CN111133291B - 用于落射荧光测量的光学流式细胞仪 - Google Patents
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Abstract
用于落射荧光测量的光学流式细胞仪。本发明涉及一种用于血细胞表征的光学流式细胞仪(1)，包括：‑流动室(3)，其提供血细胞液流的；‑至少一个发光二极管(9)，用于照射流动室(3)中流动的血细胞；‑落射荧光模块(2)，在其中，使用同一第一透镜组(13)将激发光(8、4)聚焦在血细胞液流中并收集来自每个血细胞的荧光光，以及单元光电探测器(14)用于检测来自第一透镜组(13)的落射荧光光；‑以下测量模块中的至少一个：‑光散射测量模块(5、19、24、25、26)，‑轴向光损耗测量模块(5、19、20、23、22)，‑微粒阻抗测量模块(28、29、34、35)。
Description
本发明涉及一种光学流式细胞仪，其用于通过血细胞液流上的荧光进行血细胞表征。本发明涉及用于对悬浮在液体介质中的微粒进行计数和表征的自动设备的领域，更具体地涉及用于对包含在血液样品中的各种类型细胞进行计数和表征的血液学仪器的领域。
因此，现有技术和所提出的发明涉及基于光散射和荧光，对例如包含在血液样品中的白细胞的数量进行计数以及确定它们在各种亚群内的相对分布的设备。
在已知的光学流式细胞仪中，将样品聚焦成细胞液流。将聚焦的激光束垂直地导向流动的血细胞。
当在荧光流式细胞仪光学装置中使用激光光源，便会垂直于激光束方向对荧光光进行测量。
激光器使聚焦在流动室内部的光束传输成典型尺寸100μm×30μm的椭圆型高斯光斑。
激光聚焦光学元件的设计约束是因为激光输出光束的非常特殊性质。传统的激光聚焦光学元件具有长焦距(>15mm)，用以将所需的100μm×30μm光斑尺寸置入流动室中。大多数激光聚焦光学元件还具有一个或更多个圆柱型透镜，用以将输出光束的圆形轮廓更改成更适合流式细胞仪器测量的椭圆形。
使用短焦距激光聚焦光学元件将需要输出光束在进入聚焦光学元件之前再被处理一次。
此外，长焦距光学元件实际上无法用于收集荧光光。因为这种光学元件需要高数值孔径。使用长焦距将涉及非常大的透镜直径，这是不现实的。
所以，无法设计出既将激光束聚焦成100μm×30μm的椭圆形光斑又利用高数值孔径(NA)收集荧光的光学元件。
因此，所有基于激光的荧光流式细胞仪装置依赖不同透镜来聚焦激光激发光束和收集荧光光。
这便是为什么在基于激光的荧光流式细胞仪装置中始终沿垂直于激发光束的方向收集荧光的原因。
因此，具有荧光检测的激光流式细胞仪的所有装置都包含流动室的三个不同壁附近的三个透镜。在这种情况下，因为几乎没有用来沿流动室的三个不同壁固定所有光学器件的空间，因此机械设计变得极具挑战性。
已知的文档US2009/0068726描述了一种系统，该系统包括相对于激发轴成90度布置的用于荧光测量的透镜组。
众所周知，如果光学装置包含两个不同光源，则更容易测量落射荧光和微粒散射。通常，使用激光进行微粒散射测量，使用另外的扩展光源(通常作为弧光灯)进行落射荧光测量。冲击散射光电探测器的光线来自于激光源。对于落射荧光测量，样品被弧光灯源激发。
在文档“Multiple Wavelength Illumination in Flow Cytometry using aSingle Arc Lamp and a Dispersing Element”Cytometry A,Vol.8,pp 445-452(1987)中描述了这种装置。由于使用了两种非常不同的光源，所以这种混合装置非常昂贵。每个光源具有自己的聚焦光学元件和自己的光电探测器。当涉及到设计、制造和校准这样的系统时，这种装置的复杂性是限制因素。该复杂装置非常难以成为用于常规分析仪的坚固的工业换能器。
本发明的目的是提出一种用于执行荧光测量和散射测量的紧凑型光学流式细胞仪。
本发明的另一目的是提出一种坚固的光学流式细胞仪。
利用一种用于血细胞表征的光学流式细胞仪实现了上述目的中的至少一个，该光学流式细胞仪包括：
-流动室，其提供血细胞液流，
-至少一个发光二极管，其用于照射流动室中流动的血细胞，
-落射荧光模块，在其中，使用同一第一透镜组将激发光聚焦在血细胞液流中并收集来自每个血细胞的荧光光，以及第一单元光电探测器用于检测来自第一透镜组的落射荧光，
-以下测量模块中的至少一个：
-光散射测量模块，
-轴向光损耗测量模块，
-微粒阻抗测量模块。
根据本发明的光学流式细胞仪提供了能够执行落射荧光检测的细胞仪和允许细胞分析的测量模块。
根据本发明，光散射测量模块可以包括：第二透镜组，用于收集从流动室发出的光；和至少一个散射检测通道，所述至少一个散射检测通道包括用于检测来自第二透镜组的散射光的单元光电探测器。
例如，轴向光损耗测量模块可以包括：第二透镜组，用于收集从流动室发出的光；和至少一个轴向光检测通道，所述至少一个轴向光检测通道包括用于检测来自第二透镜组的散射光的单元光电探测器；并且其中，当光学流式细胞仪还包括光散射测量模块时，该轴向光损耗测量模块可以包括同一第二透镜组。
根据本发明的光学流式细胞仪的截然不同之处在于对落射荧光和散射的测量是从同一光源执行的。
将同一光源用于血细胞荧光激发和血细胞散射测量。
与现有技术的系统相比，本发明的光学流式细胞仪更便宜且更坚固，并且完美地兼容了工业制造和常规分析仪中的使用。
仅使用两个透镜组来聚焦和收集光；使用第一透镜组来进行激发光聚焦和荧光光收集。不需要任何第三90度透镜组。
与标准的落射荧光显微镜装置不同，根据本发明的光学流式细胞仪允许对血细胞散射的光在跨过光学探询区、即流动室时进行测量。
所有标准的落射荧光显微镜系统依赖一个或更多个CCD相机来获取探询区的一个或更多个图像。在标准的荧光显微镜系统中的血细胞表征是通过在处理器单元中运行的图像处理软件来执行。
根据本发明的光学流式细胞仪与传统的落射荧光显微镜的截然不同之处在于血细胞的表征不依赖图像采集而是依赖微粒散射和落射荧光的测量。这意味着单元检测器基于检测到的光的强度来检测模拟信号(脉冲)。该信号代表光的量级。没有图像。因此，由处理单元执行的测量专注于在流动室中连续流动的每个细胞。
根据本发明的血细胞表征可以依赖多维点图的汇集。当如现有技术使用相机时，血细胞表征需要从相机图像采集中识别形状。
根据本发明，血细胞表征可以包括白细胞、红细胞、网织红细胞、网状血小板等的表征。
因此，本发明的光学流式细胞仪仅使用两个透镜组，而不需要进行与细胞液流激发的轴线垂直的测量。因此，机械设计可以更容易。因此，相对于现有技术的系统，可以制造具有尾迹维度的光学流式细胞仪。
此外，由于使用同一透镜组进行激发和荧光收集，因此根据本发明的光学流式细胞仪需要更少的光学调整。与现有技术的标准垂直装置需要三个光学校准相比，根据本发明的光学流式细胞仪仅需要两个光学校准。
由于LED是非相干光源，因此可以产生均匀强度且呈矩形形状的探询区。也能够使用聚光透镜和矩形光圈。
具有均匀强度和矩形形状的探询区极大地放宽了流动微粒的横向定位灵敏度：光脉冲特性(幅度、宽度)在探询区的整个表面上是恒定的。
在现有技术的标准激光流式细胞设备中，探询区是具有高斯强度分布的椭圆形。流动微粒与探询区中心的任何偏离牵涉光脉冲幅度和宽度的下降。
特别地，第一透镜组可以布置在第二透镜组相对于流动室的相对侧。
这样的布置简化了机械设计。
优选地，第一透镜组可以被设计成将发光二极管发射的光整形并聚焦成优选110μm×30μm的光学探询区并进入流动室中。换言之，LED使聚焦在流动室内部的光束传输成均匀且呈矩形的探询区，该探询区的尺寸与逐一的细胞测量相兼容。
优选地，发光二极管可以具有小于700nm的峰值波长。该短波通过血细胞内部结构增强了光散射。它导致更好地区分血细胞亚群。
根据本发明，散射检测通道可以包括用于沿至少一个方向选择光的光阑。
沿正向对血细胞散射的光的测量与血细胞的体积有关。该方向与激发光束非常接近，通常小于5度。为了执行该测量，必须沿特定方向收集从流动室发出的光。
根据本发明的优选实施例，第二透镜组被设计成以相对于照射光束发散成5度和/或包括在5-20度内的角度收集血细胞液流散射的前向散射光。
根据本发明的另一实施例，轴向光检测通道可以包括用于测量轴向光损耗的光学装置。
轴向光损耗是当细胞穿过光束时，来自照射光束在零度时的总光损耗的测量值。
光学流式细胞仪可以包括用于将荧光光相对于发光二极管发射的光分离的二向色镜。
有利地，第一透镜组和第二透镜组可以包含至少一个非球形表面。
非球形表面的使用允许对光收集光学元件的像差校正达到较高水平。
LED输出光的收集效率，以及将其重新聚焦成流动室中的例如100μm×30μm的小光斑，牵涉高发散的光束，该高发散的光束能够利用高数值孔径(NA)的聚焦光学元件实现。
根据本发明的优选实施例，第一透镜组聚焦由发光二极管发射的光，并沿至少为0.1球面度的立体角，优选地沿1.1球面度的立体角，收集落射荧光光。这样的值对应于高数值孔径，分别地至少为0.17，优选地0.57。
根据本发明，高数值孔径的第一透镜组的使用既可以收集最大可能量的来自LED的光，也可以收集最大可能量的来自流动室的荧光。
根据本发明的优选实施例，第一透镜组的直径可以约为10mm，其中等效焦距(EFL)从4mm至7mm。
根据本发明的优选实施例，第一透镜组可以具有大约-0.1的放大率，与血细胞液流的距离为50mm至90mm。
根据本发明的另一实施例，第二透镜组可以沿至少为0.1球面度的立体角，优选地沿1.1球面度的立体角，收集血细胞散射的光。
利用具有高数值孔径的第二透镜组，可以收集最大可能量的来自流动室的散射光。
当光线被微粒散射时，这意味着微粒使入射光线偏离其初始方向。光线将以大于进入流动室的入射角的角度从流动室发出。优选地，第二透镜组的数值孔径可以大于第一透镜组的数值孔径。
换言之，第一透镜组通常可以以θ＝30deg的半角将光束聚焦在流动室中。这意味着第二透镜组必须处理具有θ+α角度的光线，其中α为前向散射角范围。当光束具有这样高的孔径时，很难区分入射照射光束和微粒散射的偏离光束。优选地，可以将高水平的像差校正应用于镜头组。
根据本发明的另一实施例，第二透镜组的直径可以大于第一透镜组的直径。
根据本发明的优选实施例，流动室可以配置成根据流体动力学聚焦技术、或无源鞘液或根本没有鞘液来产生血细胞液流。与激光不同，LED适用于无源鞘液或无鞘鞘液。
根据本发明的另一优选例，微粒阻抗测量模块可以包括两个电极，所述两个电极在流动室中建立电感测区，以通过库尔特原理测量循环血细胞的阻抗。
能够利用DC电流、AC电流或两者实现阻抗测量。
为了说明本发明，在附图中示出了目前的优选形式；然而，应当理解，本发明不限于特定的的装置和仪器。
图1是示出了根据本发明的光学流式细胞仪的部件的示意图；
图2是示出了光学部件和光轨迹的布置的示意图；以及
图3是示出了用于阻抗测量的电极的布置的示意图。
尽管本发明易于进行各种修改和替代，但是在附图中以示例形式示出了其特定实施例，并且在本文中将对其进行详细描述。然而，应当理解的是，附图及其详细描述并非旨在将本发明限制为所公开的特定形式，相反，其目的是涵盖落入由所附权利要求书限定的本发明范围内的所有修改、等同和替代形式。
下文中，将参考附图通过说明本发明的示例性实施例来详细描述本发明。附图中相似的参考标记表示相似的元件。
图1是示出了根据本发明的示例性实施例的光学流式细胞仪的部件的示意图。
参照图1，本发明的光学流式细胞仪1包括激发/落射荧光模块2，其用于产生朝向流动室3的激发光并用于收集来自流动室的光用以执行落射荧光测量。光学流式细胞仪1包括电动的或/和其他装置，用以将样品细胞或血细胞驱动并聚焦成由鞘液包围或不由鞘液包围的液流。血细胞循环通过流动室3。由激发/落射荧光模块2产生的聚焦的光束4被垂直地定向在细胞液流上，并诱发荧光样品微粒的荧光。来自血细胞的落射荧光由激发/落射荧光模块2的同一透镜组收集。
提供散射测量模块5用于收集来自流动室3的光6。
提供处理器单元7用以控制激发/落射荧光模块2来激发和检测落射荧光信号。处理器单元7还控制散射测量模块5，以检测直接和/或间接的散射信号。
根据本发明，被聚焦到流动室中的激发光4、直接来自流动室的落射荧光光4以及直接来自流动室的散射的光6是共面的。散射测量模块5布置在激发/落射荧光模块2的对侧。
图2是示出了光学部件和光轨迹的详细布置的示意图。参照图2，示出了根据本发明的适于进入光学流式细胞仪中执行落射荧光和/或散射测量的装置。激发光8由在蓝色或紫外线波长下工作的发光二极管(LED)产生。能够使用具有短波长的超高亮度的LED，例如峰值波长小于700nm。LED 9能够以连续、调制或脉冲模式使用。
LED是扩展的、发散的和宽频带的光源，而激光是单色点源。
聚光器10是提供用以优化从LED的光收集并确保进入流动室在光学探询区内的均匀性的透镜。例如，LED 9具有1.0mm2的发光面积。传统的用于激发/荧光组的透镜的直径为10.0mm。所以，聚光器10的有效焦距通常为3.0mm至8.0mm。
由于聚光器10位于LED 9附近，所以其直径能够为2.0mm至8.0mm。
这样的聚光镜不需要精细的像差校正，它能够利用一个或两个透镜实现。因此，聚光器10可以包括至少一个梯度折射率透镜、至少一个菲涅尔透镜、至少一个非球形表面、至少一个反射表面或至少一个衍射表面。
激发光穿过激发滤光片11以缩短LED光谱(即，激发光光谱)并确保不与荧光光重叠。
在激发光轴线上布置二向色镜12。选择该二向色镜12的特性使得来自LED 9的激发光被朝向流动室3反射，同时透射来自流动室3的落射荧光。
激发光然后被导向第一透镜组13，第一透镜组13旨在使激发光作为光斑或光学探询区聚焦到细胞液流中。
第一透镜组还旨在收集来自样品的落射荧光并将其聚焦到荧光单元光电探测器14。为了能够触发和检测荧光信号，第一透镜组沿至少为0.1球面度、即0.17数值孔径(NA)来聚焦并收集光。利用1.1球面度(NA＝0.57)的立体角进行操作在适度的设计复杂度的情况下改善了检测的荧光信噪比。
传统的透镜直径约为10.0mm，这意味着该第一透镜组13具有从4.0mm至7.0mm的等效焦距(EFL)。
第一透镜组提供了放大率，使得流动室中的光学探询区能够具有小尺寸。该放大率例如为γ＝-0.1，这意味着根据所选择的EFL，对象，即细胞，应位于距离第一透镜组第一主平面50.0mm至90.0mm的位置。在这种情况下，图像形成在距离第一透镜组第二主平面大约4.0mm至8.0mm的位置。这完美地与标准流动室所需的空间兼容。
根据所选择的数值孔径，第一透镜组13能够包含一至四个透镜。图2中的实施例示出了两个透镜15和16的示例。
这些透镜能够是单重透镜、胶合双重透镜或者胶合三重透镜。
因此，第一透镜组13可以包括至少一个梯度折射率透镜、至少一个菲涅尔透镜、至少一个非球形表面、至少一个反射表面或至少一个衍射表面。可以考虑所述透镜的组合。
在第一透镜组13的输出端处，使光4作为光学探询区被高度聚焦在流动室内部的液流上。
来自血细胞的荧光光由同一第一透镜组13收集。激发光和落射荧光光沿相反方向传播。
落射荧光然后穿过二向色镜12，该二向色镜将落射荧光17经由荧光滤光片18向前传输到单元光电探测器14。
荧光滤光片18从测量的落射荧光中去除残留的蓝色杂散光或反向散射光。
优选的装置是基于单元(单像素)光电探测器。
单元光电探测器产生与每个血细胞发出的荧光光强度成正比的模拟信号。然后将模拟信号转发到处理单元以进行荧光测量。
由于光源是LED(而不是激光器)，因此很容易在流动室3的探询区中实现完全均匀的光强度。因此，不再需要强制限制携带待表征的血细胞的液流的直径。
由于标准的流式细胞仪装置需要具有流体动力学聚焦的流动室，所以所提出的光学装置适用于所有类型流动室：流体动力学聚焦、无源鞘液或无鞘液。
第二透镜组19被提供在相对于流动室3的第一透镜组13的对侧，但是在同一光轴上。第二透镜组19收集细胞透射和散射的光6。所检测到的散射光因其提供了用于血细胞表征的有用信息，因此是有用的。
对第二透镜组19的约束与第一透镜组13中的约束非常相似。仅数值孔径被略微增加，以检测散射光。由于在机械上很难将透镜组移动到太靠近流动室，因此优选地使用稍微增大的透镜直径。传统的透镜直径约为11.0mm。
第二透镜组19能够使从流动室发出的光束准直或聚焦。
如果执行多个测量(即，多个散射角或轴向光损耗)，优选地具有准直的光束。这将确保对于一个或更多个分束部件有足够的空间。
如果执行单一测量，则散射透镜组能够将光束直接聚焦在单元光电探测器上。
根据所选择的数值孔径，第二透镜组19能够包含一至四个透镜。在图2中的实施例示出了两个透镜26和27的示例。
这些镜片能够是单透镜、双胶合透镜或者三重胶合透镜。
因此，第二透镜组19可以包括至少一个梯度折射率透镜、至少一个菲涅尔透镜、至少一个非球形表面、至少一个反射表面或至少一个衍射表面。可以考虑所述的透镜组合。
图2的实施例包括单个分束器，该分束器允许两种测量，例如，前向散射测量和轴向光损耗测量。
对于轴向光损耗测量，提供分束器20用以将散射光21的一部分经由聚焦透镜23导向单元光电探测器22。
对于前向散射测量，直接穿过分束器20的光21被导向散射阻挡件或光阑24，该散射阻挡件或光阑24旨在透射仅以例如低角度或中角度的特定角度散射的光。提供聚焦透镜25用以将穿过散射阻挡件24的光导向单元光电探测器26。
分束器可以从收集的光束执行多次散射(或光损失)测量。可以考虑多个分束器来获得两种以上的测量。
分束器能够依赖特定的半反射涂层或任何未涂覆的透光材料造成的菲涅尔损耗。
也可以使用附加的直角光学元件来测量垂直于激发光束散射的光。
参照图3，流式细胞仪包括流动室30，其中将样品聚焦成细胞液流31，该细胞液流例如被鞘液32包围。聚焦的LED光4被垂直地定向到细胞液流上，并且响应于光对细胞的影响而诱发荧光。如果提供了第二透镜组19，则散射光6由第二透镜组19收集。
流动室30还可以包括旨使细胞或微粒穿过的狭窄部33。优选地，狭窄部33在细胞液流31的轴线上。激发光4布置为经由狭窄部33与细胞液流31垂直地横跨流动室。
在图3描绘的示例中，当旨在进行微粒阻抗测量时，提供狭窄部33。否则，流动室可以不包括狭窄部。
在存在狭窄部33的情况下，能够限定流动室30的两部分：设置在狭窄部33的两侧的上部分和下部分。
根据本发明，在流动室3中分别在上部分和下部分中提供电极28和29。提供电源34和测量设备35用以检测两个电极之间流体的电阻抗的变化。
图3是基于具有鞘液的流式细胞仪。然而，根据本发明的阻抗测量模块能够包括在具有无源鞘液或者根本没有鞘液的流式细胞仪中。
尽管阻抗测量使用了狭窄部，该狭窄部包括或重叠了在流动室内部的落射荧光测量的光学探询区，但是可以在光学探询区之外、在光学探询区的上游或下游执行阻抗测量。光学探询区对应于流动室内部由激发光束和微粒液流的交点限定的体积。此外，可以在有或没有光散射测、有或没有轴向光损耗测量的情况下执行阻抗测量。
一旦完全理解了上述公开内容，许多变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。以下权利要求的解释旨在包含所有这样的变化和修改。
Claims (12)
1.一种用于血细胞表征的光学流式细胞仪(1)，包括：
-流动室(3)，其提供血细胞液流，
-至少一个发光二极管(9)，其用于照射所述流动室(3)中流动的血细胞，
-落射荧光模块(2)，在其中，使用同一第一透镜组(13)将激发光聚焦在所述血细胞液流中并收集来自每个血细胞的荧光光，以及单元光电探测器(14)用于检测来自所述第一透镜组(13)的落射荧光光，
-以下测量模块中的至少一个：
-光散射测量模块，其包括：第二透镜组(19)，用于收集从所述流动室(3)发出的光；和至少一个散射检测通道，所述至少一个散射检测通道包括用于检测来自所述第二透镜组(19)的散射光的单元光电探测器(26)和用于沿至少一个方向选择光的光阑(24)；所述第二透镜组(19)被设计成以相对于照射光束发散成5度或小于5度的角度收集血细胞液流散射的前向散射光，所述散射光与血细胞的体积有关，
-轴向光损耗测量模块。
2.根据权利要求1所述的光学流式细胞仪，其特征在于，所述轴向光损耗测量模块包括：第二透镜组(19)，用于收集从所述流动室(3)发出的光；以及至少一个轴向光检测通道，所述至少一个轴向光检测通道包括用于检测来自所述第二透镜组(19)散射光的单元光电探测器(22)；并且其中，当所述光学流式细胞仪还包括所述光散射测量模块时，所述轴向光损耗测量模块包括同一第二透镜组(19)。
3.根据权利要求1或2所述的光学流式细胞仪，其特征在于，所述第一透镜组(13)布置在所述第二透镜组(19)相对于所述流动室(3)的相对侧。
4.根据权利要求1或2所述的光学流式细胞仪，其特征在于，所述第一透镜组(13)被设计成将发光二极管(9)发射的光整形并聚焦成110μm×30μm的光学探询区并进入流动室(3)中。
5.根据权利要求1或2所述的光学流式细胞仪，其特征在于，所述发光二极管(9)具有小于700nm的峰值波长。
6.根据权利要求1或2所述的光学流式细胞仪，其特征在于，所述光学流式细胞仪包括：二向色镜(12)，用于将所述荧光光相对于由所述发光二极管(9)发射的光分离。
7.根据权利要求1或2所述的光学流式细胞仪，其特征在于，所述第一透镜组(13)和第二透镜组(19)包含至少一个非球形表面。
8.根据权利要求1或2所述的光学流式细胞仪，其特征在于，所述第一透镜组(13)聚焦由发光二极管发射的光(8)，并沿至少为0.1球面度的立体角，收集落射荧光光。
9.根据权利要求1或2所述的光学流式细胞仪，其特征在于，所述第二透镜组(19)的数值孔径大于第一透镜组(13)的数值孔径。
10.根据权利要求1或2所述的光学流式细胞仪，其特征在于，所述流动室(3)被配置成根据流体动力学聚焦、无源鞘液或根本没有鞘液的技术来产生血细胞液流。
11.根据权利要求1或2所述的光学流式细胞仪，其特征在于，还包括微粒阻抗测量模块，所述微粒阻抗测量模块包括两个电极，所述两个电极在所述流动室中建立电感测区，用以通过库尔特原理来测量循环的血细胞的阻抗。
12.根据权利要求1或2所述的光学流式细胞仪，其特征在于，所述第一透镜组(13)聚焦由发光二极管发射的光(8)，并沿1.1球面度的立体角，收集落射荧光光。
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