JP2013156286A - 撮像装置 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、培養容器内で培養された生細胞や生体組織などの標本全体を走査するのに要する時間を短縮することができ、画像劣化を防止することができる撮像装置を提供することである。
【解決手段】容器８内に培養液とともに収容された標本Ａに照明光を照射して前記標本Ａを光学的にセクショニングして撮像する撮像装置であって、照明光である励起光の光束を出射する光源装置５と、該光源装置５からの励起光を前記標本Ａに照射する励起光照射部６と、容器８内に配置した標本Ａを観察する観察光学系１８と、前記励起光照射部６からの励起光または前記容器８側のうちのいずれか一方を走査する走査装置１１と、を備え、前記励起光照射部６からの励起光が該観察光学系８の光軸Ｏ１と平行な方向に対して交差する状態で斜めの角度をなすように前記標本Ａに入射されるように配置した。
【選択図】図２

Description

本発明は、主に培養容器内で培養された生細胞や生体組織などの生体標本を光学的にセクショニングして撮像するための撮像装置に関する。

生物標本を光学的にセクショニングして撮像する技術として、例えば特許文献１に示されている顕微鏡用極薄照明光発生装置がある。この装置では、レーザ発振器からのレーザ光が、凹レンズと凸レンズにより集束されて、スリット光を形成するスリット光形成手段に入射される。その後、スリット光形成手段の第一のスリットによってレーザ光が狭められ、次いで、第二のスリットを第一のスリットに対して適当量横に移動し、第一のスリットの回折によるサイドバンドを遮光することで、主光を通してスリット光を形成する。このスリット光形成手段の出力は、顕微鏡の鏡筒内に入射させられ、対物レンズの瞳面内の周縁部の１点に集光させることで、対物レンズから平行光束として射出される。射出された光束は細胞等の生物標本が載置されている透明板に入射し、その境界において屈折されて極薄照明光を形成する。これを公知の染色技術によって注目部位を蛍光染色した細胞等の標本に照射し、照明された部分をそれに垂直な方向から観察することによって細胞等の断層像や細胞の内部にある蛍光物質の像（蛍光像）が得られる。さらに、スリット光の位置をずらすことによって標本の光切断位置を走査することにより、各面の二次元画像を記録し、それをコンピュータ上で再構成することで細胞の三次元像を得ることができる。

また、特許文献２に記載の顕微鏡観察装置には、レーザ光源と光ファイバとコレクタレンズにより、十分に細い光束径を有する直線状のレーザ光を出射する光源装置と、該光源装置から発せられる直線状のレーザ光をガルバノミラーによって一次元方向に走査する走査装置と、該走査装置により走査されるレーザ光をほぼ平行な方向に指向させるシリンドリカルレンズと、試料を載置し、直線状のレーザ光が並進移動させられる領域に試料を配置することができ、さらにレーザ光が走査される平面に対して直交する方向（例えば鉛直方向）に移動させることができるステージと、試料から発せられる蛍光を捉えるＣＣＤ等の撮像装置を含み、対物レンズの焦点面が、レーザ光の走査平面に一致するように調節されている観察光学系と、これら光源装置、走査装置、ステージ及び観察光学系を制御するコンピュータからなる顕微鏡観察装置が開示されている。

この顕微鏡観察装置を用いて試料の観察を行うには、ステージ上に試料を固定し、所定の位置にステージを停止させて光源装置からレーザ光を出射させる。このレーザ光は走査装置のガルバノミラーの角度に応じて決定される方向に反射されて、シリンドリカルレンズを経由した後、試料に入射される。このときレーザ光はその一部が試料内において拡散されるが、その大部分が試料を直線状に透過する。そしてレーザ光はその経路に配置される蛍光物質を励起して蛍光を発生させる。さらにレーザ光は走査装置の作動により、水平面内を移動するので、レーザ光が移動した試料内の領域、すなわち、鉛直方向に極めて薄い平面上の領域から蛍光を発せさせることができる。蛍光物質が発生した蛍光は、観察光軸に沿う方向に進行する一部の光が対物レンズによって集光されて撮像装置により撮像される。

さらに、ステージを上下方向に移動させることで、鉛直方向に位置の異なる複数の二次元的な蛍光画像を取得できる。これらの二次元的な蛍光画像を画像処理により組み合わせることによって、三次元的な蛍光画像を取得することができる。

特許第４４６５４６０号公報 特開２００７−１１４５４２号公報

特許文献１に開示されている顕微鏡用極薄照明光発生装置では、生物標本を観察するための光学系と生物標本との関連が明確に記載されておらず、実施することが困難である。さらに、特許文献１に記載の顕微鏡用極薄照明光発生装置では、スリットを用いてスリット光を作成しているため、複数のスリット光を発生させるには、複数のスリットを並列に配置する必要があるが、このようにすることで回折によるサイドバンドが複数重畳するのでサイドバンドの影響を回避することができない。

一方、特許文献２に開示されている顕微鏡観察装置では、通常、細胞培養に使用されるプラスチック製の培養容器で培養されている細胞、生体組織を標本とする場合、標本に照射する照明光が容器の周壁部を通過する際に光の屈折などの影響を受ける可能性がある。ここで、細胞培養に使用されるプラスチック製の培養容器は、円形皿が使用される場合が多い。このような円形皿では、周壁部は格別に成形精度が高くは製造されていないので、照明光を円形皿の周壁部を透過して標本に照射する際に、円形皿の周壁部の曲面により、光の屈折などの影響を受ける可能性が大きくなる。そのため、特許文献２の装置では、容器の周壁部が障害となって、照明光を適切に標本に照射することができない。また、標本中を直線状の励起光が通過するため、標本が大きくなるにしたがって、励起光束が標本中を通過する距離が大きくなるので、励起光が次第に拡散してしまうという課題がある。また、特許文献２中には、複数の励起光束で照明することにも言及されているが、その具体的な方法が開示されていない。

したがって、特許文献１、２のいずれの先行技術によっても、標本の複数の断面を一度に撮像することはできない。このため、標本全体の走査を完了するためには多くの時間を要するという課題がある。
本発明は上記事情に着目してなされたもので、その目的は、培養容器内で培養された生細胞や生体組織などの標本全体を走査するのに要する時間を短縮することができ、画像劣化を防止することができる撮像装置を提供することにある。

本発明の第１の態様は、容器内に培養液とともに収容された標本に照明光を照射して前記標本を光学的にセクショニングして撮像する撮像装置であって、前記照明光である励起光の光束を出射する光源装置と、該光源装置からの励起光を前記標本に照射する励起光照射部と、容器内に配置した標本を観察する観察光学系と、を備え、前記励起光照射部からの励起光が該観察光学系の光軸と平行な方向に対して交差する状態で斜めの角度をなすように前記標本に入射されるように配置したことを特徴とする撮像装置である。
そして、上記第１の態様では、レーザ光源などの励起光の光束を出射する光源装置から出射される励起光が励起光照射部を介して該観察光学系の光軸と平行な方向に対して交差する状態で斜めの角度をなすように前記標本に入射される。これにより、容器の周壁部を使用せず、高精度に製造される容器の底部壁面のみを通過させる状態で、励起光照射部からの励起光を容器内の標本に入射させることができる。この状態で、観察光学系によって容器内の培養液とともに生体標本の画像を撮像し、その撮像データに基いて生体標本の立体画像を構築する。このとき、走査部によって前記励起光照射部からの励起光または前記容器側のうちのいずれか一方を走査することで、培養容器内で培養された生細胞や生体組織などの生体標本の立体画像を構築する標本全体の走査時間を短縮することができる。

本発明の第２の態様は、第１の態様において、前記励起光照射部は、前記光源装置からの励起光を複数に分割する励起光分割手段を有することを特徴とする。
そして、上記第２の態様では、該光源装置からの励起光を励起光分割手段によって複数に分割し、分割した複数の励起光が前記標本に入射され、観察光学系によって標本の画像を撮像する。これにより、前記標本の複数個所を同時に照明することができるので、標本全体の走査時間を短縮することができる。

本発明の第３の態様は、第２の態様において、前記励起光分割手段は、平行平面板の一方の面が１００％の反射率を有し、前記容器と非対向側に配置された第１の反射面、もう一方の面に前記容器と対向する側に配置された第２の反射面が形成され、前記第２の反射面は、反射回数をｉとし、照明光束分割数をｎとする場合に１／（ｎ＋１−ｉ）となる反射率を有する光反射部であることを特徴とする。

そして、上記第３の態様では、該光源装置からの励起光を平行平面板の第１の反射面で反射させたのち、第２の反射面の光反射部で励起光の反射率を暫減させ、分割した励起光強度を一定に保つことができるため、撮像される画像の明るさが一定になる。
本発明の第４の態様は、第２の態様において、前記励起光分割手段は、前記容器内の培養液の表面側に前記励起光分割手段、前記容器の底面側に前記観察光学系がそれぞれ設置され、前記容器内に前記培養液とともに配置した標本を前記容器の底面側から撮像するようにしたことを特徴とする。

そして、上記第４の態様では、培養液の上面に励起光分割手段である平行平板を配置することにより、培養液表面の表面張力による液面形状が一定となるため、培養容器の直径が小さくても、撮影した画像に歪みが発生しない。また、一般的に生体組織の培養に使用されている容器は、射出成型によって一体的に製造されていることが多く、そのような容器の底面はレーザ光のような光束を正しく透過させることができない。このような場合でも、レーザ光を分割する平行平面板を容器底面とは異なる位置に設置することによって、レーザ光を正しく透過させることができるようになる。

本発明の第５の態様は、第２の態様において、前記励起光分割手段は、前記励起光の分割数と同数のハーフミラーが前記光源装置からの励起光の光軸方向に並設されていることを特徴とする。
本発明の第６の態様は、第２の態様において、前記励起光分割手段からの複数の励起光の入射角度は、前記観察光学系の瞳に前記励起光が直接的に入射されることを防止できる角度であることを特徴とする。

本発明の第７の態様は、第１の態様において、前記走査部は、前記容器を前記観察光学系の光軸と直交する方向に走査する直線方向走査機構、または前記容器を前記観察光学系の光軸を中心に軸回り方向に回転させる方向に走査する回転方向走査機構のいずれか一方を有することを特徴とする。

そして、上記第７の態様では、レーザ光源などの励起光の光束を出射する光源装置から出射される励起光を励起光照射部の走査部によって一次元方向に走査する。このとき、前記励起光照射部からの励起光が該観察光学系の光軸と平行な方向に対して交差する状態で斜めの角度をなすように前記標本に入射される。これにより、容器の周壁部を使用せず、高精度に製造される容器の底部壁面のみを通過させる状態で、励起光照射部からの励起光を標本に入射させることができる。この状態で、観察光学系によって容器内の培養液とともに生体標本の画像を撮像し、その撮像データに基いて生体標本の立体画像を構築する。さらに、走査部によって一次元方向に走査することで、生体標本の立体画像を構築する標本全体の走査時間を短縮することができる。

本発明によれば、培養容器内で培養された生細胞や生体組織などの標本全体を走査するのに要する時間を短縮することができ、画像劣化を防止することができる撮像装置を提供することができる。

本発明の第１の実施の形態の顕微鏡観察装置のシステム全体の概略構成図。 第１の実施の形態の顕微鏡観察装置の要部の概略構成図。 第１の実施の形態の顕微鏡観察装置での撮像動作の流れを説明するためのフローチャート。 第１の実施の形態の顕微鏡観察装置の観察光学系で観察される生体標本の４箇所の断面画像を示す平面図。 本発明の第２の実施の形態の顕微鏡観察装置を示す要部の概略構成図。 本発明の第３の実施の形態の顕微鏡観察装置を示す要部の概略構成図。 本発明の第４の実施の形態の顕微鏡観察装置を示す要部の概略構成図。 本発明の顕微鏡観察装置の容器の変形例のマイクロプレートを示す斜視図。 図８Ａの８Ｂ−８Ｂ線断面図。

［第１の実施の形態］
（構成）
図１乃至図４は、本発明の撮像装置の第１の実施の形態を示す。図１は、本発明の撮像装置が適用される実施形態に係る顕微鏡観察装置１の全体の概略構成を示す。本実施形態に係る顕微鏡観察装置１は、主に試料２を保持する試料保持部３と、この試料保持部３の上方に配置され、試料２を観察する観察部４と、試料２の照明光である励起光の光束を出射する光源装置５と、該光源装置５からの励起光を前記試料２に照射する励起光照射部６と、前記励起光照射部６からの励起光を走査する走査装置（走査部）１１と、を有する。ここで、試料２は、図２に示すように平面底８ａを有する円形皿の容器８内に培養液９とともに収容された生体標本Ａである。容器８内には、生体標本Ａを適切な条件で培養するための培養液９が収容されている。容器８は、例えばφ３５ｍｍディッシュや、マルチウェルプレートなどである。

試料保持部３は、該生体標本Ａを収容した前記容器８を載置し、水平面内で容器８を移動するためのステージ１０によって形成されている。前記ステージ１０は、前記シリンドリカルレンズ１２によって、直線状のレーザ光Ｌが並進移動させられる領域に試料２を配置するように設けられ、図示しないステージ移動機構によって図２中に矢印で示すように水平面内で移動できるように構成されている。なお、ステージ１０には、容器８を載置する容器受け部１０ａに容器８の直径よりも小径な穴部１０ｂが形成されている。

光源装置５は、例えば、異なる波長のレーザ光Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃを出射する複数、本実施の形態では３つのレーザ光源２１ａ〜２１ｃと、該レーザ光源２１ａ〜２１ｃからのレーザ光Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃを一端に入射させる光ファイバ２２と、該光ファイバ２２の一端に入射させる複数のレーザ光Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃの光路を合流させるミラー２３ａ、２３ｂ及びダイクロイックミラー２３ｃと、光ファイバ２２の他端から出射されるレーザ光Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃを集光して、十分に細い光束径を有する直線状のレーザ光Ｌに変換するコレクタレンズ２４によって構成されている。図１中で、符号２５はカップリングレンズである。また、光源装置５は、図示しないレーザ光Ｌの波長選択・調光手段を備え、後述するコンピュータ２６により制御されるようになっている。

励起光照射部６は、光源装置５から発せられる直線状のレーザ光Ｌを一次元方向に走査する走査装置（走査部）１１と、該走査装置１１により走査されるレーザ光Ｌをほぼ平行な方向に指向させるシリンドリカルレンズ１２と、シリンドリカルレンズ１２からの直線状のレーザ光Ｌを試料保持部３の下方に導くための反射鏡１３と、前記光源装置５からの励起光を複数に分割する励起光分割手段１４とを有する。

前記走査装置１１は、コレクタレンズ２４から発せられた直線状のレーザ光Ｌを反射するガルバノミラー３１と、該ガルバノミラー３１の角度を変化させるモータ３２とを備えている。該モータ３２の作動によりガルバノミラー３１を所定角度範囲にわたって往復揺動させることで、該モータ３２の回転軸３２ａに直交する平面（例えば、水平面）内において直線上のレーザ光Ｌを扇状に振ることができるようになっている。

前記シリンドリカルレンズ１２は、前記走査装置１１により扇状に振られた直線状のレーザ光Ｌを透過させることにより、全ての角度位置のレーザ光Ｌが略平行となるように屈折させるようになっている。これにより、走査装置１１によりレーザ光Ｌが振られると、レーザ光Ｌは一平面（例えば、水平面）内において並進移動させられるようになっている。なお、シリンドリカルレンズ１２に代えてｆ−θレンズを用いても良い。

反射鏡１３は、シリンドリカルレンズ１２を透過させたレーザ光Ｌの進行方向に配置され、シリンドリカルレンズ１２からの直線状のレーザ光Ｌを試料保持部３の下方に導く（反射させる）ように水平面に対して斜めに傾斜させた状態で設置されている。
また、励起光分割手段１４は、反射鏡１３から反射されるレーザ光Ｌの反射光軸上に沿って平行に並設され、レーザ光Ｌを複数に分割する複数、本実施の形態では４つのハーフミラー（半透鏡）７を有する。４つのハーフミラー７は、レーザ光Ｌの一部を透過させ、残りを全反射させる。これにより、反射鏡１３から反射されるレーザ光Ｌは、４つのハーフミラー７で複数、本実施の形態では４つの光束に分割される。その後、４つのレーザ光Ｌは、ステージ１０の容器受け部１０ａの穴部１０ｂを通り、容器８の底面側から、生体標本Ａに平行に入射される。このとき、４つのレーザ光Ｌは、後述する観察光学系１８の光軸Ｏ１と平行な方向に対して交差する状態で斜めの角度をなすように前記標本Ａに入射されるように励起光分割手段１４の４つのハーフミラー７が配置されている。

前記観察部４は、対物レンズ１５と、結像レンズ１６と、ＣＣＤカメラ等の撮像部材１７とを備えた観察光学系１８を有する。対物レンズ１５は、前記ステージ１０の移動方向に対して鉛直に観察光軸Ｏ１を配置する状態に設置されている。この対物レンズ１５は、生体標本Ａの高さよりも大きな焦点深度を有する。そして、生体標本Ａから発せられる蛍光Γを対物レンズ１５で集光し、該対物レンズ１５により集められた蛍光Γを結像レンズ１６で焦点位置に集光する。撮像部材１７は、該結像レンズ１６の焦点位置に撮像面１７ａが配置されている。

なお、図１中で、符号１９ａ、１９ｂは撮像する蛍光Γの波長を切り替えるフィルターである。そして、観察光学系１８は、生体標本Ａから発せられる蛍光Γを捉え、ＣＣＤカメラ等の撮像部材１７によって画像化する。これら光源装置５、励起光照射部６、ステージ１０及び観察光学系１８は、コンピュータ２６に接続される。

前記コンピュータ２６は、光源装置５から出射されるレーザ光Ｌの調光、あるいは波長の選択を行うと共に、走査装置１１のモータ３２及びステージ１０の前記ステージ駆動機構を制御して試料２におけるレーザ光Ｌの入射位置を調節するようになっている。また、コンピュータ２６は、観察光学系１８の撮像部材１７の撮像タイミングを制御するようになっている。

（作用）
次に、上記構成の作用について図３のフローチャートを参照して説明する。本実施の形態の顕微鏡観察装置１を用いて試料の観察を行うには、ステージ１０上に生体標本Ａを収容した容器８を固定し（ステップＳ１）、所定の位置にステージ１０を停止する。続いて、次のステップＳ２で、例えばコンピュータ２６の入力装置の操作により走査装置１１による走査範囲を指定する。そして、モータ３２の作動によりガルバノミラー３１を往復揺動させた状態で次のステップＳ３に進む。このステップＳ３では、光源装置５を点灯し、光源装置５からレーザ光Ｌを出射させる。

光源装置５から発せられたレーザ光Ｌはミラー２３ａ、２３ｂあるいはダイクロイックミラー２３ｃとカップリングレンズ２５を介して光ファイバ２２の一端に入射され、光ファイバ２２の他端から発せられた後にコレクタレンズ２４によって微小光束径を有する直線状のレーザ光Ｌが出射される。出射されたレーザ光Ｌはガルバノミラー３１の角度に応じて決定される方向に反射されて、シリンドリカルレンズ１２に入射される。このシリンドリカルレンズ１２を透過させることにより、全ての角度位置のレーザ光Ｌが略平行となるように屈折させた後、シリンドリカルレンズ１２を透過されたレーザ光Ｌは、続いて反射鏡１３で試料保持部３の下方に導かれる。その後、レーザ光Ｌは、ハーフミラー７で４つの光束に分割された後、容器８の底面側から、生体標本Ａに入射させられる。このとき、４つのレーザ光Ｌは、観察光学系１８の光軸Ｏ１と平行な方向に対して交差する状態で斜めの角度をなすように前記標本Ａに入射される。

レーザ光Ｌが生体標本Ａに入射されると、レーザ光Ｌは、その一部が生体標本Ａ内において拡散されるが、その大部分が生体標本Ａを直線状に透過する。そしてレーザ光Ｌは、該レーザ光Ｌの経路に含まれる蛍光物質を励起して蛍光Γを発生させる。レーザ光Ｌは走査装置１１の作動により、図２の紙面に対して垂直な方向に移動させられるので、レーザ光が移動した生体標本Ａ内の領域から蛍光Γを発せさせることができる。

発生した蛍光Γは、全方向に向けて出射されるが、観察光軸Ｏ１に沿う方向に進行する一部の蛍光Γが対物レンズ１５によって集光された後、結像レンズ１６によって結像されて、図４に示すように生体標本Ａの４箇所の断面ｐ１〜ｐ４の画像が撮像部材１７により撮像される（ステップＳ４）。

撮像部材１７による生体標本Ａの４箇所の断面ｐ１〜ｐ４の画像の撮像が１回終了した時点で、光源装置５が消灯される（ステップＳ５）。その後、次のステップＳ６で、さらに、ステージ１０をレーザ光Ｌの進行方向に移動させる。続いて、次のステップＳ７で、予め指定された走査装置１１による走査範囲の画像の撮像が終了したか否かが判断される。そして、ステップＳ７で、走査範囲の画像の撮像が終了していない状態と判断された場合にはステップＳ３に戻る。また、ステップＳ７で、走査範囲の画像の撮像が終了している状態と判断された場合には生体標本Ａの画像の撮像が終了する。これによって、生体標本Ａ全体の断面像を取得することができる。

（効果）
そこで、上記構成のものにあっては次の効果を奏する。すなわち、本実施の形態の顕微鏡観察装置１によれば、極めて細い光束径を有する直線状の複数のレーザ光Ｌによって生体標本Ａの各位置の蛍光物質を励起させるとともに、生体標本Ａの複数断面を同時に撮像できるので、生体標本Ａ全体を走査するのに要する時間を短縮することができる。次いで、ステージ１０を水平方向に移動させた後に、ガルバノミラー３１を逆方向に揺動させることにより、観察光軸Ｏ１の方向に異なる位置の水平面に沿った断面の蛍光画像を取得することができる。したがって、この工程を繰り返すことにより、水平方向に位置の異なる複数の二次元的な蛍光画像を取得でき、これらの二次元的な蛍光画像を画像処理により組み合わせることによって、三次元的な蛍光画像を取得することができる。さらに、このように構成することにより、観察光学系１８及びレーザ光の走査される平面の上下方向の位置を変化させること無く、生体標本Ａの三次元的な蛍光画像を取得できる。これにより、培養容器８内で培養された生細胞や生体組織などの生体標本Ａ全体を走査するのに要する時間を短縮することができ、画像劣化を防止することができる撮像装置を提供することができる。

なお、本実施の形態では励起光分割手段１４は、４つのハーフミラー７が該当するが、励起光入射側をハーフミラーとし、もう一方の面をミラーとした平行平板でもよい。また、励起光分割手段１４のハーフミラー７の数は必ずしも４つに限定されるものではない。例えば、ハーフミラー７の数を増加することにより、レーザ光Ｌを分割する数を増加して標本Ａへのレーザ光Ｌの照射箇所を増やすことにより、標本Ａ全体の走査時間をさらに短縮することができる。また、上記実施の形態では、水平面内で容器８を移動するためのステージ１０は、図示しないステージ移動機構によって図２中に矢印で示すように水平面内で移動できる構成を示したが、例えば観察光軸Ｏ１を中心に軸回り方向に回転させる方向に走査する回転方向走査機構を設けてもよい。

［第２の実施の形態］
（構成）
図５は、本発明の第２の実施の形態を示す。本実施の形態は、第１の実施の形態（図１乃至図４参照）の顕微鏡観察装置１の構成を次の通り変更した変形例である。なお、図５中で、図１乃至図４と同一部分には同一の符号を付してその説明を省略する。

すなわち、第１の実施の形態では励起光分割手段１４の４つのハーフミラー７を水平方向に配置した状態で並設した構成を示したが、本実施の形態の顕微鏡観察装置４１は、励起光分割手段１４の４つのハーフミラー７を鉛直方向に配置した状態で並設した構成に変更したものである。さらに、本実施の形態では第１の実施の形態の反射鏡１３を省略し、試料保持部３の下方に配置された走査装置１１から直接的に４つのハーフミラー７にレーザ光Ｌを入射させる構成にしたものである。ここで、４つのハーフミラー７は、走査装置１１のシリンドリカルレンズ１２を透過させたレーザ光Ｌの進行方向に配置されている。

（作用・効果）
本実施の形態でも第１実施形態と同様の作用・効果が得られる。
［第３の実施の形態］
（構成）
図６は、本発明の第３の実施の形態を示す。本実施の形態は第１の実施の形態（図１乃至図４参照）の顕微鏡観察装置１の変形例である。本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態、および第２の実施形態に係る顕微鏡観察装置１、４１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡観察装置５１では、第１の実施の形態の励起光分割手段１４の４つのハーフミラー７に代えてガラス平行平面板５２を有する１つの励起光分割部材５３を設けたものである。この励起光分割部材５３は、平行平面板５２の一方の面が１００％の反射率Ｒを有する第１の反射面５４、もう一方の面に第２の反射面５５がそれぞれ形成されている。そして、第２の反射面５５は、容器８と対向する側に配置され、第１の反射面５４は、容器８と非対向側に配置されている。

さらに、平行平面板５２の第２の反射面５５は、第１の反射面５４によるレーザ光Ｌの反射回数をｉとし、照明光束の分割数をｎとする場合に１／（ｎ＋１−ｉ）となる反射率を有する光反射部である。本実施の形態では、第２の反射面５５は、励起光照射部６を出射したレーザ光Ｌを４本に分割する場合、反射率Ｒを１／４、１／３、１／２、ＡＲ（０％）のように暫増する４つの反射域５５ａ、５５ｂ、５５ｃ、５５ｄを有する。そして、励起光照射部６を出射したレーザ光Ｌを４本に分割する場合、平行平面板５２の第２の反射面５５の４つの反射域５５ａ、５５ｂ、５５ｃ、５５ｄと第１の反射面５４とによってレーザ光束Ｌを４つに分割するようにしている。

（作用）
次に、上記構成の作用について説明する。本実施の形態の顕微鏡観察装置５１では、直線状の励起光と励起光分割部材５３によって、複数個所（本実施の形態では４箇所）を同時に照明することができるので、標本全体の走査時間を短縮することができる。さらに、本実施の形態によれば、励起光分割部材５３の第２の反射面５５は、反射率を暫減させている４つの反射域５５ａ、５５ｂ、５５ｃ、５５ｄを有する。そのため、分割した励起光強度を一定に保つことができるため、撮像される画像の明るさが一定になる。

（効果）
そこで、本実施の形態の顕微鏡観察装置５１では、第１実施形態と同様の効果に加え、励起光分割部材５３で、分割した４本のレーザ光束Ｌは、いずれも同じ強度にすることができるので、均一の強度で生体標本Ａを照明することができる。
［第４の実施の形態］
（構成）
図７は、本発明の第４の実施の形態を示す。本実施の形態は第３の実施の形態（図６参照）の顕微鏡観察装置５１の変形例である。本実施形態の説明において、上述した第１〜３の実施形態に係る顕微鏡観察装置１、４１、５１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態の顕微鏡観察装置６１では、第３の実施の形態のレーザ光分割手段である励起光分割部材５３が生体標本Ａを収容する容器８内の培養液の液面に接するように配置され、図示しない支持部材によって支持されている。さらに、観察部４の観察光学系１８は、容器８の下側に配置され、倒立顕微鏡の様式の顕微鏡観察装置が構成されている。これにより、観察光学系１８を容器８の下面から観察するようにしている。

（作用）
次に、上記構成の作用について説明する。本実施の形態の顕微鏡観察装置６１では、容器８内の培養液面が表面張力によって曲率を持つ場合でも、レーザ光を直線状に保つことができ、観察部４の観察光学系１８で取得する画像がゆがむことが無くなる。また、一般的に生体組織などの生体標本Ａの培養に使用されている容器８は、射出成型によって一体的に製造されていることが多く、そのような容器８の平面底８ａはレーザ光のような光束を正しく透過させることができない。このような場合でも、レーザ光を分割する励起光分割部材５３の平行平面板５２を容器８の平面底８ａとは異なる位置に設置することによって、生体標本Ａに照射されるレーザ光を正しく透過させることができる。

（効果）
そこで、上記構成の本実施の形態の顕微鏡観察装置６１によれば、第３実施形態と同様に直線状の励起光と励起光分割部材５３によって、レーザ光を分割することにより、容器８内の生体標本Ａの複数個所（本実施の形態では４箇所）を同時に照明することができるので、容器８内の生体標本Ａ全体の走査時間を短縮することができる。

また、励起光分割部材５３の第２の反射面５５は、反射率を暫減させている４つの反射域５５ａ、５５ｂ、５５ｃ、５５ｄを有する。そのため、分割したレーザ光の励起光強度を一定に保つことができるため、撮像される画像の明るさが一定になる。
さらに、上記第３実施形態と同様の効果に加え、容器８内の培養液の上面に励起光分割部材５３である平行平面板５２を配置することにより、容器８内の培養液表面の表面張力による液面形状が一定となるため、培養容器８の直径が小さくても、撮影した画像に歪みが発生しない。また、一般的に生体組織の培養に使用されている容器８は、射出成型によって一体的に製造されていることが多く、そのような容器８の平面底８ａはレーザ光のような光束を正しく透過させることができない。このような場合でも、レーザ光を分割する励起光分割部材５３である平行平面板５２を容器８の平面底８ａとは異なる位置に設置することによって、生体標本Ａに照射されるレーザ光を正しく透過させることができる。

［変形例］
（構成）
図８Ａ，８Ｂは、顕微鏡観察装置１の容器８の変形例を示す。本変形例は、円形皿の容器８に代えてマイクロプレート（多数の光透過性ウェルをマトリックス状に一体形成した多連型容器）７１を使用するものである。ここでは、容器本体７２の表面に標本Ａを収容する複数の凹部７３がマトリックス状に一体に形成されている。

さらに、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変形実施できることは勿論である。

本発明は、主に培養容器内で培養された生細胞や生体組織などの生体標本を光学的にセクショニングして撮像するための顕微鏡観察装置などに適用される撮像装置を使用する技術分野や、これを製造する技術分野に有効である。

５…光源装置、６…励起光照射部、Ａ…標本、８…容器、１１…走査装置（走査部）、１８…観察光学系、Ｏ１…観察光軸。

Claims (7)

1. 容器内に培養液とともに収容された標本に照明光を照射して前記標本を光学的にセクショニングして撮像する撮像装置であって、
   前記照明光である励起光の光束を出射する光源装置と、
   該光源装置からの励起光を前記標本に照射する励起光照射部と、
   容器内に配置した標本を観察する観察光学系と、
   前記励起光照射部からの励起光または前記容器側のうちのいずれか一方を走査する走査部と、を備え、
   前記励起光照射部からの励起光が該観察光学系の光軸と平行な方向に対して交差する状態で斜めの角度をなすように前記標本に入射されるように配置した
   ことを特徴とする撮像装置。
2. 前記励起光照射部は、前記光源装置からの励起光を複数に分割する励起光分割手段を有することを特徴とする請求項１に記載の撮像装置。
3. 前記励起光分割手段は、平行平面板の一方の面が１００％の反射率を有し、前記容器と非対向側に配置された第１の反射面、もう一方の面に前記容器と対向する側に配置された第２の反射面が形成され、
   前記第２の反射面は、反射回数をｉとし、照明光束分割数をｎとする場合に１／（ｎ＋１−ｉ）となる反射率を有する光反射部であることを特徴とする請求項２に記載の撮像装置。
4. 前記励起光分割手段は、前記容器内の培養液の表面側に前記励起光分割手段、前記容器の底面側に前記観察光学系がそれぞれ設置され、
   前記容器内に前記培養液とともに配置した標本を前記容器の底面側から撮像するようにしたことを特徴とする請求項２に記載の撮像装置。
5. 前記励起光分割手段は、前記励起光の分割数と同数のハーフミラーが前記光源装置からの励起光の光軸方向に並設されていることを特徴とする請求項２に記載の撮像装置。
6. 前記励起光分割手段からの複数の励起光の入射角度は、前記観察光学系の瞳に前記励起光が直接的に入射されることを防止できる角度であることを特徴とする請求項２に記載の撮像装置。
7. 前記走査部は、前記容器を前記観察光学系の光軸と直交する方向に走査する直線方向走査機構、または前記容器を前記観察光学系の光軸を中心に軸回り方向に回転させる方向に走査する回転方向走査機構のいずれか一方を有することを特徴とする請求項１に記載の撮像装置。

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