JP6249049B2 - 微小粒子測定装置 - Google Patents

Description

本技術は、微小粒子測定装置に関する。より詳しくは、微小粒子に均一な強度でレーザを照射するために十分な大きさのビームスポットを形成可能な微小粒子測定装置に関する。

細胞などの微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定装置（例えばフローサイトメータ）が知られている。

フローサイトメータでは、フローセル又はマイクロチップに形成された流路に細胞を含むサンプル液を送液し、流路内を通流する細胞にレーザを照射して細胞から発生する蛍光又は散乱光を検出器で検出することにより、細胞の光学特性を測定している。また、フローサイトメータでは、光学特性の測定の結果、所定の条件を満たすと判定されたポピュレーション（群）を、細胞中から分別回収することも行われている。

例えば、特許文献１には、マイクロチップ型のフローサイトメータとして、「微小粒子を含む液体が通流される流路と、この流路を通流する液体をチップ外の空間に排出するオリフィスと、が配設されたマイクロチップと、オリフィスにおいて液体を液滴化して吐出するための振動素子と、吐出される液滴に電荷を付与するための荷電手段と、流路を通流する微小粒子の光学特性を検出する光学検出手段と、チップ外の空間に吐出された液滴の移動方向に沿って、移動する液滴を挟んで対向して配設された対電極と、対電極間を通過した液滴を回収する二以上の容器と、を備える微小粒子分取装置」が開示されている。

フローサイトメータでは、流路を通流する細胞に均一な強度でレーザを照射するため、流路に集光されるレーザのビームスポットを、スポット径が流路幅に対して十分な大きさとなるように形成している。ビームスポットを流路幅に対して十分に大きく形成することで、各細胞が流路中の通流位置に依らずにビームスポットを通過するようになるため、全ての細胞に均一な強度のレーザを照射できる。

特許文献２には、光源からの光を、複数領域に分割された位相段差素子を透過させて、微小粒子が通流するサンプル流に集光する光照射系を備えた微小粒子測定装置が開示されている。この微小粒子装置では、位相段差素子の各領域を透過する光の波面間に位相差を生じさせることにより、広範囲に均一な強度分布を有するビームスポットを形成し、サンプル流中の微小粒子に照射されるレーザの実効強度を均一化させている。

特開２０１０−１９０６８０号公報 特開２０１２−２６７５４号公報

微小粒子測定装置において、スポット径が大きいビームスポットを形成するためには、ビームスポットの結像レンズの開口数（ＮＡ）を小さくする必要がある。特に、レーザの波長に対してスポット径を大きくしたい場合には、ＮＡは極めて小さくなる。

光源から出射されたレーザのビームスポットを一対の結像レンズで形成する場合、上記の事情のため、２つの結像レンズ間の距離がそれぞれの結像レンズの焦点距離の和とされることが、良好な結像のための条件となる。しかし、それぞれの結像レンズの焦点距離が小さい場合には、２つの結像レンズを接触して配置させたとしても結像レンズ間の距離が焦点距離の和よりも大きくなってしまい、上記の条件を満たすことができない。このため、従来の微小粒子測定装置では、ＮＡが小さい結像レンズを用いて所望のスポット径を有するビームスポットを形成することは困難であった。

そこで、本技術は、所望の大きさを有するビームスポットを形成可能な微小粒子測定装置を提供することを主な目的とする。

上記課題解決のため、本技術は、光源と、前記光源から出射されたレーザのビームスポットを微小粒子に結像させる第一の結像レンズと第二の結像レンズとからなる結像レンズ系と、前記第一の結像レンズと前記第二の結像レンズとの間に配置された第一のリレーレンズと第二のリレーレンズとからなるリレーレンズ系と、前記第二のリレーレンズと前記第二の結像レンズとの間に配置された光学フィルタと、前記レーザの照射により前記微小粒子から発生する蛍光又は散乱光を検出する検出器と、前記光学フィルタと前記検出器との間に配置された光ファイバと、を備え、前記検出器は、前記光学フィルタ及び光ファイバを介して前記蛍光又は散乱光を検出する微小粒子測定装置を提供する。
前記光学フィルタは、前記蛍光又は前記散乱光を反射するミラーであってもよい。
前記微小粒子測定装置は、前記光源から出射された前記レーザを伝送する光ファイバと、該光ファイバから出射される前記レーザの前記ビームスポットを形成するレンズ系と、を備えてもよい。
前記ビームスポットを形成するレンズ系は、コリメータレンズと一対のシリンダーレンズを含んでもよい。
前記微小粒子は、流路内を流れるサンプル流に含まれる細胞であってもよい。
前記微小粒子は、マイクロチップ中の流路を流れるサンプル流に含まれる細胞であってもよい。
前記細胞に結像されるビームスポットは、前記サンプル流の送液方向と直交する幅方向に幅広な楕円形状を有していてもよい。
前記細胞に結像されるビームスポットは、前記サンプル流の送液方向と直交する幅方向の前記サンプル流の長さと同等もしくは長く形成されてもよい。

本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。

本技術により、所望の大きさを有するビームスポットを形成可能な微小粒子測定装置が提供される。

本技術に係る微小粒子測定装置の照射系及び検出系の構成を説明するための図である。 微小粒子を含むサンプル流に結像されるビームスポットの好適な大きさ及び形状の一例を説明する図である。

以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。

１．照射系
２．検出系

１．照射系
図１は、本技術に係る微小粒子測定装置の照射系及び検出系の構成を説明する模式図である。

不図示の光源から出射された光（図１中実線参照）は、光ファイバ１によって伝送され、コリメータレンズ２１、シリンダーレンズ２２及びシリンダーレンズ２３とからなるレンズ系２に入射する。図中矢印Ｆ_１は、光源から光ファイバ１への光の入射方向を示す。光源には、従来公知のものを使用すればよいが、例えばレーザ又はＬＥＤを好適に用いることができる。また、光源には、互いに異なる波長の光を放射する複数の光源を組み合わせて用いてもよい。

レンズ系２は、光学経路上の符号Ｑで示す位置に、光ファイバ１の出射端１１から出射した光（以下「レーザ」とも称する）のビームスポットを形成する。コリメータレンズ２１は、点光源となる出射端１１から出射したレーザを平行光とする。シリンダーレンズ２２及びシリンダーレンズ２３は、互いに直交する方向にレンズパワーを有しており、ビームスポットを所定の大きさ及び形状で形成するために機能する（詳しくは後述する）。

符号Ｑで示す位置に形成されたビームスポットは、第一の結像レンズ３１及び第二の結像レンズ３２からなる結像レンズ系３により、微小粒子Ｐを含むサンプル流Ｓに対して結像される。サンプル流Ｓは、フローセル又はマイクロチップに形成された流路を送液されるサンプル液の流れである。光ファイバ１の出射端１１からサンプル流Ｓまでのレーザの進行方向を図中Ｚ軸正方向で、サンプル流Ｓの送流方向を図中Ｙ軸正方向で示す。

本技術に係る微小粒子測定装置において、光ファイバ１、レンズ系２及び結像レンズ系３は、光源から出射されたレーザを微小粒子Ｐに照射するための照射系を構成する。ただし、光ファイバ１は、照射系の必須の構成となるものではない。

第一の結像レンズ３１及び第二の結像レンズ３２との間には、第一のリレーレンズ４１及び第二のリレーレンズ４２とからなるリレーレンズ系４が配置されている。結像レンズ系３とリレーレンズ系４は、いわゆる「４ｆ光学系」を構成しており、第一の結像レンズ３１、第一のリレーレンズ４１、第二のリレーレンズ４２及び第二の結像レンズ３２は以下のような位置関係を有して配置されている。すなわち、第一のリレーレンズ４１は、第一の結像レンズ３１との間の距離が第一のリレーレンズ４１の焦点距離ｆ_４１に等しい位置に配されている。第二のリレーレンズ４２は、第一のリレーレンズ４１との間の距離が第一のリレーレンズ４１の焦点距離ｆ_４１と第二のリレーレンズ４２の焦点距離ｆ_４２との和（ｆ_４１＋ｆ_４２）に等しい位置に配されている。また、第二のリレーレンズ４２は、第二の結像レンズ３２との間の距離が第二のリレーレンズ４２の焦点距離ｆ_４２に等しい位置に配されている。

４ｆ光学系によるビームスポットのスポット径の変換倍率Ｍは、第一のリレーレンズ４１の焦点距離ｆ_４１と第二のリレーレンズ４２の焦点距離ｆ_４２とを用いて「Ｍ＝ｆ_４２／ｆ_４１」の式で表される。従って、符号Ｑで示す位置に形成されたビームスポットは、結像レンズ系３及びリレーレンズ系４とからなる４ｆ光学系によってスポット径がＭ倍に変換されたビームスポットとしてサンプル流Ｓに結像される。

第一のリレーレンズ４１の焦点距離ｆ_４１と第二のリレーレンズ４２の焦点距離ｆ_４２が等しく、かつ第一の結像レンズ３１及び第二の結像レンズ３２の焦点距離も等しい場合、符号Ｑで示す位置に形成されたビームスポットと等倍のビームスポットがサンプル流Ｓに結像される。

従って、互いに直交する方向にレンズパワーを有するシリンダーレンズ２２及びシリンダーレンズ２３によって、所望の大きさ及び形状のビームスポットを符号Ｑで示す位置に形成しておけば、同じ大きさ及び形状のビームスポットをサンプル流Ｓに照射できる。また、この際、４ｆ光学系では収差を小さく抑えることもできる。

図２に、微小粒子Ｐを含むサンプル流Ｓに結像されるビームスポットの好適な大きさ及び形状の一例を示す。

サンプル流Ｓに結像されるビームスポットＢは、サンプル流Ｓの幅方向に幅広な形状を有していることが好ましい。また、ビームスポットＢは、同方向のスポット径がサンプル流Ｓの幅と同等かそれよりも大きくされていることが好ましい。具体的には、サンプル流Ｓの送液方向をＹ軸正方向、これに直交するサンプル流Ｓの幅方向をＸ軸方向とすると、ビームスポットＢは、Ｘ軸方向のスポット径ＷがＹ軸方向のスポット径Ｈよりも大きくされた楕円形状を有していることが好ましい。また、ビームスポットＢのスポット径Ｗは、サンプル流Ｓの幅ｗ以上の長さとされていることが好ましい。なお、幅ｗは、サンプル液Ｓが送液されるフローセル又はマイクロチップの流路の幅に相応する。

このような大きさ及び形状としたビームスポットＢをサンプル流Ｓに結像させることで、サンプル流Ｓ中の微小粒子Ｐが通流位置に依らずにビームスポットＢを通過することとなるため、全ての微小粒子Ｐに対して均一な強度のレーザを照射できる。

ビームスポットＢの成形は、シリンダーレンズ２２にＸ軸方向のレンズパワーを、シリンダーレンズ２３にＹ軸方向のレンズパワーを付与し、符号Ｑで示す位置に形成されるビームスポットのＸ軸方向及びＹ軸方向のスポット径を調整することによって行い得る。

符号Ｑで示す位置に形成されたビームスポットを等倍でサンプル流Ｓに結像させる場合には、Ｑで示す位置に形成されるビームスポットのＸ軸方向及びＹ軸方向のスポット径が、上述した好適な大きさ及び形状を満たすようにレーザパワーを設定すればよい。

また、符号Ｑで示す位置に形成されたビームスポットを非等倍（倍率Ｍ、Ｍは１ではない）でサンプル流Ｓに結像させる場合には、Ｑで示す位置に形成されるビームスポットのＸ軸方向及びＹ軸方向のスポット径が、Ｍ倍後に上述した好適な大きさ及び形状を満たすようにレーザパワーを設定すればよい。

シリンダーレンズ２２及びシリンダーレンズ２３の収束光のＮＡは、例えばそれぞれ０．００１／π、０．０１／πとされる。この場合、レーザの波長が０．５μｍとすると、Ｑで示す位置にはＸ軸方向及びＹ軸方向のスポット径がそれぞれ１００，１０μｍのビームスポットが形成される。

２．検出系
レーザの照射により微小粒子Ｐから発生する蛍光及び後方散乱光（図１中点線参照）は、ミラー５により反射され、光ファイバ６によって不図示の検出器に伝送される。ミラー５及び光ファイバ６は、微小粒子Ｐから発生する検出対象光を検出するための検出系を構成する。ただし、光ファイバ６は、検出系の必須の構成となるものではない。

結像レンズ系３の間にリレーレンズ系４を配置した４ｆ光学系では、結像レンズ系３のみを配した場合に比べて、第一の結像レンズ３１及び第二の結像レンズ３２との間の距離を長くとることができる。このため、図に示すように、第一のリレーレンズ４１と第二のリレーレンズ４２との間にミラー５等の光学フィルタを挿入することが容易である。

ミラー５により反射された蛍光等を検出する検出器には、ＰＭＴ（photo multiplier tube）や、フォトダイオードや、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子などが採用される。検出される蛍光は、レーザの照射によって、微小粒子Ｐ又は微小粒子Ｐに標識された蛍光色素から発生するものであってよい。検出された蛍光等は電気信号に変換され、微小粒子Ｐの光学特性判定のために利用される。

本技術に微小粒子測定装置では、上述のように、サンプル流Ｓ中の微小粒子Ｐにその通流位置に依らずに均一な強度のレーザを照射できるため、微小粒子Ｐの光学特性を正確に測定することが可能である。

ミラー５は、結像レンズ系３及びリレーレンズ系４からなる４ｆ光学系内の任意の位置に挿入できる。例えば、ミラー５は、第一の結像レンズ３１と第一のリレーレンズ４１との間、又は、第二のリレーレンズ４２と第二の結像レンズ３２との間に配置してもよい。また、ミラー５に替えて、レーザを分波するスプリッタ等の光学フィルタを挿入してもよい。スプリッタを配置し、分波されるレーザを検出する検出器を設けることで、光源から出射されるレーザの光量をモニターすることができる。

なお、図に示していないが、本技術に係る微小粒子測定装置は、レーザの照射により微小粒子Ｐから発生する前方散乱光を検出するための構成を設けることもできる。

本技術に係る微小粒子測定装置は以下のような構成もとることができる。
（１）光源から出射されたレーザのビームスポットを微小粒子に対して結像させる光学経路上に、４ｆ光学系を備える微小粒子測定装置。
（２）前記４ｆ光学系は、前記ビームスポットの結像レンズ系を構成する第一の結像レンズと第二の結像レンズとの間に配置されたリレーレンズ系であり、該リレーレンズを構成する第一のリレーレンズは、前記第一の結像レンズとの間の距離が前記第一のリレーレンズの焦点距離に等しい位置に配され、前記リレーレンズを構成する第二のリレーレンズは、前記第一のリレーレンズとの間の距離が前記第一のリレーレンズの焦点距離と前記第二のリレーレンズの焦点距離との和に等しい位置であり、かつ、前記第二の結像レンズとの間の距離が前記第二のリレーレンズの焦点距離に等しい位置に配された上記（１）記載の微小粒子測定装置。
（３）前記第一の結像レンズと前記第一のリレーレンズとの間、前記第一のリレーレンズと前記第二のリレーレンズとの間及び前記第二のリレーレンズと前記第二の結像レンズとの間から選択される一以上の位置に、光学フィルタが配置された上記（２）記載の微小粒子測定装置。
（４）前記光学フィルタは、前記レーザの照射により前記微小粒子から発生する蛍光又は散乱光を反射するミラー、又は、前記レーザを分波するスプリッタである上記（３）記載の微小粒子測定装置。
（５）前記ミラーにより反射された前記蛍光又は前記散乱光を検出する検出系を備える上記（４）記載の微小粒子測定装置。
（６）前記光源から出射された前記レーザを伝送する光ファイバと、該光ファイバから出射される前記レーザの前記ビームスポットを形成するレンズ系と、を備える上記（１）〜（５）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（７）前記ビームスポットを形成するレンズ系は、コリメータレンズと一対のシリンダーレンズを含む上記（６）記載の微小粒子測定装置。

１：光ファイバ、２１：コリメータレンズ、２２：シリンダーレンズ、２３：シリンダーレンズ、３１：第一の結像レンズ、３２：第二の結像レンズ、４１：第一のリレーレンズ、
４２：第二のリレーレンズ、５：ミラー、６：光ファイバ、Ｐ：微小粒子、Ｓ：サンプル流

Claims (5)

1. 光源と、
   前記光源から出射されたレーザのビームスポットを微小粒子に結像させる第一の結像レンズと第二の結像レンズとからなる結像レンズ系と、
   前記光源と前記結像レンズ系との間に配置され、前記ビームスポットを形成する、コリメータレンズと一対のシリンダーレンズとを含むレンズ系と、
   前記第一の結像レンズと前記第二の結像レンズとの間に配置された第一のリレーレンズと第二のリレーレンズとからなるリレーレンズ系と、
   前記第二のリレーレンズと前記第二の結像レンズとの間に配置された光学フィルタと、
   前記レーザの照射により前記微小粒子から発生する蛍光又は散乱光を検出する検出器と、
   前記光学フィルタと前記検出器との間に配置された光ファイバと、を備え、
   前記検出器は、前記光学フィルタ及び光ファイバを介して前記蛍光又は散乱光を検出する微小粒子測定装置。
2. 前記光学フィルタは、前記蛍光又は前記散乱光を反射するミラーである請求項１記載の微小粒子測定装置。
3. 前記微小粒子は、マイクロチップ中の流路を流れるサンプル流に含まれる細胞である請求項１又は２に記載の微小粒子測定装置。
4. 前記細胞に結像されるビームスポットは、前記サンプル流の送液方向と直交する幅方向に幅広な楕円形状を有している請求項３に記載の微小粒子測定装置。
5. 前記細胞に結像されるビームスポットは、前記サンプル流の送液方向と直交する幅方向の前記サンプル流の長さと同等もしくは長く形成される請求項３に記載の微小粒子測定装置。

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