JP6539052B2 - 画像取得装置および画像取得方法 - Google Patents

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Description

本発明は、画像取得装置および画像取得方法に関する。
非特許文献１は、空間光変調器（Spatial Light Modulator；ＳＬＭ）を用いた多光子吸収顕微鏡を開示する。この顕微鏡は、ＳＬＭを用いて、複数の励起光スポットを形成して走査することにより、観察対象物内の蛍光画像を高速に且つ鮮明に取得することを企図している。
特開２０１２−２２６２６８号公報
Wan Qin, Yonghong Shao, Honghai Liu, Xiang Peng, Hanben Niu, andBruce Gao, "Addressable discrete-line-scanning multiphoton microscopy based ona spatial light modulator", OPTICS LETTERS, Vol. 37, No. 5, pp.827-829, March1, 2012
近年、観察対象物に照射される励起光や照明光といった光を、ＳＬＭを用いて変調する技術が研究されている。このような技術によれば、観察対象物に対して様々な照射光、例えば平坦な強度分布を有する光や複数の位置（スポット）に同時に照射される光などを実現することができる。
このような技術において複数の位置に同時に光を照射する場合、照射光の光軸方向に対して垂直な面内において集光位置が異なる複数のスポット光を照射するものは存在するが（例えば非特許文献１を参照）、光軸方向と平行な方向、すなわち観察対象物の深さ方向において集光位置が異なる複数のスポット光を同時に照射する技術はこれまで何ら開示されていない。集光位置を深さ方向に異ならせることができれば、深さが異なる複数の箇所を同時に観察することが可能となるので、観察対象物が厚い場合などにおいて観察時間を短縮でき、また深さが異なる複数の箇所の同時刻における状況を取得できる等の顕著な利点がある。
本発明は、観察対象物の深さ方向において集光位置が互いに異なる複数の光を同時に照射することができる画像取得装置および画像取得方法を提供することを目的とする。
本発明の一実施形態による画像取得装置は、観察対象物の画像を取得する装置であって、光源から出力された照射光を変調する空間光変調器と、観察対象物において第１の集光点および第２の集光点が形成されるように、空間光変調器に呈示される変調パターンを制御する制御部と、観察対象物中に第１の集光点および第２の集光点を形成するために、変調された照射光を集光する集光光学系と、集光光学系の光軸と交差する走査方向に、観察対象物中の第１の集光点および第２の集光点の位置を走査する走査部と、多光子励起により第１の集光点から生じた蛍光である第１の観察光、及び多光子励起により第２の集光点から生じた蛍光である第２の観察光を検出する光検出器と、光検出器からの検出信号を用いて観察対象物の画像を作成する画像作成部とを備える。光検出器は、第１の観察光を検出するための第１の検出領域と、第２の観察光を検出するための第２の検出領域とを有する。第１の検出領域と第２の検出領域とは互いに独立した領域である。集光光学系の光軸の方向における第１の集光点および第２の集光点の位置は互いに異なる。
また、本発明の別の実施形態による画像取得装置は、観察対象物の画像を取得する装置であって、光源から出力された照射光を変調する空間光変調器と、観察対象物において第１の集光点および第２の集光点が形成されるように、空間光変調器に呈示される変調パターンを制御する制御部と、観察対象物中に第１の集光点および第２の集光点を形成するために、変調された照射光を集光する集光光学系と、多光子励起により第１の集光点から生じた蛍光である第１の観察光、及び多光子励起により第２の集光点から生じた蛍光である第２の観察光を検出する光検出器と、光検出器からの検出信号を用いて観察対象物の画像を作成する画像作成部とを備える。変調パターンは、集光光学系の光軸と交差する走査方向に第１の集光点および第２の集光点を走査するためのパターンを含む。光検出器は、第１の観察光を検出するための第１の検出領域と、第２の観察光を検出するための第２の検出領域とを有する。第１の検出領域と第２の検出領域とは互いに独立した領域である。集光光学系の光軸の方向における第１の集光点および第２の集光点の位置は互いに異なる。
また、本発明の一実施形態による画像取得方法は、観察対象物の画像を取得する方法であって、観察対象物において第１の集光点および第２の集光点を形成するための変調パターンを空間光変調器に呈示するステップと、観察対象物中に第１の集光点および第２の集光点を形成するために、光源から出力された照射光を空間光変調器において変調し、変調された照射光を集光光学系により集光するステップと、集光光学系の光軸と交差する走査方向に、観察対象物中の第１の集光点および第２の集光点の位置を走査しつつ、多光子励起により第１の集光点から生じた蛍光である第１の観察光、及び多光子励起により第２の集光点から生じた蛍光である第２の観察光を検出するステップと、光検出ステップにより得られた検出信号を用いて観察対象物の画像を作成するステップとを含む。光検出ステップでは、第１の観察光を検出するための第１の検出領域と、第２の観察光を検出するための第２の検出領域とを有する光検出器を用いる。第１の検出領域と第２の検出領域とは互いに独立した領域である。集光光学系の光軸の方向における第１の集光点および第２の集光点の位置は互いに異なる。
これらの画像取得装置および画像取得方法では、変調パターンが空間光変調器に呈示されることにより、光軸の方向（すなわち観察対象物の深さ方向）における集光位置が互いに異なる第１の集光点および第２の集光点を同時に且つ容易に形成することができる。そして、第１の集光点および第２の集光点が走査（スキャン）されるとともに、各集光点において生じた第１の観察光および第２の観察光が光検出器によって検出される。光検出器は、第１の観察光を検出するための第１の検出領域と、第２の観察光を検出するための第２の検出領域とを有するので、発光位置が互いに異なる第１の観察光および第２の観察光を同時に検出することができる。このように、上記の各画像取得装置および画像取得方法によれば、観察対象物の深さ方向において集光位置が互いに異なる複数の光を同時に照射することができ、更に、深さ方向において発光位置が互いに異なる複数の観察光を同時に検出することができる。従って、観察対象物が厚い場合などにおいて観察時間を短縮でき、また深さが異なる複数の箇所の同時刻における状況を容易に取得できる。
上記の画像取得装置および画像取得方法において、光軸の方向から見て第１の集光点および第２の集光点は走査方向に並んでいてもよい。これにより、例えば、走査方向前側に位置する集光点により該集光点とは異なる深さにて生じる影響を、走査方向後側に位置する集光点から生じる観察光を検出することによって同時に知ることができる。
或いは、上記の画像取得装置および画像取得方法において、光軸の方向から見て第１の集光点および第２の集光点は走査方向と交差する第１の方向に並んでいてもよい。この場合、第１の方向は、走査方向と直交してもよく、或いは走査方向に対して傾斜してもよい。これにより、例えば、光軸方向に直交する面内の異なる位置の異なる深さによって生じる現象を同時に観察することができる。
上記の画像取得装置において、走査部は、変調された照射光を受ける光スキャナを含んでもよく、或いは、観察対象物を保持しつつ走査方向に観察対象物を移動させるステージを含んでもよい。同様に、上記の画像取得方法の光検出ステップでは、変調された照射光を受ける光スキャナを用いて第１の集光点および第２の集光点の走査を行ってもよく、観察対象物を保持しつつ走査方向に観察対象物を移動させるステージを用いて第１の集光点および第２の集光点の走査を行ってもよく、或いは、第１の集光点および第２の集光点を走査するためのパターンを変調パターンに重畳させてもよい。これらの何れかによって、第１の集光点および第２の集光点の位置を好適に走査することができる。
上記の画像取得装置および画像取得方法において、光検出器は、複数のアノードを有するマルチアノード光電子増倍管を含んでもよく、或いは、複数の画素を有するエリアイメージセンサを含んでもよい。これらの何れかによって、第１および第２の観察光を精度良く検出することができる。
本発明による画像取得装置および画像取得方法によれば、観察対象物の深さ方向において集光位置が互いに異なる複数の光を同時に照射することができる。
図１は、本発明の一実施形態に係る画像取得装置の構成を示す図である。 図２は、観察対象物及びその近傍における照射光の様子を概念的に示す図である。 図３は、対物レンズの光軸方向から見た集光点の並び方向の一例を概略的に示す図である。 図４は、対物レンズの光軸方向から見た集光点の並び方向の別の例を概略的に示す図である。 図５は、光検出器の光検出面を示す正面図である。 図６は、画像取得装置の動作を示すフローチャートである。 図７は、基準高さを設定する様子を概念的に示す図である。 図８は、第１変形例を示す図であって、観察対象物及びその近傍における照射光の様子を概念的に示している。 図９は、第４変形例による集光点の様子を示す図である。 図１０は、第４変形例における光検出器の光検出面を示す正面図である。 図１１は、照射光の光軸方向から見た集光点の走査の様子を概念的に示す図である。 図１２は、照射光の光軸方向から見た集光点の走査の様子を概念的に示す図である。 図１３は、集光点の各走査領域のうち共通の領域のみを切り抜いた画像を示す。 図１４は、集光点の各走査領域のうち共通の領域のみを切り抜いた画像を示す。
以下、添付図面を参照しながら本発明による画像取得装置および画像取得方法の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
図１は、本発明の一実施形態に係る画像取得装置１Ａの構成を示す図である。画像取得装置１Ａは、観察対象物Ｂに照射光Ｌ１を照射し、これにより観察対象物Ｂにおいて生じる観察光（被検出光）Ｌ２を観察するための装置である。画像取得装置１Ａは、例えば顕微鏡装置である。観察光Ｌ２は、例えば蛍光、りん光、高周波発生光（ＳＨＧ）、反射光、透過光、散乱光などである。図１に示されるように、画像取得装置１Ａは、照射光生成ユニット１０、走査ユニット２０、照射光学ユニット３０、観察ユニット４０、及び制御ユニット５０を備えている。
照射光生成ユニット１０は、観察対象物Ｂに照射される照射光Ｌ１を生成する。本実施形態の照射光生成ユニット１０は、光源１１、ビームエキスパンダ１２、及び空間光変調器（Spatial Light Modulator：ＳＬＭ）１３を有する。
光源１１は、照射光Ｌ０を出力する。照射光Ｌ０は、例えば観察対象物Ｂに照射すべき波長の光を含む。光源１１は、例えばパルス光発振や連続波発振のレーザ光源、ＳＬＤ光源、或いはＬＥＤ光源等を含んで構成される。ビームエキスパンダ１２は、例えば照射光Ｌ０の光軸上に並んで配置された複数のレンズ１２ａ，１２ｂを含んで構成され、照射光Ｌ０の光軸に対して垂直な断面の大きさを調整する。なお、レンズ１２ａ，１２ｂは、凸レンズでも凹レンズでもよく、それらを組わせてもよい。
空間光変調器１３は、光源１１と光学的に結合されており、光源１１からの照射光Ｌ０を変調することにより、観察対象物Ｂへ照射される照射光Ｌ１を生成する。空間光変調器１３に呈示される変調パターン（ホログラム）は、後述する制御ユニット５０によって制御される。空間光変調器１３は、位相変調型でも良いし、振幅（強度）変調型でも良い。また、空間光変調器１３は、反射型及び透過型の何れであってもよい。また、空間光変調器１３は複数枚設けられてもよく、その場合、照射光Ｌ０は複数回にわたって変調される。
走査ユニット２０は、本実施形態における走査部の例である。走査ユニット２０は、走査光学系としての光スキャナ２１を有する。光スキャナ２１は、空間光変調器１３と光学的に結合されており、空間光変調器１３によって変調された照射光Ｌ１を受ける。また、光スキャナ２１は、観察対象物Ｂにおける照射光Ｌ１の照射位置を走査する。さらに、光スキャナ２１は、観察対象物Ｂの集光点において発生する観察光Ｌ２を受ける。これにより、観察光Ｌ２はデスキャンされる。光スキャナ２１は、後述する制御ユニット５０によって制御される。光スキャナ２１は、例えばガルバノミラー、共振ミラー、ＭＥＭＳミラー、２次元音響光学素子（ＡＯＭ）若しくはポリゴンミラー等によって構成される。なお、光スキャナ２１が二軸スキャナである場合、光スキャナ２１はテレセントリック光学系などの像転送光学系を含むことが好ましい。
なお、走査ユニット２０は、光スキャナ２１に加えて、ミラー２２を更に有してもよい。ミラー２２は、光スキャナ２１と照射光学ユニット３０とを光学的に結合させるために、照射光Ｌ１の光軸を屈曲させる。
照射光学ユニット３０は、走査ユニット２０から提供される照射光Ｌ１を観察対象物Ｂに照射するとともに、観察対象物Ｂからの観察光Ｌ２を観察ユニット４０へ出力する。照射光学ユニット３０は、ステージ３１、対物レンズ３２、対物レンズ移動機構３３、及び反射ミラー３４を有する。
ステージ３１は、観察対象物Ｂ（若しくは観察対象物Ｂを収容するスライドガラスやシャーレ、マイクロプレートなどの容器）を支持するための部材である。ステージ３１は、例えばガラスからなる。図１に示された例では照射光Ｌ１はステージ３１の表面側から照射されるが、照射光Ｌ１はステージ３１の裏面側からステージ３１を透過して観察対象物Ｂに照射されてもよい。ステージ３１は、後述する対物レンズ３２の光軸に対して交差（たとえば直交）する面方向に移動可能である。また、対物レンズ３２の光軸方向に移動可能であってもよい。
対物レンズ３２は、観察対象物Ｂと対向して配置され、観察対象物Ｂの内部に照射光Ｌ１の集光点を形成する集光光学系である。また、対物レンズ３２は、観察対象物Ｂの該集光点において発生した観察光Ｌ２を受け、観察光Ｌ２を平行化する。照射光Ｌ１のための対物レンズと観察光Ｌ２のための対物レンズとは別個に設けられてもよい。例えば、照射光Ｌ１のために開口数（ＮＡ）が高い対物レンズを用い、空間光変調器１３による収差補正により局所的に集光させてもよい。この場合、観察対象物Ｂの表面及び／又は内部の収差量は、実際に測定しても求められてもよいし、シミュレーション等により推定して求められてもよい。また、観察光Ｌ２のために瞳の大きな対物レンズを用い、より多くの光を取り出せるようにしてもよい。照射光Ｌ１のための対物レンズと観察光Ｌ２のための対物レンズとを観察対象物Ｂを挟むように配置して、照射光Ｌ１の観察対象物Ｂにおける透過光を観察光Ｌ２として取得してもよい。
対物レンズ移動機構３３は、対物レンズ３２を照射光Ｌ１の光軸方向に移動させるための機構である。対物レンズ移動機構３３は、例えばステッピングモータ若しくはピエゾアクチュエータ等によって構成される。
反射ミラー３４は、照射光生成ユニット１０から照射光学ユニット３０に到達した照射光Ｌ１を、対物レンズ３２へ向けて反射する。また、反射ミラー３４は、観察対象物Ｂからの観察光Ｌ２を走査ユニット２０に向けて反射する。
対物レンズ３２と空間光変調器１３との距離が長い場合には、照射光Ｌ１及び観察光Ｌ２の光軸上に少なくとも一つのテレセントリック光学系が設けられてもよい。一例として、図１には２つのテレセントリック光学系６１及び６２が示されている。テレセントリック光学系６１及び６２は、空間光変調器１３において生成された照射光Ｌ１の波面を対物レンズ３２の後側焦点へ転送する役割を有する。テレセントリック光学系６１及び６２は、両側テレセントリック光学系であることが好ましい。この場合、空間光変調器１３と光スキャナ２１との間に配置されるテレセントリック光学系６１は、空間光変調器１３の変調面と光スキャナ２１の走査面とに結像するように調整される。また、光スキャナ２１と対物レンズ３２との間に配置されるテレセントリック光学系６２は、光スキャナ２１の走査面と対物レンズ３２の瞳面とに結像するように調整される。なお、テレセントリック光学系６１，６２は、空間光変調器１３にて生成された照射光Ｌ１の波面を対物レンズ３２の後側焦点へ転送可能であれば、像側テレセントリック光学系や物体側テレセントリック光学系であってもよい。また、対物レンズ３２と空間光変調器１３との距離が極めて近い場合には、テレセントリック光学系を省くことも可能である。
観察ユニット４０は、光検出器４１、フィルタ４２、及び集光レンズ４３を有する。光検出器４１は、対物レンズ３２及び光スキャナ２１に光学的に結合されており、観察光Ｌ２を受けて、観察光Ｌ２の光強度を検出する。光検出器４１は、照射光生成ユニット１０に設けられたダイクロイックミラー１４を介して光スキャナ２１と光学的に結合される。ダイクロイックミラー１４は、空間光変調器１３によって変調された照射光Ｌ１及び光スキャナ２１によってデスキャンされた観察光Ｌ２を受ける位置に配置され、照射光Ｌ１の少なくとも一部を透過し、観察光Ｌ２の少なくとも一部を反射する。光検出器４１は、観察光Ｌ２の光強度を検出し、検出信号Ｓｄを出力する。光検出器４１は、複数のアノードを有するマルチアノード型の光電子増倍管（Photomultiplier Tube；ＰＭＴ）によって構成されてもよく、または、フォトダイオード若しくはアバランシェフォトダイオードといったポイントセンサが複数個並んでアレイ状に構成されてもよい。或いは、光検出器４１は、ＣＣＤイメージセンサ、ＥＭ−ＣＣＤイメージセンサ、若しくはＣＭＯＳイメージセンサといった、複数の画素を有するエリアイメージセンサであってもよく、また、ラインセンサであってもよい。特に、マルチアノード型のＰＭＴは、増倍率が高く且つ受光面が他よりも大きいので好ましい。
フィルタ４２は、ダイクロイックミラー１４と光検出器４１との間の光軸上に配置される。フィルタ４２は、光検出器４１に入射する光から、照射光Ｌ１の波長、及び観察に不要な蛍光等の波長をカットする。集光レンズ４３は、光検出器４１との直前に配置され、観察光Ｌ２を光検出器４１に向けて集光する。なお、フィルタ４２は、集光レンズ４３の前段、後段のどちらに配置されてもよい。また、フィルタ４２が不要な場合は設けなくてもよい。
制御ユニット５０は、照射光生成ユニット１０、走査ユニット２０、及び照射光学ユニット３０を制御する。例えば、制御ユニット５０は、光源１１、空間光変調器１３、及び光スキャナ２１を制御する。また、例えば、制御ユニット５０は、対物レンズ移動機構３３を用いて対物レンズ３２の光軸方向の位置（高さ）を制御する。また、例えば、制御ユニット５０は、観察対象物Ｂを支持するステージ３１を光軸方向と交差する方向に移動させる。制御ユニット５０は、マウスやキーボードといった入力装置５１、ディスプレイといった表示装置５２、及びコンピュータ５３を含んで構成される。
また、コンピュータ５３は、本実施形態における画像作成部の例である。コンピュータ５３は、光検出器４１からの検出信号Ｓｄ、及び光スキャナ２１における光照射位置情報を用いて、観察対象物Ｂの画像を作成する。作成された画像は、表示装置５２に表示される。また、コンピュータ５３は、本実施形態における制御部の例である。コンピュータ５３は、観察対象物Ｂにおいて所望の集光点が形成されるように、空間光変調器１３に呈示される変調パターン（ホログラム）を制御する。作成された画像は、コンピュータ５３のメモリや外部記憶装置に記憶されてもよい。
ここで、観察対象物Ｂにおける集光点の態様について詳細に説明する。図２は、観察対象物Ｂ及びその近傍における照射光Ｌ１の様子を概念的に示す図である。図２に示されるように、本実施形態では、対物レンズ３２によって、照射光Ｌ１が、複数の集光点すなわち第１の集光点Ｐ１及び第２の集光点Ｐ２に集光される。なお、図中の仮想線Ａ１は、対物レンズ３２の基準高さを表す基準線である。
集光点Ｐ１，Ｐ２は、次のような位置関係を有する。すなわち、対物レンズ３２の光軸方向（言い換えれば、観察対象物Ｂの深さ方向）における集光点Ｐ１，Ｐ２の位置は、互いに異なる。これは、対物レンズ３２の光軸と観察対象物Ｂの表面とが交わる位置からの第１の集光点Ｐ１の深さｄ１と、第２の集光点Ｐ２の深さｄ２とが互いに異なることを意味する。
また、対物レンズ３２の光軸方向と垂直な或る方向における集光点Ｐ１，Ｐ２の位置もまた、互いに異なる。言い換えれば、対物レンズ３２の光軸方向から見て、集光点Ｐ１，Ｐ２は互いに重なっておらず、所定の間隔Ｗを有する。
図３は、対物レンズ３２の光軸方向から見た集光点Ｐ１，Ｐ２の並び方向の一例を概略的に示す図である。図３（ａ）は、集光点Ｐ１，Ｐ２の走査方向Ａ２を示し、図３（ｂ）は、照射光Ｌ１の光軸方向から見た集光点Ｐ１，Ｐ２の、光スキャナ２１による走査の様子を示す。図３（ａ）に示されるように、この例では、照射光Ｌ１の光軸方向から見て集光点Ｐ１，Ｐ２が走査方向Ａ２に沿って並んでいる。また、図３（ｂ）に示されるように、光スキャナ２１による走査には高速軸と低速軸とが存在し、集光点Ｐ１，Ｐ２は、高速軸に沿って移動したのち、低速軸の方向にシフトされて再び高速軸に沿って移動するという動作を繰り返す。この例では、照射光Ｌ１の光軸方向から見た集光点Ｐ１，Ｐ２の並び方向は、高速軸（すなわち走査方向）に沿っている。なお、光スキャナ２１は、集光点Ｐ１、Ｐ２が高速軸に沿って移動しながら、低速軸方向にも移動するように、集光点Ｐ１、Ｐ２を走査してもよい。
また、図４は、対物レンズ３２の光軸方向から見た集光点Ｐ１，Ｐ２の並び方向の別の例を概略的に示す図である。図４（ａ）は、集光点Ｐ１，Ｐ２の走査方向Ａ３を示し、図４（ｂ）は、照射光Ｌ１の光軸方向から見た集光点Ｐ１，Ｐ２の、光スキャナ２１による走査の様子を示す。図４（ａ）に示されるように、この例では、照射光Ｌ１の光軸方向から見て集光点Ｐ１，Ｐ２が走査方向Ａ３と交差する方向Ａ４（第１の方向）に沿って並んでいる。また、図４（ｂ）に示されるように、この例では、照射光Ｌ１の光軸方向から見た集光点Ｐ１，Ｐ２の並び方向Ａ４は、低速軸（すなわち走査方向と交差する軸）に沿っている。方向Ａ４は、例えば走査方向Ａ３と直交しており、或いは、走査方向Ａ３に対して傾斜している。
上記のような位置関係でもって形成される集光点Ｐ１，Ｐ２は、空間光変調器１３に呈示される変調パターンを制御するコンピュータ５３と、対物レンズ３２とによって実現される。コンピュータ５３は、観察対象物Ｂにおいて集光点Ｐ１，Ｐ２が形成されるように変調パターンを制御する。そして、変調後の照射光Ｌ１を受けた対物レンズ３２によって、集光点Ｐ１，Ｐ２が形成される。
図５は、本実施形態の光検出器４１の光検出面４４を示す正面図である。図５に示されるように、光検出面４４には、集光点Ｐ１から発生した観察光（第１の観察光）の点像Ｐ３と、集光点Ｐ２から発生した観察光（第２の観察光）の点像Ｐ４とが形成される。光検出器４１は、点像Ｐ３，Ｐ４それぞれの光強度を検出することにより、第１及び第２の観察光を検出する。なお、観察対象物Ｂにおける集光点の深さが深いほど、集光点と対物レンズ３２との距離が長くなるので、光検出器４１に達する観察光の光径が大きくなる。本実施形態では集光点Ｐ１が集光点Ｐ２よりも深い位置に形成されるので、図５では、集光点Ｐ１からの観察光の点像Ｐ３が、集光点Ｐ２からの観察光の点像Ｐ４よりも大きく図示されている。
また、光検出器４１は、複数の光検出部４４ａを含む。例えば光検出器４１がマルチアノードＰＭＴである場合、光検出部４４ａは、マルチアノードＰＭＴの各アノードに相当する。また、例えば光検出器４１がエリアイメージセンサである場合、光検出部４４ａは、一つの画素もしくは画素群に相当する。また、例えば光検出器４１がフォトダイオードアレイ（ラインセンサ）である場合、光検出部４４ａは、各フォトダイオードに相当する。
また、光検出器４１は、点像Ｐ３を検出するための第１の検出領域４５ａと、点像Ｐ４を検出するための第２の検出領域４５ｂとを有する。検出領域４５ａ及び４５ｂは、互いに独立した領域であって、それぞれ一又は複数の光検出部４４ａを含んで構成される。本実施形態では集光点Ｐ１，Ｐ２の深さが互いに異なることから、平面である光検出面４４に形成される点像Ｐ３，Ｐ４の大きさも互いに異なる。すなわち、集光点Ｐ１，Ｐ２の深さｄ１，ｄ２が深いほど点像Ｐ３，Ｐ４が大きくなる。また、対物レンズ３２の焦点位置の像が光検出面４４に結像されるように構成される場合、対物レンズ３２の光軸方向における対物レンズ３２の焦点位置と集光点Ｐ１、Ｐ２との距離が互いに異なることから、平面である光検出面４４に形成される点像Ｐ３，Ｐ４の大きさも互いに異なる。すなわち、対物レンズ３２の光軸方向における対物レンズ３２の焦点位置と集光点Ｐ１，Ｐ２の距離が大きいほど点像Ｐ３，Ｐ４が大きくなる。点像Ｐ３，Ｐ４の大きさが光検出部４４ａよりも大きい場合には、複数の光検出部４４ａを検出領域として設定するとよい。
図６は、上述した画像取得装置１Ａの動作を示すフローチャートである。図６を参照しながら、本実施形態による画像取得方法について説明する。
まず、ステージ３１上に観察対象物Ｂを載置したのち、対物レンズ３２の基準高さを設定する（ステップＳ１）。このステップＳ１では、対物レンズ移動機構３３またはステージ３１によって対物レンズ３２と観察対象物Ｂとの距離を調整し、基準高さを設定する。図７は、基準高さＺ０を設定する様子を概念的に示す図である。例えば、対物レンズ３２の焦点位置が観察対象物Ｂの表面に合うように対物レンズ３２の高さを調整し、その高さを基準高さＺ０としてもよい。また、ステージ３１を対物レンズ３２の光軸方向に移動させることにより、対物レンズ３２の焦点位置が観察対象物Ｂの表面に合うようにしてもよい。コンピュータ５３は、この基準高さＺ０を記憶する。
次に、図２に示された集光点Ｐ１，Ｐ２の深さｄ１，ｄ２（すなわち画像を取得する観察対象物Ｂ内部の深さ）を設定する（ステップＳ２）。このステップＳ２では、観察者が入力装置５１を介して、画像化したい観察対象物Ｂ内部の深さ（図２の深さｄ１、ｄ２）を設定する。観察対象物Ｂ内部の深さは、実距離であってもよいし、光学距離であってもよい。なお、対物レンズ３２と観察対象物Ｂとの間の媒体（例えば空気、水、オイル、グルセリン、シリコーンなど）の屈折率及び／又は観察対象物Ｂの屈折率を考慮して、深さｄ１，ｄ２を算出してもよい。例えば、コンピュータ５３は、ステージ３１及び／又は対物レンズ３２の光軸方向における移動量（実距離）をｄとし、対物レンズ３２と観察対象物Ｂとの間の媒体の屈折率をｎａ、観察対象物Ｂの屈折率をｎｂとすると、実際の光学距離がｎｂ・ｄ／ｎａとなることを考慮して、深さｄ１，ｄ２を算出する。また、光学距離をｄとして、ステージ３１及び／又は対物レンズ３２の光軸方向における移動量がｎａ・ｄ／ｎｂとなることを考慮してもよい。
続いて、図２に示された集光点Ｐ１，Ｐ２の間隔Ｗを設定する（ステップＳ３）。前述したように本実施形態では、空間光変調器１３により変調された照射光Ｌ１を対物レンズ３２により集光することによって、観察対象物Ｂ内部に複数の集光点Ｐ１，Ｐ２を形成する。複数の集光点Ｐ１，Ｐ２の間隔Ｗが狭いと、光検出器４１において点像Ｐ３，Ｐ４が重なりクロストークを生じてしまうので、点像Ｐ３，Ｐ４が重ならない程度の適切な間隔Ｗを設定することが望ましい。特に、図５に示されたように、集光点Ｐ１，Ｐ２の深さｄ１，ｄ２が深いほど点像Ｐ３，Ｐ４が大きくなるので、クロストークを防ぐために、集光点の深さが深いほど間隔Ｗを大きくするとよい。また、例えば、対物レンズ３２の開口数（ＮＡ）、対物レンズ３２と観察対象物Ｂとの間の媒体の屈折率、観察対象物Ｂの屈折率、照射光Ｌ１の波長といったパラメータを基に、間隔Ｗを設定してもよい。
続いて、変調パターン（ホログラム）を作成する（ステップＳ４）。このステップＳ４では、上記ステップＳ２，Ｓ３において設定された集光点Ｐ１，Ｐ２の間隔Ｗ及び深さｄ１，ｄ２に基づいて、空間光変調器１３に呈示される計算機ホログラム（ＣＧＨ）を作成する。なお、このステップＳ４は、例えばコンピュータ５３によって行われる。また、深さｄ１，ｄ２及び間隔Ｗに対応するＣＧＨを予め計算し、コンピュータ５３内部の記憶手段にテーブルとして保存しておき、その中から適切なＣＧＨを選択してもよい。
続いて、ステップＳ４において作成されたＣＧＨ、すなわち観察対象物Ｂにおいて集光点Ｐ１，Ｐ２が形成されるような変調パターンを、空間光変調器１３に呈示する（パターン呈示ステップＳ５）。そして、光源１１から出力された照射光Ｌ０を空間光変調器１３において変調し、変調後の照射光Ｌ１を対物レンズ３２により集光することによって、観察対象物Ｂの深さｄ１，ｄ２に集光点Ｐ１，Ｐ２を形成する（集光点形成ステップＳ６）。このステップＳ５及びＳ６では、観察対象物Ｂ内部の深さｄ１，ｄ２に集光点Ｐ１，Ｐ２が形成されるように、対物レンズ３２と観察対象物Ｂとの距離を調整する。この状態で、ＣＧＨが空間光変調器１３に呈示されることによって、光源１１から出力された照射光Ｌ０が変調され、対物レンズ３２により変調後の照射光Ｌ１が集光され、観察対象物Ｂ内部の深さｄ１の位置に第１の集光点Ｐ１が、深さｄ２の位置に第２の集光点Ｐ２が間隔Ｗでもって形成される。なお、対物レンズ３２と観察対象物Ｂとの距離を調整した後に、ＣＧＨを空間光変調器１３に呈示し、対物レンズ３２により変調後の照射光Ｌ１を集光してもよい。
続いて、集光点Ｐ１，Ｐ２の走査及び光検出を行う（光検出ステップＳ７）。この光検出ステップＳ７では、照射光Ｌ１の光軸と交差する走査方向に、観察対象物Ｂ内部の集光点Ｐ１，Ｐ２の位置を走査しつつ、集光点Ｐ１，Ｐ２から生じた観察光Ｌ２を検出する。このとき、観察光Ｌ２は光スキャナ２１によってデスキャンされるので、集光点Ｐ１，Ｐ２を移動させながらも、光検出器４１における観察光Ｌ２の点像Ｐ３，Ｐ４の位置を固定して検出することができる。光検出器４１からは、それぞれの点像Ｐ３，Ｐ４に対応した検出信号Ｓｄがコンピュータ５３に出力される。
続いて、観察対象物Ｂの画像を作成する（画像作成ステップＳ８）。この画像作成ステップＳ８では、光検出ステップＳ７により得られた検出信号Ｓｄ（光強度情報）と、光スキャナ２１による光走査位置情報（集光点Ｐ１，Ｐ２の平面位置情報）とを用いて、コンピュータ５３にて観察対象物Ｂの画像を作成する。なお、この画像作成ステップＳ８は、上記の光検出ステップＳ７と並行して行われてもよい。
なお、画像作成ステップＳ８では、走査方向に対する集光点Ｐ１，Ｐ２の並び方向に応じて、取得される画像の特徴が異なる。まず、集光点Ｐ１，Ｐ２の並び方向が走査方向に沿っている場合（図３を参照）には、集光点Ｐ２が移動した跡の下部領域に時間差をもって集光点Ｐ１が到達する。この場合、集光点Ｐ２により観察される領域の下部領域を集光点Ｐ１により観察することになるので、集光点Ｐ２による周囲の影響を、集光点Ｐ１の画像から知ることができる。また、集光点Ｐ１によって得られた画像と集光点Ｐ２によって得られた画像とを結合して、３次元の合成画像を作成してもよい。
また、集光点Ｐ１，Ｐ２の並び方向が走査方向と交差している場合（図４を参照）には、対物レンズ３２の移動を行わなくても、集光点Ｐ１を走査することによって深さｄ１の画像を取得することができ、集光点Ｐ２を走査することによって深さｄ２の画像を取得することができる。
以上に説明した本実施形態の画像取得装置１Ａ及び画像取得方法による効果について説明する。本実施形態の画像取得装置１Ａおよび画像取得方法では、変調パターンが空間光変調器１３に呈示されることにより、照射光Ｌ１の光軸方向（すなわち観察対象物Ｂの深さ方向）における集光位置が互いに異なる集光点Ｐ１，Ｐ２を同時に且つ容易に形成することができる。そして、集光点Ｐ１，Ｐ２が走査（スキャン）されるとともに、各集光点Ｐ１，Ｐ２において生じた観察光Ｌ２が光検出器４１おいて点像Ｐ３，Ｐ４を形成し、各点像Ｐ３，Ｐ４の光強度が光検出器４１によって検出される。光検出器４１は、点像Ｐ３での観察光Ｌ２の光強度を検出するための検出領域４５ａと、点像Ｐ４での観察光Ｌ２の光強度を検出するための検出領域４５ｂとを有するので、発光位置が互いに異なる２つの観察光Ｌ２を同時に検出することができる。このように、本実施形態の画像取得装置１Ａおよび画像取得方法によれば、観察対象物Ｂの深さ方向において集光位置が互いに異なる複数の照射光Ｌ１を同時に照射することができ、更に、深さ方向において発光位置が互いに異なる複数の観察光Ｌ２を同時に検出することができる。従って、観察対象物Ｂが厚い場合などにおいて観察時間を短縮でき、また深さが異なる複数の箇所の同時刻における状況を容易に取得できる。
観察時間を短縮について、具体的な例を挙げて説明する。光スキャナの一例として共振ミラーを用いた光スキャナが挙げられるが、共振ミラーの走査速度は約１０ｋＨｚであり、高速軸の走査時間は１００μｓｅｃである。従来の顕微鏡装置では、１回の掃引が終わったのちに、対物レンズ若しくはステージを光軸方向に移動させて、光軸方向に異なる深さで掃引を行う必要があった。このため、異なる深さの領域を掃引するためには、少なくとも１００μｓｅｃ以上の時間を要していた。また、ガルバノミラーを用いた光スキャナなどその他の光スキャナも、異なる深さの領域を掃引するためには、対物レンズ若しくはステージを光軸方向に移動させる必要があるため、同程度の時間を要する。従って、いずれの場合でも、異なる深さの領域を同時に観察することは難しかった。一方、本実施形態の画像取得装置１Ａによれば、空間光変調器１３によって光軸方向の位置が異なる複数の集光点Ｐ１，Ｐ２を例えば高速軸に沿って生成することができ、わずかな時間差で、深さが異なる部分の情報を得ることができる。従って、同時に深さが異なる部分の情報を得ることができるので、深さが異なる部分の比較などを行うことが簡便になる。
また、空間光変調器１３に呈示される変調パターンを用いて複数の集光点Ｐ１，Ｐ２を形成することにより、照射光Ｌ１の光軸方向に垂直或いは平行な方向における所望の位置に容易に集光でき、且つ、集光点数、位置、強度等を容易に変えることができる。
また、図３に示されたように、照射光Ｌ１の光軸方向から見て集光点Ｐ１，Ｐ２は走査方向Ａ２に沿って並んでいてもよい。これにより、例えば、走査方向Ａ２の前側に位置する集光点Ｐ２により該集光点Ｐ２とは異なる深さにて生じる影響を、走査方向Ａ２の後側に位置する集光点Ｐ１から生じる観察光Ｌ２を検出することによってほぼ同時に知ることができる。
また、本実施形態のように、光検出器４１は、複数のアノードを有するマルチアノード光電子増倍管を含んでもよく、或いは、複数の画素を有するエリアイメージセンサを含んでもよい。これらの何れかによって、点像Ｐ３，Ｐ４それぞれにおいて観察光Ｌ２を精度良く検出することができる。
なお、本実施形態の画像取得装置は、特に多光子励起蛍光顕微鏡に好適である。その理由を以下に説明する。通常、液晶型の空間光変調器には、偏光依存性が存在する。蛍光は一般的に無偏光であるため、液晶型の空間光変調器を用いて位相制御を実施するためには、２枚の空間光変調器を用い、２つの偏光方向に対して位相変調を行うことが望ましい。しかしながら、一般的に液晶型の空間光変調器の反射率は９０％程度であり、２枚の空間光変調器を用いると反射率は８１％となる。従って、微弱な蛍光をさらに弱めてしまうおそれがある。一方、空間光変調器に代えてデフォーマブルミラーを用いる場合、デフォーマブルミラーには偏光依存性がない。しかし、１枚のミラーを背面から複数のアクチュエータで押す構造のものは位相の表現能力の点で劣り、また、マトリックス状にミラー及びアクチュエータが配置されたものは反射率の点で劣る。
多光子励起蛍光顕微鏡では、集光点近傍の光子密度の高い位置において特に蛍光を生じる。励起光を収差の影響なく集光できれば、生じる蛍光は、集光点近傍の蛍光のみであると考えられる。従って、励起光の収差のみを補正し、生じた蛍光をすべて観測すれば、蛍光側の収差の影響はほぼ無視できる。故に、観察光に空間光変調器を適用する必要がないので、上記の問題が生じず、多光子励起蛍光顕微鏡では空間光変調器を好適に使用し得る。
（第１変形例）
図８は、上記実施形態の第１変形例を示す図であって、観察対象物Ｂ及びその近傍における照射光Ｌ１の様子を概念的に示している。図８に示されるように、本変形例では、対物レンズ３２の焦点位置に一つの集光点（例えば集光点Ｐ２）を形成する。そのため、対物レンズ３２と観察対象物Ｂとの距離が図２と比較して短くなっている。この場合、対物レンズ３２及び／又はステージ３１を対物レンズ３２の光軸方向に移動させることにより、対物レンズ３２と観察対象物Ｂとの距離を調整し、対物レンズ３２と一つの集光点との距離を、対物レンズ３２の焦点距離と一致させる。なお、図中の仮想線Ａ１は、対物レンズ３２の基準高さを表している。
本変形例のように、対物レンズ３２と観察対象物Ｂとの距離を調整することにより、集光点Ｐ２の深さｄ２を実現してもよい。この場合、空間光変調器１３では、単に対物レンズ３２の焦点距離に集光点Ｐ２が形成されるような変調パターンを呈示すればよく、集光点Ｐ２の深さｄ２を実現するための（言い換えれば、集光点Ｐ２と対物レンズ３２との距離を焦点距離から変化させるための）変調パターンは不要となる。そしてこの場合、集光点Ｐ１の深さｄ１を実現するために、コンピュータ５３は、照射光Ｌ１の光軸方向における集光点Ｐ１と集光点Ｐ２との距離ｄ３に基づいて、集光点Ｐ１の深さｄ１を実現するための変調パターンを算出する（もしくは選択する）とよい。また、使用者が基準高さＺ０に対する対物レンズ３２の位置をコンピュータ５３に直接入力してもよい。
（第２変形例）
上記実施形態では光スキャナ２１によって集光点Ｐ１，Ｐ２を走査しているが、ステージ３１を光軸方向と交差する面方向に移動させることによって集光点Ｐ１，Ｐ２を走査してもよい。言い換えれば、上記実施形態の走査部は、光スキャナ２１に代えて若しくは光スキャナ２１とともに、ステージ３１を含んでもよい。このような構成であっても、集光点Ｐ１，Ｐ２を好適に走査することができる。
（第３変形例）
上記実施形態では光スキャナ２１によって集光点Ｐ１，Ｐ２を走査しているが、空間光変調器１３に呈示される変調パターンに、集光点Ｐ１，Ｐ２を走査するためのパターン（光走査ホログラム）を含ませ（重畳させ）てもよい。この場合、上記実施形態における走査部が不要となるので、画像取得装置１Ａの構成部品を削減し、小型化に寄与できる。
（第４変形例）
上記実施形態では２つの集光点Ｐ１，Ｐ２を観察対象物Ｂ内部に形成する場合について説明したが、３つ以上の集光点が観察対象物Ｂ内部に形成されてもよい。図９は、上記実施形態の第４変形例による集光点の様子を示す図である。図９に示されるように、本変形例では、４つの集光点Ｐ５〜Ｐ８を観察対象物Ｂ内部に形成する。集光点Ｐ５〜Ｐ８は、照射光Ｌ１の光軸方向における位置が互いに異なるので、観察対象物Ｂ表面からのこれらの深さｄ５〜ｄ８は互いに異なる。また、照射光Ｌ１の光軸方向から見て、これらの集光点Ｐ５〜Ｐ８は互いに一定の間隔をあけて走査方向（図中の矢印Ａ５〜Ａ８）に沿って並んでいる。
ここで、図９に示されるように、照射光Ｌ１の光軸方向から見て走査方向に集光点Ｐ５〜Ｐ８が並んでいる場合、走査方向における観察対象物Ｂの両端部には、集光点が通過しない領域（図中のＢ１，Ｂ２）が生じる。そこで、例えば集光点Ｐ５〜Ｐ８全てが通過する領域Ｂ３に限定して画像を作成するとよい。具体的には、例えば集光点Ｐ５〜Ｐ８からの観察光をそれぞれ検出して深さの異なる画像を取得し、それらの画像から、走査範囲が共通する領域の画像を切り出すとよい。
また、図１０は、本変形例における光検出器４６の光検出面４７を示す正面図である。図１０に示されるように、光検出面４７には、集光点Ｐ５〜Ｐ８それぞれから発生した観察光による点像Ｐ９〜Ｐ１２が形成される。光検出器４６は、点像Ｐ９〜Ｐ１２それぞれの光強度を検出することにより、複数の観察光を検出する。なお、観察対象物Ｂにおける集光点の深さが深いほど、集光点と対物レンズ３２との距離が長くなるので、光検出器４６に達する観察光の光径が大きくなる。本実施形態では集光点Ｐ５〜Ｐ８の順に深い位置に形成されるので、図１０では、集光点Ｐ５からの観察光の点像Ｐ９が最も大きく、集光点Ｐ８からの観察光の点像Ｐ１２が最も小さい。
また、光検出器４６は、複数の光検出部４７ａを含み、点像Ｐ９〜Ｐ１２をそれぞれ検出するための検出領域４８ａ〜４８ｄを有する。検出領域４８ａ〜４８ｄは、互いに独立した領域であって、それぞれ一又は複数の光検出部４７ａを含んで構成される。
ここで、本変形例における集光点Ｐ５〜Ｐ８の走査態様について説明する。図１１及び図１２は、照射光Ｌ１の光軸方向から見た集光点Ｐ５〜Ｐ８の走査の様子を概念的に示す図である。例えば、図１１（ａ）に示されるように、高速軸に沿って集光点Ｐ５〜Ｐ８を一列に配置してもよい。また、図１１（ｂ）に示されるように、集光点Ｐ５〜Ｐ８を複数群形成し、観察対象物Ｂを複数の領域に分割し、各領域を一群の集光点Ｐ５〜Ｐ８によって走査してもよい。また、例えば図１２に示されるように、観察対象物Ｂを複数の領域Ｂ１１〜Ｂ１４に分割し、各領域を一つの集光点Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７若しくはＰ８によって走査してもよい。
本変形例によれば、上記実施形態と同様に、観察対象物Ｂの深さ方向において集光位置が互いに異なる複数の照射光Ｌ１を同時に照射することができ、更に、深さ方向において発光位置が互いに異なる複数の観察光Ｌ２を同時に検出することができる。従って、観察対象物Ｂが厚い場合などにおいて観察時間を短縮でき、また深さが異なる複数の箇所の同時刻における状況を容易に取得できる。
なお、本変形例では４つの集光点Ｐ５〜Ｐ８が形成される場合について例示したが、集光点の数は、空間光変調器に呈示される変調パターンを制御することによって容易に変更可能である。その場合、集光点一つあたりの照射光強度は、照射光Ｌ１の全光量をＥ、集光点の数をＮ、空間光変調器の効率をηとすると、（Ｅ／Ｎ）×ηとして表される。空間光変調器の効率ηは、光利用効率（入射光量のうち位相変調に利用される光量の割合）と、回折効率（所望の位置に回折させることができる光量の割合。空間光変調器に呈示されたホログラムの空間周波数に応じて決まる。）との積である。従って、集光点の数Ｎを変更すると、集光点一つあたりの照射光強度も変化することとなる。各集光点の照射光強度が変化すると観察光強度も変化するので、再構成画像にブロックノイズが発生するおそれがある。このような問題を回避するためには、例えば、観察光Ｌ２の各点像の強度変化および強度バラツキを測定するための光学系及び測定系を設け、光源１１の光出力強度にフィードバックするとよい。或いは、集光点の数Ｎに応じて予め強度変化を予測し、集光点の数Ｎを変更する際に光源１１の光出力強度を変化させるとよい。
（実施例）
ここで、上記実施形態の実施例について説明する。本実施例では、観察対象物Ｂとして、直径３μｍの蛍光ビーズと、直径１０μｍの蛍光ビーズとをそれぞれ複数個内包した樹脂を用意した。この樹脂を対物レンズ（水浸４０倍、ＮＡ１．１５）を用いて観察した。深さｄ５〜ｄ８の各位置にそれぞれ集光点Ｐ５〜Ｐ８を形成し、これらの集光点Ｐ５〜Ｐ８を走査して画像を取得した。このとき、複数の集光点Ｐ５〜Ｐ８は、走査方向に対して直交する方向に沿って並ぶものとした。また、深さｄ５〜ｄ８は、光学距離として、ｄ５＝１５．０μｍ、ｄ６＝１１．２５μｍ、ｄ７＝７．５μｍ、ｄ８＝３．７５μｍとした。
図１３及び図１４は、集光点Ｐ５〜Ｐ８の各走査領域のうち共通の領域（図９の領域Ｂ３）のみを切り抜いた画像を示す。図１３（ａ）は集光点Ｐ８から得られた画像を示し、図１３（ｂ）は集光点Ｐ７から得られた画像を示し、図１４（ａ）は集光点Ｐ６から得られた画像を示し、図１４（ｂ）は集光点Ｐ５から得られた画像を示す。これらの画像においては、下部中央付近に１０μｍの蛍光ビーズが存在しているが、この蛍光ビーズを何れの深さにおいても観察できていることがわかる。また、これら４つの画像のうち３つの画像にわたって存在するような直径３μｍの蛍光ビーズが見当たらないことから、深さ方向の分解能も十分確保できていると考えられる。
１Ａ…画像取得装置、１０…照射光生成ユニット、１１…光源、１２…ビームエキスパンダ、１３…空間光変調器、１４…ダイクロイックミラー、２０…走査ユニット、２１…光スキャナ、２２…ミラー、３０…照射光学ユニット、３１…ステージ、３２…対物レンズ、３３…対物レンズ移動機構、３４…反射ミラー、４０…観察ユニット、４１…光検出器、４２…フィルタ、４３…集光レンズ、４４…光検出面、４４ａ…光検出部、４５ａ…第１の検出領域、４５ｂ…第２の検出領域、５０…制御ユニット、５１…入力装置、５２…表示装置、５３…コンピュータ、６１，６２…テレセントリック光学系、Ｂ…観察対象物、Ｌ０…照射光、Ｌ１…照射光、Ｌ２…観察光、Ｐ１…第１の集光点、Ｐ２…第２の集光点、Ｐ３，Ｐ４…点像、Ｐ５〜Ｐ８…集光点、Ｐ９〜Ｐ１２…点像。

Claims (20)

  1. 光源から出力された照射光を変調する空間光変調器と、
    観察対象物において第１の集光点および第２の集光点が形成されるように、前記空間光変調器に呈示される変調パターンを制御する制御部と、
    前記観察対象物中に前記第１の集光点および前記第２の集光点を形成するために、変調された前記照射光を集光する集光光学系と、
    前記集光光学系の光軸と交差する走査方向に、前記観察対象物中の前記第１の集光点および前記第２の集光点の位置を走査する走査部と、
    多光子励起により前記第１の集光点から生じた蛍光である第１の観察光、及び多光子励起により前記第２の集光点から生じた蛍光である第２の観察光を検出する光検出器と、
    前記光検出器からの検出信号を用いて前記観察対象物の画像を作成する画像作成部と、
    を備え、
    前記光検出器は、前記第１の観察光を検出するための第１の検出領域と、前記第２の観察光を検出するための第２の検出領域とを有し、
    前記第１の検出領域と前記第２の検出領域とは互いに独立した領域であり、
    前記光軸の方向における前記第１の集光点および前記第２の集光点の位置が互いに異なる、画像取得装置。
  2. 前記光軸の方向から見て前記第１の集光点および前記第２の集光点が前記走査方向に並んでいる、請求項１に記載の画像取得装置。
  3. 前記光軸の方向から見て前記第１の集光点および前記第２の集光点が前記走査方向と交差する第１の方向に並んでいる、請求項１に記載の画像取得装置。
  4. 前記第１の方向が前記走査方向と直交する、請求項３に記載の画像取得装置。
  5. 前記第１の方向が前記走査方向に対して傾斜する、請求項３に記載の画像取得装置。
  6. 前記走査部は、変調された前記照射光を受ける光スキャナを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の画像取得装置。
  7. 前記走査部は、前記観察対象物を保持しつつ前記走査方向に前記観察対象物を移動させるステージを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の画像取得装置。
  8. 前記光検出器は、複数のアノードを有するマルチアノード光電子増倍管を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の画像取得装置。
  9. 前記光検出器は、複数の画素を有するエリアイメージセンサを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の画像取得装置。
  10. 光源から出力された照射光を変調する空間光変調器と、
    観察対象物において第１の集光点および第２の集光点が形成されるように、前記空間光変調器に呈示される変調パターンを制御する制御部と、
    前記観察対象物中に前記第１の集光点および前記第２の集光点を形成するために、変調された前記照射光を集光する集光光学系と、
    多光子励起により前記第１の集光点から生じた蛍光である第１の観察光、及び多光子励起により前記第２の集光点から生じた蛍光である第２の観察光を検出する光検出器と、
    前記光検出器からの検出信号を用いて前記観察対象物の画像を作成する画像作成部と、
    を備え、
    前記変調パターンは、前記集光光学系の光軸と交差する走査方向に前記第１の集光点および前記第２の集光点を走査するためのパターンを含み、
    前記光検出器は、前記第１の観察光を検出するための第１の検出領域と、前記第２の観察光を検出するための第２の検出領域とを有し、
    前記第１の検出領域と前記第２の検出領域とは互いに独立した領域であり、
    前記光軸の方向における前記第１の集光点および前記第２の集光点の位置が互いに異なる、画像取得装置。
  11. 観察対象物において第１の集光点および第２の集光点を形成するための変調パターンを空間光変調器に呈示するパターン呈示ステップと、
    前記観察対象物中に前記第１の集光点および前記第２の集光点を形成するために、光源から出力された照射光を前記空間光変調器において変調し、変調された前記照射光を集光光学系により集光する集光点形成ステップと、
    前記集光光学系の光軸と交差する走査方向に、前記観察対象物中の前記第１の集光点および前記第２の集光点の位置を走査しつつ、多光子励起により前記第１の集光点から生じた蛍光である第１の観察光、及び多光子励起により前記第２の集光点から生じた蛍光である第２の観察光を検出する光検出ステップと、
    前記光検出ステップにより得られた検出信号を用いて前記観察対象物の画像を作成する画像作成ステップと、
    を含み、
    前記光検出ステップでは、前記第１の観察光を検出するための第１の検出領域と、前記第２の観察光を検出するための第２の検出領域とを有する光検出器を用い、
    前記第１の検出領域と前記第２の検出領域とは互いに独立した領域であり、
    前記光軸の方向における前記第１の集光点および前記第２の集光点の位置が互いに異なる、画像取得方法。
  12. 前記光軸の方向から見て前記第１の集光点および前記第２の集光点が前記走査方向に並んでいる、請求項１１に記載の画像取得方法。
  13. 前記光軸の方向から見て前記第１の集光点および前記第２の集光点が前記走査方向と交差する第１の方向に並んでいる、請求項１１に記載の画像取得方法。
  14. 前記第１の方向が前記走査方向と直交する、請求項１３に記載の画像取得方法。
  15. 前記第１の方向が前記走査方向に対して傾斜する、請求項１３に記載の画像取得方法。
  16. 前記光検出ステップでは、変調された前記照射光を受ける光スキャナを用いて前記第１の集光点および前記第２の集光点の走査を行う、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の画像取得方法。
  17. 前記光検出ステップでは、前記観察対象物を保持しつつ前記走査方向に前記観察対象物を移動させるステージを用いて前記第１の集光点および前記第２の集光点の走査を行う、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の画像取得方法。
  18. 前記光検出ステップでは、前記第１の集光点および前記第２の集光点を走査するためのパターンを前記変調パターンに重畳させる、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の画像取得方法。
  19. 前記光検出器は、複数のアノードを有するマルチアノード光電子増倍管を含む、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の画像取得方法。
  20. 前記光検出器は、複数の画素を有するエリアイメージセンサを含む、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の画像取得方法。
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