JP5554965B2 - 位相変調型空間光変調器を用いたレーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ顕微鏡の技術に関し、特に、位相変調型空間光変調器を用いたレーザ顕微鏡の技術に関する。

各々が独立に制御される複数の光変調素子（以降、ピクセル素子と記す。）を有する空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial Light Modulator、以降、ＳＬＭと記す。）を利用して、光の空間的分布及び強度（以降、パターンと記す。）を任意に制御し、所望のパターンの光を対象物に照射する技術が知られている。

現在までにさまざまな種類の空間光変調器が提案されているが、デジタルマイクロミラー（ＤＭＤ：Digital Micromirror Device）などに代表されるような、ピクセル素子が光の強度を変調する空間光変調器（以降、強度変調型ＳＬＭと記す。）や、ピクセル素子が光の位相を変調する空間光変調器（以降、位相変調型ＳＬＭと記す。）の普及が進んでいる。

強度変調型ＳＬＭは、強度変調型ＳＬＭ上に形成した光の強度のパターンを対象物に直接投影することにより、所望のパターンの光を対象物に照射することができる。しかしながら、強度変調型ＳＬＭでは、光の強度のパターンは、入射光をピクセル素子で選択的に除去することにより形成されるため、光の利用効率が低く、対象物に照射される光密度も低くなってしまうという課題が指摘されている。

これに対して、位相変調型ＳＬＭは、レーザ光源などのコヒーレント光源を用いた上で、位相変調により入射光の波面形状を変化させる。これにより、対象物上での光の強度分布を変化させることが可能であり、所望のパターンの光を形成することができる。位相変調型ＳＬＭでは、光の位相分布の変化により所望のパターンが形成されるため、原理的には光の損失はほとんど生じない。このため、強度変調型ＳＬＭと比較して、高い光の利用効率を実現できる。特許文献１では、位相変調型ＳＬＭを用いたパターン形成装置や光ピンセット装置が開示されている。

このような、光の損失を抑えて高い光の利用効率を実現することで、任意のパターンの光を対象物に高い光密度で照射することができる位相変調型ＳＬＭは、蛍光顕微鏡などのレーザ顕微鏡の分野にも応用されている。特に、非常に高い光密度が必要とされる非線形光学現象を利用する蛍光顕微鏡への応用は有効であり、非特許文献１では、非線形顕微鏡の一種である２光子励起顕微鏡が開示されている。

非特許文献１に開示された顕微鏡は、位相変調型ＳＬＭを用いることで、光の損失を抑えながら、対象物に任意のパターンの光を照射すること（以降、光パターン照射と記す。）ができる。このため、対象物を走査することなく、対象物の複数部位を、非線形現象の発生に必要な高い光密度の光で、同時に照射することが可能である。

特開２００６−７２２８０号公報

Ｖｏｌｏｄｙｍｙｒ Ｎｉｋｏｌｅｎｋｏ、他５名、"ＳＬＭ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ｓｃａｎｌｅｓｓ ｔｗｏ‐ｐｈｏｔｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｐａｔｉａｌ ｌｉｇｈｔ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ"、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ、１９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００８、Ｖｏｌｕｍｅ２、Ａｒｔｉｃｌｅ５、ｐ．１−１４

ところで、蛍光顕微鏡を利用した蛍光観測では、光パターン照射に伴って生じる対象物の動的な変化（対象物に含まれる蛍光物質の動的な変化を含む）、例えば、フォトアクティベーション、フォトコンバージョン、ＦＲＡＰ（Fluorescence Recovery After Photobleaching）、ＦＬＩＰ（Fluorescence Loss In Photobleaching）などを観測したいという要求が存在する。この要求に応えるためには、光パターン照射領域とは独立した、対象物の任意の領域を画像化する機能が必要となる。
なお、このような対象物の動的な変化を観測したいという要求は、蛍光顕微鏡に限られるものではなく、他のレーザ顕微鏡でも同様に存在する。

非特許文献１に開示された顕微鏡は、走査手段としてガルバノメータスキャナを有している。このため、通常のレーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ：laser scanning microscope、以降、ＬＳＭと記す。）として利用することも可能であり、対象物の任意の領域を画像化することができる。

しかしながら、非特許文献１に開示された顕微鏡では、光パターン照射のための位相変調型ＳＬＭと、対象物の画像化のための走査手段とが、同一光路上に配置されている。このため、光パターン照射と同時に、光パターン照射とは独立した、対象物の任意の領域を画像化することができない。したがって、光パターン照射から画像化までの間にタイムラグが生じ、その結果、対象物の動的な変化に対する観測の時間分解能が制限されてしまう。

以上のような実情を踏まえ、本発明では、高い光の利用効率で所望のパターンの光を対象物に照射し、且つ、光の照射に伴って生じる対象物の動的な変化を高い時間分解能で観測する技術を提供することを課題とする。

本発明の第１の態様は、照明光を射出するレーザ光源と、照明光を標本に照射する対物レンズと、レーザ光源と対物レンズの間の第１の照明光路と第２の照明光路とを合成する光路合成手段と、第１の照明光路上であって対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された、照明光の位相を変調する位相変調型空間光変調器と、第２の照明光路上に配置された、対物レンズの光軸と直交する平面内で標本を走査する２次元走査手段と、対物レンズと位相変調型空間光変調器との間に配置される光学系及び対物レンズで生じる収差情報が、像高毎及び照明光の波長毎に、記憶された記憶部と、位相変調型空間光変調器で記憶部から取得した収差情報を考慮して位相が変調された照明光が照射された標本を撮像し、標本上に形成される照射パターンを取得する撮像手段と、を含み、位相変調型空間光変調器は、所望のパターンと撮像手段で取得した前記照射パターンとの差が小さくなるように、照明光の位相の変調を調整するレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載のレーザ顕微鏡において、レーザ光源は、位相変調型空間光変調器へ入射する第１の照明光を射出する第１のレーザ光源と、２次元走査手段へ入射する第２の照明光を射出する第２のレーザ光源と、を含むレーザ顕微鏡を提供する。
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載のレーザ顕微鏡において、光路合成手段は、入射する光の波長に応じて、交換されるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第４の態様は、第１の態様に記載のレーザ顕微鏡において、さらに、照明光を第１の照明光と第２の照明光に分割し、第１の照明光を第１の照明光路へ、また、第２の照明光を第２の照明光路へ導く照明光路分割手段を含むレーザ顕微鏡を提供する。
本発明の第５の態様は、第４の態様に記載のレーザ顕微鏡において、レーザ光源と照明光路分割手段の間に、λ／４板を含むレーザ顕微鏡を提供する。
本発明の第６の態様は、第５の態様に記載のレーザ顕微鏡において、レーザ光源と照明光路分割手段の間に、さらに、λ／２板を含むレーザ顕微鏡を提供する。
本発明の第７の態様は、第６の態様に記載のレーザ顕微鏡において、λ／４板及びλ／２板は、光軸に対して、回転可能に配置されるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第８の態様は、第１の態様乃至第７の態様のいずれか１つに記載のレーザ顕微鏡において、さらに、第１の照明光路上であって、位相変調型空間光変調器と光路合成手段の間に、標本を、対物レンズの光軸と直交する第１の方向に走査する第１の走査手段を含むレーザ顕微鏡を提供する。
本発明の第９の態様は、第８の態様に記載のレーザ顕微鏡において、第１の走査手段は、対物レンズの瞳位置と光学的に共役であるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第１０の態様は、第８の態様または第９の態様に記載のレーザ顕微鏡において、第１の走査手段は、位相変調型空間光変調器が照明光の位相を変調することにより標本上に形成される照明光のパターンを、標本上で第１の方向へ平行移動させるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第１１の態様は、第９の態様または第１０の態様に記載のレーザ顕微鏡において、さらに、第１の照明光路上であって、位相変調型空間光変調器と光路合成手段の間に、標本を、第１の方向と直交する第２の方向に走査する第２の走査手段を含むレーザ顕微鏡を提供する。
本発明の第１２の態様は、第１１の態様に記載のレーザ顕微鏡において、第２の走査手段は、第１の走査手段と光学的に共役であるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第１３の態様は、第１の態様乃至第１２の態様のいずれか１つに記載のレーザ顕微鏡において、さらに、照明光を照射することにより標本から生じる検出光を、照明光から分離して検出光路に導く検出光路分離手段と、検出光路上に配置された、検出光を検出する光検出器と、を含むレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第１４の態様は、第１３の態様に記載のレーザ顕微鏡において、光検出器は、標本と光学的に共役な位置に配置された、検出光の強度の空間的な分布を検出する２次元センサであるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第１５の態様は、第１３の態様に記載のレーザ顕微鏡において、光検出器は、対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置近傍に配置されるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第１６の態様は、第１４の態様または第１５の態様に記載のレーザ顕微鏡において、検出光路分離手段は、対物レンズと２次元走査手段との間に配置されるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第１７の態様は、第１３の態様に記載のレーザ顕微鏡において、さらに、検出光路分離手段と光検出器の間の、標本と光学的に共役な位置に配置された共焦点絞りを含み、検出光路分離手段は、レーザ光源と２次元走査手段との間に配置されるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第１８の態様は、第１の態様乃至第１２の態様のいずれか１つに記載のレーザ顕微鏡において、さらに、標本を透過した光が入射する透過検出光学系と、照明光を照射することにより標本から生じる検出光を、透過検出光学系を介して、検出する光検出器と、を含むレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第１９の態様は、第１の態様乃至第１８の態様のいずれか１つに記載のレーザ顕微鏡において、対前記収差情報は、ディストーション及び倍率色収差、または、波面収差に関するものであるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明の第２０の態様は、第１の態様乃至第１９の態様のいずれか１つに記載のレーザ顕微鏡において、複数の画素部を有し、位相変調型空間光変調器で位相が変調された第１の照明光が照射された標本を撮像し、標本上に形成された照射パターンを取得する撮像手段を含み、レーザ顕微鏡は、２次元走査手段により偏向された第２の照明光が入射する画素部の位置と、画素部に第２の照明光が入射するときの２次元走査手段の走査位置を制御するパラメータと、を関連付けて記憶するレーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、高い光の利用効率で所望のパターンの光を対象物に照射し、且つ、光の照射に伴って生じる対象物の動的な変化を高い時間分解能で観測する技術を提供することができる。

実施例１に係るレーザ顕微鏡の構成を例示する概略図である。 実施例２に係るレーザ顕微鏡の構成を例示する概略図である。 実施例２に係るレーザ顕微鏡の構成の変形例を例示する概略図である。 実施例３に係るレーザ顕微鏡の構成を例示する概略図である。 実施例４に係るレーザ顕微鏡の構成を例示する概略図である。 実施例５に係るレーザ顕微鏡の構成を例示する概略図である。

以下、図面を参照しながら、各実施例について説明する。

図１は、本実施例に係るレーザ顕微鏡の構成を例示する概略図である。図１に例示されるレーザ顕微鏡１は、レーザ光源であるチタンサファイアレーザから射出された赤外線領域の超短パルスレーザ光（照明光）により、２光子過程を利用して標本１３を励起する２光子励起顕微鏡である。
まず、本実施例に係るレーザ顕微鏡１の構成について説明する。

レーザ顕微鏡１は、制御部１ａと、第１の照明手段Ｌ１と、第２の照明手段Ｌ２と、ダイクロイックミラー８と、結像レンズ９と、ダイクロイックミラー１０と、ダイクロイックミラー１１と、レーザ光を標本１３に照射する対物レンズ１２と、標本１３を配置し、対物レンズ１２の光軸方向に移動するステージ１ｂと、第１の検出手段Ｄ１と、第２の検出手段Ｄ２と、を含んで構成されている。

第１の照明手段Ｌ１は、所望のパターンの光を標本１３に照射する照明手段である。具体的には、赤外線領域の超短パルスレーザ光（第１の照明光）を射出するチタンサファイアレーザ２と、レーザ光の光束径を調整するビームエクスパンダ３と、プリズム型ミラー４と、所望のパターンに応じてレーザ光の位相を変調する位相変調型のＳＬＭ５と、ミラー６と、瞳リレーレンズ７とを含んで構成されている。

なお、ＳＬＭ５は、第１の照明手段Ｌ１内の第１の照明光路上であって、対物レンズ１２の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。ＳＬＭ５としては、例えば、反射型や透過型の液晶位相変調器、ミラーの駆動により光路長差を生じさせる反射型ミラー位相変調器などを用いることができる。

一般に、収差のない理想的なレンズ系では、結像位置と瞳位置の間にはフーリエ変換の関係が成り立ち、瞳関数をフーリエ変換することによって結像位置での強度分布が求められる。つまり、対物レンズ１２の収差を無視し、対物レンズ１２の焦点面に標本１３が配置されているとすると、対物レンズ１２の瞳位置と標本面（標本１３）は、フーリエ変換の関係が成り立つ。このことから、標本面は、対物レンズ１２の瞳共役位置に配置されたＳＬＭ５に対しても、フーリエ変換面であると言える。

例えば、レーザ光の位相がＳＬＭ５で変調されず、レーザ光が位相の揃った平行光としてＳＬＭ５から射出される場合には、レーザの振幅分布のフーリエ変換によって得られる点像が、フーリエ変換面である標本１３上の一点に形成される。その一方で、ＳＬＭ５でレーザ光の位相を正弦格子状に変調する場合には、射出されるレーザ光がプラスマイナス１次の進行方向を有する平面波に変換され、フーリエ変換面である標本１３上の異なる２点に、レーザ光を集光させることができる。

このように、第１の照明手段Ｌ１は、ＳＬＭ５での位相の変調を制御することで、標本１３上に所望のパターンの光を照射することができる。具体的には、例えば、細胞など対象物の形状に合わせたパターンの光を照射することができる。その他、標本１３上の一点のみに光を照射することも、多点に同時に光を照射することもできる。また、標本１３上の所望の領域を均一に照明することもできる。従って、第１の照明手段Ｌ１は、刺激手段としても、通常の蛍光観察用の照明手段としても利用可能である。

第２の照明手段Ｌ２は、チタンサファイアレーザ２とは異なる波長の赤外線レーザ光（第２の照明光）を射出するチタンサファイアレーザ１４と、レーザ光の光束径を調整するビームエクスパンダ１５と、対物レンズ１２の光軸と直交する平面内で標本１３を２次元に走査する２次元走査手段であるＸＹスキャナ１６と、瞳リレーレンズ１７と、を含んで構成されている。

なお、チタンサファイアレーザ１４も２光子励起を生じさせるため、チタンサファイアレーザ２と同様に、超短パルスレーザ光を射出する。また、ＸＹスキャナ１６は、第２の照明手段Ｌ２内の第２の照明光路上であって、対物レンズ１２の瞳位置と光学的に共役な位置またはその近傍に配置されることが望ましい。ＸＹスキャナ１６としては、例えば、ガルバノミラーや、音響光学偏向素子（ＡＯＤ：Acoustic Optical Deflector）などを用いることができる。

第２の照明手段Ｌ２は、通常のレーザ走査型顕微鏡の照明手段と同様に作用するため、ＸＹスキャナ１６を制御することで、標本１３上の任意の一点に光を照射することができる。このため、第２の照明手段Ｌ２は、第１の照明手段と同様に、刺激手段としても、通常の蛍光観察用の照明手段としても利用可能である。

なお、第２の照明手段Ｌ２からの光は標本１３上の一点に集光されるため、多点を同時に照射する必要がある場合や特定の形状の光を照射する必要がある場合には、第１の照明手段Ｌ１の使用がより有効である。

第１の照明手段Ｌ１と第２の照明手段Ｌ２は、別々の光路上に設けられているため、互いに影響を及ぼすことなく、それぞれ独立に制御される。また、それぞれの照明手段から射出された照明光は、後述するダイクロックミラー８により合成されて、同時に標本１３に照射される。

このため、第１の照明手段Ｌ１と第２の照明手段Ｌ２のいずれか一方を通常の蛍光観察用の照明手段として使用し、他方を刺激手段として使用することで、刺激による標本１３の動的な変化を、刺激とほぼ同時に観測することができる。

特に、第１の照明手段Ｌ１を刺激手段とし、第２の照明手段Ｌ２を通常の蛍光観察用の照明手段として使用する場合、所望のパターンの光刺激による標本１３の動的な変化を、刺激とほぼ同時に観測することができる。

第１の検出手段Ｄ１は、赤外線領域の波長の光を遮断する赤外線カットフィルタ１８（以降、ＩＲカットフィルタと記す。）と、結像レンズ１９と、蛍光を電気信号に変換する光検出器である電荷結合素子２０（ＣＣＤ：Charge Coupled Device、以降、ＣＣＤと記す。）と、を含んで構成されている。

なお、ＣＣＤ２０は、複数の画素部を有し、標本１３と光学的に共役な位置に配置された２次元センサである。このため、標本１３の焦点面で生じる蛍光の強度の空間的な分布（強度分布）は、ＣＣＤ２０へ投影され、ＣＣＤ２０で検出される。

第２の検出手段Ｄ２は、リレーレンズ２１と、赤外線領域の波長の光を遮断するＩＲカットフィルタ２２と、蛍光を電気信号に変換する光検出器である光電子増倍管２３（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube、以降、ＰＭＴと記す。）と、を含んで構成されている。

なお、ＰＭＴ２３は、対物レンズ１２の瞳位置と光学的に共役な位置近傍に配置されることが望ましい。レーザ顕微鏡１では、リレーレンズ２１により対物レンズ１２の瞳がリレーされた位置近傍に配置されている。これにより、対物レンズ１２の瞳がＰＭＴ２３の受光面内に投影されるようにリレーレンズ２１を構成することで、標本１３の任意の領域から生じる蛍光を検出することができる。
制御部１ａは、ステージ１ｂ、ＳＬＭ５、ＸＹスキャナ１６、ＣＣＤ２０、ＰＭＴ２３と接続され、それぞれを制御する。

次に、レーザ光源からレーザ光（照明光）を射出し、蛍光（検出光）を検出するまでの流れについて、具体的に説明する。なお、以降では、第１の照明手段Ｌ１を刺激手段として使用し、第２の照明手段Ｌ２を蛍光観察用の照明手段として使用する場合を例に説明する。

チタンサファイアレーザ２から射出されたレーザ光（第１の照明光）は、まず、ビームエクスパンダ３に入射し、レーザ光の光束径がＳＬＭ５のサイズに合わせて調整される。さらに、プリズム型ミラー４によりＳＬＭ５の仕様に応じた角度でＳＬＭ５に入射するように偏向されて、平行光としてＳＬＭ５へ入射する。

位相変調型のＳＬＭ５へ入射したレーザ光は、標本１３上で所望のパターンの光が形成されるように変調される。より厳密には、レーザ光の位相が変調される。その後、再びプリズム型ミラー４で偏向され、ミラー６及び瞳リレーレンズ７を介して、ダイクロイックミラー８へ入射する。

ダイクロイックミラー８は、波長に応じて入射光を反射または透過させる光学素子である。ダイクロイックミラー８は、レーザ光源（チタンサファイアレーザ２、チタンサファイアレーザ１４）と対物レンズ１２の間に配置されて、ＳＬＭ５が配置された第１の照明光路とＸＹスキャナ１６が配置された第２の照明光路とを合成する光路合成手段として機能する。具体的には、ダイクロイックミラー８は、第１の照明光路を通るレーザ光（第１の照明光）を反射し、第２の照明光路を通るレーザ光（第２の照明光）を透過する特性を有している。このため、ダイクロイックミラー８に入射したレーザ光（第１の照明光）は、ダイクロイックミラー８を反射する。そして、瞳リレーレンズ７とともにＳＬＭ５を対物レンズ１２の瞳に投影するリレー光学系を構成する結像レンズ９を介して、ダイクロイックミラー１０へ入射する。

ダイクロイックミラー１０及びダイクロイックミラー１１は、レーザ光を照射することにより標本１３から生じる蛍光（検出光）を、レーザ光（照明光）から分離して検出光路に導く検出光路分離手段として機能する。なお、本実施例に係るレーザ顕微鏡１では、ダイクロイックミラー１０及びダイクロイックミラー１１は、対物レンズ１２とＸＹスキャナ１６の間に配置されている。より詳細には後述するが、ダイクロイックミラー１０は、特定波長域の蛍光を選択的に透過させる特性を有し、ダイクロイックミラー１１は、特定波長域の蛍光を選択的に反射する特性を有している。このため、ダイクロイックミラー１０に入射したレーザ光は、ダイクロイックミラー１０を反射し、さらに、ダイクロイックミラー１１を透過して、対物レンズ１２へ入射する。

そして、レーザ光が入射した対物レンズ１２が、その焦点面にＳＬＭ５による位相変調に応じた所望のパターンを形成することにより、所望のパターンのレーザ光が標本１３に照射される。

一方、チタンサファイアレーザ１４から射出されたレーザ光（第２の照明光）は、まず、ビームエクスパンダ１５へ入射する。そして、ビームエクスパンダ１５により光束径が調整されたレーザ光が、平行光としてＸＹスキャナ１６へ入射する。ＸＹスキャナ１６へ入射したレーザ光は、標本１３の走査位置に応じた方向へ偏向され、瞳リレーレンズ１７を介してダイクロイックミラー８へ入射する。

ダイクロイックミラー８は、上述したように、第２の照明光路を通るレーザ光（第２の照明光）を透過する特性を有している。このため、ダイクロイックミラー８に入射したレーザ光（第２の照明光）は、ダイクロイックミラー８を透過する。以降、チタンサファイアレーザ１４から射出されたレーザ光（第２の照明光）は、チタンサファイアレーザ２から射出されたレーザ光と同一の光路を進行し、標本１３へ入射する。

なお、瞳リレーレンズ１７は、結像レンズ９とともにＸＹスキャナ１６を対物レンズ１２の瞳に投影するリレー光学系を構成している。このため、ＸＹスキャナ１６へ平行光として入射するレーザ光（第２の照明光）は、対物レンズ１２の瞳に平行光として入射し、標本１３上の一点に集光する。このため、ＸＹスキャナ１６により集光位置を２次元に移動することにより、標本１３を走査することができる。

このようにして、チタンサファイアレーザ２及びチタンサファイアレーザ１４から射出されたレーザ光が照射された標本１３では、蛍光物質が２光子過程を経て励起され、蛍光が射出される。

刺激手段として使用される第１の照明手段Ｌ１のチタンサファイアレーザ２から射出されたレーザ光を標本１３に照射して光刺激を与えると、光刺激により蛍光物質がブリーチされ、蛍光物質からの発光量が低下する。

本実施例に係るレーザ顕微鏡１では、光刺激前から光刺激後まで、常時標本１３からの蛍光を検出し続けることで、光刺激による蛍光物質からの発光量の低下やその回復などの標本１３の動的な変化を観測することができる。

この場合、ダイクロイックミラー１１としては、第２の照明手段Ｌ２からの照明光により生じた蛍光を選択的に反射する特性を有するダイクロイックミラーを用いる。

これにより、標本１３から射出され、対物レンズ１２を介してダイクロイックミラー１１に入射した蛍光は、ダイクロイックミラー１１で選択的に反射され、第２の検出手段Ｄ２に入射する。第２の検出手段Ｄ２に入射した蛍光は、リレーレンズ２１及びＩＲカットフィルタ２２を介して、リレーレンズ２１により対物レンズ１２の瞳がリレーされた位置近傍に配置されたＰＭＴ２３へ入射する。このようにして、ＸＹスキャナ１６の走査により変化するレーザ光の集光位置の各々から生じる蛍光が検出され、標本１３内で生じる蛍光量の変化を観察することができる。

なお、ＩＲカットフィルタ１８及びＩＲカットフィルタ２２は、光検出器での蛍光検出精度が向上させるためのものであり、標本１３や対物レンズ１２及びその他の光学素子を反射し、ダイクロイックミラー１０を透過した赤外線レーザ光を遮断する。

以上、本実施例に係るレーザ顕微鏡１によれば、所望のパターンの制御はＳＬＭ５で行われ、標本１３の走査の制御はＸＹスキャナ１６で行われるため、互いに影響を与えることなくそれぞれを別々に制御することができる。このため、チタンサファイアレーザ２及びチタンサファイアレーザ１４からレーザ光を同時に射出することで、標本１３を蛍光観察しながら、所望のパターンの光刺激を標本１３に与えることができる。したがって、光刺激の前後に渡って生じる標本１３の動的な変化を高い時間分解能で観測することができる。

なお、ここでは、第１の照明手段Ｌ１を刺激手段として使用し、第２の照明手段Ｌ２を蛍光観察用の照明手段として使用する場合を例示したが、特にこれに限られない。
本実施例に係るレーザ顕微鏡１は、第１の照明手段Ｌ１を蛍光観察用の照明手段として使用し、第２の照明手段Ｌ２を刺激手段として使用することもできる。

第１の照明手段Ｌ１は、ＳＬＭ５により、例えば、標本１３に含まれる細胞などの観測対象の形状に応じた光パターンを形成し、その光パターンを標本１３に照射し、標本１３を励起する。一方、第２の照明手段Ｌ２は、標本１３上の任意の一点を刺激する。そして、第１の照明手段Ｌ１からの照明光より生じる蛍光を２次元センサであるＣＣＤ２０で検出することで、標本１３の動的な変化を高い時間分解能で観測してもよい。なお、この場合、ダイクロイックミラー１０としては、第１の照明手段Ｌ１からの照明光により生じる蛍光を選択的に透過する特性を有するダイクロイックミラーを用いる。また、ダイクロイックミラー１１は、図示しない切替機構により、照明光と蛍光を透過するフィルタに切り替えられる、または、図示しない挿脱機構により、蛍光を第１の検出手段Ｄ１へ入射させるために、光路から取り外される。

また、本実施例に係るレーザ顕微鏡１は、第１の照明手段Ｌ１と第２の照明手段Ｌ２を、それぞれ異なる蛍光物質を励起する蛍光観察用の照明手段として使用することもできる。

第１の照明手段Ｌ１は、ＳＬＭ５により光パターンを標本１３に照射することにより、標本１３の所望の領域を照明して励起する。第２の照明手段は、走査手段により光の照射位置を経時的に移動させることにより、標本１３の所望の領域を照明して励起する。その上で、標本１３に電気などで刺激を与える。このようにして生じる標本１３の動的な変化を高い時間分解能で観測してもよい。なお、この場合、ダイクロイックミラー１０としては、第１の照明手段Ｌ１からの照明光により生じる蛍光を選択的に透過する特性を有するダイクロイックミラーを用い、ダイクロイックミラー１１としては、第１の照明手段Ｌ１からの照明光により生じる蛍光を選択的に透過し、第２の照明手段Ｌ２からの照明光により生じる蛍光を選択的に反射する特性を有するダイクロイックミラーを用いる。

これにより、第１の照明手段Ｌ１の２次元照明により生じる蛍光は、２次元センサであるＣＣＤ２０により検出され、第２の照明手段Ｌ２の点状照明により生じる蛍光は、ＰＭＴ２３により検出される。

さらに、以上では、光刺激による蛍光量の低下やその回復を観測するＦＲＡＰやＦＬＩＰに、レーザ顕微鏡１を使用する例について説明したが、特にこれに限られない。本実施例に係るレーザ顕微鏡１は、光刺激により、標本１３自体や標本１３に含まれる蛍光物質の変化を引き起され、その結果、蛍光波長が変化するような現象の観測に使用されてもよい。

例えば、ケージドグルタミン酸が導入された細胞に対してこれを解除する波長の刺激光を照射することにより細胞が活性化され、カルシウム濃度や膜電位の変化が引き起こされる。そして、カルシウム感受性蛍光色素や膜電位感受性蛍光色素を用いることで、各々の変化を蛍光強度や蛍光波長の変化として検出することができる。

また、アブレーションでは直接的に標本の特定部分を破壊し、残された標本の形態や活動の変化を蛍光等で観察することで、破壊部分の役割を特定することもできる。
また、蛍光物質が変化する現象であるフォトコンバージョンなどでは、光刺激により、通常の励起により生じる蛍光とは異なる波長の蛍光が生じることになる。

なお、このように、標本１３の動的な変化を蛍光波長の変化を利用して観測する場合には、第１の検出手段Ｄ１及び第２の検出手段Ｄ２に、波長の異なる蛍光をそれぞれ検出する機能が必要となる。このため、第１の検出手段Ｄ１は、ＣＣＤ２０としてカラーＣＣＤを用いてもよい。また、第２の検出手段Ｄ２は、ダイクロイックミラー等の波長分割素子をさらに設けて、変化前後の波長の光をそれぞれ異なるＰＭＴに入射させるように構成してもよい。

図２は、本実施例に係るレーザ顕微鏡の構成を例示する概略図である。

本実施例に係るレーザ顕微鏡２４は、第１の照明手段Ｌ１の構成がレーザ顕微鏡１と異なっている。その他の構成は、レーザ顕微鏡１と同様であるので、同一の符号を付与し、説明を省略する。なお、レーザ顕微鏡２４も、レーザ顕微鏡１と同様に制御部及びステージを有しているが、図２では、これらは省略されている。

レーザ顕微鏡２４の第１の照明手段Ｌ１は、チタンサファイアレーザ２及びビームエクスパンダ３の代わりに、それぞれ異なる波長のレーザ光を射出する複数の可視レーザ光源（レーザ２５、レーザ２６、レーザ２７）と、ダイクロイックミラー２８と、ダイクロイックミラー２９と、ミラー３０と、音響光学変調器３１（ＡＯＭ：Acoustic Optical Modurator、以降、ＡＯＭと記す。）と、シングルモード光ファイバ３２と、コリメートレンズ３３と、を含んでいる。また、第１の照明手段Ｌ１は、ミラー６の代わりに、瞳リレーレンズ３４及びＸＹスキャナ３５を含んでいる。

なお、ＸＹスキャナ３５は、光パターン照射の位置を標本１３上で移動させるための手段であり、第１の照明光路上で、且つ、ＳＬＭ５とダイクロイックミラー８の間であって、対物レンズ１２の瞳位置と光学的に共役な位置近傍に配置されている。ＸＹスキャナ３５は、標本１３を対物レンズ１２の光軸と直交するＸ方向（第１の方向）及びＹ方向（第２の方向）へ走査することができる点は、ＸＹスキャナ１６と同様である。ＸＹスキャナ３５としては、例えば、ガルバノミラーや、音響光学偏向素子（ＡＯＤ：Acoustic Optical Deflector）などを用いることができる。

各レーザ光源から射出されたレーザ光は、減光フィルタ（ＮＤフィルタ）またはシャッターとして機能するＡＯＭ３１へ入射する。より具体的には、レーザ光源２５から射出されたレーザ光は、ダイクロイックミラー２８を透過してＡＯＭ３１に入射する。また、レーザ光源２６から射出されたレーザ光は、ダイクロイックミラー２９、ダイクロイックミラー２８を反射してＡＯＭ３１に入射する。また、レーザ光源２７から射出されたレーザ光は、ミラー３０を反射し、ダイクロイックミラー２９を透過し、さらにダイクロイックミラー２８を反射してＡＯＭ３１に入射する。

ＡＯＭ３１から射出されたレーザ光は、入射端３２ａからシングルモード光ファイバ３２へ入射し、射出端３２ｂからコリメートレンズ３３へ向けて射出される。さらに、レーザ光は、コリメートレンズ３３で平行光に変換され、プリズム型ミラー４によりＳＬＭ５の仕様に応じた角度でＳＬＭ５に入射するように偏向されて、ＳＬＭ５へ入射する。

ＳＬＭ５へ入射したレーザ光は、標本１３上で所望のパターンの光が形成されるように変調される。より厳密には、レーザ光の位相が変調される。その後、再びプリズム型ミラー４で偏向され、瞳リレーレンズ３４、ＸＹスキャナ３５、瞳リレーレンズ７を介してダイクロイックミラー８へ入射する。以降、レーザ顕微鏡１と同様に作用することで、所望のパターンのレーザ光が標本１３に照射される。

本実施例に係るレーザ顕微鏡２４の第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２は、実施例１に係るレーザ顕微鏡１の第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２と同様に、それぞれ蛍光観察用の照明手段、刺激手段のいずれとしても使用可能である。従って、本実施例に係るレーザ顕微鏡２４によっても、実施例１に係るレーザ顕微鏡１と同様の効果を得ることができる。
また、レーザ顕微鏡２４は、第１の照明手段に含まれる複数の可視レーザ光源を用いることで、さらに、さまざまな蛍光物質に対応することができる。

さらに、ＸＹスキャナ３５による光パターン照射位置の移動は、ＳＬＭ５による位相の変調状態を変更することによる光パターン照射位置の移動に比べて高速である。このため、レーザ顕微鏡２４では、ＸＹスキャナ３５を制御することで光パターン照射位置を高速に移動させることができる。このような高速な移動により、単なる光パターン照射の位置の調整に加え、光パターン照射のさらなる高密度化も実現できる。具体的には、光パターン照射により同時に光が照射される照射領域を削減して、各位置に照射される光密度を高める。その上で、照射領域をＸＹスキャナ３５によるラスタスキャンやトルネードスキャンなどを利用して高速に移動させることで、任意の部位をさらに高い光密度で刺激または励起することができる。

図３は、本実施例に係るレーザ顕微鏡の構成の変形例を例示する概略図である。図３（ａ）に例示される変形例に係るレーザ顕微鏡３６は、ＸＹスキャナ３５の配置を除いて、実施例２に係るレーザ顕微鏡２４の構成と同様である。

ＸＹスキャナ３５は、Ｘ方向（第１の方向）に標本１３を走査するＸスキャナ３５ａと、Ｙ方向（第２の方向）に標本１３を走査するＹスキャナ３５ｂを含んでいる。通常、ＸＹスキャナは、図３（ａ）に例示されるように、２つのスキャナが近接して配置されているため、ＸＹスキャナ（２つのスキャナ）を厳密に対物レンズの瞳と光学的に共役とすることはできない。

レーザ顕微鏡３６では、Ｘスキャナ３５ａを対物レンズ１２の瞳位置と光学的に共役な位置に配置する。このように配置することで、レーザ顕微鏡３６では、光パターン照射位置をＸ方向へ移動する場合には、パターンの劣化は生じない。このため、図３（ｂ）に例示されるように、予め照射位置１３ａのＸ方向への移動を前提とすることで照射領域を削減して光密度を高めた場合でも、任意の部位をより正確に照射することができる。

また、Ｙスキャナ３５ｂは、主に光パターン照射の位置の微調整に利用される。その他、予めＸ方向に対して照射位置１３ａを高密度に形成し、Ｙ方向への移動量を小さくすることで、Ｘスキャナ３５ａ及びＹスキャナ３５ｂを使用した正確な２次元走査も可能である。

以上、本変形例に係るレーザ顕微鏡３６によれば、実施例２に係るレーザ顕微鏡２４と同様の効果を得ることができる。また、レーザ顕微鏡３６では、照射領域を削減して光密度を高めた場合に、任意の部位をより正確に照射することができる。

図４は、本実施例に係るレーザ顕微鏡の構成を例示する概略図である。

本実施例に係るレーザ顕微鏡３７の多くの構成要素は、レーザ顕微鏡１（またはレーザ顕微鏡２４）と同様である。このため、同一の構成要素には、同一の符号を付与し、説明を省略する。なお、レーザ顕微鏡３７も、レーザ顕微鏡１と同様に制御部及びステージを有しているが、図４では、これらは省略されている。

レーザ顕微鏡３７は、第１の照明手段Ｌ１と、第２の照明手段Ｌ２と、ダイクロイックミラー（ダイクロイックミラー４７ａ、ダイクロイックミラー４７ｂ）を有するターレット４７と、結像レンズ９と、ダイクロイックミラー１０と、ダイクロイックミラー１１と、レーザ光を標本１３に照射する対物レンズ１２と、第１の検出手段Ｄ１と、第２の検出手段Ｄ２と、第３の検出手段Ｄ３と、第４の検出手段Ｄ４を含んで構成されている。

第１の照明手段Ｌ１は、瞳リレーレンズ３４と、Ｘスキャナ３５ａと、瞳リレーレンズ４６と、Ｙスキャナ３５ｂとを含み、Ｘスキャナ３５ａ及びＹスキャナ３５ｂが共に、対物レンズ１２の瞳と光学的に共役である点が、レーザ顕微鏡１と異なっている。すなわち、レーザ顕微鏡３７では、ＳＬＭ５、Ｘスキャナ３５ａ、Ｙスキャナ３５ｂ、対物レンズ１２の瞳が、それぞれ光学的に共役である。

これにより、レーザ顕微鏡３７では、光パターン照射位置の移動によるパターンの劣化は生じない。予め照射位置の移動を前提とすることで照射領域を削減して光密度を高めた場合でも、任意の部位をより正確に照射することができる。
また、第１の照明手段Ｌ１は、プリズム型ミラー４が第１の照明光路に対して挿脱可能に配置されている点も、レーザ顕微鏡１と異なっている。

プリズム型ミラー４が第１の照明光路上から取り除かれた場合、ビームエクスパンダ３から射出されたレーザ光は、平行光として瞳投影リレーレンズに入射するため、ＳＬＭ５で変調されずに位相の揃った平行光としてＳＬＭ５から射出される場合のレーザ光と等しく、標本１３上の一点を照射する。この場合、ＳＬＭ５を経由することにより生じる光量の損失を抑えることができるため、第１の照明手段の光の利用効率を、さらに改善することができる。

また、第１の照明手段Ｌ１は、プリズム型ミラー４を挿入することでパターン照明を実現するための手段として機能し、プリズム型ミラー４を取り除くことで通常のレーザ走査型顕微鏡の照明手段として機能する。このため、パターン照明と通常のレーザ走査型顕微鏡の照明を同時に実現する必要がない場合には、第２の照明手段Ｌ２を省略することができる。

第２の照明手段Ｌ２は、チタンサファイアレーザ１４及びビームエクスパンダ１５の代わりに、それぞれ異なる波長のレーザ光を射出する複数の可視レーザ光源（レーザ３８、レーザ３９、レーザ４０）と、ダイクロイックミラー４１と、ダイクロイックミラー４２と、ミラー４３と、入射端４４ａ及び射出端４４ｂを有するシングルモード光ファイバ４４と、コリメートレンズ４５と、ダイクロイックミラー５９と、を含んでいる点が、レーザ顕微鏡１と異なっている。

また、ダイクロイックミラー８の代わりに、複数のダイクロイックミラー（ダイクロイックミラー４７ａ、ダイクロイックミラー４７ｂ）を含むターレット４７が光路合成手段として用いられている。ターレット４７は、レーザ光源から射出されるレーザ光の波長に応じて、光路上に配置するダイクロイックミラーを交換するために、使用される。
これにより、レーザ顕微鏡３７は、第１の照明手段に含まれる複数の可視レーザ光源を用いることで、さまざまな蛍光物質に対応することができる。

また、レーザ顕微鏡３７は、第１の検出手段Ｄ１及び第２の検出手段Ｄ２に加えて、第３の検出手段Ｄ３及び第４の検出手段Ｄ４を含んでいる点も、レーザ顕微鏡１と異なっている。

第３の検出手段Ｄ３は、いわゆる透過検出を行うための手段である。また、第３の検出手段Ｄ３は、第２の検出手段Ｄ２と同様に、標本１３の任意の領域からの蛍光（検出光）を検出するための検出手段である。具体的には、標本１３を透過した光が入射するコンデンサレンズ４８（透過検出光学系）と、蛍光を電気信号に変換する光検出器であるＰＭＴ４９と、を含んでいる。透過検出光学系は、蛍光の検出のみならず、照明の方向と同じ方向に強い反応光を発生させるSHG光などの検出にも特に好適である。なお、図４では図示していないが、標本１３とＰＭＴ４９の間に、レーザ光を遮断し、蛍光を選択的に透過させるフィルタを設けても良い。

第４の検出手段Ｄ４も、第２の検出手段Ｄ２と同様に、標本１３上の任意の一点からの蛍光を検出するための検出手段である。具体的には、入射光を集光する集光レンズ６０と、集光レンズ６０の焦点面上に配置された共焦点絞り６１と、蛍光を分離するダイクロイックミラー６２と、それぞれ所望の蛍光のみを透過させるバリアフィルタ６３及びバリアフィルタ６５と、蛍光を検出するＰＭＴ６４及びＰＭＴ６６と、を含んでいる。

なお、共焦点絞り６１は、標本１３（対物レンズ１２の焦点位置）と光学的に共役な位置に配置されている。このため、照明光が集光した標本１３上の一点から生じた蛍光のみが共焦点絞り６１に設けられたピンホールを通過し、それ以外の位置から生じた蛍光は、共焦点絞り６１で遮断される。その後、ピンホールを透過した蛍光は、ダイクロイックミラーにより反射または透過される。例えば、第２の照明手段Ｌ２を蛍光観察用の照明手段として利用している場合であって、複数の可視レーザ光源からのレーザ光により複数の蛍光物質が励起されている場合は、それぞれの蛍光物質から射出された蛍光毎に分離される。そして、ダイクロイックミラー６２を透過した蛍光のうち、所望の蛍光のみがバリアフィルタ６３を透過し、ＰＭＴ６４で検出される。同様に、ダイクロイックミラー６２を反射した蛍光のうち、所望の蛍光のみがバリアフィルタ６５を透過し、ＰＭＴ６６で検出される。

このように、第４の検出手段Ｄ４では、ＸＹスキャナ１６でデスキャンされ、且つ、標本１３と光学的に共役な共焦点絞り６１を通過した蛍光のみが検出される。このため、第２の検出手段Ｄ２や第３の検出手段Ｄ３と異なり、常に、照明光が集光している標本１３上の任意の一点から生じた蛍光のみを検出することができる。従って、不要な蛍光の検出が抑制されるため、高い分解能が実現できる。

以上、本実施例に係るレーザ顕微鏡３７の第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２は、実施例１に係るレーザ顕微鏡１の第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２と同様に、それぞれ蛍光観察用の照明手段、刺激手段のいずれとしても使用可能である。従って、本実施例に係るレーザ顕微鏡３７によれば、実施例１に係るレーザ顕微鏡１と同様の効果を得ることができる。

また、レーザ顕微鏡３７では、実施例２に係るレーザ顕微鏡２４と同様に、光パターン照射の高速な移動が可能であり、光パターン照射のさらなる高密度化も実現できる。また、レーザ顕微鏡３７では、実施例２の変形例に係るレーザ顕微鏡３６と同様に、光パターン照射の高速な移動に伴うパターンの劣化を抑制することができる。このため、光パターン照射の照射領域を削減して光密度を高めた場合でも、任意の部位を正確に照射することができる。

また、レーザ顕微鏡３７では、第２の照明手段Ｌ２の点状照明により生じる蛍光を、共焦点絞りを備えた第４の検出手段Ｄ４で検出することにより、可視レーザ光による一光子励起でも、高い分解能を実現することができる。

図５は、本実施例に係るレーザ顕微鏡の構成を例示する概略図である。図５に例示されるレーザ顕微鏡５０は、図１に例示されるレーザ顕微鏡１と同様に、レーザ光源であるチタンサファイアレーザから射出された赤外線領域の超短パルスレーザ光（照明光）により、２光子過程を利用して標本１３を励起する２光子励起顕微鏡である。

本実施例に係るレーザ顕微鏡５０の多くの構成要素は、レーザ顕微鏡１と同様である。このため、同一の構成要素には、同一の符号を付与し、説明を省略する。なお、レーザ顕微鏡５０も、レーザ顕微鏡１と同様に制御部及びステージを有しているが、図５では、これらは省略されている。

レーザ顕微鏡５０は、チタンサファイアレーザ５１と、偏光手段５２と、ビームエクスパンダ５３と、ＰＢＳ５４と、第１の照明手段Ｌ１と、第２の照明手段Ｌ２と、ＰＢＳ５７と、結像レンズ９と、ダイクロイックミラー１０と、ダイクロイックミラー１１と、レーザ光を標本１３に照射する対物レンズ１２と、第１の検出手段Ｄ１と、第２の検出手段Ｄ２と、を含んで構成されている。
偏光手段５２は、λ／２板５２ａ及びλ／４板５２ｂを含み、λ／２板５２ａ及びλ／４板５２ｂは、光軸に対して回転可能に配置されている。

本実施例に係るレーザ顕微鏡５０は、同一のレーザ光源から射出されたレーザ光を、第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２に導き、光パターン照射とそれに伴って生じる標本１３の動的な変化の観測に利用する点が、実施例１に係るレーザ顕微鏡１と異なっている。

チタンサファイアレーザ５１から射出された直線偏光であるレーザ光（照明光）は、まず、偏光手段５２へ入射し円偏光に変換される。そして、ビームエクスパンダ５３に入射し、レーザ光の光束径が調整された上で、平行光としてＰＢＳ５４へ入射する。

ＰＢＳ５４は、偏光方向に応じて入射光を反射または透過させる光学素子である。ＰＢＳ５４は、円偏光であるレーザ光をＰ偏光（例えば、第１の照明光）とＳ偏光（例えば、第２の照明光）に分割し、それぞれＳＬＭ５が配置された第１の照明光路、ＸＹスキャナ１６が配置された第２の照明光路に導く。すなわち、ＰＢＳ５４は、照明光路分割手段として機能する。

ＰＢＳ５４で分割され、第１の照明手段Ｌ１へ入射したＰ偏光であるレーザ光は、減光フィルタ（ＮＤフィルタ）またはシャッターとして機能するＡＯＭ５５へ入射する。さらに、レーザ光は、ミラー５６を反射し、プリズム型ミラー４によりＳＬＭ５の仕様に応じた角度でＳＬＭ５に入射するように偏向されて、ＳＬＭ５へ入射する。

ＳＬＭ５へ入射したレーザ光は、標本１３上で所望のパターンの光が形成されるように変調される。より厳密には、レーザ光の位相が変調される。その後、再びプリズム型ミラー４で偏向され、ミラー６、瞳リレーレンズ７を介して、ＰＢＳ５４と同様の特性を有するＰＢＳ５７へ入射する。

ＰＢＳ５７は、ＰＢＳ５４を直進した光を同様に直進させ、ＰＢＳ５４を反射した光を同様に反射することにより、光路合成手段として機能する。このため、第１の照明手段Ｌ１からＰＢＳ５７に入射したレーザ光は、ＰＢＳ５７で反射され、結像レンズ９へ入射する。以降、レーザ顕微鏡１と同様に作用することで、所望のパターンのレーザ光が標本１３に照射される。

一方、ＰＢＳ５４で分割され、第２の照明手段Ｌ２へ入射したＳ偏光であるレーザ光は、減光フィルタ（ＮＤフィルタ）またはシャッターとして機能するＡＯＭ５８へ入射する。さらに、レーザ光は、ＸＹスキャナ１６へ入射し、標本１３の走査位置に応じた方向へ偏向される。そして、瞳リレーレンズ１７を介して入射したレーザ光は、ＰＢＳ５７を透過して、第１の照明手段Ｌ１からのレーザ光と同一の光路を進行し、標本１３へ入射する。

なお、上述したように、偏光手段５２に含まれるλ／２板５２ａ及びλ／４板５２ｂは回転可能に配置されている。このため、λ／２板５２ａ及びλ／４板５２ｂの回転を制御することで、第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２に入射する偏光の強度比を任意に変更することができる。

以上、本実施例に係るレーザ顕微鏡５０の第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２は、実施例１に係るレーザ顕微鏡１の第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２と同様に、それぞれ蛍光観察用の照明手段、刺激手段のいずれとしても使用可能である。従って、本実施例に係るレーザ顕微鏡５０によれば、実施例１に係るレーザ顕微鏡１と同様の効果を得ることができる。
また、必要とするレーザ光源の数を削減することができるため、構成の簡素化され、レーザ顕微鏡全体をコンパクトに構成することができる。

図６は、本実施例に係るレーザ顕微鏡の構成を例示する概略図である。図６に例示されるレーザ顕微鏡１００は、光学的な構成は図１に例示されるレーザ顕微鏡１と同様である。このため、同一の構成要素には、同一の符号を付与し、説明を省略する。

本実施例に係るレーザ顕微鏡１００は、第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２の照明精度を向上させるために、制御部１０２と接続された記憶演算部１０３及び表示部１０４を含む点が図１に例示されるレーザ顕微鏡１と異なっている。

制御部１０２は、記憶演算部１０３、表示部１０４、ＣＣＤ２０、ＸＹスキャナ１６及びＳＬＭ５及び不図示のステージに接続されている。制御部１０２は、ＳＬＭ５及びＸＹスキャナ１６の動作を制御する。また、撮像手段として機能するＣＣＤ２０からの電気信号を受信し表示部１０４へ表示する。

記憶演算部１０３には、予め、ＳＬＭ５と対物レンズ１２の間に配置されている光学系の収差情報と、対物レンズ１２の収差情報が記憶されている。具体的には、ディスクトーション、倍率色収差、像高毎及び波長毎の波面収差に関する情報が記憶されている。
本実施例に係るレーザ顕微鏡１００では、標本の観測に先立ち、第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２による高精度な照射を行うための事前調整を行う。

事前調整は、対物レンズ１２の焦点位置に参照標本１０１を配置して開始される。参照標本１０１は、第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２からの照明光が標本上に照射される位置を正しく確認するための標本であり、例えば、蛍光プレートやミラーなどを用いることができる。

なお、第１の照明手段Ｌ１からの照明光の照射位置と、第２の照明手段Ｌ２からの照明光の照射位置は、ＣＣＤ２０で検出する。このため、必要に応じて、ＩＲカットフィルタの除去やダイクロイックミラーの特性の変更等が行われる。
まず、第１の照明手段Ｌ１の調整について説明する。

制御部１０２は、所望のパターンで参照標本１０３が照射されるように、ＳＬＭ５を制御する。このとき、制御部１０２が、ＳＬＭ５を、参照標本１０３とＳＬＭ５との間で成立するフーリエ変換の関係により理論的に求められる位相パターンに制御すると、実際には参照標本１０３上には所望のパターンは照射されない。これは、対物レンズ１２及びＳＬＭ５から対物レンズ１２の間の光学系で生じる収差や製造誤差が影響するからである。特に、ディストーション、倍率色収差、波面収差の影響が大きい。

そこで、制御部１０２は、予め測定して記憶演算部１０３に記憶されている、対物レンズ１２及びＳＬＭ５から対物レンズ１２の間の光学系の収差情報を考慮した位相パターンに、ＳＬＭ５を制御する。これにより、より所望のパターンに近い照射パターンが得られる。

または、照射された照射パターンをＣＣＤ２０で観測するようにしても良い。つまり、ＣＣＤ２０によりＳＬＭ５で位相が変調された照明光が照射された参照標本１０３を撮像し、照明光が参照標本１０３上に形成した照射パターンを取得する。取得された照射パターンは、ＣＣＤ２０から出力され、表示部１０４へ画像として表示される。

そして、制御部１０２は、記憶演算部１０３で、ＣＣＤ２０で取得された照射パターンと所望のパターンとを比較し、照射パターンと所望のパターンの差が小さくなるように、ＳＬＭ５による位相変調量を調整する。これによっても、所望のパターンに近い照射パターンが得られる。
さらに、上記の光学系の収差情報を考慮した位相パターンにＳＬＭ５を制御する方法と、上記のＣＣＤ２０で取得された照射パターンと所望のパターンとを比較し、照射パターンと所望のパターンの差が小さくなるように、ＳＬＭ５による位相変調量を調整する方法の二つを組み合わせてもよい。これにより、さらに所望のパターンに近い照射パターンが得られる。

以上のようにして、事前調整でＳＬＭ５の位相変調量が調整され、最適化されることで、実際の標本の観測でも第１の照明手段Ｌ１による高精度なパターン照射が可能となる。
次に、第２の照明手段Ｌ２の調整について説明する。

ガルバノミラーなどであるＸＹスキャナ１６は、別途、観測領域の大きさ、視野の中心位置、サンプリング位置に関するリニアリティの調整（例えば、振り角により変化する走査速度に応じたサンプリングクロックの調整）が行われている。

その上で、ＸＹスキャナ１６の制御パラメータであるスキャナ角度を変更しながら参照標本１０１を照明し、ＣＣＤ２０で照明光の照射位置を確認する。そして、確認された照射位置に対応するＣＣＤ２０の画素部の位置を、スキャナ角度と関連付けて記憶演算部１０３に記憶させる。

以上のようにして、ＣＣＤ２０の画素部の位置とＸＹスキャナ１６のスキャナ角度とが関連付けられることで、実際の標本の観測でも第２の照明手段Ｌ２による高精度な照射が可能となる。

以上、本実施例に係るレーザ顕微鏡１００によれば、実施例１に係るレーザ顕微鏡１と同様の効果を得ることができる。また、標本の観測前に行われる事前調整により、光学系の収差等に影響されず、第１の照明手段Ｌ１及び第２の照明手段Ｌ２による高精度な照射が可能となる。

１、２４、３６、３７、５０、１００・・・レーザ顕微鏡、１ｂ・・・ステージ、２、１４、５１・・・チタンサファイアレーザ、３、１５、５３・・・ビームエクスパンダ、４・・・プリズム、５・・・ＳＬＭ、６、３０、４３、５６・・・ミラー、７、１７、３４、４６・・・瞳リレーレンズ、８、１０、１１、２８、２９、４１、４２、４７ａ、４７ｂ、６２・・・ダイクロイックミラー、９・・・結像レンズ、１２・・・対物レンズ、１３・・・標本、１３ａ・・・照射位置、１６、３５・・・ＸＹスキャナ、１８、２２・・・ＩＲカットフィルタ、１９・・・結像レンズ、６０・・・集光レンズ、２０・・・ＣＣＤ、２１・・・リレーレンズ、２３、４９、６４、６６・・・ＰＭＴ、２５、２６、２７、３８、３９、４０・・・レーザ、３１、５５、５８・・・ＡＯＭ、３２、４４・・・シングルモード光ファイバ、３２ａ、４４ａ・・・入射端、３２ｂ、４４ｂ・・・射出端、３３、４５・・・コリメートレンズ、３５ａ・・・Ｘスキャナ、３５ｂ・・・Ｙスキャナ、４７・・・ターレット、４８・・・コンデンサレンズ、５２・・・偏光手段、５２ａ・・・λ／２板、５２ｂ・・・λ／４板、５４、５７・・・ＰＢＳ、６１・・・共焦点絞り、６３、６５・・・バリアフィルタ、１０１・・・参照標本、１ａ、１０２・・・制御部、１０３・・・記憶演算部、１０４・・・表示部、Ｌ１・・・第１の照明手段、Ｌ２・・・第２の照明手段、Ｄ１・・・第１の検出手段、Ｄ２・・・第２の検出手段、Ｄ３・・・第３の検出手段、Ｄ４・・・第４の検出手段

Claims (20)

1. 照明光を射出するレーザ光源と、
   前記照明光を標本に照射する対物レンズと、
   前記レーザ光源と前記対物レンズの間の第１の照明光路と第２の照明光路とを合成する光路合成手段と、
   前記第１の照明光路上であって前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された、前記照明光の位相を変調する位相変調型空間光変調器と、
   前記第２の照明光路上に配置された、前記対物レンズの光軸と直交する平面内で前記標本を走査する２次元走査手段と、
   前記対物レンズと前記位相変調型空間光変調器との間に配置される光学系及び前記対物レンズで生じる収差情報が、像高毎及び前記照明光の波長毎に、記憶された記憶部と、
   前記位相変調型空間光変調器で前記記憶部から取得した前記収差情報を考慮して位相が変調された前記照明光が照射された前記標本を撮像し、前記標本上に形成される照射パターンを取得する撮像手段と、を含み、
   前記位相変調型空間光変調器は、所望のパターンと前記撮像手段で取得した前記照射パターンとの差が小さくなるように、前記照明光の位相の変調を調整する
   ことを特徴とするレーザ顕微鏡。
2. 請求項１に記載のレーザ顕微鏡において、
   前記レーザ光源は、前記位相変調型空間光変調器へ入射する第１の照明光を射出する第１のレーザ光源と、前記２次元走査手段へ入射する第２の照明光を射出する第２のレーザ光源と、を含むことを特徴とするレーザ顕微鏡。
3. 請求項２に記載のレーザ顕微鏡において、
   前記光路合成手段は、入射する光の波長に応じて、交換されることを特徴とするレーザ顕微鏡。
4. 請求項１に記載のレーザ顕微鏡において、
   さらに、前記照明光を第１の照明光と第２の照明光に分割し、前記第１の照明光を前記第１の照明光路へ、また、前記第２の照明光を前記第２の照明光路へ導く照明光路分割手段を含むことを特徴とするレーザ顕微鏡。
5. 請求項４に記載のレーザ顕微鏡において、
   前記レーザ光源と前記照明光路分割手段の間に、λ／４板を含むことを特徴とするレーザ顕微鏡。
6. 請求項５に記載のレーザ顕微鏡において、
   前記レーザ光源と前記照明光路分割手段の間に、さらに、λ／２板を含むことを特徴とするレーザ顕微鏡。
7. 請求項６に記載のレーザ顕微鏡において、
   前記λ／４板及び前記λ／２板は、光軸に対して、回転可能に配置されることを特徴とするレーザ顕微鏡。
8. 請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡において、さらに、
   前記第１の照明光路上であって、前記位相変調型空間光変調器と前記光路合成手段の間に、前記標本を、前記対物レンズの光軸と直交する第１の方向に走査する第１の走査手段を含むことを特徴とするレーザ顕微鏡。
9. 請求項８に記載のレーザ顕微鏡において、
   前記第１の走査手段は、前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役であることを特徴とするレーザ顕微鏡。
10. 請求項８または請求項９に記載のレーザ顕微鏡において、
    前記第１の走査手段は、前記位相変調型空間光変調器が前記照明光の位相を変調することにより前記標本上に形成される前記照明光のパターンを、前記標本上で前記第１の方向へ平行移動させることを特徴とするレーザ顕微鏡。
11. 請求項９または請求項１０に記載のレーザ顕微鏡において、さらに、
    前記第１の照明光路上であって、前記位相変調型空間光変調器と前記光路合成手段の間に、前記標本を、前記第１の方向と直交する第２の方向に走査する第２の走査手段を含むことを特徴とするレーザ顕微鏡。
12. 請求項１１に記載のレーザ顕微鏡において、
    前記前記第２の走査手段は、前記第１の走査手段と光学的に共役であることを特徴とするレーザ顕微鏡。
13. 請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡において、さらに、
    前記照明光を照射することにより前記標本から生じる検出光を、前記照明光から分離して検出光路に導く検出光路分離手段と、
    前記検出光路上に配置された、前記検出光を検出する光検出器と、を含むことを特徴とするレーザ顕微鏡。
14. 請求項１３に記載のレーザ顕微鏡において、
    前記光検出器は、前記標本と光学的に共役な位置に配置された、前記検出光の強度の空間的な分布を検出する２次元センサであることを特徴とするレーザ顕微鏡。
15. 請求項１３に記載のレーザ顕微鏡において、
    前記光検出器は、前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置近傍に配置されることを特徴とするレーザ顕微鏡。
16. 請求項１４または請求項１５に記載のレーザ顕微鏡において、
    前記検出光路分離手段は、前記対物レンズと前記２次元走査手段との間に配置されることを特徴とするレーザ顕微鏡。
17. 請求項１３に記載のレーザ顕微鏡において、さらに、
    前記検出光路分離手段と前記光検出器の間の、前記標本と光学的に共役な位置に配置された共焦点絞りを含み、
    前記検出光路分離手段は、前記レーザ光源と前記２次元走査手段との間に配置されることを特徴とするレーザ顕微鏡。
18. 請求項１乃至請求項１２に記載のレーザ顕微鏡において、さらに、
    前記標本を透過した光が入射する透過検出光学系と、
    前記照明光を照射することにより前記標本から生じる検出光を、前記透過検出光学系を介して、検出する光検出器と、を含むことを特徴とするレーザ顕微鏡。
19. 請求項１乃至請求項１８のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡において、
    前記収差情報は、ディストーション及び倍率色収差、または、波面収差に関するものであることを特徴とするレーザ顕微鏡。
20. 請求項１乃至請求項１９のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡において、
    複数の画素部を有し、前記位相変調型空間光変調器で位相が変調された第１の照明光が照射された前記標本を撮像し、前記標本上に形成された照射パターンを取得する撮像手段を含み、
    前記レーザ顕微鏡は、前記２次元走査手段により偏向された第２の照明光が入射する前記画素部の位置と、当該画素部に前記第２の照明光が入射するときの前記２次元走査手段の走査位置を制御するパラメータと、を関連付けて記憶することを特徴とするレーザ顕微鏡。