CN110118758B - 一种散射荧光双模态流式成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种散射荧光双模态流式成像系统，包括具有激发光源和光束整形模块的多色正交照明单元，包括物镜、多光谱分像器和多个相机的多通道显微成像单元，以及与所述物镜共轴的进样管。所述激发光源能够发射两个或多个波长的激发光，经所述光束整形模块整形后，在与所述物镜焦面重合的位置处垂直照射所述进样管。所述物镜收集生物颗粒发出的散射光和荧光，所述多光谱分像器按照特定的光谱通带将所述散射光和荧光分由散射通道以及一个或多个荧光通道投射至不同的相机进行成像。整套系统原理基于光片照明的侧向散射和荧光发射显微成像技术，能够取得更准确的浮游生物观测结果，并适应更广谱的水域浮游生物物种范围和非生命颗粒物的在线测量需求。

Description

一种散射荧光双模态流式成像系统

技术领域

本发明属于生物及环境领域的光学仪器技术，具体涉及到一种流式成像系统。

背景技术

浮游生物是水域生态系统的基础组成部分，在整个食物链物质循环和能量流动中起到重要的作用。对浮游生物的生理、生态、多样性和过程了解是海洋资源、生物多样性、生态系统对气候变化响应等研究的基础需求。然而，尽管现有浮游生物观测技术和观测平台已有一定发展，但是识别与定量技术在检测的通量、特异性与准确性上仍然严重不足，是目前与未来相关科学研究和水环境监测需要面对的主要挑战之一。

水域环境除了具有广阔性，还掺杂有大量与浮游生物尺度类似的非生命颗粒物。这与浮游生物的微小性、异质性构成天然矛盾，造成对浮游生物大时空尺度准确观测的巨大挑战。各种观测技术的最终目的是对海洋浮游生物的分布、丰度、种群结构、大小或生物量进行及时准确的测量或估计。然而现有技术均难以突破观测准确性和通量间的矛盾，亟需从检测方法原理上寻求突破，发展通量更高、检测更准、可在现场工作的分析技术和仪器。

迄今为止，基于形态学的光学镜检仍然是最为广泛使用的浮游生物鉴定和分析经典方法。随着数字技术的进步，将高速数字成像与计算机人工智能结合，将有可能大幅提升镜检通量，获得更准确、更客观、更高效、更可重复的浮游生物观测结果。这一思想催生了成像流式细胞测量术(imaging flow cytometry)的诞生与发展。

这一技术结合了光学显微镜与传统非成像流式细胞仪的原理与优势，可在细胞流动中高通量获取其二维图像。相比人工/自动镜检，它的进样和成像速度更快，检测通量大幅提升；相比非成像流式细胞仪，它获取的细胞形态细节信息更丰富，更接近广泛使用的经典形态学镜检。

然而，现有成像流式细胞测量术在应用于天然水样中的浮游生物检测分析时，仍有很多缺陷和不足。例如，FlowCAM和Imaging Flow CytoBot(IFCB)是两种专用于浮游植物观测的成像流式细胞仪系统。两种仪器的显微摄影均基于明场成像原理，在拍摄高速流动细胞时，受到离焦模糊和拖尾模糊的困扰，难以同时对较大粒径范围内的细胞清晰成像。由于两种仪器难以应用高倍物镜，导致成像分辨率和灵敏度较差，检测2μm内的细胞困难。为了避免拖尾模糊，上述仪器均采用了闪光照明的方法提高快门速度“抓拍”细胞；但是曝光时间的大幅缩短导致图像信噪比恶化，降低测量精度。此外，上述仪器会在高流速时漏拍细胞，在低流速时出现同视野重复拍摄，造成严重的统计误差。Amnis系列成像流式细胞仪采用时间延时积分成像技术，可对细胞同时实现明场、暗场和荧光多光谱流式显微成像。相比于明场成像，可在细胞形态信息基础上额外获取更为丰富的生化信息用于比对分析。但是在时间延时积分成像中，细胞流动与相机的曝光读出需要通过复杂的测速反馈机制精确同步，否则仍会造成拖尾模糊；通过后期计算拓展有效景深的方法增加了仪器复杂度和成本，图像后处理操作也会占用大量处理时间，降低了流式成像测量的有效通量。目前该仪器的常规放大倍率为40倍，进样通道尺度仅为120μm，在实际使用中容易堵塞。由于该仪器的设计初衷是为实验室内生物医学细胞的检测，因此并不适用于对成分复杂的天然水样进行直接分析，更不可能用于水域现场环境。

为了解决上述成像技术问题，并充分考虑和利用水体中浮游生物及非生命颗粒物的光学信息特点，一种光片荧光流式成像技术应运而生。这一技术与其他成像流式细胞术的方法学根本不同在于：不再是成像光轴与细胞流动方向正交，而是共轴；激发光与成像光轴不再是共轴，而是垂直，且在空间中被束缚至仅对焦深以内目标激发照明。相比于前述仪器，这一技术在对例如自发荧光浮游植物的测量效果上具有成像质量高、测量灵敏度高、测量精度高、样品无损和测量通量高的明显优点，因此十分适合于浮游植物的现场在线观测。然而，光片荧光流式成像技术在对浮游生物观测问题的解决上仍然还有很多局限。首先，目前该技术只能依靠浮游生物体内的某些色素自发荧光作为成像对比度机制，因此难以对不能发射自发荧光的目标或其部分实现准确成像测量，这局限了其对大多数浮游动物和浮游细菌的应用前景。其次，很多浮游植物特别是20μm以上的微型和小型真核细胞，其细胞壁、鞭毛等透明结构通常不含荧光色素，这些形态学结构往往是特定浮游植物种类的独有特征；无法对这些特征观测不仅对造成后续识别困难，还会造成细胞大小和/或计数测量的错误。最后，各种分子技术的发展不仅可为不含自发荧光色素的浮游生物进行荧光标记，还可以大大增加其检测特异性；然而现有光片荧光成像流式细胞术的激发波长单一，光谱成像通道不足，无法满足对更多不同荧光标记更广光谱范围内的多光谱成像检测需求。

发明内容

为解决现有光片荧光流式成像细胞测量技术的上述局限以及其它成像流式细胞测量术的缺点，本发明提供一种散射荧光双模态流式成像系统，其原理基于光片照明的侧向散射和荧光发射显微成像技术，能够取得更准确的浮游生物观测结果，并适应更广谱的水域浮游生物物种范围和非生命颗粒物的在线测量需求。

具体地，本发明的一种散射荧光双模态流式成像系统，包括：多色正交照明单元，其包括相互配合的激发光源和光束整形模块；所述激发光源能够发射两个或多个波长的激发光。多通道显微成像单元，其包括物镜、多光谱分像器和多个相机；所述物镜收集生物颗粒发出的散射光和荧光；所述多光谱分像器按照特定的光谱通带将所述散射光和荧光分由散射通道以及荧光通道投射至不同的相机进行成像；其中，所述散射通道可以为一个，也可以为一个以上，荧光通道的数量例如为两个，或者其它所需的个数。进样管与所述物镜共轴，所述激发光源发出的光束，经所述光束整形模块整形后，在与所述物镜焦面重合的位置处，垂直照射所述进样管。

本发明的系统中，所述激发光源可以有多种设计，包括：1、所述两个或多个波长的激发光分别由不同的单波长激光器发出；2、所述两个或多个波长的激发光由多波长合束激光器发出；3、所述两个或多个波长的激发光由超连续激光器配合窄带可调谐滤光器发出。

进一步，所述两个或多个波长的激发光由激光器在自由空间输出。为了进一步使得系统紧凑以方便现场使用，所述两个或多个波长的激发光也可以由激光器通过光纤输出。

为了保证照明光场的均匀，照明光通常要垂直入射到进样管中，因而进样管的截面设计为多边形，而不是圆弧形，从而避免圆弧形对光束折射等所带来的影响。所述多边形具有2n 条边，其中n为大于等于2的自然数。对于截面为不同边数的多边形，其实也优选适用于不同个数的激发波长，具体优选地：当所述激发光源能够发射两个波长的激发光时，所述进样管的截面为四边形；当所述激发光源能够发射三个波长的激发光时，所述进样管的截面为六边形；当所述激发光源能够发射四个波长的激发光时，所述进样管的截面为四边形。

对于光片照明光场的实现，本发明优选在所述光束整形模块中使用一维90°抛物面镜来形成光片照明光场，如此能够省去柱透镜甚至显微物镜等光学器件，在照明光场仍能保持一定适应性的基础上进一步使得系统更加紧凑。

由于散射光强通常大于荧光光强，因而需要平衡各个通道的光信号以使得融合图像更加准确。优选以下三种方案：在所述散射通道中设置有中密度滤光片以对散射光信号进行衰减；或者，采用使得所述散射通道对应相机的增益低于所述荧光通道对应相机的增益的方法获得上述平衡状态；或者，在系统中设置反馈单元，所述反馈单元能够根据所述散射通道和所述荧光通道的图像光强信息反馈调节所述激发光源的信号，从而改变激发光的光强。进一步，在所述散射通道中还可以增设偏振片，从而能够有效抑制背景噪声，提升散射成像模态的对比度。

在多通道显微成像单元中，所述多光谱分像器通过双色镜将所述散射通道与所述荧光通道、所述散射通道之间以及所述荧光通道之间分开。为了避免激发光带来的影响，优选在所述双色镜之前还设置有带阻滤光片，以阻止部分激发光进入后续成像光路。

为了使系统适应更多的应用场景，对包括自发荧光、非自发荧光或者标记荧光在内的多种生物颗粒进行观测分析，所述多光谱分像器可以采用模块化设计，从而面对不同的观测生物颗粒时，可以选择具有最适当的光谱波段的成像模块。具体地，所述多光谱分像器包括一个或一个以上对应散射通道的散射通道成像模块以及一个或一个以上对应荧光通道的荧光通道成像模块，其中两个或多个所述散射通道成像模块之间、两个或多个所述荧光通道成像模块之间在机械结构上设计成可以方便替换的。所述散射通道成像模块包括一个双色镜、一个偏振片、一个中密度滤波片以及一台相机；而所述荧光通道成像模块包括一个双色镜、一个带通滤波片和一台相机。为了防止无用光信号的干扰，优选地，所述散射成像通道和/或所述荧光成像通道的双色镜之前还设有带阻滤光片。同时，上述这些模块也并不是随意插入多通道显微成像单元就能正常工作。考虑到各个滤光片的光谱特性，按照距离所述物镜后方由近及远的方向，通带波长更长的成像通道模块在通带波长较短的成像通道模块后方，即各成像通道模块需要按照该模块通带红移的方向依次排列。

在系统的具体实现上，实际的空间结构及布局可以根据不同的空间要求进行调整。例如所述多色正交照明单元的器件和所述多通道光谱成像单元的器件都布局在同一平面内，如此整个系统更加扁平化，适于在高度有限的空间下使用。或者，所述多色正交照明单元的器件设置在所述多通道光谱成像单元的一侧或者两侧，如此可以使系统在横向上更加紧凑，更容易利用纵向空间，从而使整套系统容易地放进例如管型外壳内。此外，系统还可以整合多个所述多色正交照明单元和多个与之配合的所述多通道光谱成像单元；每一组配合使用的多色正交照明单元和所述多通道光谱成像单元，其所有器件都布局在同一平面内，并且不同的所述多通道光谱成像单元具有不同放大倍率的物镜。如此能够使得系统适应更广范围粒径的观测分析。

最后，整套成像系统的光路也是非常精密的，因而所述物镜被固定在能够进行平移调节的调节机制上，从而能够调节所述物镜的焦面位置。所述多光谱分像器中的器件也配有例如具有2个或4个自由度的调节机制。如此能够方便地调节系统各个光学器件的位置，保证系统成像准确与高效。

按照生命体大小，浮游生物大体可按照由大到小次序划分为浮游动物、浮游植物和浮游细菌。本发明的散射荧光双模态流式成像系统适用于上述所有不同尺寸范围的观测对象，并能收到如下诸多现有技术所达不到的观测效果。

以观测浮游植物为例，浮游植物多是具备丰富光学信号的水体单细胞颗粒物，这是因为其体内具有十分复杂的色素组成，某种色素仅存在于特定种类细胞中，因此由各类色素对光信号的调制差异常作为光学识别的重要依据。例如，叶绿素a自发荧光就是一种水体颗粒物是否属于浮游植物的主要判据，藻红素和藻蓝素的自发荧光是反应不同蓝藻类群的重要特征。而由于光散射与散射物的大小和粒度极为相关，因而也可以被用来作为流式细胞仪和激光散射粒度仪的主要检测信号，成为2μm以内的超微型浮游生物的主要检测信息媒介。因此，使用本发明的散射荧光双模态流式成像系统观测浮游植物时，当浮游植物细胞流经照明成像检测区域时，成像系统可同时对其拍摄多张图像，分别为反应其细胞轮廓大小和形态纹理结构的暗场散射图像、反映其叶绿素a分布和浓度的荧光图像和反映其藻红素/藻蓝素分布和浓度的荧光图像。利用双模态多光谱图像间的空间关联性对其进行配准与融合，可以对细胞大小、形态、纹理、色素构成、色素分布、色素浓度进行更为全面的分析，为浮游植物的精确观测提供更为全景的特征信息。

此外，本发明的系统还为各种基于人工荧光标记的分子技术运用于生物颗粒分析提供了更为灵活强大的检测手段。只要有针对性的选择各个激发光源和成像通道的光谱通带，本发明的系统可以方便的适应于多种外加荧光标记和生物颗粒原生荧光团的自发荧光特性，更充分的利用分子技术带来的生物颗粒检测特异性优势。例如，通过分子荧光标记技术与多光谱图像分析的结合，本发明可使成像流式细胞分析技术拓展出更多的诸如研究浮游植物活性、新陈代谢、生活史、产油率等反应生理状态的功能。

第三，本发明的系统结构紧凑，模块化的设计更能方便的拓展各种现场检测场景的适用范围。根据不同的检测对象，用户可以方便的调整成像系统，获得最佳的检测结果。

最后，本发明的系统还可以与制样速度较快的分子技术配合使用，这样系统不仅能够为提取浮游植物的固有信息提供强大的手段，还为研究浮游植物以外的其他微小生物颗粒(如小型浮游动物)以及它们之间的相互作用过程提供了可能。例如，利用荧光标记物对特定浮游动物种类的快速鉴定，研究浮游动物对浮游植物的摄食、细菌与浮游植物的附着、共生与寄生关系等。如此进一步适应更多的现场观测需求。

附图说明

图1：散射荧光双模态流式成像系统基本架构示意图；

图2：用于海洋浮游植物细胞检测的散射荧光双模态流式成像系统；

图3：用于淡水浮游植物细胞检测的散射荧光双模态流式成像系统；

图4：用于多种浮游植物细胞检测的散射荧光双模态流式成像系统；

图5：用于多种生物颗粒检测的散射荧光双模态流式成像系统；

图6：基于单波长激光器自由空间输出的正交照明单元；

图7：基于单波长激光器单模光纤输出的正交照明单元；

图8：基于多波长合束激光器自由空间输出的正交照明单元；

图9：基于多波长激光器单模光纤耦合输出的正交照明单元；

图10：基于超连续激光器和声光可调滤光片输出的正交照明单元；

图11：分立波长照明光束与进样管之间的方位关系；

图12：超连续白激光照明光束与进样管之间的方位关系；

图13：实施例一的多光谱分像器结构图；

图14：多光谱分像器所有滤光片的光谱特性示意图；

图15：带有彩色成像通道系统的多光谱分像器结构图以及相应滤光片的光谱特性示意图；

图16：基于正交照明的散射/荧光双模态三通道光谱成像概念示意图，(a)散射模态(b) 红色荧光(c)橙色荧光(d)三通道融合图像；

图17：有限光谱通带成像模块化设计示意图；

图18：有限光谱通带成像模块化系统中滤光片选择原则示意图；

图19：平面紧凑型双波长对射三通道成像流式细胞仪器件结构布局；

图20：立体紧凑型双波长对射三通道成像流式细胞仪器件结构布局；

图21：立体紧凑型全粒径海洋浮游植物成像流式细胞仪器件结构布局。

具体实施方式

本发明为基于轴向流式成像技术的散射/荧光双模态多通道流式成像系统，其基本架构参见说明书附图1所示，具体包括多色正交照明单元A和多通道显微成像单元B。多色正交照明单元A包括能够发出多个波长的激发光源1和光束整形模块2，两者与进样管3相配合使用。样品从一侧(图示左侧)进入进样管3，并被多色正交照明单元A的激发光垂直照射。多通道显微成像单元B包括物镜4、多光谱分像器5、多个相机61、62和63、以及计算机7。基本工作流程为正交照明单元A中的激发光源1发出光束，经光束整形模块2整形后，从侧面垂直照射进样管 3中流动的生物颗粒，生物颗粒发出的散射光和荧光被多通道显微成像单元B的物镜4收集，然后经过多光谱分像器5投射至多台相机进行成像，并将成像数据送至计算机7进行分析处理。进一步，照射光束与成像物镜4的焦面重合，且与进样流动的方向正交。多光谱分像器5将目标图像按照特定的光谱通带分为若干幅对应于生物颗粒发出的不同波长散射和不同谱段荧光发射的光谱图像。多台相机由计算机7控制同步同时采集图像，即可得到生物颗粒目标的双模态多光谱图像，用于后续的图像处理，实现生物颗粒的成像分析。

具体的，以下在四个实施场景中对本发明的散射/荧光双模态多通道流式成像系统的更多细节做进一步说明。

实例一：用于海洋浮游植物细胞检测

如说明书附图2所示，多色正交照明单元A具体包括两套相互配合的激光器11、12和光束整形模块21、22，激光器11和激光器12的中心波长分别为445nm(蓝光b)和532nm(绿光g)，分别对应于海洋浮游植物细胞的叶绿素a和藻红素激发峰。以蓝光b激发光路为例，经过光束整形模块21，激光器11发出的高斯光束被整形且照明方向被调整成与进样管3内样品流动方向正交，照射光束与成像物镜4的焦面重合，与进样流动方垂直。浮游植物细胞颗粒将会散射照明的蓝光b和绿光g，并自发发射中心波长为580nm附近的藻红素橙色荧光o和中心波长在685nm 附近的叶绿素a深红色荧光r。上述波段的光被成像系统的物镜4收集，经过多光谱分像器5投射至三台相机61、62和63进行成像。其中散射的绿光g被投射至相机61，自发发射的橙色荧光被o投射至相机62，自发发射的深红色荧光r被投射至相机63。通过计算机控制三台相机同步同时采集图像，即可得到浮游植物细胞颗粒的双模态多光谱图像，通过后续的图像处理，即可实现海洋浮游植物细胞颗粒的成像分析。

实例二：用于淡水浮游植物细胞检测

淡水浮游植物与海水浮游植物的主要区别在于其细胞内的藻红素与藻蓝素比例不同，许多海洋浮游植物细胞含有藻红素，而淡水浮游植物细胞含有藻蓝素居多，因此实例二与实例一的主要区别在于对藻红/藻蓝素自发荧光的激发与收集。

如说明书附图3所示，多色正交照明单元A具体包括两套配合工作的激光器11、13和光束整形模块21、23，激光器11和激光器13的中心波长分别是445nm(蓝光b)和633nm(红光r)，分别对应于淡水浮游植物细胞的叶绿素a和藻蓝素激发峰。以红色激发光路为例，经过光束整形单元23，激光器13发出的高斯光束被整形且照明方向被调整成与进样管3内样品流动方向正交，照射光束与成像物镜的焦面重合，与进样流动方垂直。浮游植物细胞颗粒将会散射照明的蓝光b和红光r，并自发发射中心波长为650nm附近的藻蓝素红色荧光r1和中心波长在685nm 附近的叶绿素a深红色荧光r2。上述波段的光被成像系统的物镜4收集，经过多光谱分像器5 投射至三台相机成像。其中散射的蓝光b被投射至相机61，发出的红色荧光r1被投射至相机62，发出的深红色荧光r2被投射至相机63。通过计算机控制三台相机同步同时采集图像，即可得到浮游植物细胞颗粒的双模态多光谱图像，通过后续的图像处理，即可实现淡水浮游植物细胞颗粒的成像分析。

实例三：用于多种浮游植物细胞检测

如果需要两套系统才能对海水浮游植物和淡水浮游植物进行观测分析显然是比较麻烦的，因而，可将上述实施例一和二中的有关藻红素、藻蓝素自发荧光的激发与收集方法合并，从而实现一套系统即可全面分析海水和淡水浮游植物。

如说明书附图4所示，多色正交照明单元A具体包括三套相互配合使用的激光器11、12、 13和光束整形模块21、22、23，本实施例中使用三个激光器以覆盖更多的激发峰，中心波长分别为445nm(蓝光b)、532nm(绿光g)和633nm(红光r)。以绿光激发光路为例，经过光束整形单元22，激光器12发出的高斯光束被整形且照明方向被调整成与进样管3内样品流动方向正交，照射光束与成像物镜的焦面重合，与进样流动方垂直。浮游植物细胞颗粒将会散射照明的蓝光b、绿光g和红光r，并自发发射中心波长为580nm附近的藻红素橙色荧光o、中心波长为650nm附近的藻蓝素红色荧光r1和中心波长在685nm附近的叶绿素a深红色荧光r2。上述波段的光被成像系统的物镜4收集，经过多光谱分像器投射至四台相机成像。其中散射的蓝光b 被投射至相机61，发出的橙色荧光o被投射至相机62，发出的红色荧光r1被投射至相机63，发出的深红色荧光r2被投射至相机64。通过计算机控制四台相机同步同时采集图像，即可得到浮游植物细胞颗粒的双模态多光谱图像，通过后续的图像处理，即可实现多种浮游植物细胞颗粒的成像分析。

实例四：用于多种生物颗粒检测

上述对于海水和淡水浮游植物的方案所基于的是浮游植物自发荧光激发与发射特性。将这一检测思想推广至其他非浮游植物颗粒，由于其自发荧光激发发射特性与浮游植物的不同，或者由于对其实施荧光标记的标记物的荧光特性不同，可采用如说明书附图5所示的方案，通过配备不同波长的激发光源11-1n和不同波段的光谱成像组合来实现双模态多光谱流式成像分析。

例如，在海洋浮游生物的混合营养微食物环研究中，可能需要同时测量鞭毛虫(微型浮游动物)对海洋细菌的摄食。海洋细菌不含荧光色素，可以用荧光染料DAPI染色,利用紫外光激发的时候可以发出蓝色荧光；海洋蓝细菌含有叶绿素a和藻红素，利用蓝色和绿色激光激发，可以自发红色和橙色荧光；鞭毛虫体内可以供其自养的叶绿素a，也有吞噬进入体内的细菌，因此也可以发出多重成分的荧光，而其细胞上某些透明的部分不发射荧光。利用双模态多光谱成像，首先可以区分不同的浮游生物，还可以通过计数和尺度测量来研究不同浮游生物间的摄食关系，加上流式成像的高通量特点，使得本发明在解决上述问题中展现出独一无二的功能特性，是已有技术或发明无法做到的。

需要说明的是，本发明中双模态的实现，并非是简单的将荧光模态与散射模态进行叠加，而是需要兼顾两种模态各自的工作特点，对现有仪器设备做出特殊的改进与调整才能获得本发明所能达到的最佳观测分析效果。以下进一步对系统各个单元模块之间的配合调整细节做出详细说明

1)多色正交照明单元

多色正交照明单元可采用多种激光器作为光源实现：

◆单波长激光器自由空间输出

利用多个不同波长的单色半导体激光器输出线偏振激光，光束直径一般小于1毫米。根据感兴趣的生物颗粒的粒径大小，可以通过扩束器和平面反射镜对激光器自由输出的高斯光束的形状和路径进行调整。参见说明书附图6a所示，一种实现方案是激光器11发出的激光光束经扩束器211后光斑直径增加，被反射镜90度反射后，先后经过柱透镜和显微物镜的整形，形成一个片状光场照射目标颗粒物。片状光场照明如说明书附图6b左图所示。其中光片的厚度和长度与扩束后的光束直径与显微物镜的数值孔径有关，入射光束越粗，数值孔径越大，则光片越短越薄。光片的宽度与入射光束直径相等。当光片的厚度与成像物镜4的景深匹配时，可以消除大量焦外颗粒物产生的噪声信号，提升流式成像的信噪比。倘若不采用光束整形，而直接用激光束照明颗粒目标，由于激光束的直径一般比显微物镜的焦深要大很多(如说明书附图6b右图所示)，则大量的焦外噪声信号将会产生，导致图像信噪比大幅下降。尽管这一情况可以通过后期的图像复原去卷积算法在一定程度上改善，但本发明仍然优选使用光片照明的方式。此外，为保证成像高质量，应要求生成的光片在厚度小于等于成像物镜的焦深的基础上，长度宽度尽可能覆盖成像系统的视场大小。图示的两组激光器与光学整形元件的组合实现两个片状光场以重叠对射的方式照射到颗粒目标上，这样可以避免由于照射角度和颗粒物内的吸收产生阴影导致成像失真，可以提升成像质量。

进一步，如说明书附图6c所示，本发明首次提出系统中扩束后的光束还可以通过一维90°抛物面镜212和/或222的反射来实现片状照明，如此可以省去使用更多的反射镜、显微物镜等光学元件，这为实现系统的紧凑、便携，方便现场使用提供了更多的帮助。使用一维90°抛物面镜212和/或222时，在一些情况下可能存在光片厚度不够薄的问题。对此，完全可以进一步通过继续使用显微物镜来压缩厚度来改善光片照明光场，只是这样生成的光片朝向与不使用显微物镜生成的光片朝向相对照明光轴有90度的旋转。此使用一维90°抛物面镜的方案能够很好的解决折射透镜的色散问题，在以下的多种激光照明方式中，例如使用超连续激光“白光”的方式中都是实现光片照明的优选方案。

◆单波长激光器光纤输出

单波长的半导体激光器也常常采用保偏单模光纤耦合输出，采用光纤输出的好处是可以更加方便地调整激光输出的方向。采用说明书附图7所示方案，激光器11和12均可采用光纤进行输出，如此的照明单元将更有利于系统的紧凑。此外，对于光纤耦合输出的光束，也可以根据感兴趣的生物颗粒的粒径大小进行缩束整形，例如反向使用扩束器213和223以达到缩束效果。

◆多波长合束激光器自由空间输出

若采用一个将多个波长半导体或固态激光器封装在一起的多波长合束激光器作为光源，则可以采用如说明书附图8所示的方案。此例中，三个线偏振输出的半导体激光器被封装成一个多波长合束激光器1，三个波长的光束共轴输出。经光学整形模块2扩束后，共轴光束被一个非偏振分束器101分为两路。例如第一波长的激发光一路，通过三个平面反射镜102、103 和104的反射，再经过柱透镜和显微物镜实现激发照射。另一路，例如第二波长和第三波长的激发光，经过两个平面反射镜105和106的反射后经过柱透镜和显微物镜实现激发照射，从而实现多色正交对向照明。

◆多波长合束激光器光纤输出

与单波长激光器的情形类似，多波长合束激光器系统也可以通过单模保偏光纤耦合输出，方便光路方向的调整，也有助于提升激光光路的抗机械漂移和振动的能力。采用说明书附图 9的方案，在用光纤准直器214对光纤输出的多波长激光准直后，再反向使用扩束器213，将光束直径压缩，以匹配所需的适合的光束直径。然后通过与说明书附图8中类似的光路设计，即可实现多色正交对向照明。

◆超连续激光光纤输出

超连续激光器利用光子晶体光纤的非线性效应，可以单模输出光谱范围很宽的“白色”激光。利用说明书附图10所示的方案，将超连续激光器1的光纤输出连接一个声光可调滤光器 111，则可以利用声光可调滤光器111以电控的方式选择若干带宽很窄的波段同时输出，例如可以选择445nm、532nm和633nm波长的激光同时输出。由于超连续激光器的光纤输出已经准直，但光束通常较粗，因此后面可以跟一个反向使用的扩束器213压缩光束直径，然后利用与说明书附图8类似的光路，即可实现多色正交对向照明。

◆入射光束与进样管的空间方位关系

为了保证照明光场的均匀，照明光通常要垂直入射到进样管中，因而进样管的截面设计为多边形，而不是圆弧形，从而避免圆弧形对光束折射等所带来对照明光场的影响。例如实际中照明波长的数量不超过4个的情况下，若正交照明光束来自分立波长光源，为了使进样管内被照明平面光场均匀，可以采用如说明书附图11所示不同的照明光束与进样管方位关系：

A.截面方框形进样管结合一侧单波长+对侧单波长对射照明(2波长优选)；

B.截面方框形进样管结合一侧单波长+对侧多波长叠加对射照明(3波长可选)；

C.截面方框形进样管结合双对侧不同波长对射照明(3波长可选，4波长优选)；

D.截面多边框形，如六边形进样管结合多对侧不同波长照明(3波长优选)。

若正交照明光束来自超连续“白光”光源，可采用如说明书附图12所示的截面方框形进样管，结合一侧白光+对侧白光对射进行照明。

2)多通道显微成像单元

经进样管3流经正交照明光路的生物颗粒，其发出的散射光和荧光同时被成像物镜4收集，所成的像被投射至无限远。此处优选长工作距离无限远矫正物镜，如此易于方案在物理空间上的实现。在物镜4后的近似准直光路里插入由多种双色镜、长通/带通滤光片、中密度滤光片、线偏振片和管镜组成的多光谱分像器5，将细胞像经由三个光谱通道(一个散射光通道，两个荧光通道)分别透射至三个数字相机。

以上述实施例一的方案为例，如说明书附图13所示。被物镜4收集的海洋浮游植物细胞颗粒的散射光和色素自发荧光以准平行光束形式进入多光谱分像器5(虚线框内)。带阻滤光片 511首先将445nm的蓝光阻止，其余波长的光通过。在双色镜521处，532nm的绿色散射光被反射，波长更长的橙色和红色荧光透射。在反射一路，绿色的散射激光首先经过一个线偏振片 53，可以光轴为对称旋转调节，实现检偏器功能。这样做的目的是通过不同颗粒物的去偏振属性不同，进一步过滤背景噪声，从而提升散射成像模态的对比度。穿过线偏振片53的绿色激光继续穿过一个中密度滤光片54，进一步衰减能量，然后被管镜561投射至相机61以实现散射模态成像。由于散射光强度通常远强于荧光强度，因此，系统中需要通过更换不同光学密度或采用密度连续可调的中密度滤光片，实现对散射光强的强度调整，从而平衡多模态多光谱图像的强度。在透射一路，首先用带阻滤光片512进一步将残留的532nm激光滤除。之后光束进入双色镜522。被双色镜522反射的是波长较短的橙色荧光，透射的是波长更长的红色荧光。橙色荧光被中心波长在580nm附近的带通滤光片551进一步过滤，然后被管镜562投射至相机62成像。红色荧光被中心波长在685nm附近的带通滤光片552进一步过滤，然后被管镜563 投射至相机63成像。构成多光谱分像器5的所有滤光片的光谱特性如说明书附图14所示，其中横坐标为波长，纵坐标为透过率。

进一步，以上述实施例三的方案为例，如说明书附图15所示，还可以实现彩色散射成像与多通道荧光成像。

被物镜4收集的生物颗粒(如浮游植物)的散射光和色素自发荧光以准平行光束形式进入多光谱分像器5。双带双色镜521首先将445nm、532nm和633nm的激发光反射，波长更长的橙色和红色荧光透射。在反射一路，蓝、绿、红色的散射激光可以先后经过一个线偏振片53和一个中密度滤光片54，实现偏振和光强调节。然后被管镜561投射至一个彩色相机61实现散射模态的彩色成像。透射一路的光束进入双色镜522。被双色镜522反射的是波长较短的橙色荧光，透射的是波长更长的红色荧光。橙色荧光被中心波长在580nm附近的带通滤光片551进一步过滤，然后被管镜562投射至相机62成像。红色荧光被中心波长在685nm附近的带通滤光片552 进一步过滤，然后被管镜563投射至相机63成像。构成多光谱分像器5的所有滤光片的光谱特性如说明书附图15上图所示。在此实例中，用于激发的光源可以是以下情形：

(1)三个波长不同的单色激光器，如445nm、532nm和633nm的单波长激光器；

(2)超连续激光器发出白色激光，经声光可调滤光片选择红、绿、蓝三个波段作为激发光。

根据激发光的产生条件不同，所选用的各种滤光片的通过特性也可以有所不同。

进一步，三个管镜具有一样的焦距，其与物镜的焦距之比决定了显微系统的放大倍率。三个相机应具有一样的成像芯片，或者说，具有一样的像素数、像素大小和长宽比。但是由于散射信号的光强通常远强于荧光信号，因此相机61的灵敏度要求远低于相机62和63。实际工作时可以对相机61设置较低的增益，而相机62和63设置较高的增益来平衡多光谱图像的亮度。成像系统工作时，还可以通过对各波长激光的强度和开关调整，例如设置能够根据所述散射通道和所述荧光通道的图像光强信息反馈调节所述激发光源信号的反馈单元，从而帮助更加灵活的调整各波段激发光的强度。进一步，还可以结合不同的滤光片截止波长、通带宽度和中密度滤光片衰减强度的组合，以保障三个成像通道的特征色素选择和相对亮度的平衡，优化三个通道的成像质量。采集图像时，三台相机被设置成同步工作，可以同时通过三个光谱通道对细胞进行拍摄，实现多光谱成像。采集到的原始图像被送入图像处理分析单元进行处理分析和存储传输。

对采用上述实施例一的方案观测一个海洋甲藻细胞进行计算机模拟，模拟结果参见说明书附图16，其中，图(a)为散射模态成像，即利用实施例一中的532nm波长激光在散射成像通道中获得；图(b)为叶绿素荧光模态成像，即利用实施例一中的445nm和532nm波长激光的激发，在荧光成像通道中对680nm附近的自发荧光探测获得，其像素位置表明叶绿素或叶绿体的分布，像素值表明叶绿素浓度；图(c)为藻红素荧光模态成像，即利用实施例一中的532nm波长激光的激发，在另一荧光成像通道中对580nm附近的自发荧光探测获得，其像素位置表明藻红蛋白分布，像素值表明藻红蛋白浓度；图(d)为上述三个通道的融合图像。由融合图像可见，使用本发明的系统能够同时展示出更多非自发荧光部位的细节。

进一步，为了增加系统的通用性，针对每一个成像通道，实现其有限光谱通带成像的滤光片等光学元件组合可以模块化，使用时直接插入到成像物镜4后方的无限远光路中即可实现对该通带成像。如说明书附图17所示，每一个模块可以包括如下光学元件：一个带阻滤光片(例如511或者512)以将不用的波段光阻止；一个双色镜(例如521或者522)以将该模块的成像波段的光信号反射，波长更长的光信号透射；一个线偏振片53可以设置在反射光路上，能够以光轴为对称旋转调节，实现检偏器功能从而提升散射成像模态的对比度；一个带通滤光片(例如551)设置在反射光路上，从而将光信号过滤仅保留感兴趣的波段；管镜(例如561或者562)，以将光信号投射至相机(例如61或者62)上；在散射成像通道模块中，还需要设置中密度滤光片54，以调整其与其它荧光通道亮度的平衡。如此可以将实施例一的方案推而广之，可以实现更多光谱通带组合的多光谱成像。但是，不同光谱通带成像模块的插入位置并不随意，而是应当满足一定的顺序。所需使用的滤光片组合的光谱特性应满足如下条件：通带波长更长的成像通道模块在通带波长较短的成像通道模块后方。与之对应的光谱成像模块插入规则为：各成像通道模块按照模块通带红移方向依次排列。相应的滤光片光谱特性如说明书附图18所示，其中，以点划线所示的中密度滤光片54用于将散射光信号衰减至x％。

3)工作方式方法

A.实现对大范围粒径尺寸生物颗粒的成像

本发明引入的散射成像模态也利用了激光光片照明，使得所描述的技术十分有助于在对粒径较小的生物颗粒检测中提升检测灵敏度。例如，若采用NA＝0.8的40倍物镜，其横向分辨率优于1微米。小于1微米的颗粒散射光强远强于荧光发射信号，因此，并不需要功率很高的激光器即可准确检测的到这些小尺度的颗粒。辅以荧光信号的测量比对，可以对尺度较小一极的生物颗粒实现准确测量。而对于尺度较大的另一极，由于光片照明对于离焦模糊的抑制优势，可以在同一个物镜倍率下清晰成像。基于这样的优势，使得本技术可以大大拓宽检测的粒径范围。

由于多数微生物颗粒的粒径大于照明波长，此时的散射主要是米氏散射，散射强度与颗粒物粒径基本呈二次方关系。这使得较大粒径范围内目标的散射强度所跨越的动态范围被放大。除了优选动态范围更大的数字相机外，在分像器光路中通过偏振片和中密度滤光片的合理使用，从而调节生物颗粒散射信号的强度也是本发明所述技术得以最优实施的关键点。

B.组成仪器的器件空间布局

以上各技术方案仅展示了各光电元件之间在功能上的相互关系，以下将通过用于海洋浮游植物成像分析用的多波长激发多通道成像流式细胞仪实例展示实现上述功能关系的实际空间结构及布局。

布局1：平面紧凑型双波长对射三通道成像流式细胞仪

如说明书附图19所示，在本方案中全部光机电器件布局于同一平面(x-z)内。自左至右分别为多色正交照明单元和多通道光谱成像单元。其中的多色正交照明单元采用了两个单波长自由空间输出激光器11和12，发出的光束分别经过90度一维抛物面反射镜212、222和显微物镜的整形与方向调整，以重叠对射的方式照明进样管3内与成像物镜4焦面重叠的区域。成像物镜被固定在可以在z方向平移调节的调节机制41上(优选步进电机或压电陶瓷平移台)，以方便调节焦面与照明光轴的重合。成像物镜4收集的中心波长最长的光谱通带穿过两个双色镜后由通道CH2投射至相机62成像；其余两个波长较短的通带分别被两个双色镜和90度反射镜的组合折叠了光路，由通道CH1和CH3投射至相机61和63分别成像。所有的滤光片和管镜都按照光轴与光路光轴同轴的方位锁定在光机结构中；而反射镜与双色镜的安装还分别考虑了4个(xz平移+xy旋转)和2个自由度(xy旋转)的微调节能力，以及调节好之后的锁定机制；成像单元的光路全部被遮光机械结构或套管包裹，其内壁被涂黑，以避免外部杂散光或内壁反射光造成成像背景噪声干扰。采用两个90度一维抛物面镜212、222 和两个90度反射镜折叠的照明与成像光路使得仪器在x方向上可以更为紧凑，整个装置在y 方向趋于扁平化(lowprofile)，有助于长方体外形的桌面版仪器小型化。

布局2：立体紧凑型双波长对射三通道成像流式细胞仪

本实施方案与布局1方案的明显不同在于多色正交照明方案的实施，两只激光器及照明光路不再与成像单元处于同一平面，而是与其正交，如说明书附图20所示。两激光器的位置在成像光路y方向的上下方，激光束的出射方向仍旧沿着z轴，但与布局1中相反。通过侧视图(x-y)可见，成像通道和激光照明光路可以更紧凑的排布在一个圆形中，成像单元y方向的空间被充分利用。这样安排使得上述器件可以更有效地利用一个圆柱型外壳内的空间，并缩短z方向上的尺寸，非常有助于据此布局的仪器在水下使用。

值得指出的是，本发明前述的各种正交照明方案(包含波长分立与合束的激光自由空间与光纤输出、超连续白激光的光纤输出等)都可以很容易的以本实施例中各器件的相对空间方位关系实现。

布局3：立体紧凑型全粒径海洋浮游植物成像流式细胞仪

如说明书附图21所示，将三个布局1的方案在y方向叠加布局，并分别采用放大倍率为10x、20x和40x的成像物镜，可以分别针对不同粒径范围的浮游植物实现多光谱流式成像。辅以样品的预先富集、按粒径分组(例如0.5-2um，2-20um，20-300um三组)，并优化与不同粒径范围对应的进样管尺寸，可以大幅提升全粒径浮游植物的成像质量，为后续的图像分析打下坚实基础。

由侧视图(x-y)可见，这样的空间布局使得仪器整体趋于长方体，在x，y方向上都更紧凑，有助于长方体外形的桌面版仪器小型化。考虑仪器实现的稳固性，目前侧视图(x-y)所示的方位或其沿着z轴旋转90度的方位都有可能成为实际实施时的选择。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。根据本发明设计，还可以在细节方面改进和润饰，用以提高成像系统的各种性能，这些改进和润饰也应视为本发明型的保护范围。

上面所述的只是用图解说明本发明的一些实施方式，由于对相同技术领域的普通技术人员来说很容易在此基础上进行若干修改和改动，因此本说明书并非是要将本发明局限在所示和所述的具体结构和适用范围内，故凡是所有可能被利用的相应修改及等同物，均属于本发明所申请的专利范围。

Claims (9)

1.一种散射荧光双模态流式成像系统，包括，

多色正交照明单元(A)，其包括相互配合的激发光源(1)和光束整形模块(2)；所述激发光源(1)能够发射两个或多个波长的激发光；

多通道显微成像单元(B)，其包括物镜(4)、多光谱分像器(5)和多个相机；所述物镜(4)收集生物颗粒发出的散射光和荧光；所述多光谱分像器(5)按照特定的光谱通带将所述散射光和荧光分由散射通道以及荧光通道投射至不同的相机进行成像；

进样管(3)与所述物镜(4)共轴，所述激发光源(1)发出的光束，经所述光束整形模块(2)整形后，在与所述物镜(4)焦面重合的位置处，垂直照射所述进样管(3)；

所述进样管(3)的截面为多边形，所述多边形具有2n条边，其中n为大于等于2的自然数；

所述光束整形模块(2)包括一维90°抛物面镜，使用所述一维90°抛物面镜形成光片照明光场；

所述多光谱分像器(5)包括一个以上对应散射通道的散射通道成像模块以及一个以上对应荧光通道的荧光通道成像模块，其中多个散射通道成像模块之间以及多个荧光通道成像模块之间能够相互替换；

所述散射通道成像模块包括一个双色镜、一个偏振片、一个中密度滤波片、一台相机；

所述荧光通道成像模块包括一个双色镜、一个带通滤波片、一台相机；

所述散射成像通道和/或所述荧光成像通道的双色镜之前还设有带阻滤光片；

按照距离所述物镜(4)后方由近及远的方向，通带波长更长的成像通道模块在通带波长较短的成像通道模块后方，即各成像通道模块按照该模块通带红移的方向依次排列。

2.根据权利要求1所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，

所述两个或多个波长的激发光分别由不同的单波长激光器发出；

或者，所述两个或多个波长的激发光由多波长合束激光器发出；

或者，所述两个或多个波长的激发光由超连续激光器配合窄带可调谐滤光器发出。

3.根据权利要求2所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，所述两个或多个波长的激发光由激光器在自由空间输出，或者由激光器通过光纤输出。

4.根据权利要求1所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，

当所述激发光源(1)能够发射两个波长的激发光时，所述进样管(3)的截面为四边形；

当所述激发光源(1)能够发射三个波长的激发光时，所述进样管(3)的截面为六边形；

当所述激发光源(1)能够发射四个波长的激发光时，所述进样管(3)的截面为四边形。

5.根据权利要求1-3任一项所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，

进一步包括反馈单元，所述反馈单元能够根据所述散射通道和所述荧光通道的图像光强信息反馈调节所述激发光源(1)的信号。

6.根据权利要求1-3任一项所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，

所述散射通道对应相机的增益低于所述荧光通道对应相机的增益。

7.根据权利要求1-3任一项所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，

所述多色正交照明单元(A)的器件和所述多通道光谱成像单元(B)的器件都布局在同一平面内；

或者，所述多色正交照明单元(A)的器件设置在所述多通道光谱成像单元(B)的一侧或者两侧。

8.根据权利要求1-3任一项所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，

具有多个所述多色正交照明单元(A)和多个与之配合的所述多通道光谱成像单元(B)；

每一组配合使用的多色正交照明单元(A)和所述多通道光谱成像单元(B)，其所有器件都布局在同一平面内；

不同的所述多通道光谱成像单元具有不同放大倍率的物镜(4)。

9.根据权利要求7所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，

所述物镜(4)被固定在能够进行平移调节的调节机制(41)上，从而能够调节所述物镜(4)的焦面位置；

所述多光谱分像器(5)中的器件也配有调节机制。

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