JP6299600B2 - 微小粒子測定装置 - Google Patents
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Description
本技術は、光学的手法により微小粒子を分析する微小粒子測定装置に関する。より詳しくは、流路内を通流する微小粒子に光を照射して微小粒子から発せられる蛍光や散乱光を検出する微小粒子測定装置に関する。
細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子の分析には、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）を用いた光学的測定方法が利用されている。フローサイトメーターは、フローセルやマイクロチップなどに形成された流路内を通流する微小粒子に光を照射し、個々の微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出して、分析する装置である。
例えば、フローサイトメーターにより細胞やビーズなどの微小粒子から発せられる蛍光を検出する場合は、各微小粒子に、励起光としてレーザ光などの特定波長の光を所定の強度で照射する。そして、各微小粒子から発せられた蛍光を、レンズなどで集光した後、フィルタやダイクロイックミラーなどを用いて目的とする波長を分離・選択し、その光を、光電子増倍管（ＰＭＴ：Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ）などの受光素子によって検出する。
一方、フローサイトメーターでは、流路の概ね中央を微小粒子が通過するようにラミナフローを形成しているが、個々の微小粒子の通流位置にばらつきが生じることがある。微小粒子毎に通流位置が異なると、微小粒子と光照射や光検出のための光学系との位置関係が変化するため、蛍光や散乱光の検出強度が変動し、データの精度が低下する。そこで、従来、微小粒子の通流位置を検出して、検出精度を向上させる技術が提案されている（例えば、特許文献１，２参照）。
特許文献１に記載の流動粒子分析装置では、前方散乱光、側方散乱光又は後方散乱光から、光分割器を介して取り出した検出光（散乱光）を、４分割フォトダイオードやエリアＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ；電荷結合素子）などによって検出している。そして、その検出位置から、励起光の中心とシースフローの中心との位置ずれを検出し、この位置ずれが所定の範囲内に入るように、フローセルの位置を調節している。
また、特許文献２には、微小粒子から発せられる散乱光に生じる偏光角の変化を利用して、微小粒子の位置情報を検出し、励起光の焦点位置やフローセル又はマイクロチップの位置を調整する技術が開示されている。
しかしながら、前述した特許文献１，２に記載の技術では、微小粒子の位置検出精度が十分とは言えず、更なる検出精度向上が求められている。
そこで、本開示は、流路内を通流する微小粒子の位置を高精度で検出することが可能な微小粒子測定装置を提供することを主目的とする。
本開示に係る微小粒子測定装置は、流路を通流する微小粒子に光を照射する光照射部と、該微小粒子から発せられた散乱光を検出する散乱光検出部とを有し、前記散乱光検出部は、少なくとも、前記微小粒子から発せられた光を集光する対物レンズと、該対物レンズで集光された光のうち散乱光を第１散乱光と第２散乱光に分割する光分割素子と、前記第１散乱光を受光する第１散乱光検出器と、前記光分割素子と前記第１散乱光検出器との間に配設され、前記第１散乱光に非点収差を与える非点収差素子と、を備えており、前記対物レンズの後側主点から前記非点収差素子の前側主点までの距離Ｌと、前記非点収差素子の焦点距離ｆとの関係が下記数式１を満たすものである。
ここで、「後側主点」とは、光学系の前側（光照射部側）から入射させた平行光と、光学系の後側（検出器側）から出射した光とを使って求めた主点であり、像側主点ともいう。また、「前側主点」とは、光学系の後側（検出器側）から入射させた平行光と、光学系の前側（光照射部側）から出射した光とを使って求めた主点であり、物体側主点ともいう。
この微小粒子測定装置では、前記光分割素子が前記散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する偏光素子であり、前記第１散乱光がＳ偏光成分であってもよい。
また、前記非点収差素子には、シリンドリカルレンズを用いることができる。
その場合、前記微小粒子に対する光の入射方向をｚ方向、前記微小粒子の通流方向をｘ方向、前記ｚ方向及び前記ｘ方向に垂直な方向をｙ方向としたとき、前記非点収差素子は、前記ｙ方向に直交する平面上において、その母線と、前記ｘ方向に延びる線又は前記ｚ方向に延びる線とのなす角が０〜５°となるように配置することができる。
一方、前記第１散乱光検出器は、受光面が複数領域に分割された検出器でもよく、例えば、４分割フォトダイオードを用いることができる。
その場合、前記微小粒子に対する光の入射方向をｚ方向、前記微小粒子の通流方向をｘ方向、前記ｚ方向及び前記ｘ方向に垂直な方向をｙ方向としたとき、前記第１散乱光検出器は、前記ｙ方向に直交する平面上において、その分割線と、前記ｘ方向に延びる線又は前記ｚ方向に延びる線とのなす角が４０〜５０°となるように配置することができる。
また、この微小粒子測定装置では、前記第１散乱光の受光位置の変化から、前記微小粒子の通流位置を検出することができる。
そして、前記第１散乱光検出器は、その受光面が、格子状に、第１領域、第２領域、第３領域及び第４領域に分割されている場合、前記第１領域の検出値Ａと、前記第１領域に隣接しない前記第３領域の検出値Ｃとの差（Ａ−Ｃ）から、前記微小粒子の位置情報を取得することができる。
又は、前記第１領域の検出値Ａ及び前記第１領域に隣接しない前記第３領域の検出値Ｃとの和（Ａ＋Ｃ）と、前記第１領域に隣接する前記第２領域の検出値Ｂ及び前記第２領域に隣接しない前記第４領域の検出値Ｄとの和（Ｂ＋Ｄ）との差（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））から、前記微小粒子の位置情報を取得することもできる。
更に、前記光照射部は、マイクロ流路を備えた分析チップ内を通流する微小粒子に光を照射してもよい。
また、前記非点収差素子には、シリンドリカルレンズを用いることができる。
その場合、前記微小粒子に対する光の入射方向をｚ方向、前記微小粒子の通流方向をｘ方向、前記ｚ方向及び前記ｘ方向に垂直な方向をｙ方向としたとき、前記非点収差素子は、前記ｙ方向に直交する平面上において、その母線と、前記ｘ方向に延びる線又は前記ｚ方向に延びる線とのなす角が０〜５°となるように配置することができる。
一方、前記第１散乱光検出器は、受光面が複数領域に分割された検出器でもよく、例えば、４分割フォトダイオードを用いることができる。
その場合、前記微小粒子に対する光の入射方向をｚ方向、前記微小粒子の通流方向をｘ方向、前記ｚ方向及び前記ｘ方向に垂直な方向をｙ方向としたとき、前記第１散乱光検出器は、前記ｙ方向に直交する平面上において、その分割線と、前記ｘ方向に延びる線又は前記ｚ方向に延びる線とのなす角が４０〜５０°となるように配置することができる。
また、この微小粒子測定装置では、前記第１散乱光の受光位置の変化から、前記微小粒子の通流位置を検出することができる。
そして、前記第１散乱光検出器は、その受光面が、格子状に、第１領域、第２領域、第３領域及び第４領域に分割されている場合、前記第１領域の検出値Ａと、前記第１領域に隣接しない前記第３領域の検出値Ｃとの差（Ａ−Ｃ）から、前記微小粒子の位置情報を取得することができる。
又は、前記第１領域の検出値Ａ及び前記第１領域に隣接しない前記第３領域の検出値Ｃとの和（Ａ＋Ｃ）と、前記第１領域に隣接する前記第２領域の検出値Ｂ及び前記第２領域に隣接しない前記第４領域の検出値Ｄとの和（Ｂ＋Ｄ）との差（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））から、前記微小粒子の位置情報を取得することもできる。
更に、前記光照射部は、マイクロ流路を備えた分析チップ内を通流する微小粒子に光を照射してもよい。
本開示によれば、微小粒子の流れ方向における位置変動の影響を抑制しているため、流路内を通流する微小粒子の位置を従来よりも高精度で検出することができる。
以下、本開示を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本開示は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態
（非点収差素子の母線がｘ軸に対して垂直になるように配置されている例）
２．第１の実施の形態の変形例
（非点収差素子の母線がｘ軸に対して平行になるように配置されている例）
１．第１の実施の形態
（非点収差素子の母線がｘ軸に対して垂直になるように配置されている例）
２．第１の実施の形態の変形例
（非点収差素子の母線がｘ軸に対して平行になるように配置されている例）
＜１．第１の実施の形態＞
本発明者は、前述した課題を解決するために鋭意実験検討を行った結果、以下に示す知見を得た。前述した特許文献１，２に記載の技術では、微小粒子にレーザを照射した際に発せられる散乱光を受光素子上に投影している。受光素子に投影された散乱光は、対物視野内の粒子位置に対して感度があり、粒子の位置が変わると受光素子上の投影位置及び形状が変化する。
本発明者は、前述した課題を解決するために鋭意実験検討を行った結果、以下に示す知見を得た。前述した特許文献１，２に記載の技術では、微小粒子にレーザを照射した際に発せられる散乱光を受光素子上に投影している。受光素子に投影された散乱光は、対物視野内の粒子位置に対して感度があり、粒子の位置が変わると受光素子上の投影位置及び形状が変化する。
そして、この投影位置や形状の変化を受光素子で検知することにより、流路内における粒子通過位置をマッピングすることが可能となる。また、微小粒子の位置情報に基づいて各種光検出値を補正することにより、蛍光及び散乱光の強度についてＣＶ（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）値の改善や、蛍光スペクトル形状の正確性向上が見込まれる。
一方、特許文献１，２に記載の技術では、得られる微小粒子の位置情報が、微小粒子の流れに直交する方向及び励起光の光軸方向の２方向であり、微小粒子の通流方向における変動については、これら２種の位置情報の誤差として重畳される。このとき、微小粒子の通流位置を更に精度よく検出するためには、粒子の通流方向における変動を抑制する必要がある。
そこで、本実施形態の微小粒子測定装置においては、微小粒子の位置検出精度を向上させるため、位置検出光学系を特定の配置にすることにより、微小粒子の流れ方向における位置変動の影響を抑制する。
［装置の全体構成］
本実施形態の微小粒子測定装置は、流路を通流する微小粒子に光を照射する光照射部と、この微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出する光検出部とを有する。図１は本実施形態の微小粒子測定装置の概要を示す図である。
本実施形態の微小粒子測定装置は、流路を通流する微小粒子に光を照射する光照射部と、この微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出する光検出部とを有する。図１は本実施形態の微小粒子測定装置の概要を示す図である。
［微小粒子１０について］
本実施形態の微小粒子測定装置１により測定される微小粒子１０は、励起光１１を照射することにより、蛍光１２及び散乱光１３を発するものであればよく、細胞、微生物及びリボゾームなどの生体関連微小粒子、又はラテックス粒子、ゲル粒子及び工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれる。
本実施形態の微小粒子測定装置１により測定される微小粒子１０は、励起光１１を照射することにより、蛍光１２及び散乱光１３を発するものであればよく、細胞、微生物及びリボゾームなどの生体関連微小粒子、又はラテックス粒子、ゲル粒子及び工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれる。
そして、生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リボゾーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれる。また、細胞には、植物細胞、動物細胞及び血球系細胞などが含まれる。更に、微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。この生体関連微小粒子には、核酸や蛋白質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。
一方、工業用粒子としては、例えば有機高分子材料、無機材料又は金属材料などで形成されたものが挙げられる。有機高分子材料としては、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどを使用することができる。また、無機材料としては、ガラス、シリカ及び磁性材料などを使用することができる。金属材料としては、例えば金コロイド及びアルミニウムなどを使用することができる。なお、これら微小粒子の形状は、一般には球形であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
［光照射部の構成］
光照射部は、励起光１１を発する光源２の他、この励起光１１を微小粒子１０に向けて集光する対物レンズなどを備えている。ここで使用する光源２は、測定内容などに応じて適宜選択することができるが、例えばレーザダイオード、ＳＨＧ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）レーザ、ガスレーザ及び高輝度ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ：発光ダイオード）などを使用することができる。
光照射部は、励起光１１を発する光源２の他、この励起光１１を微小粒子１０に向けて集光する対物レンズなどを備えている。ここで使用する光源２は、測定内容などに応じて適宜選択することができるが、例えばレーザダイオード、ＳＨＧ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）レーザ、ガスレーザ及び高輝度ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ：発光ダイオード）などを使用することができる。
また、光源２と対物レンズとの間には、特定波長の光のみを透過し、それ以外の光は反射する特性をもつバンドパスフィルタ（図示せず）を配設することもできる。なお、光照射部は、特定波長の光（励起光１１）を、微小粒子１０に照射可能な構成であればよく、光源、レンズ及び光学フィルタなどの各種光学部品の種類及び配置は適宜選択可能であり、前述した構成に限定されるものではない。
［光検出部の構成］
光検出部は、蛍光１２を検出する蛍光検出部と、散乱光１３を検出する散乱光検出部を備えている。そして、これら蛍光検出部及び散乱光検出部と微小粒子１０との間には、微小粒子１０から発せられた蛍光１２や散乱光１３を集光する対物レンズ（図示せず）、蛍光１２と散乱光１３とを分離する分光フィルタ４などが配置されている。
光検出部は、蛍光１２を検出する蛍光検出部と、散乱光１３を検出する散乱光検出部を備えている。そして、これら蛍光検出部及び散乱光検出部と微小粒子１０との間には、微小粒子１０から発せられた蛍光１２や散乱光１３を集光する対物レンズ（図示せず）、蛍光１２と散乱光１３とを分離する分光フィルタ４などが配置されている。
（蛍光検出部）
蛍光検出部は、散乱光１３と分離された蛍光１２を更に所定波長毎に分離する分光素子８と、分光素子８で分光された各蛍光１４を個別に検出可能な蛍光検出器９などが設けられている。蛍光検出器９としては、例えば独立した検出チャネルが複数並べられた受光素子アレイを用いることができる。具体的には、ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ−Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ）やＰＤ（Ｐｈｏｔｏ ｄｉｏｄｅ）などの受光素子９ａ〜９ｚが一次元に配列されたＰＭＴアレイ又はフォトダイオードアレイなどの他、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）やＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）などの２次元受光素子を用いることができる。
蛍光検出部は、散乱光１３と分離された蛍光１２を更に所定波長毎に分離する分光素子８と、分光素子８で分光された各蛍光１４を個別に検出可能な蛍光検出器９などが設けられている。蛍光検出器９としては、例えば独立した検出チャネルが複数並べられた受光素子アレイを用いることができる。具体的には、ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ−Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ）やＰＤ（Ｐｈｏｔｏ ｄｉｏｄｅ）などの受光素子９ａ〜９ｚが一次元に配列されたＰＭＴアレイ又はフォトダイオードアレイなどの他、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）やＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）などの２次元受光素子を用いることができる。
また、本実施形態の微小粒子測定装置１では、フィルタやダイクロイックミラーなどの波長選択素子と、ＰＭＴなどの受光素子とを複数組み合わせることにより、複数種の蛍光色素を検出し、解析することが可能である。更に、波長の異なる複数の励起光源を組み合わせることにより、解析可能な色素の数を増やすこともできる。
（散乱光検出部）
散乱光検出部には、微小粒子１０から発せられた散乱光１３を検出する散乱光強度検出器６及び粒子位置検出器７と、散乱光１３を２つに分割する光分割素子として例えば偏光素子５などが設けられている。
散乱光検出部には、微小粒子１０から発せられた散乱光１３を検出する散乱光強度検出器６及び粒子位置検出器７と、散乱光１３を２つに分割する光分割素子として例えば偏光素子５などが設けられている。
偏光素子５は、入射する非偏光を、振動方向が直交する２つの偏光に分離するものであり、本実施形態の微小粒子測定装置１では、散乱光１３を、Ｓ偏光１３ｓとＰ偏光１３ｐとに分離する。具体的には、偏光素子５により、入射した散乱光１３のうちＰ偏光１３ｐを透過し、Ｓ偏光１３ｓを反射する。これにより、Ｐ偏光１３ｐのみが散乱光強度検出器６に入射し、Ｓ偏光１３ｓのみが粒子位置検出器７に入射することとなる。
また、散乱光強度検出器６は、微小粒子１０から発せられた前方散乱光の強度を検出するものであり、偏光素子５により分光されたＰ偏光１３ｐを検出可能なものであればよい。このように、前方散乱光（Ｐ偏光１３ｐ）の強度を検出することにより、例えば微小粒子１０の大きさに関する情報を得ることができる。
一方、粒子位置検出器７は、微小粒子１０から発せられた散乱光１３の偏光角の変化を検出するものであり、偏光素子５により分光されたＳ偏光１３ｓを検出可能なものであればよい。微小粒子位置検出器７としては、受光面が複数領域に分割された検出器を使用することができ、具体的には４分割フォトダイオードやＣＣＤなどを用いることができる。
微小粒子１０において、励起光１１に散乱現象が起きると、その前後、即ち、励起光１１と散乱光１３とで偏光角に変化が生じる。そして、例えば、光源２から出射する励起光１１の偏光をＰ偏光のみとし、微小粒子１０において生じた散乱光１３から偏光角が回転した成分（Ｓ偏光１３ｓ）のみを分離して、粒子位置検出器７で検出すると、流路３内における微小粒子１０の位置を知ることができる。
［位置検出光学系について］
次に、本実施形態の微小粒子測定装置１において、微小粒子１０の通流位置を検出する光学系（位置検出光学系）について、具体的に説明する。図２は本実施形態の微小粒子測定装置１の位置検出光学系の構成例を示す図であり、図３はその位置検出光学系の各光学部品の配置を模式的に示す図である。なお、図１〜３では、図を見やすくするため、説明に関係のない部品は適宜省略して示している。
次に、本実施形態の微小粒子測定装置１において、微小粒子１０の通流位置を検出する光学系（位置検出光学系）について、具体的に説明する。図２は本実施形態の微小粒子測定装置１の位置検出光学系の構成例を示す図であり、図３はその位置検出光学系の各光学部品の配置を模式的に示す図である。なお、図１〜３では、図を見やすくするため、説明に関係のない部品は適宜省略して示している。
図２に示すように、本実施形態の微小粒子測定装置１の位置検出光学系は、対物レンズ２１、分光フィルタ４、偏光素子５、非点収差素子２２及びコンデンサレンズ２３などで構成することができる。対物レンズ２１は、微小粒子１０から発せられた散乱光１３を集光するものであり、検出感度の観点から、開口数ＮＡが高いものを使用することが好ましい。
非点収差素子２２は、散乱光（Ｓ偏光１３ｓ）束に意図的に非点収差を与えるものであり、代表的なものとしてはシリンドリカルレンズが挙げられる。また、非点収差素子２２をコンデンサレンズ２３の後方に配置する場合は、散乱光（Ｓ偏光１３ｓ）の進行方向に対して傾斜配置されたガラス板などを使用することもできる。
コンデンサレンズ２３は、非点収差素子２２により非点収差が与えられたＳ偏光１３ｓを、粒子位置検出器７に集光するものである。なお、コンデンサレンズ２３の位置は、特に限定されるものではなく、非点収差素子２２の前方及び後方のいずれに配置してもよく、Ｓ偏光１３ｓが粒子位置検出器７の像面に集光するように、そのＦ値に応じて適宜設定することができる。
そして、本実施形態の微小粒子測定装置１は、対物レンズ２１の後側主点（像側主点）から非点収差素子２２の前側主点（物体側主点）までの距離Ｌと、非点収差素子２２の焦点距離ｆとの関係が下記数式２を満たすように設計されている。ここで、「後側主点（像側主点）」は、光学系の前側（光照射部側）から入射させた平行光と、光学系の後側（検出器側）から出射した光とを使って求めた主点である。また、「前側主点（物体側主点）」は、光学系の後側（検出器側）から入射させた平行光と、光学系の前側（光照射部側）から出射した光とを使って求めた主点である。
具体的には、本実施形態の微小粒子測定装置１では、上記数式２を満たすように、非点収差素子２２の焦点距離ｆを決定したり、対物レンズ２１及非点収差素子２２の位置を決定している。なお、距離Ｌと非点収差素子２２の焦点距離ｆとの関係が上記数式２を満たさない場合、微小粒子１０の通流方向ｘに位置ずれが発生したときに、信号の変動を抑制することができない。この距離Ｌと非点収差素子２２の焦点距離ｆとの関係はＬ＝２ｆであることが好ましく、これにより微小粒子１０の通流位置によらず、像面の結像位置を一定にすることができる。
一方、図３に示すように、本実施形態の微小粒子測定装置１では、非点収差素子２２は、ｙ軸上に、その母線２２ａが微小粒子１０の通流方向ｘに対して略垂直となるように配置されていることが好ましい。具体的には、非点収差素子２２は、ｙ軸に直交する平面上において、母線２２ａと、ｚ軸方向に延びる線とのなす角が０〜５°となるように配置されていることが好ましい。
また、粒子位置検出器７もｙ軸上に配置されており、例えば４分割の検出器の場合は、その分割線７ａが微小粒子１０の通流方向ｘに対して略±４５°となるように配置されていることが好ましい。具体的には、粒子位置検出器７は、ｙ軸に直交する平面上において、分割線７ａと、ｘ軸方向に延びる線及びｚ軸方向に延びる線とのなす角が４０〜５０°となるように配置されていることが好ましい。この場合、非点収差素子２２の母線２２ａと、粒子位置検出器７の分割線７ａとがなす角も略±４５°となる。
このような配置にすることにより、微小粒子の通流方向ｘにおける変動を効果的に抑え込むことができる。なお、ここでいう「変動」とは、微小粒子の通流位置が変化することにより生じる散乱光１３の物体高及び光軸傾きの変化がもたらす粒子位置検出器７の粒子投影像の位置及び形状の変化を指す。
また、図３においてｘは、マイクロチップ２０内を、微小粒子１０を含むラミナーフロー３０が通通流する方向を示す。また、ｚはマイクロチップ２０の励起光照射部３１に照射される励起光１１の照射方向を示し、ｙはｘ方向及びｚ方向に垂直な方向を示す。そして、図３においては、ｘ方向及びｙ方向を実線で、ｚ方向を破線で示しており、励起光１１及び散乱光１３の進行方向についても、同様にしている。更に、光学系を図３に示すような配置にする場合、散乱光１３は、ミラー２４，２５などにより、その進行方向を調整すればよい。
［動作］
次に、微小粒子測定装置１の動作、即ち、本実施形態の微小粒子測定装置１を使用して微小粒子１０を分析する方法について説明する。図１に示すように、本実施形態の微小粒子測定装置１では、流路３中を通流する微小粒子１０に対して、光照射部に設けられた光源２から励起光１１を照射し、光検出部において微小粒子１０から発せられた蛍光１２や散乱光１３を検出する。
次に、微小粒子測定装置１の動作、即ち、本実施形態の微小粒子測定装置１を使用して微小粒子１０を分析する方法について説明する。図１に示すように、本実施形態の微小粒子測定装置１では、流路３中を通流する微小粒子１０に対して、光照射部に設けられた光源２から励起光１１を照射し、光検出部において微小粒子１０から発せられた蛍光１２や散乱光１３を検出する。
具体的には、微小粒子１０から発せられた蛍光１２は、分光フィルタ４により散乱光１３と分離され、プリズムやグレーティングなどの分光素子８で分光された後、分光された蛍光１４が、蛍光検出器９の各受光素子９ａ〜９ｚで検出される。各受光素子９ａ〜９ｚでは、電流などを電気的に検出し、蛍光強度情報を電気的情報に変換する。そして、その結果に基づいて、例えば、蛍光強度の波長特性を解析し、表示する。なお、本実施形態の微小粒子測定装置１では、フィルタを用いて断片的な波長領域を複数点検出するだけでなく、蛍光スペクトルを測定することもできる。
一方、微小粒子１０から発せられた散乱光１３は、分光フィルタ４により蛍光１２と分離された後、偏光素子５により、Ｐ偏光成分１３ｐとＳ偏光成分１３ｓに分光される。そして、Ｐ偏光成分１３ｐは散乱光強度検出器６で検出され、Ｓ偏光成分１３ｓは粒子位置検出器７で検出される。
図４は微小粒子１０の通流位置と、粒子位置検出器７で検出される投影像との関係を示す図である。また、図５は図３に示すｙ方向の位置ずれに付随した投影像の移動を示す図であり、図６はｚ方向の位置ずれに付随した投影像の移動を示す図である。更に、図７Ａ〜Ｃは図３に示すｘ方向の位置ずれに付随した投影像の移動を示す図である。
粒子位置検出器７で得られる投影像は、微小粒子１０から発せられた散乱光１３のＳ偏光１３ｓを結像させた像である。そして、図４に示すように、光照射部に設けられた対物レンズの焦点位置に微小粒子１０が存在する場合は、真円状の像となるが、焦点位置からずれた位置に微小粒子が存在する場合、楕円状となる。そして、Ｓ偏光１３ｓの受光位置の変化から、微小粒子の通流位置を検出することができる。
例えば、粒子位置検出器７が４分割検出器であった場合、各受光領域ａ，ｂ，ｃ，ｄにおいて得られるシグナル値をそれぞれＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄとすると、図５に示す微小粒子１０のｙ方向における位置ずれは、（Ａ−Ｃ）により算出することができる。また、図６に示す微小粒子１０のｚ方向における位置ずれは、｛（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ）｝により算出することができる。
一方、図７Ａに示すように、粒子位置検出器７の投影像は、図５に示す微小粒子１０のｙ方向における位置ずれに起因する動きと直交する方向にも変動する。従来の検出方法では、このような場合、変動による投影像の位置変化が微小粒子１０のｙ方向及びｚ方向の算出時に誤差として重畳されるため、検出精度低下の原因となっていた。また、投影像の位置が粒子位置検出器７の中心位置からオフセットされることにより、検出器の有効径が狭まるため、検出のダイナミックレンジ及び粒子径に対するリニアリティが劣化する。
位置ずれに因る投影像の変動を抑えるようにディテクターの位置を調整することもできるが、その場合、図７Ｂに示すように、投影像が楕円形状に変形するため、同様に、検出のダイナミックレンジ及び粒子径に対するリニアリティが劣化する。これに対して、本実施形態の微小粒子測定装置では、光学系を特定の配置にしているため、図７Ｃに示すように、微小粒子１０の通流方向の位置ズレによる投影像の変動を効果的に抑制することができる。
図８Ａは微小粒子の通流方向における変動を抑制しない場合の検出信号の挙動を示す図であり、図８Ｂは投影像の挙動を示す図である。また、図９Ａは微小粒子の通流方向における変動を抑制した場合の検出信号の挙動を示す図であり、図９Ｂは投影像の挙動を示す図である。
本来、粒子位置検出器７の各受光面ａ，ｂ，ｃ，ｄにおけるシグナルは重なる状態が理想的であるが、図８Ａ及び図８Ｂに示すように微小粒子１０の通流方向ｘにおける変動を抑制しない場合は、各受光面ａ，ｂ，ｃ，ｄのシグナル値に乖離が生じる。一方、本実施形態の微小粒子測定装置１のように、微小粒子１０の通流方向ｘにおける変動を抑制すると、図９Ａ及び図９Ｂに示すように、シグナル値の乖離を小さく抑えることができる。
微小粒子１０の通流方向ｘにおける変動を抑制効果を確認するため、流路３中を流れる微小粒子１０に対して、光源２から励起光１１として波長４８８ｎｍのレーザ光を照射し、微小粒子１０から発せられた蛍光１２及び散乱光１３を検出した。具体的には、微小粒子１０から発せられた光を対物レンズで回収し、分光フィルタ４を用いて波長によって蛍光１２と散乱光１３とに分光した。
そして、蛍光１２については、分光素子８としてプリズムを用い、このプリズムによって波長に応じて分光された蛍光１４を、３２チャネルの受光素子アレイ（蛍光検出器９）に投影して検出した。一方、散乱光１３については偏光素子５で分光して、Ｐ偏光１３ｐについては散乱光強度検出器６で検出し、Ｓ偏光１３ｓについては４分割フォトダイオード（粒子位置検出器７）に投影した。
図１０Ａは微小粒子の通流方向における変動を抑制しない場合の検出信号の実測値であり、図１０Ｂは微小粒子の通流方向における変動を抑制した場合の検出信号の実測値である。図１０Ａ及び図１０Ｂに示すように、変動抑止を実施することにより、微小粒子１０の通流方向ｘにおける粒子位置ズレに起因した投影像の変動によるシグナル値の乖離を小さく抑えられることが確認された。
以上詳述したように、本実施形態の微小粒子測定装置１では、微小粒子１０の通流方向ｘにおける変動を、光学的に抑制することができるため、微小粒子の通流位置の検出信号に、余分な誤差信号の重畳されることを防止することができる。これにより、微小粒子の位置情報に基づき、各種光検出値を補正する際のノイズが低減されるため、蛍光及び散乱光の強度についてＣＶ値の改善や、蛍光スペクトル形状の正確性向上が期待できる。例えば、ラミナフロー３０中の一定の位置範囲内を通流する微小粒子１０に解析対象を絞り込むトリミング処理を施すことにより、計測値のばらつきを低減して、分散やＣＶ値を改善することができる。
また、本実施形態の微小粒子測定装置１では、蛍光１２及び散乱光１３の検出とは別に、位置検出用の光学系を設けているため、視野限定用のピンホールが不要となり、粒子位置検出器７の受光面に投影できる視野範囲を大きく取ることができる。これにより、検出信号のリニアリティーが向上する。更に、粒子内で散乱した光は光軸に対して傾いて伝搬し、大径の粒子ではその影響が顕著となるが、本実施形態の微小粒子測定装置１では、光軸に対して傾いて伝搬する散乱光も含めて信号として取り込めるため、ダイナミックレンジの拡大にも繋がる。
なお、本実施形態の微小粒子測定装置１では、偏光素子５により散乱光１３を分光しているが、本開示はこれに限定されるものではなく、散乱光強度検出器６及び粒子位置検出器７の手前に散乱光１３を２つに分割する光分割素子が設けられていればよい。この光分割素子には、前述した偏光素子５の他に、偏光分離特性を持たないパワー分割素子を使用することもでき、その場合、散乱光強度検出器６への入射光：粒子位置検出器７への入射光が、９：１程度になることが好ましい。
また、マイクロチップ２０と位置検出光学系の各光学部品の配置も、図３に示す配置に限定されるものではなく、例えば、ミラー２５の向きを変更し、非点収差素子２２及び粒子位置検出器７をｚ軸上に配置することもできる。その場合、信号挙動に応じて、非点収差素子２２及び粒子位置検出器７の設置角度を調整すればよい。
＜２．第１の実施の形態の変形例＞
図３に示す微小粒子測定装置１では、非点収差素子２２を、母線２２ａが微小粒子１０の通流方向ｘに対して垂直となるように配置しているが、本開示はこれに限定されるものではなく、母線２２ａが微小粒子１０の通流方向ｘに対して平行になるように配置してもよい。図１１は本開示の第１の実施形態の変形例に係る微小粒子測定装置における位置検出光学系の各光学部品の配置を模式的に示す図である。
図３に示す微小粒子測定装置１では、非点収差素子２２を、母線２２ａが微小粒子１０の通流方向ｘに対して垂直となるように配置しているが、本開示はこれに限定されるものではなく、母線２２ａが微小粒子１０の通流方向ｘに対して平行になるように配置してもよい。図１１は本開示の第１の実施形態の変形例に係る微小粒子測定装置における位置検出光学系の各光学部品の配置を模式的に示す図である。
図１１に示すように、本変形例に係る微小粒子測定装置では、非点収差素子２２は、ｙ軸上に、その母線２２ａが微小粒子１０の通流方向ｘに対して略平行となるように配置されている。具体的には、非点収差素子２２が、ｙ軸に直交する平面上において、その母線２２ａと、ｘ軸方向に延びる線とのなす角が０〜５°となるように配置されている。
また、粒子位置検出器７もｙ軸上に配置されており、例えば４分割の検出器の場合は、その分割線７ａが微小粒子１０の通流方向ｘに対して略±４５°となるように配置されている。具体的には、粒子位置検出器７は、ｙ軸に直交する平面上において、分割線７ａと、ｘ軸方向に延びる線及びｚ軸方向に延びる線とのなす角が４０〜５０°となるように配置されていることが好ましい。この場合も、非点収差素子２２の母線２２ａと、粒子位置検出器７の分割線７ａとがなす角は略±４５°となる。
本変形例においても、前述した第１の実施形態の微小粒子測定装置と同様に、微小粒子の流れ方向における位置変動の影響を抑制することができるため、流路内を通流する微小粒子の位置を従来よりも高精度で検出することができる。なお、本変形例における上記以外の構成及び効果は、前述した第１の実施形態と同様である。
また、本開示は、以下のような構成をとることもできる。
（１）
流路を通流する微小粒子に光を照射する光照射部と、
該微小粒子から発せられた散乱光を検出する散乱光検出部と、を有し、
前記散乱光検出部は、少なくとも、
前記微小粒子から発せられた光を集光する対物レンズと、
該対物レンズで集光された光のうち散乱光を第１散乱光と第２散乱光に分割する光分割素子と、
前記第１散乱光を受光する第１散乱光検出器と、
前記光分割素子と前記第１散乱光検出器との間に配設され、前記第１散乱光に非点収差を与える非点収差素子と、を備えており、
前記対物レンズの後側主点から前記非点収差素子の前側主点までの距離Ｌと、前記非点収差素子の焦点距離ｆとの関係が下記数式（Ｉ）を満たす微小粒子測定装置。
１．５ｆ≦Ｌ≦２．５ｆ ・・・（Ｉ）
（２）
前記光分割素子は前記散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する偏光素子であり、前記第１散乱光はＳ偏光成分である（１）に記載の微小粒子測定装置。
（３）
前記非点収差素子がシリンドリカルレンズである（１）又は（２）に記載の微小粒子測定装置。
（４）
前記微小粒子に対する光の入射方向をｚ方向、前記微小粒子の通流方向をｘ方向、前記ｚ方向及び前記ｘ方向に垂直な方向をｙ方向としたとき、
前記非点収差素子は、前記ｙ方向に直交する平面上において、その母線と、前記ｘ方向に延びる線又は前記ｚ方向に延びる線とのなす角が０〜５°となるように配置されている（１）〜（３）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（５）
前記第１散乱光検出器は、受光面が複数領域に分割された検出器である（１）〜（４）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（６）
前記第１散乱光検出器は、４分割フォトダイオードである（１）〜（５）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（７）
前記微小粒子に対する光の入射方向をｚ方向、前記微小粒子の通流方向をｘ方向、前記ｚ方向及び前記ｘ方向に垂直な方向をｙ方向としたとき、
前記第１散乱光検出器は、前記ｙ方向に直交する平面上において、その分割線と、前記ｘ方向に延びる線又は前記ｚ方向に延びる線とのなす角が４０〜５０°となるように配置されている（１）〜（６）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（８）
前記第１散乱光の受光位置の変化から、前記微小粒子の通流位置を検出する（１）〜（７）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（９）
前記第１散乱光検出器は、その受光面が、格子状に、第１領域、第２領域、第３領域及び第４領域に分割されており、
前記第１領域の検出値Ａと、前記第１領域に隣接しない前記第３領域の検出値Ｃとの差（Ａ−Ｃ）から、前記微小粒子の位置情報を取得する（１）〜（８）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１０）
前記第１散乱光検出器は、その受光面が、格子状に、第１領域、第２領域、第３領域及び第４領域に分割されており、
前記第１領域の検出値Ａ及び前記第１領域に隣接しない前記第３領域の検出値Ｃとの和（Ａ＋Ｃ）と、前記第１領域に隣接する前記第２領域の検出値Ｂ及び前記第２領域に隣接しない前記第４領域の検出値Ｄとの和（Ｂ＋Ｄ）との差（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））から、前記微小粒子の位置情報を取得する（１）〜（８）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１１）
前記光照射部は、マイクロ流路を備えた分析チップ内を通流する微小粒子に光を照射する（１）〜（１０）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１）
流路を通流する微小粒子に光を照射する光照射部と、
該微小粒子から発せられた散乱光を検出する散乱光検出部と、を有し、
前記散乱光検出部は、少なくとも、
前記微小粒子から発せられた光を集光する対物レンズと、
該対物レンズで集光された光のうち散乱光を第１散乱光と第２散乱光に分割する光分割素子と、
前記第１散乱光を受光する第１散乱光検出器と、
前記光分割素子と前記第１散乱光検出器との間に配設され、前記第１散乱光に非点収差を与える非点収差素子と、を備えており、
前記対物レンズの後側主点から前記非点収差素子の前側主点までの距離Ｌと、前記非点収差素子の焦点距離ｆとの関係が下記数式（Ｉ）を満たす微小粒子測定装置。
１．５ｆ≦Ｌ≦２．５ｆ ・・・（Ｉ）
（２）
前記光分割素子は前記散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する偏光素子であり、前記第１散乱光はＳ偏光成分である（１）に記載の微小粒子測定装置。
（３）
前記非点収差素子がシリンドリカルレンズである（１）又は（２）に記載の微小粒子測定装置。
（４）
前記微小粒子に対する光の入射方向をｚ方向、前記微小粒子の通流方向をｘ方向、前記ｚ方向及び前記ｘ方向に垂直な方向をｙ方向としたとき、
前記非点収差素子は、前記ｙ方向に直交する平面上において、その母線と、前記ｘ方向に延びる線又は前記ｚ方向に延びる線とのなす角が０〜５°となるように配置されている（１）〜（３）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（５）
前記第１散乱光検出器は、受光面が複数領域に分割された検出器である（１）〜（４）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（６）
前記第１散乱光検出器は、４分割フォトダイオードである（１）〜（５）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（７）
前記微小粒子に対する光の入射方向をｚ方向、前記微小粒子の通流方向をｘ方向、前記ｚ方向及び前記ｘ方向に垂直な方向をｙ方向としたとき、
前記第１散乱光検出器は、前記ｙ方向に直交する平面上において、その分割線と、前記ｘ方向に延びる線又は前記ｚ方向に延びる線とのなす角が４０〜５０°となるように配置されている（１）〜（６）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（８）
前記第１散乱光の受光位置の変化から、前記微小粒子の通流位置を検出する（１）〜（７）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（９）
前記第１散乱光検出器は、その受光面が、格子状に、第１領域、第２領域、第３領域及び第４領域に分割されており、
前記第１領域の検出値Ａと、前記第１領域に隣接しない前記第３領域の検出値Ｃとの差（Ａ−Ｃ）から、前記微小粒子の位置情報を取得する（１）〜（８）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１０）
前記第１散乱光検出器は、その受光面が、格子状に、第１領域、第２領域、第３領域及び第４領域に分割されており、
前記第１領域の検出値Ａ及び前記第１領域に隣接しない前記第３領域の検出値Ｃとの和（Ａ＋Ｃ）と、前記第１領域に隣接する前記第２領域の検出値Ｂ及び前記第２領域に隣接しない前記第４領域の検出値Ｄとの和（Ｂ＋Ｄ）との差（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））から、前記微小粒子の位置情報を取得する（１）〜（８）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１１）
前記光照射部は、マイクロ流路を備えた分析チップ内を通流する微小粒子に光を照射する（１）〜（１０）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
１：微小粒子測定装置、２：光源、３：流路、４：分光フィルタ、５：偏光素子、６：散乱光強度検出器、７：粒子位置検出器、７ａ：分割線、８：分光素子、９：蛍光検出器、９ａ〜９ｚ：受光素子、１０：微小粒子、１１：励起光、１２，１４：蛍光、１３ 散乱光、１３ｓ：Ｓ偏光、１３ｐ：Ｐ偏光、２０：マイクロチップ、２１：対物レンズ、２２：非点収差素子、２２ａ：母線、２３：コンデンサレンズ、２４，２５：ミラー、３０：ラミナーフロー、３１：励起光照射部
Claims (11)
- 流路を通流する微小粒子に光を照射する光照射部と、
該微小粒子から発せられた散乱光を検出する散乱光検出部と、を有し、
前記散乱光検出部は、少なくとも、
前記微小粒子から発せられた光を集光する対物レンズと、
該対物レンズで集光された光のうち散乱光を第１散乱光と第２散乱光に分割する光分割素子と、
前記第１散乱光を受光する第１散乱光検出器と、
前記光分割素子と前記第１散乱光検出器との間に配設され、前記第１散乱光に非点収差を与える非点収差素子と、を備えており、
前記対物レンズの後側主点から前記非点収差素子の前側主点までの距離Ｌと、前記非点収差素子の焦点距離ｆとの関係が下記数式（Ｉ）を満たす微小粒子測定装置。
- 前記光分割素子は前記散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する偏光素子であり、前記第１散乱光はＳ偏光成分である請求項１に記載の微小粒子測定装置。
- 前記非点収差素子がシリンドリカルレンズである請求項１又は２に記載の微小粒子測定装置。
- 前記微小粒子に対する光の入射方向をｚ方向、前記微小粒子の通流方向をｘ方向、前記ｚ方向及び前記ｘ方向に垂直な方向をｙ方向としたとき、
前記非点収差素子は、前記ｙ方向に直交する平面上において、その母線と、前記ｘ方向に延びる線又は前記ｚ方向に延びる線とのなす角が０〜５°となるように配置されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の微小粒子測定装置。 - 前記第１散乱光検出器は、受光面が複数領域に分割された検出器である請求項１〜４のいずれか１項に記載の微小粒子測定装置。
- 前記第１散乱光検出器は、４分割フォトダイオードである請求項１〜５のいずれか１項に記載の微小粒子測定装置。
- 前記微小粒子に対する光の入射方向をｚ方向、前記微小粒子の通流方向をｘ方向、前記ｚ方向及び前記ｘ方向に垂直な方向をｙ方向としたとき、
前記第１散乱光検出器は、前記ｙ方向に直交する平面上において、その分割線と、前記ｘ方向に延びる線又は前記ｚ方向に延びる線とのなす角が４０〜５０°となるように配置されている請求項１〜６のいずれか１項に記載の微小粒子測定装置。 - 前記第１散乱光の受光位置の変化から、前記微小粒子の通流位置を検出する請求項１〜７のいずれか１項に記載の微小粒子測定装置。
- 前記第１散乱光検出器は、その受光面が、格子状に、第１領域、第２領域、第３領域及び第４領域に分割されており、
前記第１領域の検出値Ａと、前記第１領域に隣接しない前記第３領域の検出値Ｃとの差（Ａ−Ｃ）から、前記微小粒子の位置情報を取得する請求項１〜８のいずれか１項に記載の微小粒子測定装置。 - 前記第１散乱光検出器は、その受光面が、格子状に、第１領域、第２領域、第３領域及び第４領域に分割されており、
前記第１領域の検出値Ａ及び前記第１領域に隣接しない前記第３領域の検出値Ｃとの和（Ａ＋Ｃ）と、前記第１領域に隣接する前記第２領域の検出値Ｂ及び前記第２領域に隣接しない前記第４領域の検出値Ｄとの和（Ｂ＋Ｄ）との差（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））から、前記微小粒子の位置情報を取得する請求項１〜９の何れか１項に記載の微小粒子測定装置。 - 前記光照射部は、マイクロ流路を備えた分析チップ内を通流する微小粒子に光を照射する請求項１〜１０の何れか１項に記載の微小粒子測定装置。
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