JP5533055B2 - 光学的測定装置及び光学的測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、微小粒子などの試料を識別する光学的測定装置及び光学的測定方法に関する。より詳しくは、特定波長の光が照射されたときに試料から発せられる蛍光や散乱光を検出し、その種類などを識別する技術に関する。
一般に、細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子を識別する場合は、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）を用いた光学的測定方法が利用されている（例えば、非特許文献１参照。）。フローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザ光を照射し、各微小粒子から発せられた蛍光又は散乱光を検出することで、複数の微小粒子を１個ずつ識別する分析手法である。
具体的には、流路内において、測定対象の微小粒子を含むサンプル液と、その周囲を流れるシース（鞘）液とで層流を形成し、サンプル液中に含まれる複数の微小粒子を１列に並べる。その状態で流路に向けてレーザ光を照射すると、微小粒子がレーザービームを横切るように１個ずつ通過する。このとき、レーザ光により励起されて各微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）又はＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）などの光検出器を用いて検出する。そして、光検出器で検出した光を電気的信号に変換して数値化し、統計解析を行うことにより、個々の微小粒子の種類、大きさ及び構造などを判定する。
このフローサイトメトリーにおいて測定される散乱光には、大きく分けて２種類あり、レーザ光の入射角とほぼ同じ角度で散乱する光を「前方散乱光」、レーザ光の進行方向に対して垂直方向に散乱する光を「側方散乱光」と呼んでいる。例えば測定対象の試料が細胞である場合、「前方散乱光」は細胞の大きさに関する情報を、「側方散乱光」は細胞の形態や内部構造に関する情報を反映することが広く知られている。そして、従来、この原理を利用した分析装置が開発されている（例えば、特許文献１，２参照）。
図１１は側方散乱光を測定する機構を備えた従来の光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。例えば、図１１に示す従来の光学的測定装置１００では、分析チップ１０２の検出領域１０９に向けて光源１０１から励起光１１１を照射し、これにより微小粒子１１０から発せられた散乱光のうち側方散乱成分１１２を、分析チップ１０２よりも手前側で検出している。具体的には、微小粒子１１０から発せられた側方散乱成分１１２は、集光レンズ１０３やピンホール１０４などを介して、ＰＭＴなどの散乱光検出器１０５で検出される。
これに対して、前方散乱成分１１３は、蛍光と同様に、光の進行方向側で検出している。具体的には、微小粒子１１０から発せられた前方散乱成分１１３は、蛍光などと共に対物レンズ１０６で集光され、更に励起光遮光マスク１０７により励起光１１１が除去された後、ＬＰＦ（long Pass Filter）１０８によって蛍光と分離され、検出器（図示せず）で検出される。
中内啓光監修，「細胞工学別冊 実験プロトコルシリーズ フローサイトメトリー自由自在」，第２版，株式会社秀潤社，２００６年８月３１日発行
しかしながら、前述した従来の技術には、以下に示す問題点がある。即ち、図１１に示す従来の光学的測定装置１００では、励起光１１１についての集光レンズの焦点、前方散乱成分１１３及び蛍光を検出するための対物レンズ１０６の焦点、側方散乱成分１１２を検出するための集光レンズ１０３の焦点の３つ焦点を合わせる必要がある。このため、従来の装置には、光学系の調整が煩雑であり、更に小型化しにくいという問題点がある。
そこで、本発明は、光学系の調整が容易で、かつ装置全体を小型化することができる光学的測定装置及び光学的測定方法を提供することを主目的とする。
本発明に係る光学的測定装置は、流路内を通流する試料に励起光を照射する光照射部と、
励起光が照射された試料から発せられた散乱光を、前記励起光の進行方向前方側で検出する散乱光検出部と、を有し、前記散乱光検出部は、少なくとも、前記散乱光を、特定の開口数以下の低開口数成分と、それよりも開口数が高い高開口数成分とに分離する散乱光分離マスクと、前記散乱光分離マスク上に対物レンズの瞳と共役面を形成するリレーレンズ系と、前記低開口数成分を検出し、前記試料の大きさに関する情報を得る第１検出器と、前記高開口数成分を検出し、前記試料の形態及び／又は内部構造に関する情報を得る第２検出器と、を備えるものである。
本発明においては、検出部に、低開口数成分と高開口数成分とを分離する散乱光分離マスクを設けているため、励起光の進行方向前方側で側方散乱光成分も検出可能となる。これにより、励起光の進行方向後方側で、側方散乱光成分を検出するための光学系が不要となる。
前記散乱光分離マスクには、前記低開口数成分よりも開口数が高く前記高開口数成分よりも開口数が低い成分を吸収する吸収領域が設けられていてもよい。
その場合、前記散乱光分離マスクは、中心部分に前記低開口数成分を透過又は反射する領域が設けられており、その周囲に前記吸収領域が設けられ、更にその外側に前記高開口数成分を反射又は透過する領域が設けられている構成とすることができる。
また、前記低開口数成分は、開口数が０．３以下であってもよい。
更に、前記高開口数成分は、開口数が０．６以上としてもよい。
本発明の光学的測定装置は、マイクロ流路を備えた分析チップを有し、前記光照射部は前記マイクロ流路内を通流する試料に励起光を照射してもよい。
更に、励起光を除去する励起光遮光マスクを設けることもできる。
更にまた、励起光が照射された試料から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部を有し、前記試料と蛍光検出部及び散乱光検出部との間に、蛍光と散乱光とを分離するフィルターが配設されていてもよい。
励起光が照射された試料から発せられた散乱光を、前記励起光の進行方向前方側で検出する散乱光検出部と、を有し、前記散乱光検出部は、少なくとも、前記散乱光を、特定の開口数以下の低開口数成分と、それよりも開口数が高い高開口数成分とに分離する散乱光分離マスクと、前記散乱光分離マスク上に対物レンズの瞳と共役面を形成するリレーレンズ系と、前記低開口数成分を検出し、前記試料の大きさに関する情報を得る第１検出器と、前記高開口数成分を検出し、前記試料の形態及び／又は内部構造に関する情報を得る第２検出器と、を備えるものである。
本発明においては、検出部に、低開口数成分と高開口数成分とを分離する散乱光分離マスクを設けているため、励起光の進行方向前方側で側方散乱光成分も検出可能となる。これにより、励起光の進行方向後方側で、側方散乱光成分を検出するための光学系が不要となる。
前記散乱光分離マスクには、前記低開口数成分よりも開口数が高く前記高開口数成分よりも開口数が低い成分を吸収する吸収領域が設けられていてもよい。
その場合、前記散乱光分離マスクは、中心部分に前記低開口数成分を透過又は反射する領域が設けられており、その周囲に前記吸収領域が設けられ、更にその外側に前記高開口数成分を反射又は透過する領域が設けられている構成とすることができる。
また、前記低開口数成分は、開口数が０．３以下であってもよい。
更に、前記高開口数成分は、開口数が０．６以上としてもよい。
本発明の光学的測定装置は、マイクロ流路を備えた分析チップを有し、前記光照射部は前記マイクロ流路内を通流する試料に励起光を照射してもよい。
更に、励起光を除去する励起光遮光マスクを設けることもできる。
更にまた、励起光が照射された試料から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部を有し、前記試料と蛍光検出部及び散乱光検出部との間に、蛍光と散乱光とを分離するフィルターが配設されていてもよい。
本発明に係る光学的測定方法は、測定対象の試料に励起光を照射する工程と、励起光が照射された試料から発せられた散乱光を、前記励起光の進行方向前方側において、一の散乱光分離マスクにより特定の開口数以下の低開口数成分と、それよりも開口数が高い高開口数成分とに分離する工程と、前記低開口数成分と前記高開口数成分とを個別に検出する工程と、前記低開口数成分の強度から前記試料の大きさに関する情報を得ると共に、前記高開口数成分の強度から前記試料の形態及び／又は内部構造に関する情報を得る工程と、を有する。
本発明によれば、励起光が照射された試料から発せられた散乱光のうち、前方散乱光成分だけでなく、側方散乱光成分も、励起光の進行方向前方側で検出しているため、光学系の調整が容易で、かつ装置全体を小型化することができる。
以下、本発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態
（励起光の進行方向側で側方散乱光を検出する光学的測定装置の例）
２．第２の実施の形態
（遮光マスクの代わりにＮＡ分離マスクを配設した光学的測定装置の例）
３．第３の実施の形態
（対物レンズ瞳にＮＡ分離マスクを配設した光学的測定装置の例）
１．第１の実施の形態
（励起光の進行方向側で側方散乱光を検出する光学的測定装置の例）
２．第２の実施の形態
（遮光マスクの代わりにＮＡ分離マスクを配設した光学的測定装置の例）
３．第３の実施の形態
（対物レンズ瞳にＮＡ分離マスクを配設した光学的測定装置の例）
＜１．第１の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
図１は本発明の第１の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。図１に示すように、本実施形態の光学的測定装置１は、マイクロ流路が形成された分析チップ３を使用して微小粒子などの試料の測定を行うものであり、少なくとも、光照射部２と検出部４とを備えている。そして、例えばマイクロチップ型ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）システムに使用される。
［光学的測定装置の全体構成］
図１は本発明の第１の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。図１に示すように、本実施形態の光学的測定装置１は、マイクロ流路が形成された分析チップ３を使用して微小粒子などの試料の測定を行うものであり、少なくとも、光照射部２と検出部４とを備えている。そして、例えばマイクロチップ型ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）システムに使用される。
［光照射部２の構成］
光照射部２は、分析チップ３に設けられた流路を通流する試料に励起光５を照射するものであり、少なくとも、励起光５を発する光源２０が設けられている。ここで使用する光源２０は、測定内容などに応じて適宜選択することができるが、例えばレーザダイオード、ＳＨＧ(Second Harmonic Generation)レーザ、ガスレーザ及び高輝度ＬＥＤ（Light Emitting Diode:発光ダイオード）などを使用することができる。
光照射部２は、分析チップ３に設けられた流路を通流する試料に励起光５を照射するものであり、少なくとも、励起光５を発する光源２０が設けられている。ここで使用する光源２０は、測定内容などに応じて適宜選択することができるが、例えばレーザダイオード、ＳＨＧ(Second Harmonic Generation)レーザ、ガスレーザ及び高輝度ＬＥＤ（Light Emitting Diode:発光ダイオード）などを使用することができる。
また、光照射部２には、必要に応じて、励起光５を試料に向けて集光する対物レンズ（図示せず）、及び特定波長の光のみを透過し、それ以外の光は反射する特性をもつバンドパスフィルター（図示せず）などを配設することもできる。例えば、バンドパスフィルターを配設した場合、不要な光成分を除去することができるため、特にＬＥＤや白色光源を励起光として用いる場合に有効である。なお、光照射部２は、特定波長の光（励起光５）を、試料に照射可能な構成であればよく、光源、レンズ及び光学フィルターなどの各種光学部品の種類及び配置は適宜選択可能であり、前述した構成に限定されるものではない。
［分析チップ３］
本実施形態の光学的測定装置１で使用する分析チップ３には、試料を通流させるマイクロ流路が設けられている。このマイクロ流路は、試料を含むサンプル液の周囲をシース液で囲んで層流を形成し、励起光５が照射される測定領域において、試料が一列に並んで通流するような構成となっている。また、分析チップ３には、採取対象の試料が集められる回収液貯留部と、採取対象外の試料が集められる排液貯留部とを設けることもでき、その場合、検出領域３１よりも下流側に、これらに連通する複数の分岐流路が設けられる。
本実施形態の光学的測定装置１で使用する分析チップ３には、試料を通流させるマイクロ流路が設けられている。このマイクロ流路は、試料を含むサンプル液の周囲をシース液で囲んで層流を形成し、励起光５が照射される測定領域において、試料が一列に並んで通流するような構成となっている。また、分析チップ３には、採取対象の試料が集められる回収液貯留部と、採取対象外の試料が集められる排液貯留部とを設けることもでき、その場合、検出領域３１よりも下流側に、これらに連通する複数の分岐流路が設けられる。
［検出部４の構成］
検出部４は、励起光５が照射された試料から発せられた蛍光６や散乱光７を検出するものであり、少なくとも、試料から発せられた蛍光６を検出する蛍光検出器（図示せず）と、試料から発せられた散乱光７を検出する散乱光検出器４７，４９が設けられている。また、試料と蛍光検出器との間には、試料側から順に、対物レンズ４０、励起光遮光マスク４１、ＬＰＦ（long Pass Filter）４２が配設されている。
検出部４は、励起光５が照射された試料から発せられた蛍光６や散乱光７を検出するものであり、少なくとも、試料から発せられた蛍光６を検出する蛍光検出器（図示せず）と、試料から発せられた散乱光７を検出する散乱光検出器４７，４９が設けられている。また、試料と蛍光検出器との間には、試料側から順に、対物レンズ４０、励起光遮光マスク４１、ＬＰＦ（long Pass Filter）４２が配設されている。
一方、ＬＰＦ４２と散乱光検出器４７，４９との間には、ＬＰＦ４２側から順に、リレーレンズ系（レンズ４３ａ，４３ｂ）、ＮＡ分離マスク４５、集光レンズ４６，４８が配設されている。更に、リレーレンズ系を構成するレンズ４３ａとレンズ４３ｂとの間には、必要に応じてピンホール４４を配置することもできる。
（対物レンズ４０）
対物レンズ４０は、試料から発せられた蛍光６及び散乱光７を集光するものであり、開口数ＮＡが高いものを使用することが望ましい。これにより、測定対象の試料から生じる微弱な蛍光６及び散乱光７を、高感度に計測することが可能となる。
対物レンズ４０は、試料から発せられた蛍光６及び散乱光７を集光するものであり、開口数ＮＡが高いものを使用することが望ましい。これにより、測定対象の試料から生じる微弱な蛍光６及び散乱光７を、高感度に計測することが可能となる。
（励起光遮光マスク４１）
励起光５の照射により、試料からは、励起光５と同波長の散乱光７と、励起光５とは波長が異なる蛍光６が発せられるが、検出部４側に入射する光には、試料に照射されずに分析チップ３を透過した励起光５も含まれる。一方、試料から発せられる蛍光６及び散乱光７は、励起光５に比べて非常に微弱な光であるため、検出部４側に入射した光から励起光５を分離する必要がある。そこで、本実施形態の光学的測定装置１においては、検出部４に入射した光から励起光５を除去するため、対物レンズ４０とＬＰＦ４２との間に、励起光遮光マスク４１を配設している。
励起光５の照射により、試料からは、励起光５と同波長の散乱光７と、励起光５とは波長が異なる蛍光６が発せられるが、検出部４側に入射する光には、試料に照射されずに分析チップ３を透過した励起光５も含まれる。一方、試料から発せられる蛍光６及び散乱光７は、励起光５に比べて非常に微弱な光であるため、検出部４側に入射した光から励起光５を分離する必要がある。そこで、本実施形態の光学的測定装置１においては、検出部４に入射した光から励起光５を除去するため、対物レンズ４０とＬＰＦ４２との間に、励起光遮光マスク４１を配設している。
図２は遮光マスク４１の構成を模式的に示す図である。図２に示すように、励起光遮光マスク４１は、中心部分に反射領域４１ａが設けられ、その周囲に透過領域４１ｂが設けられている。この励起光遮光マスク４１では、開口数ＮＡが低い励起光５を中心部分に設けられた反射領域４１ａで遮光し、試料から広い角度で出射される蛍光６や散乱光７は透過領域４１ｂを通過し、各検出器に入射する構成となっている。
ここで、励起光遮光マスク４１の反射領域４１ａは、より大きい方が励起光５の遮光性に優れるが、その場合、信号強度が小さい蛍光６及び散乱光７の感度が低下してしまうという問題がある。このため、蛍光６及び散乱光７を高感度で検出するためには、励起光遮光マスク４１の反射領域４１ａは、励起光５のＮＡを遮光できる最低限の大きさであることが望ましい。
なお、反射領域４１ａが励起光５のＮＡを大幅に超えると、蛍光６及び散乱光７の検出感度が低下することがある。また、反射領域４１ａが励起光５のＮＡと同等又は励起光５のＮＡ未満であると、透過領域４１ｂを通過する光にビーム強度が強い励起光５が混入してしまい、蛍光６及び散乱光７の測定に支障をきたすことがある。更に、光学部品の内部反射などによる迷光（励起光５）の混入も、測定に支障をきたすので、迷光及び散乱光以外の励起光成分は除去することが望ましい。
（ＬＰＦ４２）
ＬＰＦ４２は、蛍光６と散乱光７を分離するものであり、特定波長の光のみを反射し、それ以外の波長成分を透過する構成となっている。具体的には、ＬＰＦ４２では、散乱光７を反射し、蛍光６を透過する。
ＬＰＦ４２は、蛍光６と散乱光７を分離するものであり、特定波長の光のみを反射し、それ以外の波長成分を透過する構成となっている。具体的には、ＬＰＦ４２では、散乱光７を反射し、蛍光６を透過する。
（蛍光検出器）
蛍光検出器は、試料から発せられる蛍光６を検出可能なものであればよく、特に限定されるものではないが、例えばＰＤ（Photo diode）、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）又はＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube）などを使用することができる。
蛍光検出器は、試料から発せられる蛍光６を検出可能なものであればよく、特に限定されるものではないが、例えばＰＤ（Photo diode）、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）又はＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube）などを使用することができる。
（リレーレンズ系）
リレーレンズ系は、所定の間隔で配置された２枚のレンズ４３ａ，４３ｂにより構成されており、倍率が１倍で、ＮＡ分離マスク４５上に、対物レンズ４０の瞳と共役な面を形成する。なお、これらレンズ４３ａとレンズ４３ｂとの間には、ピンホール４４を配設してもよく、これにより外乱成分を除去することができる。このピンホール４４としては、例えば遮光プレートなどを使用することができる。
リレーレンズ系は、所定の間隔で配置された２枚のレンズ４３ａ，４３ｂにより構成されており、倍率が１倍で、ＮＡ分離マスク４５上に、対物レンズ４０の瞳と共役な面を形成する。なお、これらレンズ４３ａとレンズ４３ｂとの間には、ピンホール４４を配設してもよく、これにより外乱成分を除去することができる。このピンホール４４としては、例えば遮光プレートなどを使用することができる。
（ＮＡ分離マスク４５）
図３はＮＡ分離マスク４５の構成を模式的に示す図である。ＮＡ分離マスク４５は、入射する散乱光７を、側方散乱成分７ａと、前方散乱成分７ｂとに分離するものであり、例えば、特定の開口数以下の低ＮＡ成分を透過し、それよりも開口数が高い高ＮＡ成分を反射する構成とすることができる。又は、低ＮＡ成分を反射し、それよりも開口数が高い高ＮＡ成分を透過する構成としてもよい。
図３はＮＡ分離マスク４５の構成を模式的に示す図である。ＮＡ分離マスク４５は、入射する散乱光７を、側方散乱成分７ａと、前方散乱成分７ｂとに分離するものであり、例えば、特定の開口数以下の低ＮＡ成分を透過し、それよりも開口数が高い高ＮＡ成分を反射する構成とすることができる。又は、低ＮＡ成分を反射し、それよりも開口数が高い高ＮＡ成分を透過する構成としてもよい。
更に、ＮＡ分離マスク４５を、低ＮＡ成分としては例えば開口数ＮＡが０．３以下の光とし、高ＮＡ成分を例えば開口数ＮＡが０．６以上の光とし、開口数ＮＡが０．３を超え０．６未満の成分を検出しない構成することもできる。開口数ＮＡが０．３を超え０．６未満の領域は、低ＮＡ成分と高ＮＡ成分とが混在しているため、この領域の成分を検出しないようにすることにより、高ＮＡ成分を検出する散乱光検出器４７への前方散乱成分７ｂの混入を低減することができる。その結果、散乱光検出器４７，４９におけるＳＮ比が向上する。
そのようなＮＡ分離マスク４５としては、例えば、図３に示すように、中心部分に透過領域４５ａが設けられ、その周囲に吸収領域４５ｂが、更にその外側に反射領域４５ｃが設けられた構成とすることができる。これにより、入射した散乱光７のうち開口数ＮＡが低い前方散乱成分７ｂを透過し、開口数ＮＡが高い側方散乱成分７ａが反射される。その結果、前方散乱成分７ｂのみが検出器４９で検出され、側方散乱成分７ａのみが検出器４７で検出されることとなる。
又は、透過領域と反射領域とを入れ替え、中心部分に反射領域を設け、その周囲に吸収領域を、更にその外側に透過領域が設けられた構成としてもよい。この場合、入射した散乱光のうち開口数ＮＡが低い前方散乱成分が反射され、開口数ＮＡが高い側方散乱成分が透過されるため、検出器４７で前方散乱成分を検出し、検出器４９で側方散乱成分を検出することとなる。
（集光レンズ４６，４８）
集光レンズ４６，４８は、側方散乱成分７ａ及び前方散乱成分７ｂを、それぞれ散乱光検出器４７，４９に向けて集光するものであり、例えば凸レンズ、フレネルレンズ、球面レンズなどを使用することができる。
集光レンズ４６，４８は、側方散乱成分７ａ及び前方散乱成分７ｂを、それぞれ散乱光検出器４７，４９に向けて集光するものであり、例えば凸レンズ、フレネルレンズ、球面レンズなどを使用することができる。
（散乱光検出器４７，４９）
散乱光検出器４７は、試料から発せられた側方散乱成分７ａを検出するものであり、散乱光検出器４９は試料から発せられた前方散乱成分７ｂを検出するものであり、例えばＰＤ、ＣＣＤ、ＰＭＴ及びパワーメータなどを使用することができる。
散乱光検出器４７は、試料から発せられた側方散乱成分７ａを検出するものであり、散乱光検出器４９は試料から発せられた前方散乱成分７ｂを検出するものであり、例えばＰＤ、ＣＣＤ、ＰＭＴ及びパワーメータなどを使用することができる。
［光学的測定装置１の動作］
次に、本実施形態の光学的測定装置１により、分析チップ３を使用して、微小粒子などの試料を測定する方法について説明する。なお、本実施形態の光学的測定装置１により測定される試料は、励起光５を照射することにより、蛍光６及び散乱光７を発するものであればよく、例えば、細胞やマイクロビーズ等の微小粒子、ウィルス、バクテリア、酵母などが挙げられる。また、試料は、１又は複数の蛍光色素で修飾されていてもよい。
次に、本実施形態の光学的測定装置１により、分析チップ３を使用して、微小粒子などの試料を測定する方法について説明する。なお、本実施形態の光学的測定装置１により測定される試料は、励起光５を照射することにより、蛍光６及び散乱光７を発するものであればよく、例えば、細胞やマイクロビーズ等の微小粒子、ウィルス、バクテリア、酵母などが挙げられる。また、試料は、１又は複数の蛍光色素で修飾されていてもよい。
本実施形態の光学的測定装置１では、先ず、光照射部２の光源２０から、分析チップ３の検出領域３１に向けて励起光５を出射し、分析チップ３のマイクロ流路を通流する試料に励起光５を照射する。このとき、測定対象の試料はマイクロ流路内を一列に並んで通流しているため、各試料に励起光５を個別に照射することができる。そして、これにより、試料からは励起光５と同波長の散乱光７と、励起光５よりも長波長の蛍光６が放出される。
一方、試料から発せられた散乱光７及び蛍光６の信号強度は非常に小さいため、これらを精度よく検出するためには、励起光５と分離する必要がある。そこで、本実施形態の光学的測定装置１では、検出部４に入射した光を対物レンズ４０で捕捉した後、励起光遮光マスク４１によって検出部４に入射した光から励起光５を分離除去する。具体的には、開口数ＮＡが０．１未満で入射する励起光５をマスク中心部の反射領域４１ａで遮光し、開口数ＮＡが０．１以上の広い角度で放出される散乱光７及び蛍光６は透過領域４１ｂを介して入射させる。
そして、蛍光６は、ＬＰＦ４２を透過し、蛍光検出器（図示せず）で検出される。一方、ＬＰＦ４２で反射された散乱光７は、対物レンズ４０の瞳と共役な面が形成されるように構成されたリレーレンズ系（レンズ４３ａ，４３ｂ）を通過し、ＮＡ分離マスク４５によって、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとに分離される。これにより、対物レンズ４０の焦点面で生じたフォーカスずれ、光軸ずれの影響が軽微となる光学的位置にて、ＮＡ分離を行うことができるため、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとを高精度で分離することができる。
具体的には、ＮＡ分離マスク４５において、低ＮＡ成分は透過（又は反射）し、高ＮＡ成分は反射（又は透過）し、それぞれ集光レンズ４６，４８を介して、散乱光検出器４７，４９に入射する。そして、例えば散乱光検出器４７では、側方散乱成分７ａの強度を測定し、例えば試料（細胞）の形態や内部構造に関する情報を得る。一方、散乱光検出器４９では、前方散乱成分７ｂの強度を測定し、例えば試料の大きさに関する情報を得る。
ここで、散乱光の特徴として、試料（微小粒子）のサイズが大きくなるに従い、前方への指向性が強くなり、側方及び後方へは散乱しなくなる。光の波長程度以上の大きさの粒子による光の散乱現象をミー散乱と言い、特に、粒子径が励起光５の波長の１０倍以上の比較的大きいものである場合、かつ散乱角度が比較的小さな場合には、ミー散乱はフラウンホーファ回折で近似することができる。
即ち、前方散乱成分７ｂは粒子外径に依存した散乱情報（フラウンホーファ回折）を多く含み、側方散乱成分７ａは粒子の微細な内部情報（ミー散乱）を多く含むことが一般に知られている。そして、前方方向（励起光５の進行方向側）における高ＮＡ成分は、低ＮＡ成分よりも散乱角度が大きいため、側方散乱成分７ａをより多く検出することができる。
ここで、例えば高ＮＡ成分と低ＮＡ成分とを分離する際、高ＮＡ成分の基準となるＮＡが低いと、分離した高ＮＡ成分中に前方散乱成分が多く含まれることとなる。その場合、下記数式（１）に示すように、高ＮＡ成分から、低ＮＡ成分と任意の係数ｋ（ｋは正数）との積とを引いた差分を、側方散乱成分とすればよい。
このように、本実施形態の光学的測定装置１では、試料から発せられた側方散乱成分７ａ及び前方散乱成分７ｂの両方を、励起光５の進行方向側で検出しているため、分析チップ３の手前で散乱光を検出する必要がない。これにより、この後方散乱検出（側方散乱成分の励起光５の進行方向後方側での検出）のための光学系を排除することができ、軸調整も不要となる。
また、本実施形態の光学測定装置１では、測定の際、励起光５の焦点、前方散乱成分７ｂ及び蛍光６の焦点の２つの焦点を合わせればよいため、調整が容易となる。更に、従来に比べて調整軸が少ないため、装置の安定化及び低コスト化を実現することができる。
更にまた、側方散乱光は信号強度が弱いため、従来の装置ではＰＭＴで検出していたが、励起光５の進行方向に対して前方側での検出は、後方側での検出よりも、信号強度が強いため、ＰＤでの検出が可能となる。これにより、検出部４の構成をコンパクトにすることができるため、装置を小型化及び低コスト化することが可能となる。
更に、分析チップ３を使用して細胞などの微小粒子を測定する場合、励起光５の進行方向に対して斜め後方側での検出は、チップ３の厚さの誤差によりコマ収差が発生し、検出精度に大きく影響していたが、前方側での検出ではチップ厚さの影響が小さい。これにより、分析チップ３を用いた場合でも、高精度で測定することができる。
＜２．第２の実施の形態＞
［光学的測定装置１１の全体構成］
図４は本発明の第２の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図４においては、前述した第１の実施形態の光学的測定装置１の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図４に示すように、本実施形態の光学的測定装置１１は、検出部１４に、励起光遮光マスク４１に代えてＮＡ分離マスク５０を、ＮＡ分離マスク４５に代えてＮＡ分離ミラー５１を、それぞれ配設した以外は、前述した第１の実施形態と同様である。
［光学的測定装置１１の全体構成］
図４は本発明の第２の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図４においては、前述した第１の実施形態の光学的測定装置１の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図４に示すように、本実施形態の光学的測定装置１１は、検出部１４に、励起光遮光マスク４１に代えてＮＡ分離マスク５０を、ＮＡ分離マスク４５に代えてＮＡ分離ミラー５１を、それぞれ配設した以外は、前述した第１の実施形態と同様である。
［ＮＡ分離マスク５０］
図５はＮＡ分離マスク５０の構成を模式的に示す図である。ＮＡ分離マスク５０は、対物レンズ４０で捕捉された光から励起光５、及び側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとが混在する領域の光を取り除くものである。具体的には、開口数ＮＡが０．１未満及び０．３を超え０．６未満の成分を反射し、開口数ＮＡが０．１〜０．３及び０．６以上の成分を透過する構成とすることができる。
図５はＮＡ分離マスク５０の構成を模式的に示す図である。ＮＡ分離マスク５０は、対物レンズ４０で捕捉された光から励起光５、及び側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとが混在する領域の光を取り除くものである。具体的には、開口数ＮＡが０．１未満及び０．３を超え０．６未満の成分を反射し、開口数ＮＡが０．１〜０．３及び０．６以上の成分を透過する構成とすることができる。
このようなＮＡ分離マスク５０としては、例えば、図５に示すように、中心部分に反射領域５０ａが設けられ、その周囲に透過領域５０ｂを設け、更にその外側に反射領域５０ｃとし、それよりも外側は透過領域５０ｄとした構成とすることができる。これにより、蛍光６、側方散乱成分７ａ及び前方散乱成分７ｂが透過し、励起光５や側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとが混在する領域の光は反射されることとなる。その結果、検出対象の蛍光６、側方散乱成分７ａ及び前方散乱成分７ｂのみを、ＬＰＦ４２に入射させることができる。
［ＮＡ分離ミラー５１］
図６はＮＡ分離ミラー５１の構成を模式的に示す図である。ＮＡ分離ミラー５１は、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとを分離するものであり、例えば、開口数ＮＡが０．６未満の成分を透過し、開口数ＮＡが０．６を超える成分を反射する構成とすることができる。この場合、中心部分に透過領域５１ａを設け、その周囲に反射領域５１ｂを設けた構成とすればよい。これにより、前方散乱成分７ｂのみが検出器４９で検出され、側方散乱成分７ａのみが検出器４７で検出されることとなる。
図６はＮＡ分離ミラー５１の構成を模式的に示す図である。ＮＡ分離ミラー５１は、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとを分離するものであり、例えば、開口数ＮＡが０．６未満の成分を透過し、開口数ＮＡが０．６を超える成分を反射する構成とすることができる。この場合、中心部分に透過領域５１ａを設け、その周囲に反射領域５１ｂを設けた構成とすればよい。これにより、前方散乱成分７ｂのみが検出器４９で検出され、側方散乱成分７ａのみが検出器４７で検出されることとなる。
［光学的測定装置１１の動作］
次に、本実施形態の光学的測定装置１１の動作について説明する。この光学的測定装置１１では、検出部１４に入射した光を対物レンズ４０で捕捉した後、ＮＡ分離マスク５０によって、検出部１４に入射した光から励起光５及び側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂが混在する領域の光を分離除去する。具体的には、開口数ＮＡが０．１未満で入射する励起光５をマスク中心部の反射領域５０ａで遮光する。開口数ＮＡが０．１以上の広い角度で放出される散乱光７及び蛍光６は透過領域５０ｂ，５０ｄを介して入射させるが、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂが混在する領域の光は反射領域５０ｃで遮光する。
次に、本実施形態の光学的測定装置１１の動作について説明する。この光学的測定装置１１では、検出部１４に入射した光を対物レンズ４０で捕捉した後、ＮＡ分離マスク５０によって、検出部１４に入射した光から励起光５及び側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂが混在する領域の光を分離除去する。具体的には、開口数ＮＡが０．１未満で入射する励起光５をマスク中心部の反射領域５０ａで遮光する。開口数ＮＡが０．１以上の広い角度で放出される散乱光７及び蛍光６は透過領域５０ｂ，５０ｄを介して入射させるが、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂが混在する領域の光は反射領域５０ｃで遮光する。
その後、蛍光６は、ＬＰＦ４２を透過し、蛍光検出器（図示せず）で検出される。一方、ＬＰＦ４２で反射された散乱光７（側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂ）は、対物レンズ４０の瞳と共役な面が形成されるように構成されたリレーレンズ系（レンズ４３ａ，４３ｂ）を通過し、ＮＡ分離ミラー５１によって、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとに分離される。これにより、対物レンズ４０の焦点面で生じたフォーカスずれ、光軸ずれの影響が軽微となる光学的位置にて、ＮＡ分離を行うことができるため、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとを高精度で分離することができる。
具体的には、ＮＡ分離ミラー５１において、低ＮＡ成分は透過（又は反射）し、高ＮＡ成分は反射（又は透過）して、それぞれ集光レンズ４６，４８を介して、散乱光検出器４７，４９に入射する。そして、例えば散乱光検出器４７では、側方散乱成分７ａの強度を測定し、例えば試料（細胞）の形態や内部構造に関する情報を得る。一方、散乱光検出器４９では、前方散乱成分７ｂの強度を測定し、例えば試料の大きさに関する情報を得る。
このように、本実施形態の光学的測定装置１１では、ＬＰＦ４２の手前に配置されたＮＡ分離マスク５０により、励起光５と共に、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとが混在する領域の光が遮光されている。このため、分離ミラー５１により、高精度で、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとに分離することができる。
なお、本実施形態の光学的測定装置１１における上記以外の構成、動作及び効果は、前述した第１の実施形態と同様である。
＜３．第３の実施の形態＞
［光学的測定装置１２の全体構成］
前述した第１及び第２の実施形態においては、蛍光及び散乱光の両方を検出する場合について述べたが、本発明はこれに限定されるものではなく、蛍光を検出しない装置にも適用することができる。図７は本発明の第３の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図７においては、前述した第１の実施形態の光学的測定装置１の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図７に示すように、本実施形態の光学的測定装置１２は、検出部２４が、散乱光のみを検出する構成となっている。
［光学的測定装置１２の全体構成］
前述した第１及び第２の実施形態においては、蛍光及び散乱光の両方を検出する場合について述べたが、本発明はこれに限定されるものではなく、蛍光を検出しない装置にも適用することができる。図７は本発明の第３の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図７においては、前述した第１の実施形態の光学的測定装置１の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図７に示すように、本実施形態の光学的測定装置１２は、検出部２４が、散乱光のみを検出する構成となっている。
［検出部２４の構成］
検出部２４は、励起光５が照射された試料から発せられた散乱光を検出するものであり、少なくとも、試料から発せられた散乱光を検出する散乱光検出器４７，４９が設けられている。また、試料と散乱光検出器４７，４９との間には、試料側から順に、対物レンズ４０、ＮＡ分離マスク５２、集光レンズ４６，４８が配設されている。
検出部２４は、励起光５が照射された試料から発せられた散乱光を検出するものであり、少なくとも、試料から発せられた散乱光を検出する散乱光検出器４７，４９が設けられている。また、試料と散乱光検出器４７，４９との間には、試料側から順に、対物レンズ４０、ＮＡ分離マスク５２、集光レンズ４６，４８が配設されている。
この光学的測定装置１２では、対物レンズ４０の瞳にＮＡ分離マスク５２が配置されており、この位置で側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとを分離するため、リレーレンズ系は不要となる。
［ＮＡ分離マスク５２］
図８はＮＡ分離マスク５２の構成を模式的に示す図である。ＮＡ分離マスク５２は、対物レンズ４０で捕捉された光から励起光５、及び側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとが混在する領域の光を取り除くと共に、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとを分離するものである。具体的には、開口数ＮＡが０．１未満及び０．３を超え０．６未満の成分を吸収し、開口数ＮＡが０．１〜０．３の成分を透過（又は反射）し、更に、及び開口数ＮＡが０．６以上の成分を反射（又は透過）する構成とすることができる。
図８はＮＡ分離マスク５２の構成を模式的に示す図である。ＮＡ分離マスク５２は、対物レンズ４０で捕捉された光から励起光５、及び側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとが混在する領域の光を取り除くと共に、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとを分離するものである。具体的には、開口数ＮＡが０．１未満及び０．３を超え０．６未満の成分を吸収し、開口数ＮＡが０．１〜０．３の成分を透過（又は反射）し、更に、及び開口数ＮＡが０．６以上の成分を反射（又は透過）する構成とすることができる。
このＮＡ分離マスク５２としては、例えば、図８に示すように、中心部分に吸収領域５２ａが設けられ、その周囲に透過領域５２ｂを設け、更にその外側に吸収領域５２ｃとし、それよりも外側は反射領域５２ｄとした構成のものを使用することができる。これにより、励起光５や側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとが混在する領域の光はＮＡ分離マスク５２に吸収され、除去される。また、開口数ＮＡが高い側方散乱成分７ａはＮＡ分離マスク５２で反射され、検出器４７に入射する。一方、開口数ＮＡが低い前方散乱成分７ｂはＮＡ分離マスク５２を透過し、検出器４９に入射する。
又は、透過領域と反射領域とを入れ替えて、吸収領域５２ａの周囲に反射領域を設け、その外側の吸収領域５２ｃの周囲を透過領域とした構成でもよい。この場合、開口数ＮＡが低い前方散乱成分はＮＡ分離マスクで反射され検出器４７に入射すると共に、開口数ＮＡが高い側方散乱成分はＮＡ分離マスクを透過して検出器４９に入射する。
［光学的測定装置１２の動作］
次に、本実施形態の光学的測定装置１２の動作について説明する。この光学的測定装置１２では、検出部２４に入射した光を対物レンズ４０で捕捉した後、その瞳に配設されたＮＡ分離マスク５２によって、励起光５及び側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂが混在する領域の光が除去されると共に、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとが分離される。そして、側方散乱成分７ａ及び前方散乱成分７ｂは、それぞれ検出器４７及び検出器４９で検出される。
次に、本実施形態の光学的測定装置１２の動作について説明する。この光学的測定装置１２では、検出部２４に入射した光を対物レンズ４０で捕捉した後、その瞳に配設されたＮＡ分離マスク５２によって、励起光５及び側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂが混在する領域の光が除去されると共に、側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとが分離される。そして、側方散乱成分７ａ及び前方散乱成分７ｂは、それぞれ検出器４７及び検出器４９で検出される。
例えば、図８に示すＮＡ分離マスク５２を使用した場合、開口数ＮＡが０．１未満で入射する励起光５を吸収領域５２ａで遮光すると共に、励起光５や側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとが混在する領域の光を吸収領域５２ｃで遮光する。また、開口数ＮＡが０．１〜０．３の低ＮＡ成分（前方散乱成分７ｂ）は、透過領域５２ｂを透過した後、集光レンズ４８で集光され、検出器４９で検出される。一方、開口数ＮＡが０．６以上の高ＮＡ成分（側方散乱成分７ａ）は、反射領域５２ｄで反射された後、集光レンズ４６で集光され、検出器４７で検出される。
このように、本実施形態の光学的測定装置１２では、対物レンズ４０の瞳にＮＡ分離マスク５２を配置し、この位置で側方散乱成分７ａと前方散乱成分７ｂとの分離を行っているため、リレーレンズ系が不要となる。なお、本実施形態の光学的測定装置１２における上記以外の構成、動作及び効果は、前述した第１及び第２の実施形態と同様である。
以下、本発明の実施例により、本発明の効果について具体的に説明する。図９は本実施例で使用した光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。本実施例においては、図９に示す構成の光学的測定装置１３を使用して、側方散乱光７ａ，７ｃを、励起光５の進行方向の前方側及び後方側で測定し、その結果を比較した。
その際、ＮＡ分離マスク５０としては、開口数ＮＡが０．１〜０．３及び開口数ＮＡが０．６以上の成分のみを透過するようにし、開口数ＮＡが０．１未満及び開口数ＮＡが０．３を超え０．６未満の成分は反射するものを使用した。また、ＮＡ分離ミラー５１としては、開口数ＮＡが０．６未満の成分を透過し、開口数ＮＡが０．６以上の成分を反射するものを使用した。これにより、散乱光検出器４７には開口数ＮＡが０．６以上の成分が入射し、散乱光検出器４９には開口数ＮＡが０．１〜０．３の成分が入射するようにした。
励起光５の進行方向後方側の散乱光検出器６２にはＰＭＴを使用し、前方側の散乱光検出器４７，４９にはＰＤを使用した。リレーレンズ系にはｆ９０のレンズを２枚（レンズ４３ａ，４３ｂ）使用した。また、ピンホール４４の直径はφ０．８ｍｍとした。更に、側方散乱光７ｃを検出する散乱光検出器６２の手前には、集光レンズ６０及びピンホール６１を配置した。
図１０（ａ）及び（ｂ）は図９に示す装置を使用して側方散乱光を検出した結果を示す図である。図１０（ａ）は前方散乱成分７ｂ（開口数ＮＡが０．１〜０．３の成分）と励起光５の進行方向の後方側で測定した側方散乱成分７ｃとを比較した図であり、図１０（ｂ）は前方散乱成分７ｂと、励起光５の進行方向の前方側で測定した側方散乱成分７ａとを比較した図である。図１０（ｂ）に示すように、励起光５の進行方向の前方側で側方散乱成分７ａを測定しても、図１０（ａ）に示す励起光５の進行方向の前方側で側方散乱光７ｃを測定した場合と、同様の結果が得られた。
１、１１、１２、１３、１００ 光学的測定装置
２ 光照射部
３、１０２ 分析チップ
４、１４、２４ 検出部
５、１１１ 励起光
６ 蛍光
７ 散乱光
７ａ、７ｃ、１１２ 側方散乱成分
７ｂ、１１３ 前方散乱成分
２０、１０１ 光源
３１、１０９ 検出領域
４０、１０６ 対物レンズ
４１、１０７ 励起光遮光マスク
４２、１０８ ＬＰＦ
４３ａ、４３ｂ リレーレンズ
４４、６１、１０４ ピンホール
４５、５０、５２ ＮＡ分離マスク
４６、４８、６０、１０３ 集光レンズ
４７、４９、６２、１０５ 散乱光検出器
５１ ＮＡ分離ミラー
１１０ 微小粒子
２ 光照射部
３、１０２ 分析チップ
４、１４、２４ 検出部
５、１１１ 励起光
６ 蛍光
７ 散乱光
７ａ、７ｃ、１１２ 側方散乱成分
７ｂ、１１３ 前方散乱成分
２０、１０１ 光源
３１、１０９ 検出領域
４０、１０６ 対物レンズ
４１、１０７ 励起光遮光マスク
４２、１０８ ＬＰＦ
４３ａ、４３ｂ リレーレンズ
４４、６１、１０４ ピンホール
４５、５０、５２ ＮＡ分離マスク
４６、４８、６０、１０３ 集光レンズ
４７、４９、６２、１０５ 散乱光検出器
５１ ＮＡ分離ミラー
１１０ 微小粒子
Claims (9)
- 流路内を通流する試料に励起光を照射する光照射部と、
励起光が照射された試料から発せられた散乱光を、前記励起光の進行方向前方側で検出する散乱光検出部と、を有し、
前記散乱光検出部は、少なくとも、
前記散乱光を、特定の開口数以下の低開口数成分と、それよりも開口数が高い高開口数成分とに分離する散乱光分離マスクと、
前記散乱光分離マスク上に対物レンズの瞳と共役面を形成するリレーレンズ系と、
前記低開口数成分を検出し、前記試料の大きさに関する情報を得る第１検出器と、
前記高開口数成分を検出し、前記試料の形態及び／又は内部構造に関する情報を得る第２検出器と、
を備える光学的測定装置。 - 前記散乱光分離マスクには、前記低開口数成分よりも開口数が高く前記高開口数成分よりも開口数が低い成分を吸収する吸収領域が設けられている請求項１に記載の光学的測定装置。
- 前記散乱光分離マスクは、中心部分に前記低開口数成分を透過又は反射する領域が設けられており、その周囲に前記吸収領域が設けられ、更にその外側に前記高開口数成分を反射又は透過する領域が設けられている請求項２に記載の光学的測定装置。
- 前記低開口数成分は、開口数が０．３以下である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
- 前記高開口数成分は、開口数が０．６以上である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
- マイクロ流路を備えた分析チップを有し、前記光照射部は前記マイクロ流路内を通流する試料に励起光を照射する請求項１乃至５のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
- 更に、励起光を除去する励起光遮光マスクを有する請求項１乃至６のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
- 励起光が照射された試料から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部を有し、前記試料と蛍光検出部及び散乱光検出部との間には、蛍光と散乱光とを分離するフィルターが配設されている請求項１乃至７のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
- 測定対象の試料に励起光を照射する工程と、
励起光が照射された試料から発せられた散乱光を、前記励起光の進行方向前方側において、一の散乱光分離マスクにより特定の開口数以下の低開口数成分と、それよりも開口数が高い高開口数成分とに分離する工程と、
前記低開口数成分と前記高開口数成分とを個別に検出する工程と、
前記低開口数成分の強度から前記試料の大きさに関する情報を得ると共に、前記高開口数成分の強度から前記試料の形態及び／又は内部構造に関する情報を得る工程と、
を有する光学的測定方法。
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