CN108693151A - Storm/palm显微成像方法及装置 - Google Patents

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Abstract

一种STORM/PALM显微成像方法及装置，其中方法包括以下步骤：将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；产生激发光和活化光；将所述激发光和活化光合并形成照明光；用所述照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且所述成像物镜的前端置于所述折射率匹配液中。本发明将样品和成像透镜置于折射率匹配溶液中，可以有效控制样品深部的化学环境，为超高分辨成像提供了长时间稳定的光化学环境；另外以扫描光片方式照明厚样品，且以飞秒脉冲激光即行扫描双光子活化，减少了散射对照明、成像的影响，从而为厚样品的成像成为可能。

Description

STORM/PALM显微成像方法及装置
技术领域
本发明涉及一种光学成像方法及装置，尤其涉及一种适用于厚样品的STORM/PALM显微成像方法及装置。
背景技术
近年发明的STORM/PALM超高分辨率光学显微技术，突破了传统光学成像的衍射分辨率极限，分辨率达到20～30nm甚至更低。然而，这种技术的应用还有很多限制。其中最主要的一点是，这种技术的观测深度有较大限制，其深度一般不超过几微米，因而只能应用于成像薄样品或样品表面。
这一限制的原因首先在于，STORM/PALM的成像分辨率取决于单分子定位的精度，而为了高精度的单分子定位，必须高效的排除背景荧光以提高信噪比。为此，常规STORM的技术方案采取的是全内反射荧光(TIRF)或类似照明方式，这就造成了前述的观测深度限制。使用光片(LSM，或者SPIM)照明可以在厚样品内选择性的激发一个薄片区域，避免了大部背景的激发，可以有效的降低背景。Zanacchi等人提出了使用光片照明的方法，但是只实现了对一个细胞的组蛋白H2B的成像。未能对厚样品的成像提供解决方案。
但使用光片照明进行厚样品的STORM/PALM成像仍存在一些问题。其中一个问题是样品散射对光片实际形状有一定的影响，常用的生物医学样品内部折射率不均匀，吸收不大但散射强烈，从而使得光片在厚样品内迅速失去片状照明的特性，且被激发的荧光也难以清晰成像。常规分辨率下厚样品成像的经验告诉我们，使用短脉冲激光双光子成像可能在一定程度上改善照明的弥散情况。Zanacchi等人概念性的提出以双光子光片照明作为活化光的方法，但未能真正展示厚样品STORM/PALM成像的可行性，且仅照明这一方面的改善，不能解决散射样品中单分子成像的问题。厚样品的STORM/PALM成像的另一个问题是很难形成样品深部的化学微环境，这是因为STORM成像需要一系列缓冲剂用于改善成像区域荧光染料的激发特性，而这些缓冲剂很难作用到厚样品内部，从而造成这一方法在厚样品中应用的障碍。
发明内容
基于以上问题，本发明提出一种用于STORM/PALM显微成像方法及装置，用于解决上述技术问题中的至少之一。
为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提出一种STORM/PALM显微成像方法，该方法包括以下步骤：
步骤S1、将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；
步骤S2、产生激发光和活化光；
步骤S3、将激发光和活化光合并形成照明光；
步骤S4、用照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且成像物镜的前端置于折射率匹配液中。
进一步地，上述折射率匹配溶液包含有5％以上的葡萄糖；该折射率匹配溶液的折射率包括1.35～1.50。
进一步地，上述折射率匹配溶液还包含有添加剂，该添加剂包括三羟甲基氨基甲烷、碳酸二氢钙、磷酸氢钙和氯化钙中的至少一种。
进一步地，上述活化光为飞秒脉冲激光以扫描光片照明的方式提供的活化光。
进一步地，上述飞秒脉冲激光的波长范围为690nm～1080nm。
进一步地，在上述步骤S1之前，所述显微成像方法还包括对样品进行透明化处理。
进一步地，上述激发光由连续激光器产生；该连续激光器的发射波长范围包括400nm～760nm。
进一步地，上述激发光和活化光包括以扫描形式实现的贝塞尔光束或艾利光束。
为了实现上述目的，作为本发明的另一个方面，本发明还提出一种STORM/PALM显微成像装置，包括载物系统和成像系统，其中：
载物系统包括样品池，该样品池中放置有与样品相对应的折射率匹配溶液，该样品池具有至少两个开孔；
成像系统包括照明光产生模块和成像模块，照明光产生模块用于将激发光和活化光合成照明光以照明样品，该成像模块包括成像物镜，成像物镜嵌于样品池的至少两个开孔的任一个，且其前端置于折射率匹配液中，以对样品进行成像。
进一步地，上述载物系统还包括一位移台，用于对样品进行移动并将样品放置于样品池中。
本发明提出的一种STORM/PALM显微成像方法及装置，具有以下有益效果：
1、本发明将样品和成像透镜置于折射率匹配溶液中，可以有效控制样品深部的化学环境，为超高分辨成像提供了长时间稳定的光化学环境，从而为厚样品的超高分辨率成像提供必不可少的基础；
2、本发明以扫描光片方式照明厚样品，且以飞秒脉冲激光即行扫描双光子活化，减少了散射对照明、成像的影响，从而为厚样品的成像成为可能；
3、本发明以1mm为例的厚样品，可以获得优于100nm分辨率的成像。
附图说明
图1是本发明一实施例提出的用于厚样品的STORM/PALM显微成像方法原理图；
图2是本发明一实施例提出的用于厚样品的STORM/PALM显微成像装置的三维结构示意图。
图3是本发明一实施例提出的用于厚样品的STORM/PALM显微成像装置的成像结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明公开了一种STORM/PALM显微成像方法，包括以下步骤：
步骤S1、将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；
步骤S2、产生激发光和活化光；
步骤S3、将激发光和活化光合并形成照明光；
步骤S4、用照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且成像物镜的前端置于折射率匹配液中。
其中，在本发明的一些实施例中，上述折射率匹配溶液包含有5％以上的葡萄糖；该折射率匹配溶液的折射率包括1.35～1.50。
在本发明的一些实施例中，上述折射率匹配溶液还包含有添加剂，该添加剂包括三羟甲基氨基甲烷、碳酸二氢钙、磷酸氢钙和氯化钙中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，样品在置于具有折射率匹配溶液的样品池中之前，优选地，应该对样品进行透明化处理，透明化处理后，将样品浸入折射率匹配溶液中使其均一化。
在本发明的一些实施例中，活化光为飞秒脉冲激光以扫描光片照明的方式提供的活化光。该飞秒脉冲激光的波长范围为690nm～1080nm。
在本发明的一些实施例中，激发光由连续激光器产生，连续激光器的发射波长为400nm～760nm。例如，连续激光器的发射波长可以为405nm、488nm、561nm和647nm中的任一种。
在本发明的一些实施例中，激发光和活化光是以扫描形式实现的贝塞尔光束或艾利光束，例如，激发光和活化光均为以扫描形式实现的贝塞尔光束。
本发明还公开了一种STORM/PALM显微成像装置，包括载物系统和成像系统，其中：
载物系统包括样品池，该样品池中放置有与样品相对应的折射率匹配溶液，该样品池具有至少两个开孔；
成像系统包括照明光产生模块和成像模块，照明光产生模块用于将激发光和活化光合成照明光以照明样品，该成像模块包括成像物镜，成像物镜嵌于样品池的至少两个开孔的任一个，且其前端置于折射率匹配液中，以对样品进行成像。
在本发明的一些实施例中，上述载物系统还包括一位移台，用于对样品进行移动并放置于样品池中。
以下通过具体实施例对发明提出的一种STORM/PALM显微成像方法及装置进行详细描述。
实施例1
本实施例提出一种STORM/PALM显微成像方法，包括以下步骤：
步骤S1、将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；
步骤S2、产生激发光和活化光；
步骤S3、将激发光和活化光合并形成照明光；
步骤S4、用照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且成像物镜的前端置于折射率匹配液中。
本实施例还提出一种STORM/PALM显微成像装置，包括载物系统和成像系统，其中：
如图2所示，载物系统包括样品池10和位移台20，该样品池10中放置有与样品相对应的折射率匹配溶液，该样品池10具有四个开孔111～114；该位移台20用于对样品进行移动并放置于样品池10中。
如图1所示，成像系统包括照明光产生模块30和成像模块40，照明光产生模块30用于将激发光和活化光合成照明光以照明样品，该成像模块40包括成像物镜，成像物镜嵌于样品池的四个开孔111～114中的任一个，且其前端置于折射率匹配液中，以对样品进行成像。
具体的，在进行STORM/PALM显微成像时，采用本实施例提出的STORM/PALM显微成像装置，包括以下操作：
首先对样品的采取及处理进行详细描述。本实施例以截面1mm×1mm的脑组织样品的超高分辨成像为例。样品取自Thy1-YFPH品系小鼠，样品经过对anti-GFP抗体所标记的Alexa Fluor405-Alexa Fluor647荧光染料对进行STORM成像，参照CLARITY组织透明技术的要求灌流取脑，固定后在目标脑区切取截面1mm×1mm的脑样品，然后将样品放入37℃水浴聚合反应3小时，完成之后将样品置于浓度为4％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中进行透明化处理，随后用加入0.1％Triton的磷酸盐缓冲液(PBST)洗去残留的SDS溶液，然后用荧光染料对标记的抗体进行免疫荧光染色，再用PBST溶液洗去非特异性结合的抗体，最后将样品移至如图2所示的STORM/PALM显微成像装置的样品池10中，样品池10中具有折射率匹配溶液，从而样品浸入折射率匹配溶液中使其均一化，同时除去溶液中的氧气，至此完成样品的处理用于成像。
随后对样品的成像过程进行详细描述，如图1所示，其中成像系统的照明光产生模块30的激发光选择647nm的连续激光，由连续激光器311产生；双光子的活化光选择800nm的飞秒脉冲激光，由飞秒脉冲激光器312产生。连续激光经第一反射镜313传输至声光可调谐滤波器314，声光可调谐滤波器314选择所需激发光的波长和功率，随后激发光通过光纤接口315耦合进光纤316，光纤输出的激发光经第一透镜317转换成平行光，转换成的平行光经过第一半波片318调整偏振后传输至偏振分光棱镜323，同时，活化光经第二反射镜319传输至帕克尔开关320，活化光经帕克尔开关320后经由第二半波片321，并通过第三反射镜322传输至偏振分光棱镜323，在偏振分光棱镜323处，激发光的S偏光和活化光的P偏光合并成为第一照明光。照明光从偏振分光棱镜323射出后，经由第四反射镜411、第二透镜412、第五反射镜413、第三透镜414将照明光传输至第一检流计振镜415，且传输至第一检流计振镜415的照明光的有效数值孔径约为0.2NA，其中，第一检流计振镜415位于第一照明物镜417后焦面共轭的位置，从而实现成像区域的面照明。经第一检流计振镜415扫描后，照明光经由一对焦距相等的平凸透镜416传输至第一照明物镜417，第一照明物镜417嵌入图2所示样品池的第一开孔111，照明光从第一照明物镜417输出后对样品进行照明。照明的样品浸泡在折射率匹配缓冲液中，第一成像物镜418嵌入图2所示样品池的第二开孔112，与第一照明物镜417共焦点，用于采集荧光光子，荧光光子经由第一荧光滤波器419和第一镜筒透镜420传输到第一sCMOS相机421成像，得到样品的像。其中，第一成像物镜418的前端也浸入折射率匹配缓冲液中，第一成像物镜418与样品之间分别形成一水镜，且第一成像物镜418为Zeiss公司工作距离2mm、数值孔径为1.0的成像物镜。光路中插入长焦距的柱面镜422(CL，cylindrical lens)用于引入非对称像差，从而为相机提供1μm范围内的轴向位置信息。其中，样品由位移台20置于样品池10内的成像位置，所述的折射率匹配缓冲液的匹配折射率约为1.45。图1中虚线框部分的结构为可选装置，其为在偏振分光棱镜323处，激发光的P偏光和活化光的S偏光合并成为第二照明光，经过第四透镜423、第六反射镜424、第五透镜425、第二检流计振镜426、另一焦距相等的平凸透镜427传输到达第二照明物镜428，即第二照明光经过与第一照明光相同的传输路径到达嵌于第三物镜孔113的第二照明物镜428，第二照明光从第二照明物镜428输出后对样品进行照明，第二成像物镜429嵌入图2所示样品池的第四物镜孔114，与第二照明物镜428共焦点，用于采集荧光光子，荧光光子经由第二荧光滤波器430和第二镜筒透镜431传输到第二sCMOS相机432成像，得到样品的像。光路中插入另一长焦距的柱面镜433，以用于引入非对称像差。
在成像过程中，样品由100～500mW的647nm激光照射使荧光分子转入暗态，调节飞秒活化激光和647nm激发激光，使得成像中的活化分子数量适中。通常经数万幅图像采集可以重建出一个局部的三维重构。由位移台轴向位移至新的成像区域，继续采集重构，直至完成全部样品成像。图3为本系统获得的一个平面内荧光超分辨成像的结果，可清晰分辨神经元树突脊的颈(约150nm)以及树突上新生的丝状伪足。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；
步骤S2、产生激发光和活化光；
步骤S3、将所述激发光和活化光合并形成照明光；
步骤S4、用所述照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且所述成像物镜的前端置于所述折射率匹配液中。
2.如权利要求1所述的STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，所述折射率匹配溶液包含有5％以上的葡萄糖；所述折射率匹配溶液的折射率为1.35～1.50。
3.如权利要求2所述的STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，所述折射率匹配溶液还包含有添加剂，所述添加剂包括三羟甲基氨基甲烷、碳酸二氢钙、磷酸氢钙和氯化钙中的至少一种。
4.如权利要求1所述的STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，所述活化光为飞秒脉冲激光以扫描光片照明的方式提供的活化光。
5.如权利要求4所述的STORM/PALM超高分辨显微成像方法，其特征在于，所述飞秒脉冲激光的波长范围为690nm～1080nm。
6.如权利要求1所述的STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，在所述步骤S1之前，所述显微成像方法还包括对样品进行透明化处理。
7.如权利要求1所述的STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，所述激发光由连续激光器产生；所述连续激光器的发射波长范围包括400nm～760nm。
8.如权利要求1所述的STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，所述激发光和活化光包括以扫描形式实现的贝塞尔光束或艾利光束。
9.一种STORM/PALM显微成像装置，包括载物系统和成像系统，其中：
所述载物系统包括样品池，所述样品池中放置有与样品相对应的折射率匹配溶液，所述样品池具有至少两个开孔；
所述成像系统包括照明光产生模块和成像模块，照明光产生模块用于将激发光和活化光合成照明光以照明样品，所述成像模块包括成像物镜，所述成像物镜嵌于所述样品池的至少两个开孔的任一个，且其前端置于所述折射率匹配液中，以对样品进行成像。
10.如权利要求9所述的STORM/PALM显微成像装置，其特征在于，所述载物系统还包括一位移台，用于对样品进行移动并将样品放置于样品池中。
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