CN107209359B - 图像取得装置以及图像取得方法 - Google Patents

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Abstract

一种图像取得装置，具备：空间光调制器，调制照射光；控制部，以在观察对象物形成第1聚光点以及第2聚光点的方式控制调制图案；聚光光学系统，对上述照射光进行聚光；扫描部，在与上述聚光光学系统的光轴相交叉的扫描方向上扫描上述第1以及第2聚光点的位置；光检测器，检测从上述第1聚光点产生的第1观察光以及从上述第2聚光点产生的第2观察光；上述光检测器具有用于检测上述第1观察光的第1检测区域、用于检测上述第2观察光的第2检测区域，上述光轴的方向上的上述第1聚光点以及第2聚光点的位置互相不同。

Description

图像取得装置以及图像取得方法
技术领域
本发明的一个方面涉及图像取得装置以及图像取得方法。
背景技术
非专利文献1公开了使用了空间光调制器(Spatial LightModulator：SLM)的多光子吸收显微镜。该显微镜企图通过使用SLM并形成多个激发光光点(spot)来进行扫描，从而高速而且鲜明地取得观察对象物内的荧光图像。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利申请公开2012-226268号公报
非专利文献
非专利文献1：Wan Qin,Yonghong Shao,Honghai Liu,Xiang Peng,Hanben Niu,and Bruce Gao,“Addressable discrete-line-scanning multiphoton microscopybased on a spatial light modulator”,OPTICS LETTERS,Vol.37,No.5,pp.827-829,March 1,2012
发明内容
发明所要解决的技术问题
近年来，研究使用SLM来调制被照射于观察对象物的激发光或照明光等的光的技术。根据这样的技术，相对于观察对象物能够实现各种各样的照射光、例如具有平坦的强度分布的光或同时被照射于多个位置(光点)的光等。
在这样的技术中在将光同时照射于多个位置的情况下，在相对于照射光的光轴方向垂直的面内照射聚光位置不同的多个光点光的情况存在(例如参照非专利文献1)，但是在与光轴方向相平行的方向上、即在观察对象物的深度方向上同时照射聚光位置不同的多个光点光的技术至今为止完全没有被公开。如果能够在深度方向上使聚光位置不同的话则因为能够同时观察深度不同的多个部位，所以在观察对象物厚的情况等下能够缩短观察时间，另外具有能够取得深度不同的多个部位的同时刻的状况等的显著的优点。
本发明的一个方面的目的在于，提供一种能够在观察对象物的深度方向上同时照射聚光位置互相不同的多个光的图像取得装置以及图像取得方法。
解决问题的技术手段
本发明的一个实施方式的图像取得装置是一种取得观察对象物的图像的装置，具备：空间光调制器，调制从光源输出的照射光；控制部，以在观察对象物中形成第1聚光点以及第2聚光点的方式控制被呈现于空间光调制器的调制图案；聚光光学系统，为了将第1聚光点以及第2聚光点形成于观察对象物中而对被调制的照射光进行聚光；扫描部，在与聚光光学系统的光轴相交叉的扫描方向上扫描观察对象物中的第1聚光点以及第2聚光点的位置；光检测器，检测从第1聚光点产生的第1观察光以及从第2聚光点产生的第2观察光；图像制作部，使用来自光检测器的检测信号来制作观察对象物的图像。光检测器具有用于检测第1观察光的第1检测区域、用于检测第2观察光的第2检测区域。聚光光学系统的光轴的方向上的第1聚光点以及第2聚光点的位置互相不同。
另外，本发明的其它的实施方式的图像取得装置是一种取得观察对象物的图像的装置，具备：空间光调制器，调制从光源输出的照射光；控制部，以在观察对象物中形成第1聚光点以及第2聚光点的方式控制被呈现于空间光调制器的调制图案；聚光光学系统，为了将第1聚光点以及第2聚光点形成于观察对象物中而对被调制的照射光进行聚光；光检测器，检测从第1聚光点产生的第1观察光以及从第2聚光点产生的第2观察光；图像制作部，使用来自光检测器的检测信号来制作观察对象物的图像。调制图案包含用于在与聚光光学系统的光轴相交叉的扫描方向上扫描第1聚光点以及第2聚光点的图案。光检测器具有用于检测第1观察光的第1检测区域、用于检测第2观察光的第2检测区域。聚光光学系统的光轴的方向上的第1聚光点以及第2聚光点的位置互相不同。
另外，本发明的一个实施方式的图像取得方法是一种取得观察对象物的图像的方法，包含：将用于在观察对象物中形成第1聚光点以及第2聚光点的调制图案呈现于空间光调制器的步骤；为了将第1聚光点以及第2聚光点形成于观察对象物中而在空间光调制器上调制从光源输出的照射光并由聚光光学系统对被调制的照射光进行聚光的步骤；在与聚光光学系统的光轴相交叉的扫描方向上扫描观察对象物中的第1聚光点以及第2聚光点的位置并检测从第1聚光点产生的第1观察光以及从第2聚光点产生的第2观察光的步骤；使用由光检测步骤获得的检测信号来制作观察对象物的图像的步骤。在光检测步骤中使用具有用于检测第1观察光的第1检测区域、用于检测第2观察光的第2检测区域的光检测器。聚光光学系统的光轴的方向上的第1聚光点以及第2聚光点的位置互相不同。
在这些图像取得装置以及图像取得方法中，通过调制图案被呈现于空间光调制器从而就能够同时而且容易地形成光轴的方向(即观察对象物的深度方向)上的聚光位置互相不同的第1聚光点以及第2聚光点。于是，第1聚光点以及第2聚光点被扫描(scan)并且由光检测器检测在各个聚光点上产生的第1观察光以及第2观察光。光检测器因为具有用于检测第1观察光的第1检测区域和用于检测第2观察光的第2检测区域，所以能够同时检测发光位置互相不同的第1观察光以及第2观察光。这样，根据以上所述的各个图像取得装置以及图像取得方法，能够同时照射聚光位置在观察对象物的深度方向上互相不同的多个光，再有，能够同时检测发光位置在深度方向上互相不同的多个观察光。因此，在观察对象物厚的情况等下能够缩短观察时间，另外能够容易取得到深度不同的多个部位的同时刻的状况。
在以上所述的图像取得装置以及图像取得方法中，第1聚光点以及第2聚光点从光轴的方向来看也可以在扫描方向上进行排列。由此，例如通过检测从位于扫描方向后侧的聚光点产生的观察光从而就能够同时知晓由位于扫描方向前侧的聚光点而在与该聚光点不同的深度所产生的影响。
或者，在以上所述的图像取得装置以及图像取得方法中，第1聚光点以及第2聚光点从光轴的方向来看也可以在与扫描方向相交叉的第1方向上进行排列。在此情况下，第1方向既可以与扫描方向相垂直或者也可以相对于扫描方向倾斜。由此，例如能够同时观察由垂直于光轴方向的面内的不同位置的不同的深度而产生的现象。
在以上所述的图像取得装置中，扫描部既可以包含接收被调制的照射光的光扫描器或者也可以包含保持观察对象物并在扫描方向上使观察对象物移动的平台。同样，在以上所述的图像取得方法的光检测步骤中既可以使用接收被调制的照射光的光扫描器来进行第1聚光点以及第2聚光点的扫描，也可以使用保持观察对象物并在扫描方向上使观察对象物移动的平台来进行第1聚光点以及第2聚光点的扫描，或者也可以使用于扫描第1聚光点以及第2聚光点的图案重叠于调制图案。由这些的任意一者，能够扫描第1聚光点以及第2聚光点的位置。
在以上所述的图像取得装置以及图像取得方法中，光检测器既可以包含具有多个阳极的多阳极光电倍增管，或者也可以包含具有多个像素的区域图像传感器(area imagesensor)。由这些的任意一者，能够高精度地检测出第1以及第2观察光。
发明的效果
根据本发明的一个方面的图像取得装置以及图像取得方法，能够同时照射聚光位置在观察对象物的深度方向上互相不同的多个光。
附图说明
图1是表示本发明的一个实施方式所涉及的图像取得装置结构的示意图。
图2是概念性地表示观察对象物以及其附近的照射光的情况的示意图。
图3是概略性地表示从物镜的光轴方向看到的聚光点的排列方向的一个例子的示意图。
图4是概略性地表示从物镜的光轴方向看到的聚光点的排列方向的另一个例子的示意图。
图5是表示光检测器的光检测面的正面图。
图6是表示图像取得装置的动作的流程图。
图7是概念性地表示设定基准高度的情况的示意图。
图8是表示第1变形例的示意图，并且概念性地表示了观察对象物以及其附近的照射光的情况。
图9是表示第4变形例的聚光点的情况的示意图。
图10是表示第4变形例中的光检测器的光检测面的正面图。
图11是概念性地表示从照射光的光轴方向看到的聚光点的扫描的情况的示意图。
图12是概念性地表示从照射光的光轴方向看到的聚光点的扫描的情况的示意图。
图13表示聚光点的各个扫描区域中只切掉了共同的区域的图像。
图14表示聚光点的各个扫描区域中只切掉了共同的区域的图像。
具体实施方式
以下，参照附图，对本发明的一个方面的图像取得装置以及图像取得方法的实施方式进行详细的说明。还有，在附图的说明中将相同符号标注于相同要素，并省略重复的说明。
图1是表示本发明的一个实施方式所涉及的图像取得装置1A的结构的图。图像取得装置1A是一种用于将照射光L1照射于观察对象物B并且观察由此在观察对象物B上产生的观察光(被检测光)L2的装置。图像取得装置1A例如是显微镜装置。作为显微镜装置例如可以列举正立型显微镜或者倒立型显微镜。观察光L2例如是荧光、磷光、高频发生光(SHG)、反射光、透过光、散射光等。如图1所示，图像取得装置1A具备照射光生成单元10、扫描单元20、照射光学单元30、观察单元40以及控制单元50。
照射光生成单元10生成被照射于观察对象物B的照射光L1。本实施方式的照射光生成单元10具有光源11、光束扩展器12以及空间光调制器(Spatial Light Modulator：SLM)13。
光源11输出照射光L0。照射光L0例如包含应照射到观察对象物B的波长的光。光源11例如包含脉冲光振荡或连续波振荡的激光光源、SLD光源、或LED光源等来构成。光束扩展器12例如包含被排列配置于照射光L0的光轴上的多个透镜12a,12b来构成，调整相对于照射光L0的光轴垂直的截面的大小。还有，透镜12a,12b既可以是凸透镜也可以是凹透镜，也可以组合它们。
空间光调制器13与光源11光学性地结合，调制来自光源11的照射光L0，从而生成向观察对象物B进行照射的照射光L1。空间光调制器13具有被排列成二维的多个像素，按多个像素列的每列调制从光源11输出的照射光L0的强度或者相位。被呈现于空间光调制器13的调制图案(全息图(hologram))由后面所述的控制单元50来进行控制。空间光调制器13既可以是相位调制型的也可以是振幅(强度)调制型的。另外，空间光调制器13也可以是反射型以及透过型中的任何一种。另外，空间光调制器13也可以被设置多枚，在该情况下，照射光L0经多次被调制。
扫描单元20是本实施方式中的扫描部的例子。扫描单元20具有作为扫描光学系统的光扫描器21。光扫描器21光学性地与空间光调制器13相结合，接收被空间光调制器13调制的照射光L1。另外，光扫描器21扫描观察对象物B上的照射光L1的照射位置。再有，光扫描器21接收在观察对象物B的聚光点上发生的观察光L2。由此，观察光L2被除扫描(de-scan)。光扫描器21被后面所述的控制单元50控制。光扫描器21例如由电流镜(galvano mirror)、共振镜、MEMS镜、二维声光元件(AOM)或者多角镜(polygon mirror)等构成。还有，在光扫描器21为双轴扫描器的情况下，光扫描器21可以包含远心光学系统等图像传输光学系统。
还有，扫描单元20除了光扫描器21之外也可以进一步具有镜22。镜22为了光学性地结合光扫描器21和照射光学单元30而使照射光L1的光轴弯曲。
照射光学单元30将从扫描单元20提供的照射光L1照射于观察对象物B并且将来自观察对象物B的观察光L2输出到观察单元40。照射光学单元30具有平台31、物镜32、物镜移动机构33以及反射镜34。还有，作为反射镜34也可以使用分色镜。
平台31是用于支撑观察对象物B(或者容纳观察对象物B的载玻片或浅底皿、微型板、玻璃底皿等容器)的构件。平台31例如由玻璃构成。在图1所表示的例子中照射光L1从平台31的表面侧进行照射，但是，也可以是照射光L1从平台31的背面侧透过平台31而照射到观察对象物B。平台31在相对于后面所述的物镜32的光轴交叉(例如垂直)的面方向上能够进行移动。另外，也可以在物镜32的光轴方向上能够进行移动。
物镜32是与观察对象物B相对地配置并将照射光L1的聚光点形成于观察对象物B的内部的聚光光学系统。另外，物镜32接收在观察对象物B的该聚光点上发生的观察光L2并使观察光L2平行化。用于照射光L1的物镜和用于观察光L2的物镜也可以分开设置。例如，也可以是为了照射光L1而使用数值孔径(NA)高的物镜并通过由空间光调制器13得到的像差修正而被局部聚光。在此情况下，观察对象物B的表面以及/或者内部的像差量既可以通过实际测定来求得也可以由模拟等来推定求得。另外，也可以是为了观察光L2而使用瞳孔大的物镜来取出更多光。也可以是以夹着观察对象物B的方式配置用于照射光L1的物镜和用于观察光L2的物镜从而将照射光L1的观察对象物B中的透过光作为观察光L2来取得。
物镜移动机构33是用于在照射光L1的光轴方向上使物镜32移动的机构。物镜移动机构33例如由步进电机或者压电致动器等构成。
反射镜34向物镜32反射从照射光生成装置10到达照射光学装置30的照射光L1。另外，反射镜34朝向扫描装置20反射来自观察对象物B的观察光L2。
在物镜32与空间光调制器13的距离长的情况下，也可以将至少一个远心光学系统设置于照射光L1以及观察光L2的光轴上。作为一个例子，在图1中表示2个远心光学系统61以及62。远心光学系统61以及62具有将在空间光调制器13上生成的照射光L1的波阵面传输到物镜32的后侧焦点的作用。远心光学系统61以及62也可以是两侧远心光学系统。在此情况下，被配置于空间光调制器13与光扫描器21之间的远心光学系统61以成像于空间光调制器13的调制面和光扫描器21的扫描面的方式被调整。另外，被配置于光扫描器21与物镜32之间的远心光学系统62以成像于光扫描器21的扫描面和物镜32的瞳孔面的方式被调整。还有，远心光学系统61,62如果能够将在空间光调制器13上生成的照射光L1的波阵面传输到物镜32的后侧焦点的话则也可以是像侧远心光学系统或物体侧远心光学系统。另外，在物镜32与空间光调制器13的距离极其近的情况下，也可以省去远心光学系统。
观察单元40具有光检测器41、滤光片42以及聚光透镜43。光检测器41被光学性地结合于物镜32以及光扫描器21，接收观察光L2并检测观察光L2的光强度。光检测器41经由被设置于照射光生成单元10的分色镜14而光学性地与光扫描器21相结合。分色镜14被配置于接收被空间光调制器13调制的照射光L1以及被光扫描器21除扫描的观察光L2的位置，透过照射光L1的至少一部分并反射观察光L2的至少一部分。光检测器41检测观察光L2的光强度并输出检测信号Sd。光检测器41既可以由具有多个阳极的多阳极型的光电倍增管(Photomultiplier Tube：PMT)构成，或者，也可以由多个光电二极管被排列成阵列状来进行构成的光电二极管阵列或者多个雪崩光电二极管被排列成阵列状来进行构成的雪崩光电二极管阵列构成。或者，光检测器41也可以是CCD图像传感器、EM-CCD图像传感器、或者CMOS图像传感器等的具有多个像素的区域图像传感器(area image sensor)，另外，也可以是线传感器。特别是多阳极型的PMT，倍增率高并且其受光面大于其他的。
滤光片42被配置于分色镜14与光检测器41之间的光轴上。滤光片42从入射到光检测器416的光中将照射光L1的波长以及对于观察来说不需要的荧光等的波长截止。聚光透镜43被配置于光检测器41的正前方，朝着光检测器41对观察光L2进行聚光。还有，滤波片42也可以被配置于聚光透镜43的前段、后段的任一方。另外，在不需要滤波器42的情况下也可以不设置。
控制单元50控制照射光生成单元10、扫描单元20以及照射光学单元30。例如，控制单元50控制光源11、空间光调制器13以及光扫描器21。另外，例如控制单元50使用物镜移动机构33来控制物镜32的光轴方向的位置(高度)。另外，例如控制单元50使支撑观察对象物B的平台31在与光轴方向相交叉的方向上移动。控制单元50包含鼠标或键盘等的输入装置51、显示器等的显示装置52以及计算机53来构成。
另外，计算机53是本实施方式中的图像制作部的例子。计算机53例如是个人电脑或智能设备等，并具有图像处理电路(图像处理器)以及控制电路(控制处理器)、内部存储器。计算器53使用来自光检测器41的检测信号Sd以及光扫描器21中的光照射位置信息来制作观察对象物B的图像。被制作的图像被显示于显示装置52。另外，计算机53为本实施方式中的控制部(控制器)的例子。计算机53以在观察对象物B中形成所希望的聚光点的方式控制被呈现于空间光调制器13的调制图案(全息图)。计算机53通过控制被呈现于空间光调制器13的调制图案，从而由空间光调制器13的多个像素的每个像素控制强度或者相位的调制量。被制作的图像也可以被存储在计算机53的存储器或外部存储装置。
在此，对观察对象物B中的聚光点的形态进行详细的说明。图2是概念性地表示观察对象物B及其附近的照射光L1的情况的图。如图2所示，在本实施方式中，照射光L1由物镜32而被聚光于多个聚光点、即第1聚光点P1以及第2聚光点P2。还有，图中的假想线A1为表示物镜32的基准高度的基准线。
聚光点P1,P2具有如以下所述的位置关系。即，物镜32的光轴方向(换言之，观察对象物B的深度方向)上的聚光点P1,P2的位置互相不同。这是指来自物镜32的光轴和观察对象物B的表面相交的位置的第1聚光点P1的深度d1与第2聚光点P2的深度d2互不相同。
另外，与物镜32的光轴方向相垂直的某个方向上的聚光点P1,P2的位置也互相不同。换言之，从物镜32的光轴方向来看聚光点P1,P2互相不重叠，并且具有规定的间隔W。
图3是概略性地表示从物镜32的光轴方向看到的聚光点P1,P2的排列方向的一个例子的图。图3(a)表示聚光点P1,P2的扫描方向A2，图3(b)表示从照射光L1的光轴方向看到的聚光点P1,P2的由光扫描器21进行的扫描的情况。如图3(a)所示，在该例子中，从照射光L1的光轴方向看，聚光点P1,P2沿着扫描方向A2进行排列。另外，如图3(b)所示，对于由光扫描器21进行的扫描来说存在高速轴和低速轴，聚光点P1,P2重复在沿着高速轴移动之后在低速轴的方向上移动并再次沿着高速轴移动的动作。在该例子中，从照射光L1的光轴方向看到的聚光点P1,P2的排列方向沿着高速轴(即扫描方向)。还有，光扫描器21也可以以聚光点P1,P2一边沿着高速轴进行移动一边也在低速轴方向上进行移动的方式扫描聚光点P1,P2。另外，并不限定于线扫描，也可以是拼接扫描(tiling scan)。
另外，图4是概略性地表示从物镜32的光轴方向看到的聚光点P1,P2的排列方向的另一个例子的示意图。图4(a)表示聚光点P1,P2的扫描方向A3，图4(b)表示从照射光L1的光轴方向看到的聚光点P1,P2的由光扫描器21进行的扫描的情况。如图4(a)所示，在这个例子中从照射光L1的光轴方向来看，聚光点P1,P2沿着与扫描方向A3相交叉的方向A4(第1方向)进行排列。另外，如图4(b)所示，在这个例子中从照射光L1的光轴方向看到的聚光点P1,P2的排列方向A4沿着低速轴(即与扫描方向相交叉的轴)。方向A4例如与扫描方向A3相垂直，或者相对于扫描方向A3倾斜。
以如以上所述那样的位置关系形成的聚光点P1,P2由控制被呈现于空间光调制器13的调制图案的计算机53和物镜32来实现。计算机53以在观察对象物B中形成聚光点P1,P2的方式控制调制图案。于是，由接收调制后的照射光L1的物镜32来形成聚光点P1,P2。
图5是表示本实施方式的光检测器41的光检测面44的正面图。如图5所示，在光检测面44上形成从聚光点P1发生的观察光(第1观察光)的点像P3、从聚光点P2发生的观察光(第2观察光)的点像P4。光检测器41通过检测点像P3,P4各自的光强度从而检测第1以及第2观察光。还有，因为观察对象物B中的聚光点的深度越深则聚光点与物镜32的距离变得越长，所以到达光检测器41的观察光的光径变大。在本实施方式中因为聚光点P1被形成于深于聚光点P2的位置，所以在图5中来自聚光点P1的观察光的点像P3被图示成大于来自聚光点P2的观察光的点像P4。
另外，光检测器41包含多个光检测部44a。例如在光检测器41为多阳极PMT的情况下，光检测部44a相当于多阳极PMT的各个阳极。另外，例如在光检测器41为区域图像传感器的情况下，光检测部44a相当于一个像素或者像素组。另外，例如在光检测器41为光电二极管阵列(线传感器)的情况下，光检测部44a相当于各个光电二极管。
另外，光检测器41具有用于检测点像P3的第1检测区域45a、用于检测点像P4的第2检测区域45b。检测区域45a以及45b为互相独立的区域，分别包含一个或者多个光检测部44a来构成。在本实施方式中因为聚光点P1,P2的深度互相不同，所以被形成于平面即光检测面44的点像P3,P4的大小也互相不同。即，聚光点P1,P2的深度d1,d2越深则点像P3,P4变得越大。另外，在物镜32的焦点位置的图像以被成像于光检测面44的方式进行构成的情况下，因为物镜32的光轴方向上的物镜32的焦点位置与聚光点P1,P2的距离互相不同，所以被形成于平面即光检测面44的点像P3,P4的大小也互相不同。即，物镜32的光轴方向上的物镜32的焦点位置与聚光点P1,P2的距离越大则点像P3,P4变得越大。在点像P3,P4的尺寸大于光检测部44a的情况下可以将多个光检测部44a作为检测区域来进行设定。
图6是表示以上所述的图像取得装置1A的动作的流程图。参照图6，对本实施方式的图像取得方法进行说明。
首先，在将观察对象物B载置于平台31上之后，设定物镜32的基准高度(步骤S1)。在该步骤S1中，由物镜移动结构33或者平台31来调整物镜32与观察对象物B的距离并设定基准高度。图7是概念性地表示设定基准高度Z0的情况的示意图。例如，也可以以物镜32的焦点位置对准观察对象物B的表面的方式调整物镜32的高度并将该高度作为基准高度Z0。另外，也可以通过使平台31在物镜32的光轴方向上进行移动从而使物镜32的焦点位置对准观察对象物B的表面。计算机53存储该基准高度Z0。
接着，设定图2所表示的聚光点P1,P2的深度d1,d2(即取得图像的观察对象物B内部的深度)(步骤S2)。在该步骤S2中，观察者通过输入装置51设定要图像化的观察对象物B内部的深度(图2的深度d1,d2)。观察对象物B内部的深度既可以是实际距离也可以是光学距离。还有，也可以考虑物镜32与观察对象物B之间的介质(例如空气、水、油、甘油、硅酮等)的折射率以及/或者观察对象物B的折射率来计算深度d1,d2。例如，计算机53如果将平台31以及/或者物镜32的光轴方向上的移动量(实际距离)设定为d；将物镜32与观察对象物B之间的介质的折射率设定为na；将观察对象物B的折射率设定为nb的话则考虑实际的光学距离成为nb·d/na而计算深度d1,d2。另外，也可以将光学距离设定为d并考虑平台31以及/或者物镜32的光轴方向上的移动量成为na·d/nb。
接着，设定图2所表示的聚光点P1,P2的间隔W(步骤S3)。通过如以上所述在本实施方式中由物镜32来对被空间光调制器13调制的照射光L1进行聚光，从而将多个聚光点P1,P2形成于观察对象物B内部。如果多个聚光点P1,P2的间隔W狭窄的话则因为在光检测器41中点像P3,P4发生重叠并产生串扰，所以优选设定点像P3,P4不发生重叠的程度的适宜的间隔W。特别是如图5所示，因为聚光点P1,P2的深度d1,d2越深则点像P3,P4变得越大，所以为了防止串扰而可以是聚光点的深度越深则越增大间隔W。另外，例如也可以基于物镜32的数值孔径(NA)、物镜32与观察对象物B之间的介质的折射率、观察对象物B的折射率、照射光L1的波长等的参数来设定间隔W。
接着，制作调制图案(全息图)(步骤S4)。在该步骤S4中，根据在上述步骤S2,S3中被设定的聚光点P1,P2的间隔W以及深度d1,d2制作被呈现于空间光调制器13的计算机生成全息图(CGH)。还有，该步骤S4例如可以由计算机53来进行。另外，预先计算对应于深度d1,d2以及间隔W的CGH并作为表格保存于计算机53内部的存储单元，从而从中选择恰当的CGH。
接着，将在步骤S4中制作的CGH、即在观察对象物B中聚光点P1,P2被形成的那样的调制图案呈现于空间光调制器13(图案呈现步骤S5)。于是，通过在空间光调制器13中调制从光源11输出的照射光L0并由物镜32来对调制后的照射光L1进行聚光，从而将聚光点P1,P2形成于观察对象物B的深度d1,d2(聚光点形成步骤S6)。在步骤S5以及S6中，以聚光点P1,P2被形成于观察对象物B内部的深度d1,d2的方式调整物镜32与观察对象物B的距离。在此状态下，通过CGH被呈现于空间光调制器13，从而调制从光源11输出的照射光L0，调制后的照射光L1被物镜32聚光，第1聚光点P1以间隔W被形成于观察对象物B内部的深度d1的位置并且第2聚光点P2以间隔W被形成于观察对象物B内部的深度d2的位置。还有，也可以在调整了物镜32与观察对象物B的距离之后将CGH呈现于空间光调制器13，并由物镜32来对调制后的照射光L1进行聚光。
接着，进行聚光点P1,P2的扫描以及光检测(光检测步骤S7)。在该光检测步骤S7中，在与照射光L1的光轴相交叉的扫描方向上扫描观察对象物B内部的聚光点P1,P2的位置并检测从聚光点P1,P2产生的观察光L2。此时，观察光L2因为被光扫描器21除扫描，所以能够一边使聚光点P1,P2移动一边固定光检测器41上的观察光L2的点像P3,P4的位置来进行检测。从光检测器41将对应于各个点像P3,P4的检测信号Sd输出至计算机53。
接着，制作观察对象物B的图像(图像制作步骤S8)。在该图像制作步骤S8中，使用由光检测步骤S7获得的检测信号Sd(光强度信息)和由光扫描器21得到的光扫描位置信息(聚光点P1,P2的平面位置信息)并以计算机53制作观察对象物B的图像。还有，该图像制作步骤S8也可以与以上所述的光检测步骤S7并行来进行。
还有，在图像制作步骤S8中，对应于相对于扫描方向的聚光点P1,P2的排列方向，被取得的图像的特征不同。首先，在聚光点P1,P2的排列方向沿着扫描方向的情况下(参照图3)，聚光点P1有时间差地到达聚光点P2进行移动的痕迹的下部区域。在此情况下，因为由聚光点P1来观察由聚光点P2而被观察的区域的下部区域，所以能够从聚光点P1的图像了解到由聚光点P2引起的周围的影响。另外，也可以结合由聚光点P1获得的图像和由聚光点P2获得的图像来制作三维合成图像。
另外，在聚光点P1,P2的排列方向与扫描方向相交叉的情况(参照图4)下，即使不进行物镜32的移动也能够通过扫描聚光点P1来取得深度d1的图像，并且能够通过扫描聚光点P2来取得深度d2的图像。
对以上所说明的本实施方式的图像取得装置1A以及图像取得方法的效果进行说明。在本实施方式的图像取得装置以及图像取得方法中，通过将调制图案呈现于空间光调制器13从而就能够同时而且容易地形成照射光L1的光轴方向(即观察对象物B的深度方向)上的聚光位置互相不同的聚光点P1,P2。于是，聚光点P1,P2被扫描(scan)并且在各个聚光点P1,P2上产生的观察光L2在光检测器41上形成点像P3,P4，各个点像P3,P4的光强度被光检测器41检测。光检测器41因为具有用于检测在点像P3上的观察光L2的光强度的检测区域45a和用于检测在点像P4上的观察光L2的光强度的检测区域45b，所以能够同时检测发光位置互相不同的2个观察光L2。这样，根据本实施方式的图像取得装置1A以及图像取得方法，能够同时照射在观察对象物B的深度方向上聚光位置互相不同的多个照射光L1，再有，能够同时检测在深度方向上发光位置互相不同的多个观察光L2。因此，在观察对象物B厚的情况等下能够缩短观察时间，另外能够容易取得深度不同的多个部位的同时刻的状况。
关于观察时间的缩短能够列举具体例子来进行说明。作为光扫描器的一个例子可以列举使用了共振镜的光扫描器，但是共振镜的扫描速度大约为10kHz，高速轴的扫描时间为100μsec。在现有的显微镜装置中，有必要在1次扫描结束之后使物镜或者平台在光轴方向上移动从而在光轴方向上以不同的深度进行扫描。因此，为了扫描不同深度的区域而需要至少100μsec以上的时间。另外，使用了电流镜的光扫描器等其他光扫描器也扫描不同深度的区域而有必要使物镜或者平台在光轴方向上移动，所以需要相同程度的时间。因此，任一情况下，都难以同时观察不同深度的区域。另一方面，根据本实施方式的图像取得装置1A，由空间光调制器13而能够沿着例如高速轴生成光轴方向的位置不同的多个聚光点P1,P2，并且以一点点时间差就能够取得深度不同的部分的信息。因此，因为能够同时取得深度不同的部分的信息，所以进行深度不同的部分的比较等会变得简便。
另外，通过使用被呈现于空间光调制器13的调制图案来形成多个聚光点P1,P2，从而就能够容易聚光于垂直或者平行于照射光L1的光轴方向的方向上的所希望的位置，并且能够容易地改变聚光点数、位置、强度等。
另外，如图3所示，从照射光L1的光轴方向来看聚光点P1,P2也可以沿着扫描方向A2进行排列。由此，例如通过检测从位于扫描方向A2的后侧的聚光点P1产生的观察光L2，从而就能够基本上同时知晓由位于扫描方向A2的前侧的聚光点P2而在与该聚光点P2不同的深度产生的影响。
另外，如本实施方式所述，光检测器41既可以包含具有多个阳极的多阳极光电倍增管，或者也可以包含具有多个像素的区域图像传感器。由这些中的任意一者，能够分别在点像P3,P4上高精度地检测出观察光L2。
还有，本实施方式的图像取得装置特别能够被用于多光子激发荧光显微镜。其理由在下面进行说明。通常，对于液晶型的空间光调制器来说存在有偏振依赖性。因为荧光一般是非偏振光，所以为了使用液晶型的空间光调制器来实施相位控制而优选使用2枚空间光调制器来相对于2个偏振光方向进行相位控制。然而，一般来说液晶型的空间光调制器的反射率为90％左右，如果使用2枚空间光调制器的话则反射率成为81％。因此，恐怕会进一步减弱微弱的荧光。另一方面，在取代空间光调制器而使用可变形镜的情况下，对于可变形镜来说没有偏振依赖性。但是，具有从背面用多个致动器来推压1枚镜的结构的构件在相位的表现能力这一点上较为逊色，另外，镜以及致动器被配置成矩阵状的构件在反射率这一点上较为逊色。
在多光子激发荧光显微镜中，在聚光点附近的光子密度高的位置上特别会产生荧光。如果没有像差的影响而对激发光进行聚光的话则可以认为所产生的荧光只是聚光点附近的荧光。因此，如果只修正激发光的像差并观测所有所产生的荧光的话则基本上能够无视荧光侧的像差的影响。于是，没有必要将空间光调制器适用于观察光，所以不会发生以上所述问题，并且在多光子激发荧光显微镜中能够适宜使用空间光调制器。
(第1变形例)
图8是表示上述实施方式的第1变形例的示意图，并且概念性地表示了观察对象物B以及其附近的照射光L1的情况。如图8所示，在本变形例中将一个聚光点(例如聚光点P2)形成于物镜32的焦点位置。因此，物镜32与观察对象物B的距离与图2相比较变短。在此情况下，通过在物镜32的光轴方向上使物镜32以及/或者平台31移动，从而调整物镜32与观察对象物B的距离并使物镜32与一个聚光点的距离同物镜32的焦点距离相一致。还有，图中的假想线A1表示物镜32的基准高度。
如本变形例所述，通过调整物镜32与观察对象物B的距离从而实现聚光点P2的深度d2。在此情况下，在空间光调制器13上如果呈现单单聚光点P2被形成于物镜32的焦点距离的那样的调制图案的话即可，并且用于实现聚光点P2的深度d2的(换言之，用于从焦点距离使聚光点P2与物镜32的距离变化的)调制图案变得不需要。于是，在此情况下，为了实现聚光点P1的深度d1，计算机53可以根据照射光L1的光轴方向上的聚光点P1与聚光点P2的距离d3计算出(或者选择)用于实现聚光点P1的深度d1的调制图案。另外，使用者也可以直接将相对于基准高度Z0的物镜32的位置输入到计算机53。
(第2变形例)
在上述实施方式中由光扫描器21来扫描聚光点P1,P2，但是也可以通过在与光轴方向相交叉的面方向上使平台31移动从而扫描聚光点P1,P2。换言之，上述实施方式的扫描部也可以取代光扫描器21或者与光扫描器21一起包含平台31。即使是这样的结构也能够适宜扫描聚光点P1,P2。
(第3变形例)
在上述实施方式中由光扫描器21来扫描聚光点P1,P2，但是也可以在被呈现于空间光调制器13的调制图案上包含(重叠)用于扫描聚光点P1,P2的图案(光扫描全息图)。在此情况下，因为上述实施方式中的扫描部变得不再需要，所以能够削减图像取得装置1A的构成构件并且能够有助于小型化。
(第4变形例)
在上述实施方式中对将2个聚光点P1,P2形成于观察对象物B内部的情况进行了说明，但是也可以将3个以上的聚光点形成于观察对象物B内部。图9是表示上述实施方式的第4变形例的聚光点的情况的示意图。如图9所示在本变形例中将4个聚光点P5～P8形成于观察对象物B内部。聚光点P5～P8因为在照射光L1的光轴方向上的位置互相不同，所以自观察对象物B表面起的这些深度d5～d8互相不同。另外，从照射光L1的光轴方向来看，这些聚光点P5～P8互相空开一定间隔沿着扫描方向(图中的箭头A5～A8)进行排列。
在此，如图9所示，从照射光L1的光轴方向来看在扫描方向上聚光点P5～P8进行排列的情况下，聚光点不通过的区域(图中的B1,B2)产生于扫描方向上的观察对象物B的两端部。因此，例如也可以限定于所有聚光点P5～P8通过的区域B3来制作图像。具体来说，例如分别检测来自聚光点P5～P8的观察光并取得深度不同的图像，并从这些图像提取扫描范围共同的区域的图像。
另外，图10是表示本变形例中的光检测器46的光检测面47的正面图。如图10所示，在光检测面47上形成由发生于各个聚光点P5～P8的观察光形成的点像P9～P12。光检测器46通过检测点像P9～P12各自的光强度，从而检测多个观察光。还有，因为观察对象物B中的聚光点的深度越深则聚光点与物镜32的距离变得越长，所以到达光检测46的观察光的光径变大。在本实施方式中因为按聚光点P5～P8的顺序形成于深的位置，所以在图10中来自聚光点P5的观察光的点像P9为最大，且来自聚光点P8的观察光的点像P12为最小。
另外，光检测器46包含多个光检测部47a，并且具有用于分别检测点像P9～P12的检测区域48a～48d。检测区域48a～48d是互相独立的区域，并且分别包含一个或者多个光检测部47a来构成。
在此，对本变形例中的聚光点P5～P8的扫描方式进行说明。图11以及图12是概念性地表示从照射光L1的光轴方向看到的聚光点P5～P8的扫描的情况的示意图。例如，如图11(a)所示也可以沿着高速轴将聚光点P5～P8配置成一列。另外，如图11(b)所示也可以形成聚光点P5～P8的多个组，将观察对象物B分割成多个区域并且由一个组的聚光点P5～P8来扫描各个区域。另外，例如如图12所示也可以将观察对象物B分割成多个区域B11～B14并且由一个聚光点P5、P6、P7或者P8来扫描各个区域。
根据本变形例，与上述实施方式相同能够同时照射在观察对象物B的深度方向上聚光位置互相不同的多个照射光L1，再有，能够同时检测在深度方向上发光位置互相不同的多个观察光L2。因此，在观察对象物B厚的情况等下能够缩短观察时间，另外，能够容易地取得深度不同的多个部位的同时刻的状况。
还有，在本变形例中对4个聚光点P5～P8被形成的情况进行了例示，但是聚光点的个数通过控制被呈现于空间光调制器的调制图案从而就能够容易地进行变更。在此情况下，每一个聚光点的照射光强度如果将照射光L1的全光量设定为E；将聚光点的个数设定为N；将空间光调制器的效率设定为η的话则可以表示为(E/N)×η。空间光调制器的效率η是光利用率(入射光量中被用于相位调制的光量的比例)与衍射效率(能够衍射到所希望的位置的光量的比例。对应于被呈现于空间光调制器的全息图的空间频率来决定。)之积。因此，如果变更聚光点的个数N的话则每一个聚光点的照射光强度也会发生变化。因为如果各个聚光点的照射光强度发生变化的话则观察光强度也发生变化，所以恐怕块效应(blockiness)会发生于再构成图像。为了避免这样的问题，例如也可以设置用于测定观察光L2的各个点像的强度变化以及强度偏差的光学系统以及测定系统，并且反馈给光源11的光输出强度。或者，对应于聚光点的个数N来预测强度变化，在变更聚光点的个数N的时候使光源11的光输出强度变化。
(实施例)
在此，对上述实施方式的实施例进行说明。在本实施例中，作为观察对象物B，准备分别内包多个直径为3μm的荧光珠和直径为10μm的荧光珠的树脂。使用物镜(浸水40倍，NA1.15)来观察该树脂。在深度d5～d8的各个位置分别形成聚光点P5～P8，扫描这些聚光点P5～P8并取得图像。此时，多个聚光点P5～P8沿着相对于扫描方向垂直的方向进行排列。另外，深度d5～d8作为光学距离分别是d5＝15.0μm；d6＝11.25μm；d7＝7.5μm；d8＝3.75μm。
图13以及图14表示聚光点P5～P8的各个扫描区域中只切掉了共同的区域(图9的区域B3)的图像。图13(a)表示从聚光点P8获得的图像，图13(b)表示从聚光点P7获得的图像，图14(a)表示从聚光点P6获得的图像，图14(b)表示从聚光点P5获得的图像。在这些图像中，在下部中央附近存在有10μm的荧光珠，但是可知即使在任一深度也能够观察到该荧光珠。另外，遍布这些4个图像中的3个图像进行存在的那样的直径为3μm的荧光珠没有看到，所以可以认为深度方向的分辨率也能够充分确保。
产业上的利用可能性
能够同时照射在观察对象物的深度方向上聚光位置互相不同的多个光。
符号的说明
1A…图像取得装置、10…照射光生成单元、11…光源、12…光束扩展器、13…空间光调制器、14…分色镜、20…扫描单元、21…光扫描器、22…镜、30…照射光学单元、31…平台、32…物镜、33…物镜移动机、34…反射镜、40…观察单元、41…光检测器、42…滤光片、43…聚光透镜、44…光检测面、44a…光检测部、45a…第1检测区域、45b…第2检测区域、50…控制单元、51…输入装置、52…显示装置、53…计算机、61,62…远心光学系统、B…观察对象物、L0…照射光、L1…照射光、L2…观察光、P1…第1聚光点、P2…第2聚光点、P3,P4…点像、P5～P8…聚光点、P9～P12…点像。

Claims (37)

1.一种图像取得装置，其特征在于：
具备：
空间光调制器，调制从光源输出的照射光；
控制部，以在观察对象物中形成第1聚光点以及第2聚光点的方式控制被呈现于所述空间光调制器的调制图案；
聚光光学系统，为了将所述第1聚光点以及所述第2聚光点形成于所述观察对象物中而对被调制了的所述照射光进行聚光；
扫描部，在与所述聚光光学系统的光轴相交叉的扫描方向上扫描所述观察对象物中的所述第1聚光点以及所述第2聚光点的位置；
光检测器，检测利用多光子激发从所述第1聚光点产生的作为荧光的第1观察光以及利用多光子激发从所述第2聚光点产生的作为荧光的第2观察光；以及
图像制作部，使用来自所述光检测器的检测信号来制作所述观察对象物的图像，
所述光检测器具有用于检测所述第1观察光的第1检测区域、以及用于检测所述第2观察光的第2检测区域，
所述第1检测区域和所述第2检测区域是互相独立的区域，
所述光轴的方向上的所述第1聚光点以及所述第2聚光点的位置互相不同，
所述光检测器的光检测面具有多个光检测部，根据所述第1观察光的点像的大小，调整对应于所述第1检测区域的所述光检测部的数量，根据所述第2观察光的点像的大小，调整对应于所述第2检测区域的所述光检测部的数量。
2.如权利要求1所述的图像取得装置，其特征在于：
从所述光轴的方向看，所述第1聚光点以及所述第2聚光点在所述扫描方向上进行排列。
3.如权利要求1所述的图像取得装置，其特征在于：
从所述光轴的方向看，所述第1聚光点以及所述第2聚光点在与所述扫描方向相交叉的第1方向上进行排列。
4.如权利要求3所述的图像取得装置，其特征在于：
所述第1方向与所述扫描方向相垂直。
5.如权利要求3所述的图像取得装置，其特征在于：
所述第1方向相对于所述扫描方向倾斜。
6.如权利要求1～5中任意一项所述的图像取得装置，其特征在于：
所述扫描部包含接收被调制了的所述照射光的光扫描器。
7.如权利要求1～5中任意一项所述的图像取得装置，其特征在于：
所述扫描部包含保持所述观察对象物并在所述扫描方向上使所述观察对象物移动的平台。
8.如权利要求1～5中任意一项所述的图像取得装置，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个阳极的多阳极光电倍增管。
9.如权利要求6所述的图像取得装置，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个阳极的多阳极光电倍增管。
10.如权利要求7所述的图像取得装置，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个阳极的多阳极光电倍增管。
11.如权利要求1～5中任意一项所述的图像取得装置，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个像素的区域图像传感器。
12.如权利要求6所述的图像取得装置，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个像素的区域图像传感器。
13.如权利要求7所述的图像取得装置，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个像素的区域图像传感器。
14.如权利要求1～5中任意一项所述的图像取得装置，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个雪崩光电二极管的雪崩光电二极管阵列。
15.如权利要求6所述的图像取得装置，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个雪崩光电二极管的雪崩光电二极管阵列。
16.如权利要求7所述的图像取得装置，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个雪崩光电二极管的雪崩光电二极管阵列。
17.一种图像取得装置，其特征在于：
具备：
空间光调制器，调制从光源输出的照射光；
控制部，以在观察对象物中形成第1聚光点以及第2聚光点的方式控制被呈现于所述空间光调制器的调制图案；
聚光光学系统，为了将所述第1聚光点以及所述第2聚光点形成于所述观察对象物中而对被调制了的所述照射光进行聚光；
光检测器，检测利用多光子激发从所述第1聚光点产生的作为荧光的第1观察光以及利用多光子激发从所述第2聚光点产生的作为荧光的第2观察光；以及
图像制作部，使用来自所述光检测器的检测信号来制作所述观察对象物的图像，
所述调制图案包含用于在与所述聚光光学系统的光轴相交叉的扫描方向上扫描所述第1聚光点以及所述第2聚光点的图案，
所述光检测器具有用于检测所述第1观察光的第1检测区域、以及用于检测所述第2观察光的第2检测区域，
所述第1检测区域和所述第2检测区域是互相独立的区域，
所述光轴的方向上的所述第1聚光点以及所述第2聚光点的位置互相不同，
所述光检测器的光检测面具有多个光检测部，根据所述第1观察光的点像的大小，调整对应于所述第1检测区域的所述光检测部的数量，根据所述第2观察光的点像的大小，调整对应于所述第2检测区域的所述光检测部的数量。
18.一种图像取得方法，其特征在于：
包含：
图案呈现步骤，将用于在观察对象物中形成第1聚光点以及第2聚光点的调制图案呈现于空间光调制器；
聚光点形成步骤，为了将所述第1聚光点以及所述第2聚光点形成于观察对象物中，在所述空间光调制器中调制从光源输出的照射光并由聚光光学系统对被调制了的所述照射光进行聚光；
光检测步骤，在与所述聚光光学系统的光轴相交叉的扫描方向上扫描所述观察对象物中的所述第1聚光点以及所述第2聚光点的位置并检测利用多光子激发从所述第1聚光点产生的作为荧光的第1观察光以及利用多光子激发从所述第2聚光点产生的作为荧光的第2观察光；以及
图像制作步骤，使用由所述光检测步骤获得的检测信号来制作所述观察对象物的图像，
在所述光检测步骤中，使用具有用于检测所述第1观察光的第1检测区域、以及用于检测所述第2观察光的第2检测区域的光检测器，
所述第1检测区域和所述第2检测区域是互相独立的区域，
所述光轴的方向上的所述第1聚光点以及所述第2聚光点的位置互相不同，
所述光检测器的光检测面具有多个光检测部，根据所述第1观察光的点像的大小，调整对应于所述第1检测区域的所述光检测部的数量，根据所述第2观察光的点像的大小，调整对应于所述第2检测区域的所述光检测部的数量。
19.如权利要求18所述的图像取得方法，其特征在于：
从所述光轴的方向看，所述第1聚光点以及所述第2聚光点在所述扫描方向上进行排列。
20.如权利要求18所述的图像取得方法，其特征在于：
从所述光轴的方向看，所述第1聚光点以及所述第2聚光点在与所述扫描方向相交叉的第1方向上进行排列。
21.如权利要求20所述的图像取得方法，其特征在于：
所述第1方向与所述扫描方向相垂直。
22.如权利要求20所述的图像取得方法，其特征在于：
所述第1方向相对于所述扫描方向倾斜。
23.如权利要求18～22中任意一项所述的图像取得方法，其特征在于：
在所述光检测步骤中，使用接收被调制了的所述照射光的光扫描器来进行所述第1聚光点以及所述第2聚光点的扫描。
24.如权利要求18～22中任意一项所述的图像取得方法，其特征在于：
在所述光检测步骤中，使用保持所述观察对象物并在所述扫描方向上使所述观察对象物移动的平台来进行所述第1聚光点以及所述第2聚光点的扫描。
25.如权利要求18～22中任意一项所述的图像取得方法，其特征在于：
在所述光检测步骤中，将用于扫描所述第1聚光点以及所述第2聚光点的图案重叠于所述调制图案。
26.如权利要求18～22中任意一项所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个阳极的多阳极光电倍增管。
27.如权利要求23所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个阳极的多阳极光电倍增管。
28.如权利要求24所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个阳极的多阳极光电倍增管。
29.如权利要求25所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个阳极的多阳极光电倍增管。
30.如权利要求18～22中任意一项所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个像素的区域图像传感器。
31.如权利要求23所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个像素的区域图像传感器。
32.如权利要求24所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个像素的区域图像传感器。
33.如权利要求25所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个像素的区域图像传感器。
34.如权利要求18～22中任意一项所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个雪崩光电二极管的雪崩光电二极管阵列。
35.如权利要求23所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个雪崩光电二极管的雪崩光电二极管阵列。
36.如权利要求24所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个雪崩光电二极管的雪崩光电二极管阵列。
37.如权利要求25所述的图像取得方法，其特征在于：
所述光检测器包含具有多个雪崩光电二极管的雪崩光电二极管阵列。
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