CN104830664A - 一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：微流体分选芯片内封装有用作分选驱动的金属弹片，压电陶瓷设置在微流体分选芯片的金属弹片外侧；压电陶瓷驱动模块将触发信号转换成驱动压电陶瓷的高电压信号，使得压电陶瓷产生机械位移并通过挤压或释放金属弹片将目标细胞分离到不同的分选出口，实现细胞分选。本发明的微流体分选芯片的驱动由进样模块的恒压阀控制，光学检测模块对单细胞进行照明检测，实时信号控制模块分析细胞的类型，外置压电陶瓷驱动高速细胞分选，整个系统可以采用很低的压力对细胞进行进样和分离，保证对细胞的无损伤特性，对实现微型全分析系统，促进再生医疗、肿瘤预后检测的应用具有十分重要意义，可以广泛适用于个性化流式细胞分选。

Description

一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统

技术领域

本发明涉及生物研究与临床应用技术领域，特别是涉及一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统。

背景技术

流式细胞仪(FlowCytometer，简称FCM)是一种集光学、机械、电子、流体于一体的用于生物细胞荧光标记分析的高新仪器。它主要用来测量并统计分析大量经过染色细胞的各类标记物荧光强度信息，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的，对细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量，并按照其特性的不同分类收集的精密仪器。FCM以其快速、灵活、灵敏、可定量、大样本的特点，广泛运用于各生物化学的基础研究和临床实践中。现有的商业化流式细胞分选仪可以分为四个部分：流动室和流体进样系统、光学检测系统、信号检测与存储、分析系统以及静电细胞分选系统。流动室和流体进样系统通过鞘液(通常是等渗水溶液)将细胞样品包裹束缚成几十um的直径，保证单个细胞依次通过空间上固定的检测位置；在该位置单个或多束微小的单色激光照射到细胞上，并产生散射和荧光信号，该信号被检测、转换与分析出来；再以直方图、散点图等形式显示给用户，用户可以通过设门等方式设置对细胞进行分离的判断逻辑。

现有流式细胞仪存在体积庞大、结构复杂，无菌实验前需反复清洗管道、人工费时的问题；且其分选过程在空气中完成，体系开放，会产生包含细胞、细菌、病毒等样品的气溶胶污染，限制了在临床治疗中的使用。目前BD、Beckman Coulter等公司的细胞分选系统均采用了Jet-in-Air的静电偏转分离方式，虽然可以高速分离细胞，但是由于其较高的流体剪切力会对细胞产生损害，影响其活性和基因表达。如在再生细胞治疗、干细胞研究中，利用传统静电细胞分选仪分选的细胞存在存活率低的问题。同时在细胞再生、转基因样品或者病毒/细菌感染过的样品研究中，确保环境的密闭和无菌性是非常关键的问题，基于微流控的芯片细胞分选系统有着广泛的前景。当前也出现了一些在芯片上完成细胞分选的方案，如MiltenyiBiotec的Tyto分选微芯片采用了微型电磁机械阀的结构，将微小的翼状磁性结构放置在电磁场中，通过控制外部线圈通断来选择阀的开启与关闭，从而实现细胞的快速分离，但是由于其涉及到不同材料微小结构的加工与装配，导致结构复杂成本昂贵。

开发低成本、密封无菌的细胞分选回收系统仍然是研究热点，具有样品用量少、集成度高、体积小的微流体技术在该领域崭露头角。微流体分选芯片通常是由含有微小管道的塑料或聚合物材料键合、粘接而成，但是现有的微流体细胞分选方案，例如电渗流、电泳、气动控制、机械阀、光镊、光致热凝胶等分选方案存在分选速度慢或结构复杂、昂贵的问题；一些高通量的细胞分选方法如介电电泳、超声、表面声波分离方法等依赖于细胞自身特性，其普适性差。另外，多数微流体芯片使用水相鞘液来聚焦细胞位置，导致分选后的样品被大量稀释，不便于少量样品的检测。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种可以进行无菌化检测，同时对细胞无损伤无稀释的基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选回收系统。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：包括一微流体分选芯片、一进样模块、一光学检测模块、一实时信号控制模块、一压电陶瓷驱动模块和一个以上的压电陶瓷；所述微流体分选芯片内封装有用作分选驱动的金属弹片，所述压电陶瓷设置在所述金属弹片外侧；所述进样模块的进口连接一气瓶，所述进样模块的出口连接所述微流体分选芯片的进口，所述进样模块通过控制气体压力将细胞样本和油相鞘液压入到所述微流体分选芯片的微管道内，使所述油相鞘液流将细胞样本流束缚在所述微流体分选芯片的检测管道中央，并保证单个细胞依次通过所述微流体分选芯片的检测区域；所述光学检测模块用于照明每个流经所述微流体分选芯片的检测管道的细胞，激发细胞产生荧光和散射光，完成荧光和散射光的收集，并将检测得到的荧光和散射光信号发送到所述实时信号控制模块；所述实时信号控制模块将散射光和荧光信号转化为电信号进行调理和量化处理，并将处理结果与用户设置值进行逻辑判断，如果满足用户设定分选要求则发送触发信号到所述压电陶瓷驱动模块；所述压电陶瓷驱动模块将触发信号转换成驱动所述压电陶瓷的高电压信号，使得所述压电陶瓷产生机械位移并通过挤压或释放所述金属弹片将目标细胞分离到不同的分选出口，实现细胞分选。

所述金属弹片将目标细胞分离到不同的分选出口的方式包括推动驱动方式、吸液驱动方式和依次接力驱动方式，三种驱动方式具体实现过程为：A)推动驱动方式：所述实时信号控制模块在目标细胞流过所述微流体分选芯片的驱动口位置的瞬间，对所述压电陶瓷施加作用力给予位于此驱动口处的压电陶瓷以脉冲驱动的正向电压，使得所述压电陶瓷产生向下位移，挤压所述金属弹片，压缩所述微流体分选芯片驱动口所在腔室体积，使得多余的液体被挤压出去，在驱动口产生向外推动的流体，从而将目标细胞推到分选出口中去；B)吸液驱动方式：使用前，所述压电陶瓷顶迫所述金属弹片向内发生一定弯曲，使用时，当检测到目标细胞经过所述微流体分选芯片的检测管道时，在其流过所述微流体分选芯片的驱动口位置的瞬间，给予所述压电陶瓷以脉冲驱动的负向电压，使得所述压电陶瓷产生向上位移，释放已弯曲的所述金属弹片，在驱动口产生向内吸纳的流体，从而将目标细胞拉拽到分选出口中去；C)依次接力的驱动方式，当所述微流体分选芯片设置有两个以上的驱动口时，还可以采用推动式和吸液式、推动式和推动式、吸液式和吸液式依次接力的驱动方式。

所述油相鞘液采用憎水性物质，所述憎水性物质为矿物油、硅油或植物油。

所述微流体分选芯片包括一基片、一盖片和一个以上的所述金属弹片，所述基片顶部设置有若干管道凹槽和凹台；所述盖片底部采用化学修饰、热压键合或激光键合方式与所述基片顶部进行密封固定，不仅使所述基片上的各凹槽成为密封空间形成所述微流体分选芯片的微管道，而且使各所述凹台形成若干个大腔室作为所述微流体分选芯片的驱动口；所述盖片顶部还设置一个以上的用于密封固定所述金属弹片的凹台，各所述金属弹片的内侧通过紫外感光胶或环氧树脂胶间隔粘接在所述盖片顶部的凹台内，且各所述金属弹片分别位于所述微流体分选芯片的相应驱动口位置，各所述金属弹片的外侧放置所述压电陶瓷；所述微管道包括一样品管道、两鞘液管道、一检测管道、一未分选出口管道、一个以上分选出口管道和一个以上排气管道；所述盖片顶部还设置有若干进样孔，所述进样孔分别与所述样品管道入口和鞘液管道入口连通形成所述微流体分选芯片的储液池；所述盖片顶部还设置一个以上用于排出微管道内的空气的排气孔，每一所述排气孔通过所述排气管道连通每一所述驱动口；所述盖片顶部还设置有一个以上的分选孔和一未分选孔，所述分选孔和未分选孔相应连通所述分选出口管道和未分选出口管道。

所述驱动口采用管道向外逐渐释放的“喇叭型”结构，喇叭型驱动口的出口宽度为20～30um。

所述微流体细胞分选系统还包括一芯片加持架，所述芯片加持架包括一矩形支撑板，所述矩形支撑板中心设置一用于嵌设固定所述微流体分选芯片的环形凹台，所述环形凹台顶部间隔设置一进样密封件和一出口密封板件，所述进样密封件上设置有与所述盖片上的进样孔连通的进样螺纹孔，所述进样螺纹孔底部设置有用于与所述微流体分选芯片密封连接的密封胶圈，所述出口密封件上设置有与所述盖片的分选孔和未分选孔相连通的出口螺纹孔，所述进样密封件和出口密封件顶部设置一支板，所述支板顶部设置一供所述压电陶瓷滑动的滑槽，所述压电陶瓷通过支板固定至所述微流体分选芯片驱动口上方，所述支板顶部设置有与所述进样密封件进行固定的螺纹孔，所述进样密封件和出口密封件两侧均设置有用于进行安装固定的通槽。

所述进样模块包括两个恒压阀、一个恒压阀控制系统和两个缓冲瓶；两个所述缓冲瓶的上部分别通过两个所述恒压阀连接所述气瓶出口，两个所述缓冲瓶的底部分别通过进样管道连接所述微流体分选芯片的储液池；所述恒压阀控制系统分别控制两个所述恒压阀提供两路稳定的气压，对两个所述缓冲瓶施加不同的气压，使得样品液和鞘液以不同的速度逐渐进入所述微流体分选芯片的微管道。

所述光学检测模块包括单色激光器、光纤、物镜透镜组、双透镜系统、二向色镜组、滤色片组和光电倍增管组，其中，所述双透镜系统包括平行共轴的两个透镜和一小孔光阑，所述小孔光阑位于透镜的焦面上；所述单色激光器发出的激光经过两个45°的所述二向色镜被反射到所述物镜透镜组，经所述物镜透镜组聚焦到所述微流体分选芯片的检测管道中央，当染色细胞经过激光聚焦点区域时，会同时产生散射光和激发荧光，散射光和激发光波长相同，经所述光纤侧向收集后发送到所述光电倍增管；荧光信号经所述物镜透镜组收集后透过所述二向色镜透射到所述双透镜系统，位于焦面的所述小孔光阑构成空间滤波器，滤除照明焦点以外的杂散信号，并由所述二向色镜组分光反射处理后依次通过所述滤色片发射到所述光电倍增管转换成电学信号。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、由于本发明将压电陶瓷设置在微流体分选芯片的金属弹片外侧，压电陶瓷产生机械位移并通过挤压或释放金属弹片将检测管道中的目标细胞高速分离不同的分选管道，快速实现细胞分选；由于封装用金属弹片的压电陶瓷为密闭系统，压电陶瓷不与微流体分选芯片直接接触，对细胞无损伤，可以有效保持细胞的无菌环境以及活性，该驱动力不依赖于细胞自身的特性，适用于绝大多数细胞分选；本发明还具有高效、成本低廉、易于操作、密封一次性等优点。2、本发明利用油相鞘液取代水相鞘液，由于鞘液采用不与水相溶的憎水性物质，在形成稳定鞘液的同时，在出口处水相细胞样品液会自动和油相鞘液分离，使得样品液可回收且避免了传统水相鞘液的稀释，在出口可以通过离心的方式将油相鞘液和细胞样品液完全分离，而油相鞘液经高压灭菌后可再次使用，因此在保证仪器性能的同时避免了鞘液对样品的稀释，具有样品和试剂消耗少且可回收的优点。3、本发明的微流体分选芯片由多层含有微小管道的塑料、金属或聚合物材料键合、粘接而成，整体结构无菌密封，对存在生物危害的样品也能适用，微流体分选芯片即插即用，无需清洗，避免了各个样品间的交叉污染，一次性使用后可丢弃分选芯片，不需关机清洗流程，维护成本低。4、本发明的驱动口采用管道逐渐收缩的“喇叭型”结构，流体的运动途径被收缩，流动横截面积缩小，加快出口处流体的速度，增大了驱动力，减少了响应时间。5、本发明的每个分选驱动口的金属弹片可采用推动、吸液驱动方式中的一种，多个驱动口可采用不同的依次接力的驱动方式，采用两次或多次接力的方式，可以有效缩短单次驱动作用时间，提高分选速度和分选成功率；而且减小了单次驱动的作用力，降低驱动电压，提高了细胞活性。综上所述，本发明的微流体分选芯片的驱动由进样模块的恒压阀控制，光学检测模块对单细胞进行照明检测，实时信号控制模块分析细胞的类型，外置压电陶瓷驱动高速细胞分选，整个系统可以采用很低的压力对细胞进行进样和分离，保证对细胞的无损伤特性，对实现微型全分析系统，促进再生医疗、肿瘤预后检测的应用具有十分重要意义，可以广泛适用于个性化流式细胞分选。

附图说明

图1是本发明的系统结构示意图；

图2是本发明的微流体芯片结构示意图，其中，图(a)是芯片三层结构以及外置压电陶瓷安装位置的说明图，图(b)是芯片检测与分选核心区域的实物图；

图3是本发明的微流体芯片的盖片和基片的实例图，其中，图(a)为盖片结构示意图，图(b)是基片结构示意图；

图4是本发明的油相鞘液包裹水相样品液显微图，箭头表示流动方向，其中，图(a)是高样品流速时的管道流速分布，其样品流较宽，图(b)是低样品压力时的管道流速分布，其样品流较窄；

图5是本发明的模拟信号处理流程示意图；

图6是本发明的判断逻辑及驱动生成流程图；

图7是本发明的外置压电陶瓷驱动原理图，其中，图(a)和(b)分别是推动式分选的未分选和分选两种状态示意图；图(c)和(d)分别是吸液式分选的未分选和分选两种状态示意图；

图8是本发明的微流体芯片分离细胞的效果图，其中，图(a)样品液保持在管道中间流动的状态，其层流中的细胞被检测到；图(b)中外置压电陶瓷开始将细胞推向上面的分选出口管道，样品层流开始向上运动；图(c)～(e)是细胞被推进分选出口管道的动态过程；图(f)细胞已经被分离进分选出口管道；

图9是本发明微流体多路分选的管道简示图，其中，图(a)是单驱动器单个分选出口，图(b)是双驱动器两个分选出口，图(c)是四驱动器四个驱动出口；

图10是本发明的样品回收出口油相鞘液和水相细胞溶液自动分离的效果图，其中，图(a)是肉眼可见的宏观分离效果图；图(b)是原始样品中细胞的显微图；图(c)是出口油相鞘液中的细胞显微图；图(d)是出口自动分离后的样品溶液的细胞显微图；

图11是本发明的芯片加持架的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。

如图1所示，本发明的基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统包括一微流体分选芯片1、一进样模块2、一光学检测模块、一实时信号控制模块3、一压电陶瓷驱动模块4和一个以上的压电陶瓷5；微流体分选芯片1内封装有用作分选驱动的金属弹片，压电陶瓷5设置在微流体分选芯片1的金属弹片外侧；进样模块2的进口连接一气瓶6，进样模块2的出口连接微流体分选芯片1的进口，进样模块2通过控制气体压力将样本和油相鞘液压入到微流体分选芯片1的微管道内，使油相鞘液流将样本流束缚在微流体分选芯片1的检测管道中央，并保证单个细胞依次通过检测管道；光学检测模块用于照明每个流经检测管道的细胞，激发细胞产生荧光和散射光，完成荧光和散射光的收集，并将检测得到的荧光和散射光信号发送到实时信号控制模块3；实时信号控制模块3将散射光和荧光信号转化为电信号进行调理和量化处理，并将处理结果与用户设置值进行逻辑判断，如果满足用户设定分选要求则发送触发信号到压电陶瓷驱动模块4；压电陶瓷驱动模块4将触发信号转换成驱动压电陶瓷5的高电压信号，使得压电陶瓷5产生机械位移并通过挤压或释放金属弹片将目标细胞分离到不同的分选出口，实现细胞分选。

在一个优选的实施例中，微流体分选芯片1是细胞分选系统的核心，也是单个细胞的依次流动、检测和分离的载体，它由多层含有微小管道的塑料、金属或聚合物材料键合、粘接而成。

如图2(a)所示，微流体分选芯1包括一基片11、一盖片12和一个以上的金属弹片13，本发明实施例中金属弹片13的个数为两个，但是不限于此，基片11和盖片12材质可以采用硅、陶瓷、玻璃、塑料、硅树脂和树脂中的至少一种；金属弹片13材质可以采用铜、铁、不锈钢和铝合金中的至少一种。基片11顶部设置有若干管道凹槽和凹台。盖片12底部采用化学修饰、热压键合或激光键合方式与基片11顶部进行密封固定，不仅使基片11上的各凹槽成为密封空间形成微流体分选芯片的微管道14，微管道14的高度为20～100um，本发明实施例中微管道14的高度为50um；而且使各凹台形成若干个大腔室作为微流体分选芯片1的驱动口15，本发明实施例中的驱动口15采用管道向外逐渐释放的“喇叭型”结构，喇叭型驱动口的出口宽度为20～30um；盖片12顶部还设置一个以上的用于密封固定金属弹片13的凹台122，各金属弹片13的内侧通过紫外感光胶或环氧树脂胶间隔粘接在凹台122内，且各金属弹片13分别位于微流体分选芯片1的相应驱动口15位置，各金属弹片13的外侧放置压电陶瓷5。

如图2(b)、图3所示，微管道14包括一样品管道a、两鞘液管道b、一检测管道c、一未分选出口管道d、一个以上分选出口管道e和一个以上排气管道f；样品管道a的两侧对称设置两鞘液管道b，两鞘液管道b的入口端连通成一体，样品管道c和两鞘液管道b的出口端连接检测管道c入口，检测管道c的出口端分别并联连接一个未分选出口管道d和一个以上分选出口管道e，检测管道c的两侧分别连接各驱动口15，各驱动口15还分别连接排气管道f；其中，未分选出口管道d略宽于分选出口管道e，绝大多数样品液由于层流从检测管道c流入未分选出口管道d。

如图3(a)和(b)所示，盖片12顶部还设置有若干进样孔121，进样孔121分别与样品管道入口和鞘液管道入口连通形成微流体分选芯片的储液池；使用时，油相鞘液经进样孔121分别通过两鞘液管道b进入检测管道c，样品液经进样孔121通过样品管道a进入检测管道c，油相鞘液将样品液包裹在检测管道c中央，使得样品液中细胞依次以相同的流速经过检测管道c；盖片12顶部还设置一个以上用于排出微管道内的空气的排气孔123，每一排气孔123通过排气管道f连通每一驱动口15；盖片12顶部还设置有一个以上的分选孔124和一未分选孔124，分选孔124和未分选孔124相应连通分选出口管道e和未分选出口管道d。初次使用时，在样品注入前，先通入鞘液将微管道内的初始气体排净，避免空气压缩对分选的影响；鞘液填充完微管道所有位置排净空气后，将所有排气孔进行密封后，再通入样品液。

在一个优选的实施例中，进样模块2包括两个恒压阀(图中未示出)、一恒压阀控制系统21和两个缓冲瓶22，两个缓冲瓶22的上部分别通过两个恒压阀连接气瓶6出口，两个缓冲瓶22的底部分别通过进样管道螺纹旋拧连接微流体分选芯片1的储液池；恒压阀控制系统21分别控制两个恒压阀提供两路稳定的气压，对两个缓冲瓶22施加不同的气压，使得样品液和油相鞘液以不同的速度逐渐进入微流体分选芯片1的微管道13。当待分离的样品量较少时例如10～500uL，可以预先将样品液和鞘液放置在微流体分选芯片1的储液池中，两个缓冲瓶22中分别放置空气，恒压阀控制系统21控制气体压力将储液池中的样品和鞘液压入到微流体分选芯片1的微管道13中；如果待分离的样品量较多，可以将样品液或鞘液预先分别放置到缓冲瓶22，恒压阀控制系统21首先将气体压到各缓冲瓶22上方，然后将液体从缓冲瓶下方的进样管道压入到微流体分选芯片1的储液池，再进入微流体分选芯片1的微管道13内，通过此种方式可以完成0.5～10mL样品液的进样。实际使用时，可以通过设置不同的样品液和油相鞘液的驱动压力，进而调节不同的细胞样品流速以及管道中流动分布。如图4(a)和(b)所示，将样品液/鞘液的气体压力从5：6调节为1：3时，样品流宽度逐渐变窄的变化，样品流越窄说明细胞流经的位置变化越小，越容易单个通过检测管道，图4(b)所示的样品最细处宽度为10um，通过调节压力，样品中的细胞能以0.1～2m/s的速度流动，并在油性鞘液包裹下形成单细胞流，样品液被油相鞘液呈鞘状包裹住，以保证细胞是一个接一个的经过检测通道。

在一个优选的实施例中，如图1所示，光学检测模块基于共焦显微原理实现，它包括单色激光器70、光纤71、物镜透镜组72、双透镜系统73、二向色镜组74、滤色片组75和光电倍增管组76，双透镜系统73包括平行共轴的两个透镜731和一小孔光阑732，其中，小孔光阑732位于透镜731的焦面上；单色激光器70(例如波长为488nm激光器)发出的激光经过两个45°的长波通二向色镜(截止频率略高于单色激光器波长)，例如490LP二向色镜只允许高于490nm的波长通过，而单色激光器70发出的低于490nm波长的光被反射到物镜透镜组72，经物镜透镜组72聚焦到微流体分选芯片1的检测管道c中央，当染色细胞经过激光聚焦点区域时，会同时产生散射光和激发荧光，散射光和激发光波长相同，经光纤71侧向收集后发送到光电倍增管76；荧光信号波长大于单色激发器波长，例如均为490nm以上波长的光，经物镜透镜组72收集后透过二向色镜74发射到双透镜系统73，位于焦面的小孔光阑732构成空间滤波器，滤除照明焦点以外的杂散信号，并由二向色镜组分光反射处理后依次通过滤色片75发射到不同光电倍增管76中转换成电学信号。

在一个优选的实施例中，如图5、图6所示，实时信号控制模块3首先将接收的电学信号通过采用一级偏置、放大和二级偏置调理到合适的范围，并通过A/D转换为数字信号，并将数字信号与用户预设置的分选阈值进行逻辑分析处理，判断是否满足用户设置的分选标准，如果满足分选标准，实时信号控制模块3在目标细胞流过驱动口位置的瞬间，发出触发信号到压电陶瓷驱动模块4对压电陶瓷5施加作用力，压电陶瓷3挤压或释放金属弹片13，当金属弹片13发生变形后作用微流体分选芯片驱动口所在腔室体积，使目标细胞落入到分选出口，完成细胞分选。例如用户想筛选绿色荧光蛋白表达量高的细胞，并设定分选阈值为2.7V，那么实时信号控制模块3持续判断细胞流经时绿色荧光通道的检测电压是否达到2.7V，如果是则说明该细胞是过量表达绿色荧光蛋白的细胞，是用户指定待分选的类型。

如图6所示，由于压电驱动作用区位于检测管道c下方，该触发信号需延迟等待一定的细胞流动时间(如距离50um，细胞流速为0.5m/s，则延迟100us)后，当细胞由检测管道上游运动到下游驱动口位置的瞬间，压电陶瓷驱动模块4产生一定脉宽和一定电压的驱动信号，该信号控制压电陶瓷5立即产生形变，并压缩或释放微管道中的流体进而推动或拉拽目标细胞，从而实现根据检测的光学信号的差异，将细胞分离开的目的。其中，驱动电压的幅值和压电陶瓷的形变成正相关，电压越高，推力越大。

如图7所示，任意金属弹片13驱动目标细胞的分选方式包括推动驱动方式、吸液驱动方式和依次接力的驱动方式，下面对三种方式进行详细说明：

A)推动驱动方式：如图7(a)和(b)所示，实时信号控制模块3在目标细胞流过驱动口位置的瞬间，对压电陶瓷5施加作用力给予位于此驱动口处的压电陶瓷5以脉冲驱动的正向电压(+50V)，使得压电陶瓷5产生向下位移，挤压微流体分选芯片1的金属弹片13，压缩微流体芯片上驱动口所在腔室体积，使得多余的液体被挤压出去，在驱动口产生向外推动的流体，从而将目标细胞推到分选出口中去；

B)吸液驱动方式：如图7(c)和(d)所示，使用前，压电陶瓷5顶迫压金属片向13内发生一定弯曲。使用时，当检测到目标细胞经过检测管道c时，在其流过分离驱动口位置的瞬间，给予压电陶瓷5以脉冲驱动的负向电压(-50V)，并施加到外置压电陶瓷产生向上位移，释放已弯曲的金属弹片，在驱动口产生向内吸纳的流体，从而将目标细胞拉拽到分选出口中去。

C)依次接力的驱动方式：为增大细胞运动的整体位移，提高细胞分选速度，当微流体分选芯片设置有两个及以上的驱动口时，还可以采用推动式和吸液式、推动式和推动式、吸液式和吸液式依次接力的驱动方式；如图2(b)所示的驱动口个数为两个时，待分离的细胞经过吸液驱动口时，先被拉拽向分选出口管道运动一定距离，待再经过推动驱动口时，再被推动向分选出口，两次施加脉冲电压的时间间隔，为两驱动口距离除以细胞流动的速度，其他接力的方式与此类似。通过两次接力的方式，缩短了单次驱动作用时间，提高了分选速度和分选成功率；而且减小了单次驱动的作用力，降低驱动电压，提高了细胞活性。如图8所示，图(a)～(f)为高速相机以每秒5988Hz速度连续拍摄一个细胞分离过程的图像，图(a)中管道中央样品液中的细胞被检测到绿色荧光高表达(图中激光和荧光光斑被滤除掉)，图(b)中外置压电陶瓷开始将细胞推向上面的分选出口管道，样品层流开始向上运动；图(c)～(e)是细胞被推进分选出口管道的动态过程；图(f)细胞已经被分离进分选出口管道。

在一个优选的实施例中，如图9所示，微流体分选芯片1的驱动口个数可以为单个、两个或多个，当驱动口采用单个时，对应设置一个分选出口和一个未分选出口，可以节约成本和空间；当驱动口采用两个时，可以对应设置两个分选出口；当驱动口采用四个时，对应四个分选出口，实现更多通道的同时分选，其他数目的分选出口设计依次类推，在此不做限定。每个分选驱动口的金属弹片13可以采用推动、吸液驱动方式中的一种，多个驱动口可以采用不同的依次接力的驱动方式。

在一个优选的实施例中，压电陶瓷5可以采用圆柱形堆叠压电陶瓷，施加正向电压时的最大位移量可以达到100um，施加负向电压的最大位移量为60um，也可以采用其他类型的压电陶瓷，在此不作限定。

在一个优选的实施例中，油相鞘液可以采用矿物油、硅油或植物油等液体憎水性物质。由于鞘液采用不与水相溶的憎水性物质，在形成稳定鞘液的同时，在出口处细胞样品液会自动和油相鞘液分离，使得样品液可回收且避免了传统水相鞘液的稀释。在出口可以通过离心的方式将油相鞘液和细胞样品液完全分离，经高压灭菌后可再次使用。如图10所示，图(a)为未分选出口处细胞样品液自动和油相鞘液分层的效果，当选择密度小的油作为鞘液时，自动分层的底部为细胞溶液。将实验前后的不同溶液放在显微镜下观察，图(b)为未通入的原始细胞显微图像，细胞(透明圆点)的浓度和图(d)鞘液分层后只取底部样品溶液的细胞显微图的浓度一致；而图(c)分层后上部鞘液的显微图中不含细胞(小黑点是显微镜和载玻片上的污垢)，说明回收的细胞液并未被稀释。

在一个优选的实施例中，如图11所示，为了便于微流体分选芯片位置的固定，本发明还包括一芯片加持架8，它包括一矩形支撑板81，矩形支撑板81中心设置一用于嵌设固定微流体分选芯片的环形凹台82，环形凹台82顶部间隔设置一进样密封件83和一出口密封板件84。进样密封件83上设置有与盖片12上的进样孔121连通的进样螺纹孔85，进样螺纹孔85底部设置有用于与微流体分选芯片1密封连接的密封胶圈，出口密封件84上设置有与盖片12的分选孔和未分选出孔相连通的出口螺纹孔86。进样密封件83和出口密封件84顶部设置一支板87，支板87顶部设置一供压电陶瓷5滑动的滑槽881，压电陶瓷5通过支板87固定至微流体分选芯片驱动口上方，支板87顶部设置有与进样密封件83进行固定的螺纹孔882。另外，进样密封件83和出口密封件84两侧均设置有通槽89便于进样密封件83和出口密封件84安装位置的调整，使用时，通过螺栓与设置在矩形支撑板81两侧的螺孔89连接固定。第一次使用时先只安装进样密封件83，通入鞘液排净微流体分选芯片管道内气体后，用胶带密封排气孔后，依次安装出口密封件84和支板87。

下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统的工作过程：

本实施例中微流体分选芯片1的密封方式采用化学修饰键合，其中，基片11材料选用PDMS，盖片12材料选用PMMA，金属弹片13材质选用铜，金属弹片13直径为27mm，分选管道个数设置为一个，喇叭形驱动口个数设置为一个，喇叭型驱动口宽度为20um，微流体分选芯片1的检测通道c的宽度为240um，样品液/油相鞘液压力设置为6psi/4psi，压电陶瓷驱动电压参数为60V，驱动信号脉宽为100us，金属弹片13驱动目标细胞的分选方式采用推动驱动方式，样品液采用含有细胞的PBS(Thermo fisher)溶液，油相鞘液采用Mineral Oil(Sigma)，本实施例中待分离的样品量为15uL，具体分离过程为：

进样模块2通过控制气体压力将悬浮在PBS中的细胞样品液和油相鞘液压入到微流体分选芯片1的微管道14内，使油相鞘液流将样本流束缚在微流体分选芯片1的检测管道c中，并保证单个细胞依次通过检测管道c，光学检测模块照明每个流经检测管道的细胞，激发细胞产生荧光和散射光，完成荧光和散射光的收集，并将检测得到的荧光和散射光信号发送到实时信号控制模块3，例如用户想筛选红色荧光蛋白表达量高的细胞，并设定分选阈值为3.0V，那么实时信号控制模块3持续判断细胞流经时红色荧光通道的检测电压是否达到3.0V，如果是则说明该细胞是过量表达红色荧光蛋白的细胞，是用户指定待分选的类型，在该目标细胞流过驱动口位置的瞬间，实时信号控制模块3发出触发信号到压电陶瓷驱动模块4对压电陶瓷5施加作用力，压电陶瓷3挤压金属弹片13，当金属弹片13发生变形后作用微流体分选芯片的驱动口所在腔室体积，使目标细胞红色荧光蛋白落入到分选出口，完成细胞分选。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。

Claims (10)

1.一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：包括一微流体分选芯片、一进样模块、一光学检测模块、一实时信号控制模块、一压电陶瓷驱动模块和一个以上的压电陶瓷；

所述微流体分选芯片内封装有用作分选驱动的金属弹片，所述压电陶瓷设置在所述金属弹片外侧；

所述进样模块的进口连接一气瓶，所述进样模块的出口连接所述微流体分选芯片的进口，所述进样模块通过控制气体压力将细胞样本和油相鞘液压入到所述微流体分选芯片的微管道内，使所述油相鞘液流将细胞样本流束缚在所述微流体分选芯片的检测管道中央，并保证单个细胞依次通过所述微流体分选芯片的检测区域；

所述光学检测模块用于照明每个流经所述微流体分选芯片的检测管道的细胞，激发细胞产生荧光和散射光，完成荧光和散射光的收集，并将检测得到的荧光和散射光信号发送到所述实时信号控制模块；

所述实时信号控制模块将散射光和荧光信号转化为电信号进行调理和量化处理，并将处理结果与用户设置值进行逻辑判断，如果满足用户设定分选要求则发送触发信号到所述压电陶瓷驱动模块；

所述压电陶瓷驱动模块将触发信号转换成驱动所述压电陶瓷的高电压信号，使得所述压电陶瓷产生机械位移并通过挤压或释放所述金属弹片将目标细胞分离到不同的分选出口，实现细胞分选。

2.如权利要求1所述的一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：所述金属弹片将目标细胞分离到不同的分选出口的方式包括推动驱动方式、吸液驱动方式和依次接力驱动方式，三种驱动方式具体实现过程为：

A)推动驱动方式：所述实时信号控制模块在目标细胞流过所述微流体分选芯片的驱动口位置的瞬间，对所述压电陶瓷施加作用力给予位于此驱动口处的压电陶瓷以脉冲驱动的正向电压，使得所述压电陶瓷产生向下位移，挤压所述金属弹片，压缩所述微流体分选芯片驱动口所在腔室体积，使得多余的液体被挤压出去，在驱动口产生向外推动的流体，从而将目标细胞推到分选出口中去；

B)吸液驱动方式：使用前，所述压电陶瓷顶迫所述金属弹片向内发生一定弯曲，使用时，当检测到目标细胞经过所述微流体分选芯片的检测管道时，在其流过所述微流体分选芯片的驱动口位置的瞬间，给予所述压电陶瓷以脉冲驱动的负向电压，使得所述压电陶瓷产生向上位移，释放已弯曲的所述金属弹片，在驱动口产生向内吸纳的流体，从而将目标细胞拉拽到分选出口中去；

C)依次接力的驱动方式，当所述微流体分选芯片设置有两个以上的驱动口时，还可以采用推动式和吸液式、推动式和推动式、吸液式和吸液式依次接力的驱动方式。

3.如权利要求1所述的一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：所述油相鞘液采用憎水性物质，所述憎水性物质为矿物油、硅油或植物油。

4.如权利要求2所述的一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：所述油相鞘液采用憎水性物质，所述憎水性物质为矿物油、硅油或植物油。

5.如权利要求1或2或3或4所述的一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：所述微流体分选芯片包括一基片、一盖片和一个以上的所述金属弹片，所述基片顶部设置有若干管道凹槽和凹台；所述盖片底部采用化学修饰、热压键合或激光键合方式与所述基片顶部进行密封固定，不仅使所述基片上的各凹槽成为密封空间形成所述微流体分选芯片的微管道，而且使各所述凹台形成若干个大腔室作为所述微流体分选芯片的驱动口；所述盖片顶部还设置一个以上的用于密封固定所述金属弹片的凹台，各所述金属弹片的内侧通过紫外感光胶或环氧树脂胶间隔粘接在所述盖片顶部的凹台内，且各所述金属弹片分别位于所述微流体分选芯片的相应驱动口位置，各所述金属弹片的外侧放置所述压电陶瓷；

所述微管道包括一样品管道、两鞘液管道、一检测管道、一未分选出口管道、一个以上分选出口管道和一个以上排气管道；所述盖片顶部还设置有若干进样孔，所述进样孔分别与所述样品管道入口和鞘液管道入口连通形成所述微流体分选芯片的储液池；所述盖片顶部还设置一个以上用于排出微管道内的空气的排气孔，每一所述排气孔通过所述排气管道连通每一所述驱动口；所述盖片顶部还设置有一个以上的分选孔和一未分选孔，所述分选孔和未分选孔相应连通所述分选出口管道和未分选出口管道。

6.如权利要求5所述的一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：所述驱动口采用管道向外逐渐释放的“喇叭型”结构，喇叭型驱动口的出口宽度为20～30um。

7.如权利要求5所述的一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：所述微流体细胞分选系统还包括一芯片加持架，所述芯片加持架包括一矩形支撑板，所述矩形支撑板中心设置一用于嵌设固定所述微流体分选芯片的环形凹台，所述环形凹台顶部间隔设置一进样密封件和一出口密封板件，所述进样密封件上设置有与所述盖片上的进样孔连通的进样螺纹孔，所述进样螺纹孔底部设置有用于与所述微流体分选芯片密封连接的密封胶圈，所述出口密封件上设置有与所述盖片的分选孔和未分选孔相连通的出口螺纹孔，所述进样密封件和出口密封件顶部设置一支板，所述支板顶部设置一供所述压电陶瓷滑动的滑槽，所述压电陶瓷通过支板固定至所述微流体分选芯片驱动口上方，所述支板顶部设置有与所述进样密封件进行固定的螺纹孔，所述进样密封件和出口密封件两侧均设置有用于进行安装固定的通槽。

8.如权利要求1或2或3或4或6或7所述的一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：所述进样模块包括两个恒压阀、一个恒压阀控制系统和两个缓冲瓶；两个所述缓冲瓶的上部分别通过两个所述恒压阀连接所述气瓶出口，两个所述缓冲瓶的底部分别通过进样管道连接所述微流体分选芯片的储液池；所述恒压阀控制系统分别控制两个所述恒压阀提供两路稳定的气压，对两个所述缓冲瓶施加不同的气压，使得样品液和鞘液以不同的速度逐渐进入所述微流体分选芯片的微管道。

9.如权利要求5所述的一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：所述进样模块包括两个恒压阀、一个恒压阀控制系统和两个缓冲瓶；两个所述缓冲瓶的上部分别通过两个所述恒压阀连接所述气瓶出口，两个所述缓冲瓶的底部分别通过进样管道连接所述微流体分选芯片的储液池；所述恒压阀控制系统分别控制两个所述恒压阀提供两路稳定的气压，对两个所述缓冲瓶施加不同的气压，使得样品液和鞘液以不同的速度逐渐进入所述微流体分选芯片的微管道。

10.如权利要求1或2或3或4或6或7或9所述的一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统，其特征在于：所述光学检测模块包括单色激光器、光纤、物镜透镜组、双透镜系统、二向色镜组、滤色片组和光电倍增管组，其中，所述双透镜系统包括平行共轴的两个透镜和一小孔光阑，所述小孔光阑位于透镜的焦面上；

所述单色激光器发出的激光经过两个45°的所述二向色镜被反射到所述物镜透镜组，经所述物镜透镜组聚焦到所述微流体分选芯片的检测管道中央，当染色细胞经过激光聚焦点区域时，会同时产生散射光和激发荧光，散射光和激发光波长相同，经所述光纤侧向收集后发送到所述光电倍增管；荧光信号经所述物镜透镜组收集后透过所述二向色镜透射到所述双透镜系统，位于焦面的所述小孔光阑构成空间滤波器，滤除照明焦点以外的杂散信号，并由所述二向色镜组分光反射处理后依次通过所述滤色片发射到所述光电倍增管转换成电学信号。