル）。
ある実施形態において、方法は、コア領域のサイズである光コンベアの光伝達面、例えばコア領域の直径であるコアを有する光ファイバ（図３の右のパネルを参照）上に対物レンズの結像集束光の第１の光路を導くことを含む。かかる実施形態において、アパーチャ要素は、必要とされない。光コンベア（例えば光ファイバ）がない実施形態において、対物レンズの結像集束光の第１の光路は、コア領域のサイズである光検出面を有する検出器に導かれる。
ある実施形態において、方法は、１つ又は複数の追加の検出器（例えば第２の検出器、第３の検出器等）によって、対物レンズの結像集束光の第２の光路における１つ又は複数の光波長を検出することを含む。第１及び第２の光路を生成する光フィルタの構成に依存して、第２の光路は、光フィルタによって反射されるか又は光フィルタによって通過される対物レンズの集束光とすることができる。
ある実施形態において、第２の光路において検出される１つ又は複数の光波長は、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光を含む。ある実施形態において、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子、例えば細胞、サブ細胞粒子（例えば上記のような）から放射される光である。ある実施形態において、ＳＳＣ及び非ＳＳＣ波長光の両方が、第２の光路において検出される。上記で注目したように、第２の光路におけるＳＳＣ波長光は、第１の光路にないＳＳＣ波長光の部分である。一般に、第２の光路におけるＳＳＣ波長光の部分は、第１の光路における部分より少ない。ＳＳＣ波長光が、第１及び第２の光路の両方において別々に検出される場合に、それは、検査中のサンプルの相異なる様相を評価するために用いることができる。例えば、第１の光路におけるＳＳＣ波長光（非コア領域のＳＳＣ波長光が検出されることをブロックするように処理される）は、検査中のサンプルにおけるサブマイクロメートルサイズの粒子（例えばサブ細胞器官、小胞等）を識別するために用いることができ、一方で第２の光路におけるＳＳＣ波長光（非コア領域のＳＳＣ波長光が検出されることをブロックするように処理される）は、検査中のサンプルにおけるより大きな粒子を識別するために用いることができる。
ある実施形態において、方法は、（上記のように）１つ又は複数の検出器に伝達される前に光を処理する光分散（又は分離器）モジュールに、対物レンズの結像集束光の第２の光路を通過させることを更に含む。
主題の方法を実行する際に、本明細書で開示されるような光検出システムを通して伝播される光は、５つ以上の相異なる波長、１０以上の相異なる波長、２５以上の相異なる波長、５０以上の相異なる波長、１００以上の相異なる波長、２００以上の相異なる波長、３００以上の相異なる波長など、及び４００以上の相異なる波長で集束光を測定することを含み、１つ又は複数の波長で測定される。
幾つかの実施形態において、方法は、一連の波長（例えば２００ｎｍ〜１０００ｎｍ）にわたって集束光を測定することを含む。例えば、方法は、２００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長領域の１つ又は複数にわたる光スペクトルを集束することを含んでもよい。更に他の実施形態において、方法は、１つ又は複数の特定の波長で集束光を測定することを含む。例えば、集束光は、４５０ｎｍ、５１８ｎｍ、５１９ｎｍ、５６１ｎｍ、５７８ｎｍ、６０５ｎｍ、６０７ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６６０ｎｍ、６６７ｎｍ、６７０ｎｍ、６６８ｎｍ、６９５ｎｍ、７１０ｎｍ、７２３ｎｍ、７８０ｎｍ、７８５ｎｍ、６４７ｎｍ、６１７ｎｍ、及びそれらの任意の組み合わせの１つ又は複数で測定されてもよい。ある実施形態において、方法は、あるフルオロフォアの蛍光ピーク波長に一致する光の波長を測定することを含む。
集束光は、連続的に又は離散間隔で測定されてもよい。幾つかの例において、方法は、光の測定を連続的に行うことを含む。他の例において、光は、０．００１ミリ秒ごと、０．０１ミリ秒ごと、０．１ミリ秒ごと、１ミリ秒ごと、１０ミリ秒ごと、１００ミリ秒、及び１０００ミリ秒ごと、又はある他の間隔などの離散間隔で測定される。
集束光の測定は、主題の方法の間に、２回以上、３回以上、５回以上、及び１０回以上など、１回以上行われても良い。ある実施形態において、光は、２回以上測定され、ある複数の例におけるデータは平均化される。
光測定は、限定するわけではないが、数ある光検出器の中で、能動画素センサ（ＡＰＳ）、アバランシェフォトダイオード、画像センサ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、強化型電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、発光ダイオード、光子計数器、ボロメータ、焦電検出器、フォトレジスタ、光電池、フォトダイオード、光電子増倍管、フォトトランジスタ、量子ドット光伝導体又はフォトダイオード、及びそれらの組み合わせなどの光センサ又は光検出器を含む任意の便利なプロトコルで行われてもよい。ある実施形態において、伝達された光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）、半導体電荷結合素子（ＣＣＤ）、能動画素センサ（ＡＰＳ）、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）画像センサ、又はＮ型金属酸化膜半導体（ＮＭＯＳ）画像センサで測定される。ある実施形態において、光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）で測定される。伝達される光が、ＣＣＤで測定される場合に、ＣＣＤの活性検出表面積は、０．０１ｃｍ2 〜１０ｃｍ2 など、０．０５ｃｍ2 〜９ｃｍ2 など、０．１ｃｍ2 〜８ｃｍ2 など、０．５ｃｍ2 〜７ｃｍ2 など、及び１ｃｍ2 〜５ｃｍ2 で変化してもよい。
キット
本開示の態様は、キットを更に含み、キットは、本明細書で説明されるようなコア領域の選択的ＳＳＣ集束モジュールを含む。本明細書で説明されるようなコア領域のＳＳＣ集束モジュールは、集束光のコア領域からのＳＳＣ波長光の選択的検出を可能にするように構成されている。かかるものとして、キットは、例えばコア領域の外側にあるＳＳＣ波長光をブロックするか又は選択的にブロックするための１つ又は複数のアパーチャ要素と、１つ又は複数の光フィルタと、１つ又は複数の光伝達要素と、１つ又は複数の検出器と、それらの任意の組み合わせとを有することができる。ある実施形態において、アパーチャ要素（単複）は、アパーチャ直径を増加又は低減させるための調整可能なアパーチャを有してもよく、調整可能なアパーチャは、それを通過するＳＳＣ波長光のコア領域のサイズを調整する。ある実施形態において、コア領域の選択的ＳＳＣ集束モジュールは、既存の光検出システム、例えばフローサイトメータに追加されるように構成され、且つかかるものとして、モジュールを装着又は挿入するためのハードウェアを有していてもよい。
キットの様々な分析コンポーネントが、別個のコンテナに存在してもよく、又はそれらの幾つか又は全ては、予め組み合わされ／組み立てられてもよい。例えば、アパーチャ及び光ファイバ光コンベアは、予め組み立てられ、単一の密封パッケージに存在することができる。
上記のコンポーネントに加えて、主題のキットは、（ある実施形態において）例えば、コア領域の選択的ＳＳＣ集束モジュールを光検出装置に追加するための、又は主題の方法の態様に従ってコア領域の選択的ＳＳＣ集束モジュールを有するシステムを用いるための指示を更に含んでもよい。これらの指示は、様々な形態で主題のキットに存在してもよく、指示の１つ又は複数が、キットに存在してもよい。これらの指示が存在し得る１つの形態は、適切な媒体又は基板、例えば情報が印刷される１枚又は複数枚の紙、キットのパッケージング、添付文書等における印刷情報として存在する。これらの指示の更に別の形態は、コンピュータ可読媒体、例えばディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、ポータブルフラッシュドライブ等であり、それらの上に情報が記録されている。存在可能なこれらの指示の更に別の形態は、隔たったサイトにおける情報にアクセスするために、インターネットを介して用いられ得るウェブサイトアドレスである。
ユーティリティ
本明細書で詳述されるようなコア領域のＳＳＣ集束モジュールを含む光検出システムは、現在利用可能なシステムとして比較して、ＳＳＣ検出における信号対雑音比を改善することに用途を見出す。開示されるコア領域のＳＳＣ集束モジュールは、多数の光波長を含む対物レンズの結像光で観察される色収差を考慮するように構成されている。これは、例えば、フローストリームにおいて検査されるサンプルにおけるサブ細胞（即ちサブマイクロメートル）サイズの粒子の検出における改善を可能にし、例えばフローサイトメータにおいて、サブマイクロメートルサイズの粒子及びより大きな粒子例えば細胞の両方の改善された同時検出及び分析を可能にする。
添付の請求項にもかかわらず、本明細書に記載される開示は、以下の付記によっても定義される。
１．フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された集光システムと、
対物レンズの結像集束光を少なくとも２つの光波長に分離するように構成された光分散モジュールと、
少なくとも２つの光波長の第１の光波長を検出するように構成された第１の検出器及び少なくとも２つの光波長の第２の光波長を検出するように構成された第２の検出器であって、第１の光波長がＳＳＣ波長光である第１及び第２の検出器と、
集光システムと光分散モジュールとの間に配置されたアパーチャであって、コア領域の外側にある対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光が第１の検出器に達することを選択的にブロックするように構成された光マスクを含むアパーチャと
を備える光検出システム。
２．アパーチャは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる直径を有する付記１に記載の光検出システム。
３．光マスクは、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光の通過をブロックしない付記１又は２に記載の光検出システム。
４．非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子から放射される光である付記３に記載の光検出システム。
５．アパーチャと光分散モジュールとの間に配置された光ファイバ光コンベアを更に備え、光ファイバ光コンベアは、アパーチャを通過した対物レンズの結像集束光を光分散モジュールに伝達するように構成されている付記１〜４のいずれか一つに記載の光検出システム。
６．検出器は、フォトダイオードに基づいた光検出器又は光電子増倍管（ＰＭＴ）を含む付記５に記載の光検出システム。
７．光ファイバ光コンベアは、コア領域より大きい直径を有するコアを含む付記６に記載の光検出システム。
８．フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された集光システムと、
対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光を受光するように構成された検出器と、
対物レンズの結像集束光の少なくとも第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタであって、第１の光路が、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含み、且つ第１の光路が検出器に伝達される光フィルタと、
コア領域の外側にある、第１の光路におけるＳＳＣ波長光が通過して検出器に達することをブロックするように構成されたアパーチャと
を備える光検出システム。
９．第１の光路は、集束ＳＳＣ波長光の５０％〜９９％を含む付記８に記載の光検出システム。
１０．対物レンズの結像集束光の第２の光路を少なくとも２つの光波長に分離するように構成された光分散モジュールと、
少なくとも２つの光波長の第１の光波長を検出するように構成された第２の検出器及び少なくとも２つの光波長の第２の光波長を検出するように構成された第３の検出器と
を更に備える付記８又は９に記載の光検出システム。
１１．アパーチャは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる直径を有する付記１〜１０のいずれか一つに記載の光検出システム。
１２．第２の光路は、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光を含む付記８〜１１のいずれか一つに記載の光検出システム。
１３．非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子から放射される光である付記１２に記載の光検出システム。
１４．アパーチャと検出器との間に配置された光ファイバ光コンベアを更に備え、光ファイバ光コンベアは、アパーチャを通過した対物レンズの結像集束光を検出器に伝達するように構成されている付記８〜１３のいずれか一つに記載の光検出システム。
１５．光ファイバ光コンベアは、コア領域より大きい直径を有するコアを含む付記１４に記載の光検出システム。
１６．アパーチャが、光ファイバ光コンベアに直接装着されている付記１５に記載の光検出システム。
１７．アパーチャが、検出器に直接装着されている付記８に記載の光検出システム。
１８．光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を反射するように構成されている付記８〜１７のいずれか一つに記載の光検出システム。
１９．光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を通過させるように構成されている付記８〜１７のいずれか一つに記載の光検出システム。
２０．フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された集光システムと、
対物レンズの結像集束ＳＳＣ波長光を受光するように構成された検出器と、
対物レンズの結像集束光の少なくとも第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタであって、第１の光路が、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含み、且つ第１の光路が検出器に伝達される光フィルタと、
ＳＳＣ波長光のコア領域からの第１の光路におけるＳＳＣ波長光を検出器に選択的に伝達するように構成された光ファイバ光コンベアと
を備える光検出システム。
２１．第１の光路は、集束ＳＳＣ波長光の５０％〜９９％を含む付記２０に記載の光検出システム。
２２．対物レンズの結像集束光の第２の光路を少なくとも２つの光波長に分離するように構成された光分散モジュールと、
少なくとも２つの光波長の第１の波長を検出するように構成された第２の検出器及び少なくとも２つの光波長の第２の波長を検出するように構成された第３の検出器と
を更に備える付記２０又は２１に記載の光検出システム。
２３．光ファイバ光コンベアの光伝達コアは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる断面直径を有する付記２０〜２２のいずれか一つに記載の光検出システム。
２４．第２の光路は、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光を含む付記２０〜２３のいずれか一つに記載の光検出システム。
２５．非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子から放射される光である付記２４に記載の光検出システム。
２６．検出器は、フォトダイオードに基づいた光検出器又は光電子増倍管（ＰＭＴ）を含む付記２０〜２５のいずれか一つに記載の光検出システム。
２７．光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を反射するように構成されている付記２０〜２６のいずれか一つに記載の光検出システム。
２８．光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を通過させるように構成されている付記２０〜２６のいずれか一つに記載の光検出システム。
２９．光源と、
検出ゾーンを含むフローセルと、
付記１〜２８のいずれか一つに記載の光検出システムと
を備えるフローサイトメータ。
３０．フローストリームを分析する方法であって、
フローストリームを光源で照射することと、
照射されたフローストリームの検出ゾーンから集束される対物レンズの結像集束光を生成することと、
アパーチャを通して光分散モジュールまで対物レンズの結像集束光を通過させることであって、
（ｉ）アパーチャが、コア領域の外側にある側方散乱（ＳＳＣ）波長光が通過することを選択的にブロックする光マスクを含み、
（ｉｉ）光分散モジュールが、対物レンズの結像集束光を少なくとも第１及び第２の光波長に分離するように構成され、第１の光波長がＳＳＣ波長光であることと、
フローストリームを分析するために、第１及び第２の光波長を検出することと
を含む方法。
３１．アパーチャは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる直径を有する付記３０に記載の方法。
３２．アパーチャは、コア領域と一致するために、直径において２００μｍ〜４００μｍにわたる直径を有する付記３０に記載の方法。
３３．光マスクは、少なくとも１つの非ＳＳＣ光波長の通過をブロックしない付記３０〜３２のいずれか一つに記載の方法。
３４．非ＳＳＣ光波長は、フローストリームにおける粒子から放射される光である付記３３に記載の方法。
３５．光ファイバ光コンベアによってアパーチャを通された対物レンズの結像光を光分散モジュールに伝達することを更に含む付記３０〜３４のいずれか一つに記載の方法。
３６．フローストリームを分析する方法であって、フローストリームを分析するために、
フローストリームを光源で照射することと、
照射されたフローストリームの検出ゾーンから集束される対物レンズの結像光を生成することと、
対物レンズの結像集束光の少なくとも第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタ上に対物レンズの結像集束光を導くことであって、第１の光路が、対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光の少なくとも一部を含むことと、
第１の光路におけるＳＳＣ波長光のコア領域を検出器に選択的に伝達するように構成された光ファイバ光コンベアを通して集束ＳＳＣ波長の第１の光路を伝達することと
を含む方法。
３７．光ファイバ光コンベアの光伝達コアは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる断面直径を有する付記３６に記載の方法。
３８．光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を反射するように構成される付記３６又は３７に記載の方法。
３９．光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を通過させるように構成される付記３６又は３７に記載の方法。
４０．第１の光路は、集束ＳＳＣ波長光の５０％〜９９％を含む付記３６〜３９のいずれか一つに記載の方法。
４１．集束ＳＳＣ波長光の第２の光路にあるＳＳＣ波長光が、第２の検出器によって検出される付記３６〜４０のいずれか一つに記載の方法。
４２．検出器は、フォトダイオードに基づいた光検出器又は光電子増倍管（ＰＭＴ）を含む付記３６〜４１のいずれか一つに記載の方法。
４３．第２の光路は、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光を含み、方法は、少なくとも１つの非ＳＳＣ光波長を検出することを更に含む付記３６〜４２のいずれか一つに記載の方法。
４４．非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子から放射される光である付記４３に記載の方法。
４５．フローストリームを分析する方法であって、フローストリームを分析するために、
フローストリームを光源で照射することと、
照射されたフローストリームの検出ゾーンから集束される対物レンズの結像光を生成することと、
対物レンズの結像集束光の少なくとも第１の光路及び第２の光路を生成するように構成された光フィルタ上に対物レンズの結像集束光を導くことであって、第１の光路が、対物レンズの結像集束光からの側方散乱（ＳＳＣ）波長光の少なくとも一部を含むことと、
アパーチャを通して検出器まで集束ＳＳＣ波長光の第１の光路を通過させることであって、アパーチャが、コア領域の外側にあるＳＳＣ波長光の通過をブロックすることと
を含む方法。
４６．アパーチャは、コア領域と一致するために５０μｍ〜５００μｍにわたる直径を有する付記４５に記載の方法。
４７．光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を反射するように構成される付記４５又は４６に記載の方法。
４８．光フィルタは、第１の光路を生成するために、対物レンズの結像集束光を通過させるように構成される付記４５又は４６に記載の方法。
４９．第１の光路は、集束ＳＳＣ波長光の５０％〜９９％を含む付記４５〜４８のいずれか一つに記載の方法。
５０．集束ＳＳＣ波長光の第２の光路にあるＳＳＣ波長光が、第２の検出器によって検出される付記４５〜４９のいずれか一つに記載の方法。
５１．検出器は、フォトダイオードに基づいた光検出器又は光電子増倍管（ＰＭＴ）を含む付記４５〜５０のいずれか一つに記載の方法。
５２．第２の光路は、少なくとも１つの非ＳＳＣ波長光を含み、方法は、少なくとも１つの非ＳＳＣ光波長を検出することを更に含む付記４５〜５１のいずれか一つに記載の方法。
５３．非ＳＳＣ波長光は、フローストリームにおける粒子から放射される光である付記５２に記載の方法。
５４．光ファイバ光コンベアによってアパーチャを通過した第１の光路を検出器に伝達することを更に含む付記４５〜５３のいずれか一つに記載の方法。
５５．アパーチャが、光ファイバ光コンベアに直接装着される付記５４に記載の方法。
５６．アパーチャが、検出器に直接装着される付記４５に記載の方法。
前述の発明は、明確な理解のために実例及び例によって多少詳細に説明されたが、ある変更及び修正が、添付の請求項の趣旨又は範囲から逸脱せずにこの開示に行われ得ることが、この開示の教示に照らして当業者には容易に明らかになる。
従って、前述の記載は、単に本発明の原理を示すだけである。本明細書では明示的に説明も図示もされなかったけれども、本発明の原理を具体化し、且つその趣旨と範囲内に含まれる様々な配置を当業者が考案できることが理解されよう。更に、本明細書で挙げられた全ての例及び条件付きの言葉は、かかる特に挙げられた例及び条件に限定されない本発明の原理を理解する際に読者を支援するように主に意図されている。更に、本発明の原理、態様及び実施形態を列挙する本明細書の全ての言明と同様にそれらの具体例は、それらの構造的及び機能的な均等物を包含するように意図されている。加えて、かかる均等物が、現在周知の均等物及び将来開発される均等物の両方、即ち構造にかかわらず同じ機能を実行するどんな開発される要素も含むことが意図されている。従って、本発明の範囲は、本明細書で図示され説明される例示的な実施形態に限定されるようには意図されていない。もっと正確に言えば、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年２月１８日出願の米国仮特許出願第６２／１１７，８００号明細書の優先権を主張し、その仮特許出願の開示は、参照によって本明細書で援用される。

Claims (5)

  1. フローセルの検出ゾーンから対物レンズの結像集束光を生成するように構成された集光システムと、
    前記対物レンズの結像集束光を少なくとも２つの光波長に分離するように構成された光分散モジュールと、
    前記少なくとも２つの光波長の第１の光波長を検出するように構成された第１の検出器及び前記少なくとも２つの光波長の第２の光波長を検出するように構成された第２の検出器であって、前記第１の光波長がＳＳＣ波長光である第１及び第２の検出器と、
    前記集光システムと前記光分散モジュールとの間に配置されたアパーチャであって、コア領域の外側にある前記対物レンズの結像集束光からのＳＳＣ波長光が前記第１の検出器に達することをブロックし、前記第２の光波長の透過をブロックしないように構成された光マスクを含むアパーチャと
    を備えることを特徴とする光検出システム。
  2. 前記アパーチャと前記光分散モジュールとの間に配置された光ファイバ光コンベアを更に備え、前記光ファイバ光コンベアは、前記アパーチャを通過した対物レンズの結像集束光を前記光分散モジュールに伝達するように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の光検出システム。
  3. 前記光ファイバ光コンベアは、前記コア領域より大きい直径を有するコアを含むことを特徴とする請求項２に記載の光検出システム。
  4. 光源と、
    検出ゾーンを含むフローセルと、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載の光検出システムと
    を備えることを特徴とするフローサイトメータ。
  5. フローストリームを分析する方法であって、
    フローストリームを光源で照射することと、
    前記照射されたフローストリームの検出ゾーンから集束される対物レンズの結像光を生成することと、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載の光検出システムに前記対物レンズの結像集束光を通過させることと
    を含むことを特徴とする方法。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016133760A1 (en) * 2015-02-18 2016-08-25 Becton, Dickinson And Company Optical detection systems and methods of using the same
WO2016172173A1 (en) * 2015-04-20 2016-10-27 Stc.Unm Method for simultaneous spectrally resolved detection or imaging of items in multiple flowing streams
CN107421638B (zh) * 2017-08-25 2019-09-06 西京学院 一种光学衍射模拟方法及其装置
US10578542B2 (en) * 2017-10-16 2020-03-03 Becton, Dickinson And Company Multi-photon counting for high sensitivity flow cytometer systems and methods for using the same
EP3743706A4 (en) * 2018-01-23 2021-10-20 Becton, Dickinson and Company LIGHT DETECTION DYNAMIC DARKENING SYSTEMS AND METHODS FOR USING THEM
CN110118758B (zh) * 2019-04-01 2022-06-03 深圳市趣方科技有限公司 一种散射荧光双模态流式成像系统
US20220236165A1 (en) * 2021-01-27 2022-07-28 Becton, Dickinson And Company Flow cytometers including fiber optic light collectors, and methods of use thereof

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3864044A (en) * 1972-11-27 1975-02-04 Combustion Equip Ass Method and apparatus for the analysis of a dispersed phase capable of transmitting and focusing light
US3960449A (en) 1975-06-05 1976-06-01 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Measurement of angular dependence of scattered light in a flowing stream
JPS5573011A (en) * 1978-11-27 1980-06-02 Fujitsu Ltd Mask forming method of optical fiber and face
US4347935A (en) 1979-05-16 1982-09-07 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Method and apparatus for electrostatically sorting biological cells
JPS5766342A (en) * 1980-04-28 1982-04-22 Agency Of Ind Science & Technol Optical measuring method for suspension particles in medium
US4667830A (en) 1981-06-15 1987-05-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and means for sorting individual particles into containers for culturing, cloning, analysis, or the like
US4600302A (en) 1984-03-26 1986-07-15 Becton, Dickinson And Company Flow cytometry apparatus with uniform incoherent light excitation
JPS61165637A (ja) * 1985-01-18 1986-07-26 Canon Inc 粒子解析装置
US4690561A (en) * 1985-01-18 1987-09-01 Canon Kabushiki Kaisha Particle analyzing apparatus
US4770992A (en) 1985-11-27 1988-09-13 Den Engh Gerrit J Van Detection of specific DNA sequences by flow cytometry
US4704891A (en) 1986-08-29 1987-11-10 Becton, Dickinson And Company Method and materials for calibrating flow cytometers and other analysis instruments
KR970007077B1 (ko) * 1987-03-13 1997-05-02 코울터 일렉트로닉스 인커퍼레이티드 광산란 기술을 이용한 다중-부분식별 분석 방법
JP2529966B2 (ja) * 1987-03-28 1996-09-04 株式会社東芝 粒径測定装置
JPS63292039A (ja) * 1987-05-26 1988-11-29 Fuji Electric Co Ltd 液体中微粒子検出装置
US5245318A (en) 1987-07-24 1993-09-14 Canon Kabushiki Kaisha Particle analyzing apparatus having pressure control system
US5040890A (en) 1987-11-25 1991-08-20 Becton, Dickinson And Company Sheathed particle flow controlled by differential pressure
US5047321A (en) 1988-06-15 1991-09-10 Becton Dickinson & Co. Method for analysis of cellular components of a fluid
US5030002A (en) 1989-08-11 1991-07-09 Becton, Dickinson And Company Method and apparatus for sorting particles with a moving catcher tube
EP0515211A3 (en) 1991-05-23 1993-04-07 Becton Dickinson And Company Apparatus and method for phase resolved fluorescence lifetimes of independent and varying amplitude pulses
WO1993005478A1 (en) 1991-08-28 1993-03-18 Becton, Dickinson & Company Gravitational attractor engine for adaptively autoclustering n-dimensional data streams
US5422712A (en) * 1992-04-01 1995-06-06 Toa Medical Electronics Co., Ltd. Apparatus for measuring fluorescent spectra of particles in a flow
JP3260469B2 (ja) * 1992-04-01 2002-02-25 シスメックス株式会社 粒子分析装置
US5547849A (en) * 1993-02-17 1996-08-20 Biometric Imaging, Inc. Apparatus and method for volumetric capillary cytometry
NO930980L (no) * 1993-03-18 1994-09-19 Flowtech As Optisk konfigurasjon for væskeströmcytofotometer
CA2125228A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-09 Thomas J. Mercolino Three-color flow cytometry with automatic gating function
JPH0727693A (ja) * 1993-07-13 1995-01-31 Omron Corp 流れ式粒子分析装置
US5483469A (en) 1993-08-02 1996-01-09 The Regents Of The University Of California Multiple sort flow cytometer
US5464581A (en) 1993-08-02 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Flow cytometer
US5475487A (en) 1994-04-20 1995-12-12 The Regents Of The University Of California Aqueous carrier waveguide in a flow cytometer
US5631165A (en) * 1994-08-01 1997-05-20 Abbott Laboratories Method for performing automated hematology and cytometry analysis
US5700692A (en) 1994-09-27 1997-12-23 Becton Dickinson And Company Flow sorter with video-regulated droplet spacing
US5643796A (en) 1994-10-14 1997-07-01 University Of Washington System for sensing droplet formation time delay in a flow cytometer
US5602039A (en) 1994-10-14 1997-02-11 The University Of Washington Flow cytometer jet monitor system
US5620842A (en) 1995-03-29 1997-04-15 Becton Dickinson And Company Determination of the number of fluorescent molecules on calibration beads for flow cytometry
JPH10132728A (ja) * 1996-10-29 1998-05-22 Nippon Koden Corp 粒子分類装置の散乱光収集装置
US6821740B2 (en) 1998-02-25 2004-11-23 Becton, Dickinson And Company Flow cytometric methods for the concurrent detection of discrete functional conformations of PRB in single cells
US6097485A (en) * 1999-03-08 2000-08-01 Integrated Waveguides, Inc. Microchip optical transport technology for use in a personal flow cytometer
US6372506B1 (en) 1999-07-02 2002-04-16 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for verifying drop delay in a flow cytometer
US6813017B1 (en) 1999-10-20 2004-11-02 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method employing incoherent light emitting semiconductor devices as particle detection light sources in a flow cytometer
US6809804B1 (en) 2000-05-11 2004-10-26 Becton, Dickinson And Company System and method for providing improved event reading and data processing capabilities in a flow cytometer
CA2439307A1 (en) * 2001-02-23 2002-09-06 Genicon Sciences Corporation Methods for providing extended dynamic range in analyte assays
US6683314B2 (en) 2001-08-28 2004-01-27 Becton, Dickinson And Company Fluorescence detection instrument with reflective transfer legs for color decimation
US7201875B2 (en) 2002-09-27 2007-04-10 Becton Dickinson And Company Fixed mounted sorting cuvette with user replaceable nozzle
JP3891925B2 (ja) * 2002-12-03 2007-03-14 ベイバイオサイエンス株式会社 生物学的粒子の情報を得る装置
FR2873813B1 (fr) * 2004-07-30 2006-11-17 Abx Sa Procede et dispositif de caracterisation des composants cellulaires d'un liquide biologique
JP4921356B2 (ja) * 2005-03-29 2012-04-25 シスメックス株式会社 癌・異型細胞および凝集粒子を弁別する方法および細胞分析装置
GB0513128D0 (en) * 2005-06-27 2005-08-03 Ojk Consulting Ltd An optical arrangement for a flow cytometer
JP4756948B2 (ja) * 2005-08-08 2011-08-24 ベイバイオサイエンス株式会社 フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法
US7400458B2 (en) * 2005-08-12 2008-07-15 Philips Lumileds Lighting Company, Llc Imaging optics with wavelength dependent aperture stop
US7738094B2 (en) 2007-01-26 2010-06-15 Becton, Dickinson And Company Method, system, and compositions for cell counting and analysis
US8140300B2 (en) 2008-05-15 2012-03-20 Becton, Dickinson And Company High throughput flow cytometer operation with data quality assessment and control
US8233146B2 (en) 2009-01-13 2012-07-31 Becton, Dickinson And Company Cuvette for flow-type particle analyzer
US9134221B2 (en) 2009-03-10 2015-09-15 The Regents Of The University Of California Fluidic flow cytometry devices and particle sensing based on signal-encoding
WO2010124028A2 (en) 2009-04-21 2010-10-28 Vasylyev Sergiy V Light collection and illumination systems employing planar waveguide
US8665439B2 (en) 2009-06-30 2014-03-04 Microbix Biosystems, Inc. Method and apparatus for limiting effects of refraction in cytometry
US8906308B2 (en) * 2010-01-15 2014-12-09 Abbott Laboratories Method for determining volume and hemoglobin content of individual red blood cells
JP5533055B2 (ja) * 2010-03-10 2014-06-25 ソニー株式会社 光学的測定装置及び光学的測定方法
JP2012026837A (ja) * 2010-07-22 2012-02-09 Sony Corp 微小粒子測定装置
US8528427B2 (en) 2010-10-29 2013-09-10 Becton, Dickinson And Company Dual feedback vacuum fluidics for a flow-type particle analyzer
CN103649294B (zh) 2011-04-29 2016-05-18 贝克顿·迪金森公司 多路分类系统和方法
WO2013049623A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Brian David Warner Fluid exchange methods and devices
WO2013101675A2 (en) * 2011-12-29 2013-07-04 Abbott Laboratories Flow cytometry systems and methods for blocking diffraction patterns
WO2013173446A1 (en) * 2012-05-15 2013-11-21 1087 Systems, Inc. Cytometry system with interferometric measurement
JP2014020918A (ja) * 2012-07-18 2014-02-03 Sony Corp 微小粒子測定装置及び微小粒子分析方法
WO2014144585A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Beckman Coulter, Inc. Radiated light filtering for a flow cytometer
JP2016521362A (ja) 2013-04-12 2016-07-21 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 細胞分取のための自動セットアップ
WO2016133760A1 (en) * 2015-02-18 2016-08-25 Becton, Dickinson And Company Optical detection systems and methods of using the same

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